硫酸软骨素的提取方法 【技术领域】：本发明涉及一种生化药剂，特别是直接从动物软骨中提取硫酸软骨素的生产工艺。
【背景技术】：硫酸软骨素是动物软骨中提取的粘性多糖，多存在于动物的软骨、喉骨、鼻骨(猪含41％)、牛、马中膈和气管(含36％～39％)中，它是一种酸性粘多糖—糖胺聚糖，在胰蛋白酶的作用下，糖胺聚糖可以从软骨组织中的蛋白质中离解出来。可用于治疗头疼、偏头痛、冠心病、心绞痛、关节炎疼痛等症，在国外，对硫酸软骨素药理的研究已经达到分子的水平。
目前，国内外普遍采用稀碱或浓碱与酶解相结合的方法来提取硫酸软骨素，还有报道用稀碱稀盐综合提取法、酶解-树脂提取法、超声波提取法、乙酸抽提法。硫酸软骨素的分离纯化有乙醇沉淀法、离子交换色谱法、季铵盐配合法、吸附法和纤维素分离法等。在以上的几种提取方法中，收率虽然可以达到很高的水平，如高华(硫酸软骨素生产新工艺研究，青岛大学学报，2003，18(4)：55-58)等采用浓碱-复合酶酶解法，收率可达32.6％。但以上的生产方法都存在很大问题，稀碱酶解工艺中用的稀碱溶液量太大，大于6倍软骨重，在后面的酒精沉淀中，用酒精量更大，如浓缩原液，十分耗能。浓碱酶解工艺用碱量很大，如高华等所用碱量为软骨重的8％，给后面的提纯带来不便，若反应时间延长，又使硫酸软骨素的分子量下降，同样也存在步骤繁琐的问题。另外，国家知识产权局于1998年5月27日公开的专利申请号为96116057.8号，名称为《硫酸软骨素及其提取方法》的发明专利申请采用的是稀盐稀碱法，其不足是盐碱用量较大，提取时间较长，提取不充分，收率较低。
总之，目前的生产工艺存在的问题有：用碱盐量大、高耗能、生产步骤繁琐和收率较低等。
【发明内容】：本发明的目地主要是从节能、节省试剂、缩短生产时间、简化工艺等角度出发，提供一种新的硫酸软骨素的提取方法，该方法有利于工业化生产。
由于硫酸软骨素和软骨中的蛋白质是以糖肽共价键结合在一起的，在碱性条件下，以胰蛋白酶为催化剂，糖胺聚糖可以从软骨组织中的胶原蛋白中离解出来。根据这个原理，本工艺直接把胰蛋白酶加入，调节反应的pH，温度等条件，直接生产硫酸软骨素。这样以来，缩短了工艺流程，反应时间只需要4～8小时，用碱量比稀碱酶解法节省80％以上，收率并没有下降，而且比原来要高3～5个百分点。
其具体提取方法，依次包括：
(1)将洁白干净的软骨块放入反应釜内，并加入适量水，加入软骨块重量的0.1～1.5％的胰蛋白酶，调节pH在8.0～9.0之间，控制温度在45～55℃之间，搅拌3～10小时；
(2)当软骨块反应完全后，用盐酸或乙酸调节酶解液使pH在5～7之间，加热至70～85℃，保温10～40分钟；
(3)酶解液冷却后，过滤或离心除渣，得到较清的过滤酶解液，加入酶解液重0.2～2.0％的活性炭，使pH在3～5之间搅拌20～60分钟，过滤或离心除渣；
(4)向上步得到的酶解液中加入酶解液体积的2.5～4倍的工业酒精，使乙醇的浓度达到55～80％，沉淀；
(5)将上步沉淀物用95％以上的酒精洗涤2至3遍，干燥后即得所述硫酸软骨素成品。
本方法的优点及效果：本方法通过对目前工艺的改进创新，采用一步酶解法生产硫酸软骨素(CS)，通过正交试验，找到CS生产的优化工艺条件为：水解时间为6h，水解温度为48℃，胰酶用量为0.7％倍鲜软骨重，三种因素中对水解影响程度主要为水解温度，其次为酶用量和水解时间。整个反应过程pH值在8.5～9.0之间。此最佳水平组合可使硫酸软骨素收率达到42％或更高。采用该新工艺后，可简化生产流程，大大缩短生产时间，减少用碱量，同时减少下游提纯的难度，减轻对环境的污染，而且可采用原有的生产设备，易于工业化生产。
【具体实施方式】：
硫酸软骨素提取工艺流程如下：
实施例1：
(1)白干净的软骨块放入反应釜内，并加入适量水，加入0.7％软骨块重的胰蛋白酶，调节pH在8.5-9.0之间，控制温度在48℃，搅拌6小时；
(2)当软骨块反应完全后，用乙酸调节酶解液pH在5-6之间，加热至80℃，保温15分钟；
(3)酶解液冷却后过滤或离心除渣，得到较清的过滤酶解液，加入0.5％的活性炭，在pH调到4，搅拌30分钟，过滤或离心除渣；
(4)向上步得到的酶解液中加入3倍的工业酒精，使乙醇的浓度达到70％，并加入0.5％的乙酸钠盐析；
(5)将沉淀物用95％以上的酒精洗涤3遍，干燥后即得所述硫酸软骨素成品。
将上述方法生产的硫酸软骨素进行分析，结果如下：
项目 结果
含水量/％ 6.9
含氮量/％ 3.12
纯度/％ 88.6
氯化物 ＜0.14％
无机硫酸盐(以SO4计) ＜0.24％
重金属(以Pb计) ＜40ppm
50g/L CS溶液OD640值 0.03
其他实施例参考数值(按实施例1反应顺序依次为)，见下表：
表1、胰蛋白酶温度搅拌时间酶解液pH加热温度保温时间 活性 炭pH值 搅拌 时间 加酒 精乙醇浓度乙酸钠0.3％45℃8h8.5-9.0℃15min 0.4％3.5 20h 2.5倍65％1.0％1.5％55℃4h8.5-9.0℃130min 1.5％5.0 50h 4倍74％0.3％