P18小分子抑制剂及在人造血干细胞体外扩增中的用途.pdf

本发明涉及p18小分子抑制剂及在人造血干细胞体外扩增中的用途，其结构为：本发明还提供了该p18小分子抑制剂的制备方法及用途，本发明p18小分子抑制剂对于人造血干细胞自我更新具有较好的促进作用，可为日后临床治疗提供新的方法。

权利要求书
1.  一种p18小分子抑制剂，其特征在于：其结构为：


2.  权利要求1所述p18小分子抑制剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
在冰浴条件下，将环己胺和对羧基苯磺酰氯溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺，搅拌1 小时，升至室温后，继续搅拌，TLC监控反应完成后，旋转蒸发除去反应溶液，残余物纯化， 得中间体；
在冰浴条件下，将所得中间体溶解在水中，加入氢氧化钠，升至室温后，搅拌30分钟， 所得反应液真空冻干，得终产品。

3.  权利要求1所述p18小分子抑制剂在人造血干细胞体外扩增中的用途。

4.  根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述用途中，p18小分子抑制剂在扩增培 养基中的浓度为10-50nM。

5.  一种人造血干细胞体外扩增方法，其特征在于：包括如下步骤：将新鲜分离的人脐带 血CD34+细胞使用扩增培养基(StemSpan SFEM培养基+[100ng/mL]SCF/TPO/Flt3L/IL-6)重 悬至细胞浓度为5×104细胞/mL，然后铺于96孔板中，每孔为190μL细胞悬液，随后向其 中添加10μL使用同种扩增培养基稀释过的p18小分子抑制剂，p18小分子抑制剂的终浓度 为20nM，在37℃，5％CO2恒温培养箱中培养7天。

说明书p18小分子抑制剂及在人造血干细胞体外扩增中的用途
技术领域
本发明涉及医药领域，特别涉及p18小分子抑制剂及其在人脐带血来源造血干细胞的 体外扩增中的用途。
背景技术
干细胞因其具有自我更新及多向分化的能力而成为临床上治疗多种疾病的有效途径之 一，这也代表了再生医学新时代的到来。其中造血干细胞研究开始最早、研究最为深入且 应用最为广泛。应用骨髓移植治疗白血病等恶性血液疾病已有50多年的历史。但骨髓中造 血干细胞数量较低，移植后难以在病人体内有效进行造血重建，这也成为干细胞临床应用 的一个瓶颈。
造血干细胞在体内有多种选择，例如自我更新、分化、迁移(归巢)、静息、凋亡等， 在这些不同的选择背后，有一个非常复杂的信号通路网络调节造血干细胞的不同命运。例 如Wnt、Notch、Shh/BMP、TGF-β、IGF等发育相关的调节蛋白，Bmi等染色质相关因子， HoxB、NFκ等转录因子，INK4、KIP、PTEN等细胞周期调节蛋白等均参与了该信号调节 网络。对于造血干细胞而言，其最为重要的特性即为自我更新。目前已有多项研究指出， 造血干细胞的自我更新调节与细胞周期的调节息息相关。进入细胞周期是造血干细胞进行 自我更新的最后一步，因此细胞周期，尤其是G1期的调节可能会对造血干细胞的自我更新 产生至关重要的作用。
细胞周期主要通过连续的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的活性变化来调控，而CDK 的活性又必须取决于Cyclin的含量水平。在体内，除了Cyclin和催化亚基的磷酸化/去磷酸 化的调控，CDK很大程度上还受CKIs(细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂)的调控。目前已知 CKI中两类低分子量家族蛋白，Cip/Kip和INK4可以与CDK反应，并可抑制细胞通过G1 期。其中，Cip/Kip家族，主要包括p21，p27和p57，可以与很多Cyclin-CDK复合物反应； INK家族，主要包括p16，p15，p18和p19，可以特异性的抑制CDK4、6。
越来越多的研究表明，相对于其他的CKI而言，p18对造血干细胞的自我更新调控作 用更为强大。例如，p18的缺失会导致小鼠造血移植率的显著升高，并且该种作用是通过提 高造血干细胞对称性自我更新分裂的比率来实现的，相较于以往单纯提高造血干细胞的增 殖效率，提高其对称性分裂可免于导致造血干细胞的分化和耗竭。因此，p18是一个特异影 响造血干细胞自我更新的独特的INK蛋白。
目前体外扩增造血干细胞主要依靠向培养基中添加血清以及SCF、TPO、Flt3L等细胞 因子，但扩增效果仍不理想，造血干细胞在体外很快便发生分化、衰竭。之前的研究中曾 采用加入多种细胞因子液体培养基、与基质细胞共同培养或在生物反应器中培养等方法以 体外扩增造血干/祖细胞，但上述方法仍不能获得充足的具有移植能力的造血干细胞来进行 临床治疗。
而小分子化合物则在体外培养中显示了其独特的优势。首先，化合物的作用效果可通 过调节化合物的结构、浓度来改变，其过程简单可控；其次，小分子化合物相较于细胞因 子或转录因子等其性质更为稳定，化合物的前期处理以及给药非常方便。因此，在传统扩 增造血干细胞的方法中加入小分子化合物，甚至完全采用小分子化合物替代现有的血清、 细胞因子等物质，可能对体外培养造血干细胞发挥重要作用。
本发明旨在研究制得一种新的p18小分子抑制剂，并通过该p18小分子抑制剂体外培 养人造血干细胞，以达到造血干细胞的体外扩增的目的。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种p18小分子抑制剂及其在人造血干细 胞体外扩增中的用途。
本发明采用的技术方案为：
一种p18小分子抑制剂，其结构为：

本发明还提供了该p18小分子抑制剂的制备方法，包括如下步骤：
在冰浴条件下，将环己胺和对羧基苯磺酰氯溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺，搅拌1 小时，升至室温后，继续搅拌，TLC监控反应完成后，旋转蒸发除去反应溶液，残余物纯化， 得中间体；
在冰浴条件下，将所得中间体溶解在水中，加入氢氧化钠，升至室温后，搅拌30分钟， 所得反应液真空冻干，得终产品。
涉及的反应方程式为：

本发明还提供了该p18小分子抑制剂在人造血干细胞体外扩增中的用途。
具体地，所述用途中，p18小分子抑制剂在扩增培养基中的浓度为10-50nM。
具体地，本发明还提供了一种人造血干细胞体外扩增方法，包括如下步骤：
将新鲜分离的人脐带血CD34+细胞使用扩增培养基(StemSpan SFEM培养基+[100ng/mL] SCF/TPO/Flt3L/IL-6)重悬至细胞浓度为5×104细胞/mL，然后铺于96孔板中，每孔为190μL 细胞悬液，随后向其中添加10μL使用同种扩增培养基稀释过的p18小分子抑制剂，p18小 分子抑制剂的终浓度为20nM。在37℃，5％CO2恒温培养箱中培养7天。
本发明所具有的有益效果：
本发明p18小分子抑制剂对于人造血干细胞自我更新具有较好的促进作用，可为日后 临床治疗提供新的方法。
附图说明
图1：实施例3中体外培养后细胞表型比例变化统计分析图；
图2：实施例3中体外培养后细胞表型绝对数量变化统计分析图；
图3：实施例4中鹅卵石样区域形成细胞泊松统计分布图；
图4：实施例5中流式分析检测移植后骨髓中人CD45+细胞含量散点图；
图5：实施例5中统计分析移植后各组小鼠骨髓内来源于人的细胞含量的变化。
具体实施方式
为了理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保 护范围。
实施例1
一种p18小分子抑制剂，其结构为：

该p18小分子抑制剂的制备方法，包括如下步骤：
在冰浴条件下，将环己胺(495毫克，5.0毫摩尔)和对羧基苯磺酰氯(1100毫克，5 毫摩尔)溶解在二氯甲烷(100毫升)中，加入三乙胺(707毫克，7毫摩尔)，搅拌1小 时，升至室温后，继续搅拌，TLC监控反应完成后，旋转蒸发除去反应溶液，残余物用快速 制备柱纯化，得终产品(中间体)300毫克，收率21％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.94(d,J＝8.4Hz,2H),7.68(d,J＝8.4Hz, 2H),7.51(bs,1H),2.90-2.91(m,1H),1.42-1.55(m,5H),0.99-1.11(m,5H).LC-MS (ESI):m/z 284.0(M+H)+.
在冰浴条件下，将上述中间体(103毫克，0.36毫摩尔)溶解在5毫升水中，加入氢 氧化钠(14.56毫克，0.36毫摩尔)，升至室温后，搅拌30分钟，所得反应液真空冻干， 得终产品100毫克，收率90％。
Sodium 4-(N-cyclohexylsulfamoyl)benzoate(005A).
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.74(d,J＝8.4Hz,2H),7.41(d,J＝6.8Hz,2H),3.60-3.61 (m,1H),1.46-1.58(m,5H),0.99-1.16(m,5H).
LC-MS(ESI):m/z 283.1(M+H)+。
实施例2
一种人造血干细胞体外扩增方法，包括如下步骤：
将新鲜分离的人脐带血CD34+细胞使用扩增培养基(StemSpan SFEM培养基+[100ng/mL] SCF/TPO/Flt3L/IL-6)重悬至细胞浓度为5×104细胞/mL，然后铺于96孔板中，每孔为190μL 细胞悬液，随后向其中添加10μL使用同种扩增培养基稀释过的p18小分子抑制剂，p18小 分子抑制剂的终浓度为20nM。在37℃，5％CO2恒温培养箱中培养7天。
实施例3：细胞表型分析
采用流式检测CD34+，CD34+CD49f+细胞的比例以及绝对数量对于p18小分子抑制剂体 外扩增造血干细胞的作用进行验证，结果显示p18小分子抑制剂对于造血干细胞的体外扩 增作用明显。
流式分析检测p18小分子抑制剂对人造血干细胞体外扩增作用的实验方法：
①将收集到的新生儿脐带血用HES(5:1)沉降红细胞，60分钟后，收集上层液体， 用4-5倍体积的ACK于37℃水浴裂解红细胞15分钟，离心1800rpm，10分钟；
②弃上清，观察红细胞裂解情况，将细胞收集到1个50mL离心管中，用40ml ACK 再次于37℃水浴裂解15分钟，离心1800rpm，10分钟；
③将细胞用20ml PE缓冲液洗涤一遍，过滤，离心1500rpm，8分钟。同时对细胞进 行计数，根据MNCs数加入CD34磁珠，充分混匀后4℃避光孵育30分钟；
④孵育结束后，每管用20mlPE缓冲液洗一遍，若有沉淀，需要过滤，离心1500rpm， 5分钟。弃上清，用1mlPE缓冲液重悬；
⑤安装LS柱，用1mlPE缓冲液润柱3遍。逐滴加入细胞悬液，于磁场中通过；
⑥用2mlPE缓冲液洗柱，2遍；
⑦将柱子移出磁场，放在收集管上，加入3mlPE缓冲液，用活塞快速推出细胞，取 10ul计数。
⑧将获得的细胞用扩增培养基(StemSpan SFEM培养基+[100ng/mL] SCF/TPO/Flt3L/IL-6)重悬细胞至浓度为5.0×104cells/mL，铺于96孔板中，随后立即加入适 当浓度的待测化合物(p18小分子抑制剂)，对照组则不添加p18小分子抑制剂；
⑨细胞于5％CO2，37℃细胞培养箱中培养7天；
⑩7天后，流式分析检测CD34及CD49f的比例；
根据得出的各群细胞数量以及比例的数值，采用Prism5软件进行统计分析。
结果分析：
由图1、2可知，p18小分子抑制剂005A在体外培养中可显著提高CD34+CD49f+细胞的 比例(005A组(20nM浓度)为30.83％，对照组为19.87％)，处理后005A组中20nM浓度 时，其为对照组的约1.5倍，且具有显著性差异(p<0.05)。同时，在该浓度下，p18小分子 抑制剂005A处理后，CD34+CD49f+细胞的绝对数量也提高了约1.4倍(005A组为 5509/104cells，对照组为3831/104cells，p<0.05)。由以上结果可知，p18小分子抑制剂处理 后的确可以显著提高造血干细胞的水平。
实施例4：细胞体外功能分析
采用鹅卵石样区域形成细胞分析(Cobblestone area forming cells analysis)对经过p18小分 子抑制剂处理的人造血干细胞进行功能分析，结果显示p18小分子抑制剂体外处理可显著 提高造血干细胞的水平。
①复苏M2-10B4细胞，用传代培养基(高糖1640+10％FBS)重悬细胞，并进行细胞 计数；
②使用胶原蛋白包被96孔板。每孔约加入50μL胶原蛋白溶液，轻摇孔板使其平铺于 板底。半开盖置于超净台内，室温晾干至少1h；
③照射基质细胞；显微镜下观察基质细胞状态良好且达到所需细胞数时消化收集细 胞；使用传代培养基洗细胞两次，并进行细胞计数；使用长周期培养基(H5100+10-6M HC) 重悬细胞，使细胞浓度约为106-108/mL，照射剂量为8000cGy(X-ray)；
④使用PBS缓冲液或长周期培养基中和胶原蛋白表面的浮酸；
⑤照射完成后离心收集细胞，并进行细胞计数。使用长周期培养基重悬细胞，使其浓 度为1.25×104/mL；
⑥将细胞接种于胶原蛋白已包被的96孔板中，每孔加入100μL M2-10B4细胞悬液， 于孵箱(37℃，5％CO2)中培养，至少过夜后才可铺上层细胞(即待测细胞)。
⑦收集待测细胞，此处待测细胞的详细制备方法参照实施例3中步骤①-⑨。进行细胞 计数，然后使用长周期培养基重悬细胞；小心地移除孔板内90％的培养基，注意不要吸干 或搅动基质细胞层；
⑧每孔按计算浓度加入上层待测细胞，100μL/孔；
⑨每周半量换液(新鲜培养基中不含有p18小分子抑制剂)，换液时小心不要搅动基 质细胞层。
⑩5周后，计数含有鹅卵石样区域的阳性孔数，并利用泊松分布进行统计，采用Prism5 软件绘图。
结果分析：
由图3可知，p18小分子抑制剂005A(20nM)处理后，细胞中原始造血细胞比例明显上 升，为1/397(1/313～1/503)，而对照组则为1/1031(1/745～1/1425)，p＝0.0174。因此可认为p18 小分子抑制剂005A处理后，可形成原始造血区域的细胞比例有明显升高，因此认为005A 可在体外扩增造血干细胞。
实施例5：动物模型试验
采用免疫缺陷鼠模型是检测造血干细胞的造血重建能力的金标准，通过移植实验可检 测移植细胞的长期造血能力，通过本次实验发现，p18小分子抑制剂005A处理后并未损伤 细胞的造血重建能力，且可有效提高造血重建的比例。
①将新鲜分得的人脐带血CD34+细胞经流式分选出CD34+38-45RA-90+细胞；
②取一定数量的CD34+38-45RA-90+细胞于Day0进行移植，作为未培养组对照；
③将获得的CD34+38-45RA-90+细胞用扩增培养基(StemSpan SFEM培养基+[100ng/mL] SCF/TPO/Flt3L/IL-6)重悬细胞至浓度为5.0×104cells/mL，铺于96孔板中，随后立即加入适 当浓度的待测化合物(p18小分子抑制剂)，对照组则不添加p18小分子抑制剂；随后于 5％CO2，37℃细胞培养箱中培养7天；然后进行移植；
④所采用小鼠为4-5周龄NOD-SCID小鼠，移植前8-10h进行半致死剂量(220cGy)照 射；
⑤按照培养前500个细胞/只小鼠移植，注射方式采用单侧胫骨髓腔移植；
⑥12周后，处死小鼠，取双侧骨髓分别进行流式分析检测人CD45细胞所占比例。
结果分析：
由图4可知，利用以上实验方法，移植后在小鼠内可成功出现来源于人的细胞群。并 且由图5可知，经p18小分子抑制剂005A处理后，细胞的造血重建能力显著高于对照组， 小鼠骨髓内来源于人的细胞比例明显高于对照组(p<0.05)，与未培养时造血干细胞的重建水 平相当，并可由注射侧骨髓(IF)中迁移至未注射侧骨髓(BM)中，而对照组小鼠中未注射侧骨 髓中基本未见来源于人的细胞(p<0.05)。同时，经005A处理后，造血重建水平较高(>10％) 的小鼠只数要高于未培养组(005A组为6/9，而未培养组为2/8，005A组约为未培养组的2.67 倍)。因此可认为，经过体外培养后细胞并未丧失其造血重建的能力，并进行了有效的自我 更新。