一种快速得到纤用大麻再生植株的方法.pdf

一种快速得到纤用大麻再生植株的方法，包括如下步骤：（1）将纤用大麻种子经无菌处理、播种得到无菌苗；（2）从2-3天苗龄的无菌苗上撕取子叶，切去叶尖，正置于含噻苯隆和α-萘乙酸的芽诱导培养基上培养；（3）经步骤（2）培养18-24天后，待不定芽伸长至1-2厘米高时，将不定芽切下，转到含有吲哚丁酸的生根培养基上培养生根，培养时间为35-42天，得到生根小苗。采用本发明，外植体取材方便、快捷，周期短，诱导再生率较高，获得子叶外植体，只需要3天；获得健壮的再生丛芽，只需要18-24天。并且随时可以播种、获取外植体，不受取材季节、消毒过程等因素的制约，适用于大麻遗传转化研究。

权利要求书1.  一种快速得到纤用大麻再生植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将纤用大麻种子经无菌处理、播种得到无菌苗；（2）在超净工作台上，将子叶从2天苗龄或3天苗龄的无菌苗上撕下，切去叶尖，正置于含噻苯隆和α-萘乙酸的芽诱导培养基上培养出不定芽；所述芽诱导培养基为MS基础培养基，噻苯隆浓度为0.1-0.2mg/L，α-萘乙酸浓度为0.01-0.05mg/L, 附加蔗糖30g/L，琼脂6-7g/L，pH5.5-6.0，光照强度2200-2600lx，光照时间14-16h/d，温度24±2℃，培养时间为18-24天；（3）经步骤（2）培养18-24天后，待不定芽伸长至1-2厘米高时，将不定芽切下，转到含有吲哚丁酸的生根培养基上培养生根，所述生根培养基为1/2MS基础培养基，其中吲哚丁酸浓度为0.3-0.5mg/L，附加蔗糖30g/L，琼脂6-7g/L，pH5.5-6.0，光照强度2200-2600lx，光照时间14-16h/d，温度24±2℃；培养时间为35-42天，得到生根小苗。2.  根据权利要求1所述的快速得到纤用大麻再生植株的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述去尖子叶为1/2子叶。

说明书一种快速得到纤用大麻再生植株的方法
技术领域
本发明涉及一种快速得到纤用大麻再生植株的方法。
背景技术
大麻（Cannabis Sativa L.）是大麻科（Cannabinaceace）大麻属（Cannabis）一年生草本植物，在我国有数千年的种植利用历史。大麻浑身是宝，既能生产优质的纺织纤维，在食品、药用和建材工业等方面也有巨大应用价值。大麻根据其四氢大麻酚（THC）含量分为毒品大麻、中间型大麻和纤用大麻三种，我国是纤用大麻种植大国，种植面积占世界的30%左右。
由于上世纪很多国家禁止种植一切大麻，导致许多珍贵种质资源遗失，对大麻的研究也远远落后于其他经济作物。而且，大麻是雌雄异株的常异花授粉作物，种质杂合度高。使用常规的系统育种方法进行品种选育和改良进展缓慢。基因工程技术是植物育种中普遍应用的方法,但要获得目标性状改良的转基因植物，建立一个高效的再生体系是前提。
在大麻再生体系研究中，外植体的选择十分重要。现有技术主要受制于外植体的选择，目前用于大麻再生的外植体有茎尖、带节茎段、下胚轴、叶片，这些材料的取材周期和便捷性受到限制。选用大田采摘的实生苗的茎尖、茎段等作为外植体，将受到生长季节和消毒程序繁琐的限制〔参见尹品训,杨明,郭鸿彦,刘振博,胡学礼,陈裕，大麻的离体培养与快速繁殖[J]. 西南农业学报. 2005(04)〕。选用种子消毒后（未去种皮）播种产生的无菌苗的茎尖、下胚轴、带节茎段作为外植体，从播种到无菌苗长大到适宜取材时期，需要15-20天，影响实验周期的紧密性〔参见张利国,宋宪友,房郁妍,郑楠,吴广文.大麻新品种龙大麻一号再生体系初探[J]. 中国麻业科学. 2012(03)〕。申请号为200610088353.7的中国专利申请，将种子消毒后接种于培养基，20天后才能获得茎尖外植体，30天后获得侧芽，培养周期较长。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种周期较短，操作方便的快速得到纤用大麻再生植株的方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种快速得到纤用大麻再生植株的方法，包括如下步骤：
（1）将纤用大麻种子经无菌处理、播种得到无菌苗；
参见程超华，李育君，赵立宁，唐蜻，臧巩固，三重处理法获得大麻种子无菌苗研究[J]. 中国麻业科学. 2011(01)；
（2）在超净工作台上，将子叶从2天苗龄或3天苗龄的无菌苗上撕下（不宜切下，否则会影响再生频率），切去叶尖，正置于含噻苯隆（TDZ）和α-萘乙酸（NAA）的芽诱导培养基上培养出不定芽；所述芽诱导培养基为MS基础培养基，噻苯隆浓度为0.1-0.2mg/L，α-萘乙酸浓度为0.01-0.05mg/L, 附加蔗糖30g/L，琼脂（6-7）g/L，pH5.5-6.0，光照强度2200-2600lx，光照时间14-16h/d，温度24±2℃，培养时间为18-24天；
（3）经步骤（2）培养18-24天后，待不定芽伸长至1-2厘米高时，将不定芽切下，转到含有吲哚丁酸（IBA）的生根培养基上培养生根，所述生根培养基为1/2MS（即MS营养物质减半）基础培养基，其中吲哚丁酸（IBA）浓度为0.3-0.5mg/L，附加蔗糖30g/L，琼脂（6-7）g/L，pH5.5-6.0，光照强度2200-2600lx，光照时间14-16h/d，温度24±2℃；培养时间为35-42天，得到生根小苗。
所得到的生根小苗按常规方法移植栽培。
进一步，步骤（2）中，所述去尖子叶优选为1/2子叶。
本发明所指“大麻”，均为纤用大麻，其四氢大麻酚（THC）质量含量<0.3%。
本发明的方法特别适用纤用大麻品种，再生植株诱导率为46%-48%。
本发明基于种子的消毒、剥皮处理，第一次提出用子叶作为外植体建立再生体系，可以便捷、快速地得到再生植株。使用2天苗龄或3天苗龄的无菌苗子叶作为外植体，这些外植体为无菌状态，生长势均一，可在28天内得到大量再生芽，可比原有方法减少实验周期7-14天，这可为将来的遗传转化工作提供很大的便利。
本发明采用2天苗龄或3天苗龄无菌苗的子叶作为外植体，从播种到获得子叶只需要3天时间，子叶再生频率达到46%-48%，可以快速、便捷地得到再生植株。
采用本发明，外植体取材方便、快捷，获得子叶外植体，只需要3天，获得健壮的再生丛芽，只需要18-24天，周期短，并且随时可以播种、获取外植体，不受取材季节、消毒过程等因素的制约，非常适合用于遗传转化研究。
附图说明
图1是本发明实施例1所得3天苗龄的大麻无菌苗图；
图2是本发明实施例1用作外植体的1/2子叶图；
图3是本发明实施例1子叶基部长出的丛生芽图；
图4是本发明实施例1丛生芽伸长图；
图5是本发明实施例1再生植株生根图；
图6是本发明实施例1再生植株移栽成活图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本实施例之快速得到纤用大麻再生植株的方法，包括如下步骤：
（1）将纤用大麻种子经无菌处理、播种得到无菌苗；
参见程超华，李育君，赵立宁，唐蜻，臧巩固，三重处理法获得大麻种子无菌苗研究[J]. 中国麻业科学. 2011(01)；
（2）在超净工作台上，将子叶从3天苗龄的无菌苗上撕下（不宜切下，否则会影响再生频率），切去叶尖，留下1/2子叶，正置于含噻苯隆（TDZ）和α-萘乙酸（NAA）的芽诱导培养基上培养出不定芽；所述芽诱导培养基为MS基础培养基，噻苯隆浓度为0.2mg/L，α-萘乙酸浓度为0.05mg/L, 附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH5.8，光照强度2300lx，光照时间16h/d，温度24±2℃，培养时间为20天；
（3）经步骤（2）培养20天后，待不定芽伸长至1-2厘米高时，将不定芽切下，转到含有吲哚丁酸（IBA）的生根培养基上培养生根，所述生根培养基为1/2MS（即MS营养物质减半）基础培养基，其中吲哚丁酸（IBA）浓度为0.5mg/L，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH5.8，光照强度2300lx，光照时间16h/d，温度24±2℃；培养时间为35天，得到生根小苗。
所得到的生根小苗按常规方法移植栽培。图1是本发明实施例1所得3天苗龄的大麻无菌苗图；图2是本发明实施例1用作外植体的1/2子叶图；图3是本发明实施例1子叶基部长出丛生芽图；图4是本发明实施例1丛生芽伸长图；图5是本发明实施例1再生植株生根图；图6是本发明实施例1再生植株移栽成活图。说明采用本发明，可以顺利的得到外植体，产生再生植株，并且生根移栽成活。
本实施例中，外植体取材方便、快捷，获得子叶外植体，只需要3天，获得健壮的再生丛芽，只需要20天，周期短，并且随时可以播种、获取外植体，不受取材季节、消毒过程等因素的制约，非常适合用于遗传转化研究。
实施例2
分别选取2天、4天、5天、6天苗龄的无菌苗，将子叶撕下进行处理，其他处理步骤同实施例1。采用2－6天不同苗龄外植体的再生频率结果见表1中。可见采用2天、3天苗龄外植体更适合。
表1 不同苗龄外植体的再生频率
子叶苗龄（天）再生频率(%)247.8±5.1  346.7±5.7  436.7±4.9  522.2±3.5  611.9±3.7 
对照例
分别选取两组3天苗龄的无菌苗，分别将子叶作撕下、切下处理，其他处理步骤同实施例1。采用撕下方法及切下方法所得外植体的再生频率结果见表2中。可见采用撕下更适合。
表2 不同取材方法的3D苗龄外植体再生频率
取材方法再生频率(%)撕47.3±4.8  切6.2±3.7