一种减压超声辅助提取制备高纯度水溶性橄榄苦甙的方法.pdf

本发明公开了一种减压超声辅助提取制备高纯度水溶性橄榄苦甙的方法，属于天然药物提取制备技术领域，其包括如下步骤：药材的预处理、减压超声提取、萃取-反萃取、脱色、结晶-重结晶。本发明针对橄榄苦甙熔点低、易分解等特性，提出了利用减压产生的真空度以及超声波产生的空化效应和搅拌作用，并添加一定量的提取液，经简便的分离纯化工艺，制备纯度高、水溶性好的橄榄苦甙新工艺。此工艺制备的产品含量达95％以上，且具有产品收率高，工艺简单，分离纯化条件温和，毒性小，生产成本低廉等优点，可适用于产业化生产。

权利要求书1.  一种减压超声耦合提取制备高纯度橄榄苦甙的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)药材预处理：将橄榄叶洗净、晒干、粉碎，过80目筛，得到橄榄叶粉末，备用；2)减压超声提取：将橄榄叶粉末与提取液按质量体积比1g∶10-15mL浸泡12-24小时，在真空度0.08-0.1MPa，功率200-240W，温度35-40℃的条件下，减压超声提取30-50分钟，提取两次；抽滤得到滤液。3)萃取-反萃取：将步骤2)所得到的提取液减压浓缩至波美度在8-10之间，用乙酸乙酯萃取3至4次，合并萃取液，减压浓缩至无乙酸乙酯，再经乙醚进行反萃取，进一步除杂；将反萃取之后的浸膏，减压烘干，得橄榄苦甙粗品；4)脱色：将步骤3)所得到的橄榄苦甙粗品用一定浓度的醇溶液超声溶解，抽滤，得到澄清溶液，再加入适量活性炭进行加热回流脱色处理；5)结晶-重结晶：将步骤4)所得到的脱色后溶液进行减压浓缩至波美度在8-10之间，用一定浓度的醇溶液进行溶解，减压浓缩醇溶液至无醇味，烘干，再用乙酸乙酯进行热溶，趁热过滤，低温下静置，待晶体析出后，过滤收集晶体，再将晶体用乙酸乙酯热溶，按上述步骤进行重结晶，可制备水溶性好、含量高的橄榄苦甙精品。2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述专属提取剂为工业乙醇与工业甲醇按体积比1∶1的复配溶液。3.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述抽滤的条件为：真空度0.07-0.09MPa。4.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述减压浓缩的条件为：真空度0.07-0.09MPa，温度为40-50℃。5.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述浓缩液与乙酸乙酯的总体积比为1∶15-20。6.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述浓缩浸膏与乙醚的质量体积比为1∶5-10。7.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述减压烘干的条件为：真空度0.09-0.1MPa，温度为35-40℃。8.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述加热回流脱色处理的条件为：活性炭的添加了量为其重量的2-3‰，温度为45-50℃。9.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中所述减压浓缩的条件为：真空度0.09-0.1MPa，温度为45-50℃。10.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中所述乙酸乙酯热溶的条件为： 橄榄苦甙粗品与乙酸乙酯的质量体积比为1g∶8-10mL，热溶温度为45-50℃。11.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中所述低温静置的条件为：低温温度为0至5℃，静置的时间为12-24小时。

说明书一种减压超声辅助提取制备高纯度水溶性橄榄苦甙的方法
技术领域
本发明涉及一种提取制备高纯度水溶性橄榄苦甙的方法，具体涉及一种减压超声辅助提取制备橄榄苦甙的方法。
背景技术
橄榄叶为木樨科木樨榄属油橄榄树(Olea europaea L)的叶子，其主要含有裂环烯醚萜及其苷、黄酮及其苷、双黄酮及其苷、低分子单宁等成分。橄榄叶提取物中主要成分为环烯醚萜类苦涩物质，其活性最高的为橄榄苦甙(Oleuropein)。橄榄苦甙分子量为540.5，CAS号：32619-42-4。
橄榄苦甙是一种双分子结构酚类和黄酮类物质，熔点87～89℃，易吸湿，暴露在空气和阳光下会分解。其具有天然的抗氧化、抗肿瘤、延缓衰老、增强心血管功能、治疗慢性前列腺炎、增强免疫力、调节内分泌系统、护肝、抗炎等重要的保健功能，同时还有降血脂、降血糖的药理作用，广泛应用于食品、化妆品和生物制药等重要领域。
橄榄苦甙具有强力的抗细菌和抗病毒特性，可用于制造治疗病毒、细菌、原生动物类、寄生虫和吸血虫等所引起的疾病和治疗感冒德尔药物。橄榄苦甙还可以保护皮肤细胞不受紫外线的伤害，防止紫外线对皮肤膜脂质的分解，促进纤维细胞生成胶原蛋白，减少纤维细胞胶原酶的分泌，组织细胞膜的抗聚糖反应，从而高度保护纤维细胞，自然抵御因氧化而导致的肌肤破坏，更免受UV紫外线伤害，有效维持肌肤柔嫩与弹性，达到护肤、嫩肤的功效。目前，水溶性高含量90％的橄榄苦甙主要用于护肤品，可以保护皮肤细胞不受紫外线的伤害，有效维持肌肤柔嫩与弹性，达到扶肤、嫩肤的功效。
目前公开橄榄苦甙的提取分离纯化技术较多，一般采用醇提或碱提法提取橄榄叶中的有效成分，然后进行上柱层析等一系列分离纯化步骤，得到高纯度的橄榄苦甙，但传统的工艺为进一步提高产品含量需要用到树脂吸附或滤膜纯化，耗能大，耗材多，耗时长，产品的收率低，工业污染大；且因其熔点低、易分解等特性，一般的热提法往往会在其提取过程中发生分解，最终导致其收率偏低。因此，常用单一的提取方法或多或少存在一定的弊端。
专利CN 102532217 A公开了一种“从油橄榄叶中提取分离高含量橄榄苦甙”的方法，其方法包括：将橄榄叶切碎、低温提取、过滤、浓缩或直接层析、低温浓缩、干燥、最后得到含量大于80％的橄榄苦甙产品。其以一定浓度的乙醇或水为提取溶剂低温提取，利用树脂串联或二次吸附层析技术，大大提高产品的含量，但因树脂需再生或再利用，后期处理较繁 琐增加了工艺的成本，无法扩大化生产。专利CN 102702287 A公开了一种“从橄榄叶中提取纯化橄榄苦甙”的方法，其方法包括：用pH值为8-10的碱液对橄榄叶进行常温浸提，将所得提取液经分子筛型大孔吸附树脂柱层析，然后用体积浓度为50-80％的乙醇洗柱，收集含目标成分的洗脱液，浓缩干燥，得到低含量的橄榄苦甙；再将低含量的橄榄苦甙用极性值为3.8-4.2的极性溶剂溶解，抽滤，滤液浓缩，得到浓缩液；再向浓缩液中加入有机溶剂调节极性，低温条件下放置析出晶体，干燥，得到高纯度的橄榄苦甙。此工艺因采用碱液提取，可使得橄榄苦甙水解成羟基酪醇，提取时间长，水解程度高，最终导致产品的收率偏低，仅为4％左右。大孔吸附树脂柱的应用，会增加能耗，提高生产成本。专利CN 101003557 A公开了一种“富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物”的制备方法，其包括以下步骤：先用极性溶剂对油橄榄叶进行提取，再碱性离心沉降，获得离心清液和沉淀物，接着进行膜耦合分离，得到通过纳滤膜的浓缩液，再介质吸附，对吸附介质进行洗脱得到洗脱液，真空浓缩，再进行真空冷冻干燥或喷雾干燥，获得橄榄苦苷含量大于50％的富含高纯度橄榄苦苷的有橄榄叶提取物。此工艺节省能源、清洁环保，步骤却较繁琐，需用到膜分离和介质吸附技术，成本较高，不易实现工业化生产。专利CN 102850416 A公开了“一种油橄榄叶提取物的制备方法及所用装置”，其步骤为：将油橄榄叶先使用混合溶剂，经超声减压沸腾提取，真空抽滤，得到澄清液；再进行石油醚萃取除去脂溶性杂质并收集下层清液，通过旋转蒸发至溶剂无醇味，再稀释，稀释液通过大孔树脂纯化后，静置一段时间使橄榄苦苷及黄酮类物质吸附充分，再使用适当浓度的乙醇-水混合溶剂将橄榄苦苷洗脱并收集目标液，将收集的目标溶液经过葡聚糖凝胶的纯化，静置后用乙醇-水溶液洗脱，再收集含有有效成分的洗脱液，将其旋转蒸发至无醇味，最后通过干燥或得的提取物，其中橄榄苦苷含量大85-92％和总黄酮含量达25-35％。此工艺纯化步骤较复杂，且耗材、耗能较大，无法实现良好的经济效益。专利CN 102228514 A公开了“一种从油橄榄叶中提取橄榄苦苷的方法”，其包括：在用水或醇水混合溶剂提取之后，将提取液浓缩之后依次经过三步分离：大孔树脂吸附并用醇水溶剂洗脱、脱色树脂吸附(对橄榄提取液中的色素有良好吸附作用的脱色树脂(对橄榄苦苷有良好吸附作用的大孔吸附树脂，洗脱除去其他杂质)，吸附除去色素)和有机溶剂萃取，逐步对提取液当中的橄榄苦苷进行分离纯化，最后获得高含量的橄榄苦苷提取物，橄榄苦苷的含量大于40％。此工艺简便，易于操作，但其产品含量较低，无法直接添加到药品或化妆品当中，且需要进一步的分离纯化。
本发明是针对上述生产工艺的缺陷，着重解决了橄榄苦甙提取率偏低且易分解的难题，再结合简易且有效地分离纯化工艺，开发了快速高效提取制备含量高、水溶性好的橄榄苦甙新工艺，其生产周期短，提取效率高，分离纯化工艺简便，可实现绿色、环保，降低生 产成本，提高产品的得率和质量，易于工业化生产。
发明内容
本发明首次提出了将超声波的空化作用和次级效应与减压技术相结合，采用复配提取液，通过简易高效的分离纯化工艺，制备高纯度、水溶性好的橄榄苦甙纯品。该技术可有效防止橄榄苦甙的分解，且提高产品收率的同时，亦能提高其纯度，具有操作简单、高效环保、成本低廉、易于扩大化生产等特点。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
1)原料预处理：将橄榄叶洗净、晒干、粉碎，过80目筛，得到橄榄叶粉末，备用；
2)减压超声提取：将橄榄叶粉末与复配提取液按质量体积比1g∶10-15mL浸泡12-24小时，在真空度0.08-0.1MPa，功率200-240W，温度35-40℃的条件下，减压超声提取30-50分钟，提取两次；抽滤得到滤液。
3)萃取-反萃取：将步骤2)所得到的提取液减压浓缩至波美度在8-10之间，用乙酸乙酯萃取3至4次，合并萃取液，减压浓缩至无乙酸乙酯，再经乙醚进行反萃取，进一步除杂；将反萃取之后的浸膏，减压烘干，得橄榄苦甙粗品；
4)脱色：将步骤3)所得到的橄榄苦甙粗品用一定浓度的醇溶液超声溶解，抽滤，得到澄清溶液，再加入适量活性炭进行加热回流脱色处理；
5)结晶-重结晶：将步骤4)所得到的脱色后溶液进行减压浓缩至波美度在8-10之间，用一定浓度的醇进行溶解，减压浓缩醇溶液至无醇味，烘干，再用乙酸乙酯进行热溶，趁热过滤，低温下静置，待晶体析出后，过滤收集晶体，再将晶体用乙酸乙酯热溶，按上述步骤进行重结晶，可制备水溶性好、含量高的橄榄苦甙纯品。
具体地，步骤2)中所述复配提取液为95％乙醇与95％甲醇按体积比1∶1的混合溶液。
具体地，步骤2)中所述抽滤的条件为：真空度0.07-0.09MPa。
具体地，步骤3)中所述减压浓缩的条件为：真空度0.07-0.09MPa，温度为40-50℃。
具体地，步骤3)中所述浓缩液与乙酸乙酯的总体积比为1∶15-20。
具体地，步骤3)中所述浓缩浸膏与乙醚的质量体积比为1∶5-10。
具体地，步骤3)中所述减压烘干的条件为：真空度0.09-0.1MPa，温度为35-40℃。
具体地，步骤3)中所述一定浓度的醇溶液为：10-30％的乙醇或甲醇溶液。
具体地，步骤4)中所述加热回流脱色处理的条件为：活性炭的添加了量为其重量的2-3‰，温度为45-50℃。
具体地，步骤5)中所述减压浓缩的条件为：真空度0.09-0.1MPa，温度为45-50℃。
具体地，步骤3)中所述一定浓度的醇溶液为：95％的乙醇或甲醇溶液。
具体地，步骤5)中所述乙酸乙酯热溶的条件为：橄榄苦甙粗品与乙酸乙酯的质量体积比为1g∶8-10mL，热溶温度为45-50℃。
具体地，步骤5)中所述低温静置的条件为：低温温度为0至5℃，静置的时间为12-24小时。
具体实施方法
【实施例1】
取橄榄叶1kg，洗净、晾干，粉碎过80目筛，加复配提取液(95％乙醇与95％甲醇按体积比1∶1)10L，浸泡12h。使用减压超声提取设备，在真空度0.08MPa，功率200W，温度35℃的条件下，减压超声提取30分钟，提取两次，并在真空度0.07MPa下抽滤合并两次滤液。在真空度0.07MPa，温度为40℃的条件下减压浓缩滤液至波美度为8。取3L的乙酸乙酯分三次萃取浓缩液，收集乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至无乙酸乙酯，再用0.3L的乙醚分三次进行反萃取除杂，回收乙醚萃取相，萃余相进行减压烘干，得橄榄苦甙粗品。将烘干后的粗品，用0.15L 10％的乙醇溶液超声溶解，抽滤，得到澄清溶液，再加入0.8g活性炭进行加热回流脱色处理。脱色后溶液进行减压浓缩至波美度为8，用0.1L 95％乙醇进行溶解，减压浓缩醇溶液至无醇味，烘干，再用0.1L乙酸乙酯进行45℃热溶，趁热过滤，低温下静置，待晶体析出后，过滤收集晶体，再将晶体用0.07L乙酸乙酯45℃热溶，按上述步骤进行重结晶，可制备水溶性好、含量高的橄榄苦甙纯品，其纯度可达95.06％，得率为6.86％。
【实施例2】
取橄榄叶5kg，洗净、晾干，粉碎过80目筛，加复配提取液60L，浸泡15h。使用减压超声提取设备，在真空度0.08MPa，功率220W，温度40℃的条件下，减压超声提取40分钟，提取两次，并在真空度0.07MPa下抽滤合并两次滤液。在真空度0.07MPa，温度为40℃的条件下减压浓缩滤液至波美度为8。取15L的乙酸乙酯分三次萃取浓缩液，收集乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至无乙酸乙酯，用1L的乙醚分三次进行反萃取除杂，回收乙醚萃取相，萃余相进行减压烘干，得橄榄苦甙粗品。将烘干后的粗品，用0.8L 10％的乙醇溶液超声溶解，抽滤，得到澄清溶液，再加入5g活性炭进行加热回流脱色处理。脱色后溶液进行减压浓缩至波美度为8，用0.5L 95％乙醇进行溶解，减压浓缩醇溶液至无醇味，烘干，再用0.5L乙酸乙酯进行45℃热溶，趁热过滤，低温下静置，待晶体析出后，过滤收集晶体，再将晶体用0.35L乙酸乙酯45℃热溶，按上述步骤进行重结晶，可制备水溶性好、含量高的橄榄苦甙纯品，其纯度可达95.34％，得率为7.03％。
【实施例3】
取橄榄叶10kg，洗净、晾干，粉碎过80目筛，加复配提取液130L，浸泡18h。使用 减压超声提取设备，在真空度0.08MPa，功率240W，温度40℃的条件下，减压超声提取50分钟，提取两次，并在真空度0.07MPa下抽滤合并两次滤液。在真空度0.07MPa，温度为40℃的条件下减压浓缩滤液至波美度为8。取30L的乙酸乙酯分三次萃取浓缩液，收集乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至无乙酸乙酯，用2L的乙醚分三次进行反萃取除杂，回收乙醚萃取相，萃余相进行减压烘干，得橄榄苦甙粗品。将烘干后的粗品，用1.6L 10％的乙醇溶液超声溶解，抽滤，得到澄清溶液，再加入11g活性炭进行加热回流脱色处理。脱色后溶液进行减压浓缩至波美度为8，用0.5L 95％乙醇进行溶解，减压浓缩醇溶液至无醇味，烘干，再用0.8L乙酸乙酯进行45℃热溶，趁热过滤，低温下静置，待晶体析出后，过滤收集晶体，再将晶体用0.7L乙酸乙酯45℃热溶，按上述步骤进行重结晶，可制备水溶性好、含量高的橄榄苦甙纯品，其纯度可达95.62％，得率为7.41％。
【实施例4】
取橄榄叶100kg，洗净、晾干，粉碎过80目筛，加复配提取液1500L，浸泡20h。使用减压超声提取设备，在真空度0.08MPa，功率240W，温度40℃的条件下，减压超声提取50分钟，提取两次，在真空度0.07MPa下抽滤合并两次滤液，在真空度0.07MPa，温度为40℃的条件下减压浓缩滤液至波美度为8。取300L的乙酸乙酯分三次萃取浓缩液，收集乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至无乙酸乙酯，用21L的乙醚分三次进行反萃取除杂，回收乙醚萃取相，萃余相进行减压烘干，得橄榄苦甙粗品。将烘干后的粗品，用17L 10％的乙醇溶液超声溶解，抽滤，得到澄清溶液，再加入120g活性炭进行加热回流脱色处理。脱色后溶液进行减压浓缩至波美度为8，用5L 95％乙醇进行溶解，减压浓缩醇溶液至无醇味，烘干，再用9L乙酸乙酯进行45℃热溶，趁热过滤，低温下静置，待晶体析出后，过滤收集晶体，再将晶体用8L乙酸乙酯45℃热溶，按上述步骤进行重结晶，可制备水溶性好、含量高的橄榄苦甙纯品，其纯度可达95.83％，得率为7.49％。
【实施例5】
取橄榄叶300kg，洗净、晾干，粉碎过80目筛，加复配提取液4500L，浸泡24h。使用减压超声提取设备，在真空度0.08MPa，功率240W，温度40℃的条件下，减压超声提取50分钟，提取两次，并在真空度0.07MPa下抽滤合并两次滤液。在真空度0.07MPa，温度为40℃的条件下减压浓缩滤液至波美度为8。取900L的乙酸乙酯分三次萃取浓缩液，收集乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至无乙酸乙酯，用60L的乙醚分三次进行反萃取除杂，回收乙醚萃取相，萃余相进行减压烘干，得橄榄苦甙粗品。将烘干后的粗品，用50L 10％的乙醇溶液超声溶解，抽滤，得到澄清溶液，再加入360g活性炭进行加热回流脱色处理。脱色后溶液进行减压浓缩至波美度为8，用15L 95％乙醇进行溶解，减压浓缩醇溶液至无醇味，烘干，再用27L 乙酸乙酯进行45℃热溶，趁热过滤，低温下静置，待晶体析出后，过滤收集晶体，再将晶体用25L乙酸乙酯45℃热溶，按上述步骤进行重结晶，可制备水溶性好、含量高的橄榄苦甙纯品，其纯度可达95.90％，得率为7.51％。
【实施例6】
取橄榄叶500kg，洗净、晾干，粉碎过80目筛，加复配提取液7500L，浸泡24h。使用减压超声提取设备，在真空度0.08MPa，功率240W，温度40℃的条件下，减压超声提取50分钟，提取两次，并在真空度0.07MPa下抽滤合并两次滤液。在真空度0.07MPa，温度为40℃的条件下减压浓缩滤液至波美度为8。取1500L的乙酸乙酯分三次进行反萃取浓缩液，收集乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至无乙酸乙酯，用102L的乙醚分三次萃取除杂，回收乙醚萃取相，萃余相进行减压烘干，得橄榄苦甙粗品。将烘干后的粗品，用75L 10％的乙醇溶液超声溶解，抽滤，得到澄清溶液，再加入600g活性炭进行加热回流脱色处理。脱色后溶液进行减压浓缩至波美度为8，用25L 95％乙醇进行溶解，减压浓缩醇溶液至无醇味，烘干，再用44L乙酸乙酯进行45℃热溶，趁热过滤，低温下静置，待晶体析出后，过滤收集晶体，再将晶体用41L乙酸乙酯45℃热溶，按上述步骤进行重结晶，可制备水溶性好、含量高的橄榄苦甙纯品，其纯度可达95.98％，得率为7.50％。