自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产品.pdf

本发明提供了自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备的方法，其中，所述方法包括通过从自体皮肤中获取表皮细胞和培养得到成纤维细胞；本发明还提供了含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，其中，所述产品包括将其中一种或两种细胞添加到自体外周血富含血小板的血浆中，同时可以添加营养因子，生产出含自体活细胞的生物美容产品，可用于白癜风祛斑、疤痕修复、皮肤祛皱以及除斑等美容作用。

权利要求书
1.  一种自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备的方法，其中，所述方法包 括通过从自体皮肤中获取表皮细胞和经体外培养得到成纤维细胞。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述自体表皮细胞由取人 0.1-2cm2皮肤，用1×磷酸盐缓冲液PBS 5ml浸润15分钟，用1ml移液枪吸弃， 再用1×PBS同样反复冲洗，洗涤后用分散剂II(disperse II)消化，放置4℃冰 箱过夜，第二天取出皮肤用镊子将表皮和真皮撕开，表皮用眼科剪刀剪碎至 1mm3左右，用1×PBS洗涤后加入到15ml离心管中，1000转每分种离心5分 钟后弃上清，加入3ml 0.25％(质量体积比)胰酶消化1-60分钟，其中胰酶含 质量体积比0.01％EDTA；消化后过40μm细胞筛，过滤后加入5-10ml 1×PBS， 经1000转每分钟离心10分钟得到细胞沉淀，再次5-15ml 1×PBS重悬后，经 1000转每分钟离心10分钟获得表皮细胞沉淀，加1-5ml 0.9％生理盐水重悬， 苔盘兰计数，得到的107-108表皮细胞；放置4℃冰箱存放备用；
获得的表皮细胞经western blotting蛋白质检测表皮细胞生长因子表达水 平，经灰度分析结果显示其灰度值达到9000以上。

3.  根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述自体成纤维 细胞由上述获得真皮用眼科剪刀剪碎至1mm3左右，用1×PBS洗涤后加入到 15ml离心管中，1000转每分种离心5分钟后弃上清，加入3ml 0.25％胰酶消 化1-60分钟，消化后过40μm细胞筛，过滤后加入5-10ml 1×PBS，经1000 转每分钟离心10分钟得到单细胞沉淀，再次5-15ml 1×PBS重悬后，经1000 转每分钟离心10分钟获得单细胞沉淀，加入α-MEM培养基重悬，苔盘兰计 数，用α-MEM培养基按1-10×106细胞/ml加入10-20ml到75cm2培养瓶中， 于37℃，5％CO2培养箱中培养；每隔2天更换一次新鲜培养液；
成纤维细胞在75cm2培养瓶中生长融合达到90％以上，用5ml移液管吸弃 培养液，加入0.5ml 0.25％胰酶消化后1000转每分钟离心5分钟收集成纤维细 胞；用5ml移液管加入10ml新鲜的α-MEM培养基，加入到75cm2培养瓶中 继续在37℃，5％CO2培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液；如此连续 传代1-5代培养经胰酶消化离心后，获得4×107以上的成纤维细胞，用4-10ml 生理盐水重悬，计数，即获得成纤维细胞，放置冰箱4℃存放备用；
获得的成纤维细胞经western blotting蛋白质检测成纤维细胞生长因子表 达水平，经灰度分析结果显示其灰度值达到12000以上。

4.  根据权利要求2-3任一项所述的方法，其特征在于，所述自体皮肤来 源于耳后取皮、眼袋割除后皮肤、手臂取皮和腿上取皮；优选地，选择耳后取 皮。

5.  根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述PBS的pH值 7.4，其含100活性单位/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素。

6.  根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，所述α-MEM培养 基，其含1-10％胎牛血清、1-100ng/ml重组人干细胞生长因子、1-50ng/ml重 组人表皮生长因子和1-50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子。

7.  一种含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，其特征在于，所 述产品包括将权利要求1-6任一项所述的自体表皮细胞、成纤维细胞中的一种 或两种添加到自体外周血富含血小板的血浆中，生产出含自体活细胞的生物美 容产品；优选同时添加营养因子；
所述自体血浆由抽取人50-100ml肝素或EDTA抗凝外周血，经1000转 每分钟离心10分钟得到的10-40ml血浆，再次3000转每分钟离心10分钟 获得10-40ml富含血小板血浆，放置4℃冰箱存放备用；
取1-10×106自体表皮细胞和/或成纤维细胞，加入到5ml自体富含血小 板的血浆中，混匀；优选，同时加入10ng-1ug营养因子，装入10ml无菌可 密封的针管中，制备成含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，放 置冰箱4℃中保存，保质期为48小时。

8.  根据权利要求7所述的生物美容产品，其特征在于，优选加入所述自 体表皮细胞和成纤维细胞；优选同时添加所述营养因子。

9.  根据权利要求7-8任一项所述的生物美容产品，其特征在于，所述营养 因子，即为超氧化歧化酶、灵芝多糖、胎盘提取多肽素和银杏叶提取液；优选 地，含有两种以上所述营养因子。

10.  一种权利要求7-9中任一项所述的生物美容产品的应用。

说明书自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产品
技术领域
本发明涉及自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备的方法以及通过所述方 法获得的生物美容产品。特别地，本发明涉及通过从自体皮肤中获取表皮细胞 和培养得到成纤维细胞，将其中一种或两种细胞添加到自体外周血富含血小板 的血浆中，同时还可以添加营养因子，生产出含自体活细胞的生物美容产品， 本发明的生物美容产品可用于白癜风祛斑、疤痕修复、皮肤祛皱以及除斑等美 容作用。
背景技术
日前，市场上已经出现了各种细胞用于美容方面的产品，也被商家赋予了 各种神奇的功效和希望，尤其是干细胞在美容方面的应用。事实上，活细胞在 医学美容的应用上取得一些很好的效果，主要体现在皱纹填充、祛斑等方面起 到一定作用。但是现在市场上应用的活细胞多数都为同源异体的，进入皮肤内 容易发生免疫排斥而被清除，因而在皮肤中发挥作用的细胞微乎其微。
细胞生长因子也是一直受追捧的美容方法，出现很多细胞生长因子被应用 到美容中，包括干细胞因子、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、神经生长 因子及纤维母细胞生长因子等。各种细胞因子需要在低温条件下保存，以保持 其蛋白活性。然而在化妆品制作过程中，由于无法保证整个生产过程均处在低 温条件下，那么添加该产品极易造成细胞因子的失活和变性，从而失去细胞因 子对组织和细胞的修复活性。同时，细胞因子加入到化妆品中，其有效浓度必 然被降低，不能保证细胞因子对细胞核组织的修复效果。消费者在使用过程中 很难对该产品进行定量使用，可能会造成效果不稳定的现象。
另外，羊胎素和肉毒杆菌内毒素作为目前备受消费者青睐的产品，因其使 用简便、效果显著、安全可靠而广受欢迎。但它们使用后的副反应较多，常见 的有表情不自然、畏光流泪、局部肿胀、淤斑、注射部位麻木、头痛、额部紧 绷感、邻近部位皱纹加深等。这两种因子应用易产生较明显的依赖性，随着注 射的次数增多，人对其的敏感性降低，而导致病人使用该方法更为频繁，每次 的使用量也会逐渐增多。
综上，因为各种原因和问题，目前市场上生物美容产品存在各种效果不佳， 对人们的皮肤美容的疗效还远远不够，即使其中加入各种营养成分。本发明利 用个体化的材料和营养物质，发挥其细胞生物学活性和自分泌营养因子的功 能，将对消费者的美容效果达到更佳的美容作用，并且联合美容物理疗法将产 生更好的白癜风祛斑、疤痕修复、皮肤祛皱以及除斑等效果。
发明内容
本发明是我们研发团队通过多年的科研工作，发现了能从自体皮肤中获得 表皮细胞和成纤维细胞，通过体外体内实验证实这两种细胞对皮肤产生更好地 白癜风祛斑、疤痕修复、皮肤祛皱以及除斑等作用。本发明利用自体皮肤来源 的表皮细胞和成纤维细胞的生物学作用，可以高效产生皮肤美容作用，而且联 合美容物理疗法将产生更好功效。本发明中的表皮细胞是成对存在，中间的孔 隙中气孔，可以进行气体交换，细胞内有叶绿体，对皮肤起重要保护作用。
本发明中成纤维细胞是皮肤真皮中的主体细胞成分，其分泌的胶原纤维， 弹性纤维及基质成分，与成纤维细胞一同构成了真皮的主体。尽管很多化妆品 公司和美容医生声称非介入的美容方法能达到使皮肤皱纹消失的效果，但科学 研究表示这一方法的效果是有限的。皮肤衰老反映在细胞水平即为细胞衰老。 当紫外线和其他外界环境能刺激成纤维母细胞，上调胶原酶的基因表达，从而 使胶原酶生成增多，这导致了胶原蛋白被降解，水分流失，皮肤组织失去支撑， 皱纹和黄斑即生成。
本发明提供了自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备的方法，其中，所述方 法包括通过从自体皮肤中获取表皮细胞和培养得到成纤维细胞。
本发明所述的自体表皮细胞由自体皮肤经酶消化法和机械法直接获得表 皮单细胞悬液，减去了中间复杂的过程，并保证了表皮细胞的活性和数量。获 得的表皮细胞经western blotting蛋白质表达检测，其高表达特异高表达表皮生 长因子(Epidermal growth factor，EGF)。
同时，本发明所述的自体成纤维细胞由同一皮肤的真皮经酶消化法和机械 法获得细胞悬液后，在体外培养条件下获得足量的成纤维细胞，并western  blotting蛋白质表达检测特异高表达成纤维生长因子(Fibroblast growth factor， FGF)。
本发明所述的自体皮肤来源于耳后取皮、眼袋割除后皮肤、手臂取皮和腿 上取皮等，优选地，选择耳后取皮。
本发明还提供了含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，其中， 所述产品包括将其中一种或两种细胞添加到自体外周血富含血小板的血浆中， 同时可以添加营养因子，生产出含自体活细胞的生物美容产品。
本发明所述的自体富含血小板血浆是通过采集抗凝外周血两次离心获得 的富含血小板的血浆，其富含各种生长因子，其中成纤维细胞生长因子、表皮 生长因子、血小板衍生生长因子与血管内皮生长因子等。
含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品主要由如下成分组成：
1)1-20×106自体表皮细胞和/或成纤维细胞；
2)1-50ml自体富含血小板血浆；
3)任选的10ng-1ug营养因子；
生物美容制剂装入10ml无菌的塑料针管中，可用盖子密封包装，形成产 品。
该生物美容制剂保存在4℃条件下，保质期为48小时。
本发明所述的一种或两种自体表皮细胞和/或成纤维细胞，优选地包括加 入自体表皮细胞和成纤维细胞两种细胞。
本发明所述的营养因子，即为超氧化歧化酶、灵芝多糖、胎盘提取多肽素 和银杏叶提取液等，优选地，含有两种以上。
通过本发明的方法，通过自体皮肤获取的表皮细胞和/或成纤维细胞，加 入到自体外周血来源的富含血小板血浆，优选添加一种或多种皮肤营养因子， 制备成生物美容产品。由本发明提供的方法得到含有自体皮肤获取的表皮细胞 和/或成纤维细胞的生物美容产品，能够对白癜风祛斑、皮肤疤痕修复、皮肤 祛皱以及除斑等功能。特别当联合物理美容疗法使用时，将产生更佳的美容疗 效，即白癜风磨削术、高温深蓝射频美容疗法、微针疗法等，能打开表皮毛孔 或微创表皮皮层，为营养因子和细胞进入皮肤的通道，有助于皮肤的再生增殖。
附图说明
图1表示由实施例2所制备的成纤维细胞在倒置显微镜下观察的生长图 片。
图2表示由实施例3制备的自体成纤维细胞表达成纤维细胞生长因子 Westem Blotting图片。
图3表示1名女性经由实施例5所制备的自体表皮细胞和成纤维细胞的生 物美容产品治疗后腿部白癜风改善的图片。
具体实施方式
本发明提供了自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备的方法，其中，所述方 法包括通过从自体皮肤中获取表皮细胞和培养得到成纤维细胞。
所述自体表皮细胞由取人0.1-2cm2皮肤，用1×磷酸盐缓冲液(PBS，pH 值7.4，含100活性单位/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素)5ml浸润15分钟， 用1ml移液枪吸弃，再用1×PBS(pH值7.4，含100活性单位/ml青霉素和 0.1mg/ml链霉素)同样反复中洗，洗涤后用disperse II消化，放置4℃冰箱 过夜，第二天取出皮肤用镊子将表皮和真皮撕开。
表皮用眼科剪刀剪碎至1mm3左右，用1×PBS洗涤后加入到15ml离心 管中，1000转每分种离心5分钟后弃上清，加入3ml 0.25％(质量体积比)胰 酶消化1-60分钟，其中胰酶含质量体积比0.01％EDTA；消化后过40μm细胞 筛，过滤后加入5-10ml 1×PBS，经1000转每分钟离心10分钟得到细胞沉淀， 再次5-15ml 1×PBS重悬后，经1000转每分钟离心10分钟获得表皮细胞沉淀， 加1-5ml 0.9％生理盐水重悬，苔盘兰计数，得到的107-108表皮细胞放置4℃冰 箱存放备用。获得的表皮细胞经western blotting蛋白质检测表皮细胞生长因子 表达水平，经灰度分析结果显示其灰度值达到9000以上。
获得的表皮细胞经western blotting蛋白质检测，其高表达表皮细胞生长因 子。本发明的制造方法中对表皮细胞进行冻存，冻存液优选为90％胎牛血清和 10％二甲基亚砜。复苏后培养的表皮细胞仍高表达EGF。
所述自体成纤维细胞由上述获得真皮用眼科剪刀剪碎至1mm3左右，用1 ×PBS洗涤后加入到15ml离心管中，1000转每分种离心5分钟后弃上清，加 入3ml 0.25％胰酶消化1-60分钟，消化后过40μm细胞筛，过滤后加入5-10ml 1×PBS，经1000转每分钟离心10分钟得到单细胞沉淀，再次5-15ml 1×PBS 重悬后，经1000转每分钟离心10分钟获得单细胞沉淀，加入α-MEM培养基 重悬，苔盘兰计数，用α-MEM培养基(含1-10％胎牛血清、1-100ng/ml重组 人干细胞生长因子、1-50ng/ml重组人表皮生长因子和1-50ng/ml重组人碱性成 纤维细胞生长因子)按1-10×106细胞/ml加入10-20ml到75cm2培养瓶中，于 37℃，5％CO2培养箱中培养；每隔2天更换一次新鲜培养液；
成纤维细胞在75cm2培养瓶中生长融合达到90％以上，用5ml移液管吸弃 培养液，加入0.5ml 0.25％胰酶消化后1000转每分钟离心5分钟收集成纤维细 胞；用5ml移液管加入10ml新鲜的α-MEM培养基(含1-10％胎牛血清、 1-100ng/ml重组人干细胞生长因子、1-50ng/ml重组人表皮生长因子和 1-50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)，加入到75cm2培养瓶中继续在 37℃，5％CO2培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液；如此连续传代1-5 代培养经胰酶消化离心后，获得4×107以上的成纤维细胞，用4-10ml生理盐 水重悬，计数，即获得成纤维细胞，放置冰箱4℃存放备用。
获得的成纤维细胞经western blotting蛋白质检测成纤维生长因子表达水 平，经灰度分析结果显示其灰度值达到12000以上。本发明的制造方法中对成 纤维细胞进行冻存，冻存液优选为50％小牛血清、40％成纤维细胞培养液和 10％二甲基亚砜，其中细胞培养液更优选为成纤维细胞培养液。复苏后培养的 成纤维细胞仍高表达FGF。
本发明所述的自体皮肤来源于耳后取皮、眼袋割除后皮肤、手臂取皮和腿 上取皮等，优选地，选择耳后取皮。
本发明还提供了含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，其中， 所述产品包括将其中一种或两种细胞添加到自体外周血富含血小板的血浆中， 优选同时可以添加营养因子，生产出含自体活细胞的生物美容产品。
所述自体血浆由抽取人50-100ml肝素或EDTA抗凝外周血，经1000转 每分钟离心10分钟得到的10-40ml血浆，再次3000转每分钟离心10分钟获 得10-40ml富含血小板血浆，放置4℃冰箱存放备用。
取1-10×106自体表皮细胞和/或成纤维细胞，加入到5ml自体富含血小板 的血浆中，混匀，优选同时还可以加入10ng-1ug营养因子，装入10ml无菌可 密封的针管中，制备成含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，放 置冰箱4℃中保存，保质期为48小时。
含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品主要由如下成分组成：
1)1-20×106自体表皮细胞和/或成纤维细胞；
2)1-50ml自体富含血小板血浆；
3)任选的10ng-1ug营养因子；
生物美容制剂装入10ml无菌的塑料针管中，可用盖子密封包装，形成产 品。
该生物美容制剂保存在4℃条件下，保质期为48小时。
根据本发明所述的含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，其 特征在于，所述的一种或两种自体表皮细胞和/或成纤维细胞，优选地包括加 入自体表皮细胞和成纤维细胞两种细胞。
根据本发明所述的含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，其 特征在于，优选地，添加了一种或一种以上营养因子，即为超氧化歧化酶、灵 芝多糖、胎盘提取多肽素和银杏叶提取液等，更优选地，含有两种以上。
本发明提供了含自体表皮细胞和/或成纤维细胞、自体富含血小板血浆和 营养因子的生物美容产品，能够对对白癜风祛斑、皮肤疤痕修复、皮肤祛皱以 及除斑等功能。本发明还提供了联合物理美容疗法使用，即白癜风磨削术、高 温深蓝射频美容疗法、微针疗法等，能打开表皮毛孔或微创表皮皮层，为营养 因子和细胞进入皮肤的通道将产生，更佳的美容疗效。与白癜风磨削术联合美 容具体方法如下：
白癜风患者躺卧在手术台上，使用白癜风皮肤进行清洁，清水擦洗干净； 麻醉达成后，以皮肤磨削机磨削创面达点状渗血，尽可能使皮肤磨削厚度均匀 一致，肾上腺素盐水纱布等合适止血后，将本发明的6ml含自体表皮细胞和/ 或成纤维细胞的生物美容产品涂抹在皮肤磨削机磨削创面，纳米银敷料覆盖， 无菌敷料包扎固定，注意适当加压。
患者减少局部活动，患肢抬高，红外线照射，减少分泌物渗出。术后第3～ 5天打开外层敷料，保持干燥，直至敷料脱落。创面愈合后应用胶原美皮护、 抗瘢痕药物、弹力绷带等综合抗瘢痕治疗，预防瘢痕增生。
以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些 示例。
实施例1 人自体表皮细胞的制备
由取人0.1-2cm2皮肤，用1×磷酸盐缓冲液(PBS，pH值7.4，含100IU/ml 青霉素和0.1mg/ml链霉素)5ml浸润15分钟，用1ml移液枪吸弃，再用1 ×PBS(pH值7.4，含100IU/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素)同样反复冲洗， 洗涤后用disperse II消化，放置4℃冰箱过夜，第二天取出皮肤用镊子将表皮 和真皮撕开。
表皮用眼科剪刀剪碎至1mm3左右，用1×PBS洗涤后加入到15ml离心 管中，1000转每分种离心5分钟后弃上清，加入3ml 0.25％(质量体积比)胰 酶消化30分钟，其中胰酶含质量体积比0.01％EDTA；消化后过40μm细胞筛， 过滤后加入10ml 1×PBS，经1000转每分钟离心10分钟得到细胞沉淀，再次 10ml 1×PBS重悬后，经1000转每分钟离心10分钟获得表皮细胞沉淀，加5ml 0.9％生理盐水重悬，苔盘兰计数，得到的5.4×107表皮细胞放置4℃冰箱存放 备用。
实施例2 人自体成纤维细胞的制备
取制备例1中获得的真皮用眼科剪刀剪碎至1mm3左右，用1×PBS洗涤 后加入到15ml离心管中，1000转每分种离心5分钟后弃上清，加入3ml 0.25％ 胰酶消化30分钟，消化后过40μm细胞筛，过滤后加入10ml 1×PBS，经1000 转每分钟离心10分钟得到单细胞沉淀，再次10ml 1×PBS重悬后，经1000 转每分钟离心10分钟获得单细胞沉淀，加入α-MEM培养基重悬，苔盘兰计 数，用α-MEM培养基(含10％胎牛血清、50ng/ml重组人干细胞生长因子、 25ng/ml重组人表皮生长因子和25ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)按 1-10×106细胞/ml加入15ml到75cm2培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培 养；每隔2天更换一次新鲜培养液；
成纤维细胞在75cm2培养瓶中生长融合达到90％以上，用5ml移液管吸弃 培养液，加入0.5ml 0.25％胰酶消化后1000转每分钟离心5分钟收集成纤维细 胞；用5ml移液管加入10ml新鲜的α-MEM培养基(含10％胎牛血清、50ng/ml 重组人干细胞生长因子、25ng/ml重组人表皮生长因子和25ng/ml重组人碱性 成纤维细胞生长因子)，加入到75cm2培养瓶中继续在37℃，5％CO2培养箱 中生长，每隔2天换一次新鲜培养液；如此连续传代5代培养经胰酶消化离心 后，获得4.6×107的成纤维细胞，用4.6ml生理盐水重悬，计数，即获得成纤 维细胞，放置冰箱4℃存放备用。图1为成纤维细胞在倒置显微镜下观察生长 图片，图1A中为成纤维细胞第1代时生长形态，成纤维细胞成长梭形；图1B 中成纤维细胞第5代时生长形态，成纤维细胞成长梭形更加明现。
实施例3 人自体表皮细胞和成纤维细胞特异蛋白表达检测
取实施例1中制备的自体表皮细胞和实施例2中制备的成纤维细胞悬液各 1份50μL(2×106个)加入500μL预冷即用型总蛋白提取裂解液(RIPA，北京 百泰克公司)(含体积比1％蛋白酶抑制剂，瑞士Roche公司)，冰上孵育20 分钟后，每分钟13000转，4℃离心20分钟。取上清，分装-80℃保存备用。 按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(武汉博士德公司)使用说明操作， 测定蛋白浓度。以RIPA调整蛋白浓度，样品终浓度为1.0μg/μL，加入5×蛋白 样品缓冲液，95℃下5分钟。
根据目的蛋白的分子量，配制10％分离胶，浓缩胶浓度为5％。待检测蛋 白样品上样量：20μg/孔。电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20分钟；分离胶恒 压120V，通过标准分子量预染蛋白来确定电泳停止时间。湿转法，转膜条件： 300mA恒流；0.45μm孔径PVDF膜，转膜时间80分钟。转膜完成后丽春红 染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。封闭：将膜完全浸没于5％(mg/mL) 牛血清白蛋白(BSA)的转膜缓冲液(含体积比3％吐温-20，TBST)中，室 温下水平摇床孵育1小时。
一抗孵育：5％(mg/mL)BSA-TBST分别稀释一抗EGF和FGF(均购自 美国Santa公司；β肌动蛋白，Beta actin为内参对照)，4℃水平摇床孵育过夜。
次日，洗膜：TBST洗3次，每次10分钟。二抗孵育：5％(mg/mL)BSA-TBST 稀释二抗，山羊抗兔IgG(H+L)辣根过氧化酶(HRP)和山羊抗鼠IgG(H+L) HRP 1∶10000，室温孵育40分钟。洗膜：TBST洗膜3次，每次10分钟。化 学发光底物ECL滴加到膜的蛋白面，反应3-5分钟；胶片曝光：10秒-5分钟 (曝光时间随不同光强度而调整)，显影2分钟，定影。胶片用扫描仪扫描为 大于300DPI的TIF格式图片。
图2中为人自体表皮细胞和成纤维细胞特异蛋白western blotting检测图 片。图2A为实施例1中制备的自体表皮细胞1及其冻存复苏后的自体表皮细 胞2表达EGF的westem blotting检测，结果表明两者均表达EGF蛋白；图2B 为实施例2中制备的自体成纤维细胞1及其冻存复苏后的自体成纤维细胞2 表达bFGF的western blotting检测，结果表明两者均高表达bFGF蛋白；阴性 对照为293T细胞(人肾上皮细胞系)。
使用Quantity One分析软件(Bio-Rad公司)进行灰度分析，经灰度分析 结果显示EGF蛋白灰度值达到10900，bFGF蛋白灰度值达到21300。
实施例4 自体表皮细胞和/或成纤维细胞生物美容产品的制备
所述自体血浆由抽取人70ml肝素或EDTA抗凝外周血，经1000转每分 钟离心10分钟得到的30ml血浆，再次3000转每分钟离心10分钟获得30ml 富含血小板血浆，放置4℃冰箱存放备用。
分别取5×106实施例1中制备的自体表皮细胞和实施例2中制备的成纤维 细胞，加入到5ml自体富含血小板的血浆中，混匀，分别加入100ng灵芝多糖 和胎盘提取多肽素，装入10ml无菌可密封的针管中，制备成含自体表皮细胞 和/或成纤维细胞的生物美容产品，放置冰箱4℃中保存，保质期为48小时。
实施例5 白癜风皮肤修复
白癜风患者躺卧在手术台上，使用白癜风皮肤进行清洁，清水擦洗干净； 麻醉达成后，以皮肤磨削机磨削创面达点状渗血，尽可能使皮肤磨削厚度均匀 一致，肾上腺素盐水纱布等合适止血后，将本发明的6ml实施例4中生产的生 物美容产品涂抹在皮肤磨削机磨削创面，纳米银敷料覆盖，无菌敷料包扎固定， 注意适当加压。
患者减少局部活动，患肢抬高，红外线照射，减少分泌物渗出。术后第3 天打开外层敷料，保持干燥，直至敷料脱落。创面愈合后应用胶原美皮护、抗 瘢痕药物、弹力绷带等综合抗瘢痕治疗，预防瘢痕增生。
图3中是一名患有白癜风的34岁女性，进行本发明的自体表皮细胞和成 纤维细胞的生物美容产品进行白癜风皮肤修复，经自体表皮细胞和成纤维细胞 的生物美容产品治疗后腿部白癜风改善的图片。图3A图为该患者治疗前腿部 白癜风的图片，图3B为患者腿部白癜风磨削后，经自体表皮细胞和成纤维细 胞的生物美容产品治疗一次后，发现该女性腿部白癜风得到明显的改善，皮肤 上白癜风几乎消失，恢复成与周围皮肤相似的肤色。