一种新型组织特异性小环载体 hIFNγ 基因治疗药物 技术领域 本发明涉及基因工程技术领域， 更具体地说是涉及一种由 EB 病毒特异性启动子 oriP 启动的人 IFNγ 基因与非病毒类小环载体构建而成的重组体， 靶向性抑制鼻咽癌生长 的作用研究。
背景技术
基因治疗是一种新的治疗手段， 可用于多种疾病的治疗， 包括癌症、 遗传性疾病、 感染性疾病、 心血管疾病和自身免疫性疾病等。 随着分子生物学技术的进步， 肿瘤基因治疗 在实验研究和临床试验中的应用都有了很大的进展。在基因治疗过程中， 基因导入系统是 最关键的技术。 目前， 在基因导入载体方面主要分为两大类， 即病毒载体系统及非病毒载体 系统。国内已经应用于临床的 “今又生” 便是一种由腺病毒载体携带 p53 抑癌基因治疗多种 肿瘤的基因治疗试剂。虽然病毒载体作为基因传递的工具被广泛地采纳， 但仍存在着局限 性， 可诱导机体产生某种程度的免疫反应， 引起插入突变等致瘤及致毒的风险， 且载体容量有限， 制备滴度不高等。曾经报道的一例死于基因治疗的病例便是因腺病毒载体引起的全 身炎症反应导致。 因此， 需要寻求一种更为安全的基因载体， 而非病毒基因载体以其设计灵 活、 低毒性、 低免疫原性、 低致瘤性、 易制备及可以实现细胞特异性和长期基因表达的优点， 为基因治疗开辟出一条新的道路。
小环 DNA(minicircle DNA) 载体是一种自 1997 年发展起来的新型非病毒基因载 体， 与传统的质粒载体相比， 小环 DNA 载体仅含有外源基因的表达盒， 不包括来自细菌质粒 的骨架结构。因为该载体所携带的外源基因的表达盒以环状超螺旋的形式存在， 所以被称 为小环 DNA。 小环 DNA 是由相应的母体质粒 (parent plasmid) 在宿主菌内以体内重组的方 式产生的。小环 DNA 的母体质粒的基本结构与常规质粒相同， 含有外源基因的表达盒及原 核骨架 ( 原核复制起点、 抗性基因筛选标记等 )， 此外， 该质粒上还携带有一个重组酶的表 达盒。重组酶可在宿主菌内被诱导表达， 将母体质粒重组成为两个环状 DNA， 分别是携带外 源基因表达盒的小环 DNA 和环状骨架 ( 原核复制起点、 抗性基因筛选标记、 重组酶的表达盒 等 )。小环 DNA 在宿主菌内重组产生后， 可通过相应的纯化方法与环状骨架分离， 去除环状 骨架的污染。
目前， 已构建成功的小环 DNA 载体系统根据所选用的重组酶的种类不同， 可分为 3 种。它们所采用的整合酶分别是 λ 噬菌体来源的重组酶、 P1 噬菌体来源的 cre 重组酶和 链霉菌温和噬菌体来源的 φC31 整合酶。美国斯坦福大学的 Chen Zhiying 等在 2003 年构 建的小环载体系统采用源于链霉菌温和噬菌体的 φC31 整合酶， 这种重组酶所介导的重组 过程为单向反应， 小环 DNA 的产率可达 97％。这一系统最大的特点在于毋需复杂的纯化过 程， 可由宿主菌内直接提取小环 DNA。 该系统的母体质粒上携带有内切酶 I-SceI 的表达盒， 当 φC31 整合酶在宿主菌内完成重组过程后， I-SceI 可将环状骨架及少量未重组的母体质 粒消化成为线性 DNA， 这些线性 DNA 随后被胞内的外切酶降解。因此， 采用这一系统可直接 由宿主菌内提取小环 DNA， 毋需进一步纯化， 有利于小环 DNA 的大规模制备。本发明所采用的就是此种小环 DNA 系统。
研究表明， 在超过 90％的鼻咽癌组织中可以检测到 EB 病毒感染， 而在癌旁正常组 织中则检测不到 EB 病毒的存在。 鼻咽癌属于 EB 病毒 II 型潜伏型感染， 在携带 EB 病毒的细 胞中恒定表达 EB 病毒核抗原 1(EBNA1) 蛋白。EBNA1 可以使 EB 病毒的基因组以稳定的附加 体形式存在， 并参与病毒基因组的复制、 核转移， 介导 EB 病毒对宿主的免疫逃逸。 在 EB 病毒 基因组中存在 3 个 EBNA1 结合位点， 其中亲和力最高的是位于 oriP 序列中的 FR 区。FR 区 由 20 个串联重复的 30bp 序列组成， 是依赖于 EBNA1 的转录增强子。Li Jianhua 等在 2002 年构建了带有 FR 序列的 CMV 启动子 (oriP-CMV promoter)， 在鼻咽癌组织中特异表达 p53 基因， 这是首次针对 EB 病毒阳性的鼻咽癌组织构建特异表达外源基因的基因治疗载体。如 果把这种启动子用于改造小环载体， 将有望获得在 EB 病毒阳性的鼻咽癌组织中高效、 持续 表达外源基因的靶向性小环载体。 发明内容
Wu Jiangxue 等在 2006 年首次将小环载体应用于抗肿瘤基因治疗， 构建携带人 IFNγ 的重组小环 DNA 载体 mc-IFNγ， 采用瘤内注射的方式治疗鼻咽癌移植瘤荷瘤小鼠， 证 明小环载体可在肿瘤组织内介导外源基因高效、 持续表达， 较传统质粒更有效的抑制鼻咽 癌移植瘤的生长。
在此基础上， 本发明将对小环载体进行改进， 构建在 EB 病毒阳性鼻咽癌组织中靶 向表达的小环载体， 研究靶向小环载体对鼻咽癌的抑制作用， 为鼻咽癌等 EB 病毒阳性的肿 瘤的治疗提供新的候选药物。
为实现上述目的， 本发明构建了在 EB 病毒阳性鼻咽癌组织中靶向表达的小环载 体 mc-oriP-IFNγ， 该载体的启动子由 EB 病毒 oriP 序列的 FR 区和 CMV 启动子的最小序列 组成， 受 EBNA1 诱导表达。该重组体由非病毒载体小环质粒与人 IFNγ 基因构建而成， 其启 动子为靶向 EB 病毒阳性组织的 oriP-CMV。表达框序列为 5alI-oriP-HindIII-IFNγ-NheI -PolyA-SpeI ：
母环 p2ФC31 载体上的限制性内切酶位点 SalI 前一个碱基
-gtcgac6gtgaggatagcatatgctacccggatacagattaggatagcatatactacccagatataga ttaggatagcatatgctaccgcagatatagattaggatagcctatgctacccagatataaattaggatagcatatac tacccagatatagattaggatagcatatgctacccagatatagattaggatagcctatgctacccagatatagatta ggatagcatatgctacccagatatagattaggatagcatatgctatccagatatttgggtagtatatgctacccaga tataaattaggatagcatatcctcccttaatctctattaggatagcatatgctacccggatacagattaggatagca tatactacccagatatagattaggatagcatatgctacccagatatagattaggatagcttatgctacccagatata aattaggatagcatatactacccagatatagattaggatagcatatgctacccagatatagattaggatagcctatg ctacccagatatagattaggatagcatatgctatccagatatttgggtagtatatgctacccatggcaacattagcc caccgtgctttcagcgacctcgtgaatatgaggaccaacaaccctgtgcttggcgctcaggcgcaagtgtgtgtaat ttgtcctccagatcgcagcaatcgcgcccctatcttggcccgcccacctacttatgcaggtattccccgggtcgagg taggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccac gctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccccgaattggg898aagctt904atgaaa tatacaagttatatcttggcttttcagctctgcatcgttttgggttctcttggctgttactgccaggacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattttaatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttag gcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagccaaattgtctccttttacttcaaactt tttaaaaactttaaagatgaccagagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaagacatgaatgtcaagttttt caatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagctgactaattattcggtaactgacttgaatgtccaacgca aagcaatacatgaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtcag atgctgtttcgaggtcgaagagcatcccagtaa1405gctagc1411ctgtgccttctagttgccagccatctgttgttt gcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgca tcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaaga caatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgg 1636actagt- 母环 p2ФC31 载体上的限制性内切 酶位点 SpeI 后一个碱基
其中 ：
1.1-6 ： 限制性内切酶位点 SalI
2.7-898 ： EB 病毒特异性启动子 oriP
3.899-904 ： 限制性内切酶位点 HindIII
4.905-1405 ： 人 IFNγ 基因编码区 5.1406-1411 ： 限制性内切酶位点 NheI
6.1412-1636 ： 多聚腺苷酸尾 polyA
7.1637-1642 ： 限制性内切酶位点 SpeI
本发明的重组体是通过如下方法获得 ：
1. 通过 SalI 和 HindIII 双酶切从 pDC312.oriP.LUCI 质粒 ( 加拿大 Liu Feifei 教授提供 ) 上获得 oriP 启动子构建在中间载体 pSP72(promega) 质粒上， 形成 pSP72-oriP 质粒。
2. 通过 PCR 的方法从 pcDNA3.1(invitrogen) 质粒上获得 polyA 基因连接在 oriP 启动子之后， 形成 pSP72-oriP-polyA 质粒。
3. 通过 PCR 的方法从 pShuttle-IFNγ 质粒上获得 IFNγ 基因连接在 oriP 启动子 之后， 形成 pSP72-oriP-IFNγ-polyA 质粒 ( 简写成 pSP72-oriP-IFNγ)。
4. 通 过 SalI 和 SpeI 两 个 位 点 将 中 间 载 体 pSP72 质 粒 上 的 表 达 框 oriP-IFNγ-polyA 片段连接至母环 p2ФC31 上构建成 p2ФC31-oriP-IFNγ-polyA 质粒 ( 简写成 p2ФC31-oriP-IFNγ)。
5. 将母环重组体 p2ФC31-oriP-IFNγ 转化 E.coli Top10 菌株， 挑选单克隆接种 至 TB 培养基中培养过夜。在 20℃， 4000rpm 离心 20min 收集细胞， 用含 1.5％ L-arabinose 的 LB 培养基按 4 ∶ 1(v/v) 的比例重悬细胞， 32℃， 250rpm 振荡培养 4 小时后， 加入 1/2 体 积的含 1％ L-arabinose 的新鲜 LB 培养基 (pH8.0) 于 37℃继续培养 4 小时， 收集细菌， 提 取质粒 mc-oriP-IFNγ。该重组体具有以下优点 ：
1. 可介导外源基因高效表达 ： 小环 DNA 明显小于携带同一表达盒的相应的质粒载 体， 这提高了它在胞外和胞内的生物利用度。在体外试验中， 小环 DNA 介导的外源基因的表 达水平较相应的母体质粒高 2-10 倍。 Chen 等的研究表明， 小环 DNA 所携带的外源基因可在 小鼠体内高效表达， 表达水平较质粒载体高几十至数百倍。
2. 可介导外源基因在体内持续表达 ： 最新的研究表明， 外源基因表达盒与细菌质
粒骨架之间的共价连接会导致外源基因的沉默， 这是造成质粒载体所携带的外源基因在体 内只能瞬时表达的主要原因， 也是质粒载体临床应用的主要限制因素。由于不含有来自细 菌质粒的骨架结构， 小环 DNA 所携带的外源基因可在体内高效表达 ( 较质粒载体高几十至 数百倍 )， 且持续表达的时间可长达数月。
3. 安全性高 ： 去除了细菌骨架的小环 DNA 不含有源自原核 DNA 的 CpG 序列， 因此 不会引起机体针对基因载体的免疫反应， 提高了载体的安全性。此外本发明针对 EB 病毒阳 性的鼻咽癌组织构建特异表达外源基因的小环载体， 使得 IFNγ 在 EB 病毒阳性的鼻咽癌组 织中高效、 持续表达。减少了因 IFNγ 在肝脏等器官中长期表达对正常组织产生的毒副作 用。
综上所述， 由 1997 年至今， 小环 DNA 这一载体系统得到了不断的发展与完善。目 前小环 DNA 载体的制备方式已从体外酶切、 纯化发展成为经体内重组后， 通过由宿主菌中 直接提取的方式大规模制备， 这一进步使得小环 DNA 载体作为一种新型基因治疗载体在临 床上的应用成为可能。
本发明成功构建了携带人 IFNγ 基因的靶向小环 DNA 载体 (mc-oriP-IFNγ)， 用 于 治 疗 鼻 咽 癌 移 植 瘤 荷 瘤 小 鼠， 实验结果显示小环载体可在体外及体内介导外 源 基 因 高 效、 持 续 表 达， 小 环 DNA 载 体 介 导 的 IFNγ 的 表 达 水 平 较 传 统 的 质 粒 载 体 (p2φC31-oriP-IFNγ) 高， 且基因表达持续时间长， 并能靶向性抑制 EB 病毒阳性的鼻咽癌 细胞的生长， 在 EB 病毒阴性的细胞中基本不表达。上述研究成果表明， 靶向性小环载体在 抗肿瘤基因治疗中有很大的应用潜力， 解决了 IFNγ 蛋白半衰期短， 不稳定的问题。迄今为 止， 已被证明与 EB 病毒感染有关的恶性肿瘤除鼻咽癌外， 还包括 B 细胞淋巴瘤、 卡波西肉 瘤、 乳腺癌及胃癌等， 本发明所构建的受 EBNA1 诱导表达的靶向性小环载体也有望用于这 些 EB 病毒阳性的肿瘤的治疗。 附图说明 图 1 是本发明的实验技术路线图
图 2 是本发明中重组体表达框的构建及小环诱导生成示意图
图 3 是本发明的重组体转染 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞， 利 用荧光素酶双报告基因分析系统检测 luciferase 活性的结果
图 4 是本发明的重组体转染 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞， 利 用 ELISA 的方法分析靶向性小环载体表达 IFNγ 的结果
图 5 是本发明的重组体转染 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞， 利 用 WST 的方法分析靶向性小环载体对细胞生长抑制作用的结果
图 6 是本发明的重组体对鼻咽癌移植瘤荷瘤小鼠的治疗作用的结果
具体实施方式
下列实施例是对本发明的进一步解释和说明， 对本发明不构成任何限制。
实施例 1
如图 1 和图 2 所示， 构建重组体及小环诱导过程 ：
1. 通过 SalI 和 HindIII 双酶切从 pDC312.oriP.LUCI 质粒 ( 加拿大 Liu Feifei教授提供 ) 上获得 oriP 启动子构建在中间载体 pSP72(promega) 质粒上， 形成 pSP72-oriP 质粒。
2. 设 计 引 物 5 ′ -CCCAAGCTTCTGCAGGCTAGCCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATC-3 ′ 和 5 ′ -CCGCTCGAGGGGCCCACTAGTCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGC-3 ′。 通 过 PCR 的 方 法 从 pcDNA3.1(invitrogen) 质粒上获得 polyA 基因。胶回收后双酶切， 连接至中间载体 pSP72 质粒上， 形成 pSP72-oriP-polyA 质粒。
3. 设 计 引 物 5 ′ -CCCAAGCTTATGAAATATACAAGTTATATC-3 ′ 和 5′ -CTAGCTAGCTTACTGGGATGC-3′。通过 PCR 的方法从 pShuttle-IFNγ 质粒上获得 IFNγ 基因。胶回收后双酶切， 连接至中间载体 pSP72 质粒上， 形成 pSP72-oriP-IFNγ-polyA 质 粒 ( 简写成 pSP72-oriP-IFNγ)。
4. 通过 SalI 和 SpeI 两个位点酶切将中间载体 pSP72 质粒上的表达框连接至母环 p2ФC31 上构建成 p2ФC31-oriP-IFNγ-polyA 质粒 ( 简写成 p2ФC31-oriP-IFNγ)。
5. 将母环重组体 p2ФC31-oriP-IFNγ 转化 E.coli Top10 菌株， 挑选单克隆接种 至 TB 培养基中培养过夜。在 20℃， 4000rpm 离心 20min 收集细胞， 用含 1.5％ L-arabinose 的 LB 培养基按 4 ∶ 1(v/v) 的比例重悬细胞， 32℃， 250rpm 振荡培养 4 小时后， 加入 1/2 体 积的含 1％ L-arabinose 的新鲜 LB 培养基 (pH8.0) 于 37℃继续培养 4 小时， 收集细菌， 提 取质粒 mc-oriP-IFNγ。 实施例 2
如图 3 所示， 荧光素酶报告基因分析 ：
将各重组体用脂质体 lipofectamine 2000 转染 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞， 按 24 孔板每孔转染 1 微克质粒的量转染， 按时间点收集细胞裂解后， 用荧 光素酶双报告基因试剂盒检测。实验分为以下各组 ： 1， pSP72-oriP-luci ； 2， pSP72-luci ； 3， p2ФC31-oriP-luci ； 4， p2ФC31-luci ； 5， mc-oriP-luci ； 6， mc-luci ； 7， p2ФC31 ； 8， 空白 对照。结果显示 oriP 启动子在 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞中特异性启动 luciferase 基因 的表达， 在 EB 病毒阴性的细胞中几乎不表达。而对照 CMV 启动子则在 EB 病毒阳性的鼻咽 癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞中都可启动 luciferase 基因的表达， 不具有靶向性。
实施例 3
如图 4 所示， ELISA 检测 IFNγ 的表达 ：
将各重组体用脂质体 lipofectamine 2000 转染 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞， 按 24 孔板每孔转染 1 微克质粒的量转染， 按时间点收集细胞上清 后用检测人 IFNγ 的 ELISA 试剂盒分析。实验分为以下各组 ： 1， pSP72-oriP-IFNγ ； 2， pSP72-IFNγ ； 3， p2ФC31-oriP-IFNγ ； 4， p2ФC31-IFNγ ； 5， mc-oriP-IFNγ ； 6， mc-IFNγ ； 7， p2ФC31 ； 8， 空白对照。结果显示 oriP 启动子在 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞中特异性启 动 IFNγ 基因的表达， 在 EB 病毒阴性的细胞中几乎不表达。而对照 CMV 启动子则在 EB 病 毒阳性的鼻咽癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞中都可启动 IFNγ 基因的表达， 不具有靶向性。
实施例 4
如图 5 所示， WST 分析结果 ：
将各重组体用脂质体 lipofectamine 2000 转染 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞， 按 24 孔板每孔转染 1 微克质粒的量转染， 按时间点加入 CCK-8 后
在 酶 标 仪 上 读 数 分 析。 实 验 分 为 以 下 各 组 ： 1， pSP72-oriP-IFNγ ； 2， pSP72-IFNγ ； 3， p2ФC31-oriP-IFNγ ； 4， p2ФC31-IFNγ ； 5， mc-oriP-IFNγ ； 6， mc-IFNγ ； 7， p2ФC31 ； 8， 空 白对照。结果显示靶向性重组体对 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞具有抑制生长的作用。而对 照非靶向性重组体则对 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞都有杀伤， 不具有 靶向性。
实施例 5
如图 6 所示， 各重组体体内抑瘤结果分析 ：
背景技术
基因治疗是一种新的治疗手段， 可用于多种疾病的治疗， 包括癌症、 遗传性疾病、 感染性疾病、 心血管疾病和自身免疫性疾病等。 随着分子生物学技术的进步， 肿瘤基因治疗 在实验研究和临床试验中的应用都有了很大的进展。在基因治疗过程中， 基因导入系统是 最关键的技术。 目前， 在基因导入载体方面主要分为两大类， 即病毒载体系统及非病毒载体 系统。国内已经应用于临床的 “今又生” 便是一种由腺病毒载体携带 p53 抑癌基因治疗多种 肿瘤的基因治疗试剂。虽然病毒载体作为基因传递的工具被广泛地采纳， 但仍存在着局限 性， 可诱导机体产生某种程度的免疫反应， 引起插入突变等致瘤及致毒的风险， 且载体容量有限， 制备滴度不高等。曾经报道的一例死于基因治疗的病例便是因腺病毒载体引起的全 身炎症反应导致。 因此， 需要寻求一种更为安全的基因载体， 而非病毒基因载体以其设计灵 活、 低毒性、 低免疫原性、 低致瘤性、 易制备及可以实现细胞特异性和长期基因表达的优点， 为基因治疗开辟出一条新的道路。
小环 DNA(minicircle DNA) 载体是一种自 1997 年发展起来的新型非病毒基因载 体， 与传统的质粒载体相比， 小环 DNA 载体仅含有外源基因的表达盒， 不包括来自细菌质粒 的骨架结构。因为该载体所携带的外源基因的表达盒以环状超螺旋的形式存在， 所以被称 为小环 DNA。 小环 DNA 是由相应的母体质粒 (parent plasmid) 在宿主菌内以体内重组的方 式产生的。小环 DNA 的母体质粒的基本结构与常规质粒相同， 含有外源基因的表达盒及原 核骨架 ( 原核复制起点、 抗性基因筛选标记等 )， 此外， 该质粒上还携带有一个重组酶的表 达盒。重组酶可在宿主菌内被诱导表达， 将母体质粒重组成为两个环状 DNA， 分别是携带外 源基因表达盒的小环 DNA 和环状骨架 ( 原核复制起点、 抗性基因筛选标记、 重组酶的表达盒 等 )。小环 DNA 在宿主菌内重组产生后， 可通过相应的纯化方法与环状骨架分离， 去除环状 骨架的污染。
目前， 已构建成功的小环 DNA 载体系统根据所选用的重组酶的种类不同， 可分为 3 种。它们所采用的整合酶分别是 λ 噬菌体来源的重组酶、 P1 噬菌体来源的 cre 重组酶和 链霉菌温和噬菌体来源的 φC31 整合酶。美国斯坦福大学的 Chen Zhiying 等在 2003 年构 建的小环载体系统采用源于链霉菌温和噬菌体的 φC31 整合酶， 这种重组酶所介导的重组 过程为单向反应， 小环 DNA 的产率可达 97％。这一系统最大的特点在于毋需复杂的纯化过 程， 可由宿主菌内直接提取小环 DNA。 该系统的母体质粒上携带有内切酶 I-SceI 的表达盒， 当 φC31 整合酶在宿主菌内完成重组过程后， I-SceI 可将环状骨架及少量未重组的母体质 粒消化成为线性 DNA， 这些线性 DNA 随后被胞内的外切酶降解。因此， 采用这一系统可直接 由宿主菌内提取小环 DNA， 毋需进一步纯化， 有利于小环 DNA 的大规模制备。本发明所采用的就是此种小环 DNA 系统。
研究表明， 在超过 90％的鼻咽癌组织中可以检测到 EB 病毒感染， 而在癌旁正常组 织中则检测不到 EB 病毒的存在。 鼻咽癌属于 EB 病毒 II 型潜伏型感染， 在携带 EB 病毒的细 胞中恒定表达 EB 病毒核抗原 1(EBNA1) 蛋白。EBNA1 可以使 EB 病毒的基因组以稳定的附加 体形式存在， 并参与病毒基因组的复制、 核转移， 介导 EB 病毒对宿主的免疫逃逸。 在 EB 病毒 基因组中存在 3 个 EBNA1 结合位点， 其中亲和力最高的是位于 oriP 序列中的 FR 区。FR 区 由 20 个串联重复的 30bp 序列组成， 是依赖于 EBNA1 的转录增强子。Li Jianhua 等在 2002 年构建了带有 FR 序列的 CMV 启动子 (oriP-CMV promoter)， 在鼻咽癌组织中特异表达 p53 基因， 这是首次针对 EB 病毒阳性的鼻咽癌组织构建特异表达外源基因的基因治疗载体。如 果把这种启动子用于改造小环载体， 将有望获得在 EB 病毒阳性的鼻咽癌组织中高效、 持续 表达外源基因的靶向性小环载体。 发明内容
Wu Jiangxue 等在 2006 年首次将小环载体应用于抗肿瘤基因治疗， 构建携带人 IFNγ 的重组小环 DNA 载体 mc-IFNγ， 采用瘤内注射的方式治疗鼻咽癌移植瘤荷瘤小鼠， 证 明小环载体可在肿瘤组织内介导外源基因高效、 持续表达， 较传统质粒更有效的抑制鼻咽 癌移植瘤的生长。
在此基础上， 本发明将对小环载体进行改进， 构建在 EB 病毒阳性鼻咽癌组织中靶 向表达的小环载体， 研究靶向小环载体对鼻咽癌的抑制作用， 为鼻咽癌等 EB 病毒阳性的肿 瘤的治疗提供新的候选药物。
为实现上述目的， 本发明构建了在 EB 病毒阳性鼻咽癌组织中靶向表达的小环载 体 mc-oriP-IFNγ， 该载体的启动子由 EB 病毒 oriP 序列的 FR 区和 CMV 启动子的最小序列 组成， 受 EBNA1 诱导表达。该重组体由非病毒载体小环质粒与人 IFNγ 基因构建而成， 其启 动子为靶向 EB 病毒阳性组织的 oriP-CMV。表达框序列为 5alI-oriP-HindIII-IFNγ-NheI -PolyA-SpeI ：
母环 p2ФC31 载体上的限制性内切酶位点 SalI 前一个碱基
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其中 ：
1.1-6 ： 限制性内切酶位点 SalI
2.7-898 ： EB 病毒特异性启动子 oriP
3.899-904 ： 限制性内切酶位点 HindIII
4.905-1405 ： 人 IFNγ 基因编码区 5.1406-1411 ： 限制性内切酶位点 NheI
6.1412-1636 ： 多聚腺苷酸尾 polyA
7.1637-1642 ： 限制性内切酶位点 SpeI
本发明的重组体是通过如下方法获得 ：
1. 通过 SalI 和 HindIII 双酶切从 pDC312.oriP.LUCI 质粒 ( 加拿大 Liu Feifei 教授提供 ) 上获得 oriP 启动子构建在中间载体 pSP72(promega) 质粒上， 形成 pSP72-oriP 质粒。
2. 通过 PCR 的方法从 pcDNA3.1(invitrogen) 质粒上获得 polyA 基因连接在 oriP 启动子之后， 形成 pSP72-oriP-polyA 质粒。
3. 通过 PCR 的方法从 pShuttle-IFNγ 质粒上获得 IFNγ 基因连接在 oriP 启动子 之后， 形成 pSP72-oriP-IFNγ-polyA 质粒 ( 简写成 pSP72-oriP-IFNγ)。
4. 通 过 SalI 和 SpeI 两 个 位 点 将 中 间 载 体 pSP72 质 粒 上 的 表 达 框 oriP-IFNγ-polyA 片段连接至母环 p2ФC31 上构建成 p2ФC31-oriP-IFNγ-polyA 质粒 ( 简写成 p2ФC31-oriP-IFNγ)。
5. 将母环重组体 p2ФC31-oriP-IFNγ 转化 E.coli Top10 菌株， 挑选单克隆接种 至 TB 培养基中培养过夜。在 20℃， 4000rpm 离心 20min 收集细胞， 用含 1.5％ L-arabinose 的 LB 培养基按 4 ∶ 1(v/v) 的比例重悬细胞， 32℃， 250rpm 振荡培养 4 小时后， 加入 1/2 体 积的含 1％ L-arabinose 的新鲜 LB 培养基 (pH8.0) 于 37℃继续培养 4 小时， 收集细菌， 提 取质粒 mc-oriP-IFNγ。该重组体具有以下优点 ：
1. 可介导外源基因高效表达 ： 小环 DNA 明显小于携带同一表达盒的相应的质粒载 体， 这提高了它在胞外和胞内的生物利用度。在体外试验中， 小环 DNA 介导的外源基因的表 达水平较相应的母体质粒高 2-10 倍。 Chen 等的研究表明， 小环 DNA 所携带的外源基因可在 小鼠体内高效表达， 表达水平较质粒载体高几十至数百倍。
2. 可介导外源基因在体内持续表达 ： 最新的研究表明， 外源基因表达盒与细菌质
粒骨架之间的共价连接会导致外源基因的沉默， 这是造成质粒载体所携带的外源基因在体 内只能瞬时表达的主要原因， 也是质粒载体临床应用的主要限制因素。由于不含有来自细 菌质粒的骨架结构， 小环 DNA 所携带的外源基因可在体内高效表达 ( 较质粒载体高几十至 数百倍 )， 且持续表达的时间可长达数月。
3. 安全性高 ： 去除了细菌骨架的小环 DNA 不含有源自原核 DNA 的 CpG 序列， 因此 不会引起机体针对基因载体的免疫反应， 提高了载体的安全性。此外本发明针对 EB 病毒阳 性的鼻咽癌组织构建特异表达外源基因的小环载体， 使得 IFNγ 在 EB 病毒阳性的鼻咽癌组 织中高效、 持续表达。减少了因 IFNγ 在肝脏等器官中长期表达对正常组织产生的毒副作 用。
综上所述， 由 1997 年至今， 小环 DNA 这一载体系统得到了不断的发展与完善。目 前小环 DNA 载体的制备方式已从体外酶切、 纯化发展成为经体内重组后， 通过由宿主菌中 直接提取的方式大规模制备， 这一进步使得小环 DNA 载体作为一种新型基因治疗载体在临 床上的应用成为可能。
本发明成功构建了携带人 IFNγ 基因的靶向小环 DNA 载体 (mc-oriP-IFNγ)， 用 于 治 疗 鼻 咽 癌 移 植 瘤 荷 瘤 小 鼠， 实验结果显示小环载体可在体外及体内介导外 源 基 因 高 效、 持 续 表 达， 小 环 DNA 载 体 介 导 的 IFNγ 的 表 达 水 平 较 传 统 的 质 粒 载 体 (p2φC31-oriP-IFNγ) 高， 且基因表达持续时间长， 并能靶向性抑制 EB 病毒阳性的鼻咽癌 细胞的生长， 在 EB 病毒阴性的细胞中基本不表达。上述研究成果表明， 靶向性小环载体在 抗肿瘤基因治疗中有很大的应用潜力， 解决了 IFNγ 蛋白半衰期短， 不稳定的问题。迄今为 止， 已被证明与 EB 病毒感染有关的恶性肿瘤除鼻咽癌外， 还包括 B 细胞淋巴瘤、 卡波西肉 瘤、 乳腺癌及胃癌等， 本发明所构建的受 EBNA1 诱导表达的靶向性小环载体也有望用于这 些 EB 病毒阳性的肿瘤的治疗。 附图说明 图 1 是本发明的实验技术路线图
图 2 是本发明中重组体表达框的构建及小环诱导生成示意图
图 3 是本发明的重组体转染 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞， 利 用荧光素酶双报告基因分析系统检测 luciferase 活性的结果
图 4 是本发明的重组体转染 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞， 利 用 ELISA 的方法分析靶向性小环载体表达 IFNγ 的结果
图 5 是本发明的重组体转染 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞， 利 用 WST 的方法分析靶向性小环载体对细胞生长抑制作用的结果
图 6 是本发明的重组体对鼻咽癌移植瘤荷瘤小鼠的治疗作用的结果
具体实施方式
下列实施例是对本发明的进一步解释和说明， 对本发明不构成任何限制。
实施例 1
如图 1 和图 2 所示， 构建重组体及小环诱导过程 ：
1. 通过 SalI 和 HindIII 双酶切从 pDC312.oriP.LUCI 质粒 ( 加拿大 Liu Feifei教授提供 ) 上获得 oriP 启动子构建在中间载体 pSP72(promega) 质粒上， 形成 pSP72-oriP 质粒。
2. 设 计 引 物 5 ′ -CCCAAGCTTCTGCAGGCTAGCCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATC-3 ′ 和 5 ′ -CCGCTCGAGGGGCCCACTAGTCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGC-3 ′。 通 过 PCR 的 方 法 从 pcDNA3.1(invitrogen) 质粒上获得 polyA 基因。胶回收后双酶切， 连接至中间载体 pSP72 质粒上， 形成 pSP72-oriP-polyA 质粒。
3. 设 计 引 物 5 ′ -CCCAAGCTTATGAAATATACAAGTTATATC-3 ′ 和 5′ -CTAGCTAGCTTACTGGGATGC-3′。通过 PCR 的方法从 pShuttle-IFNγ 质粒上获得 IFNγ 基因。胶回收后双酶切， 连接至中间载体 pSP72 质粒上， 形成 pSP72-oriP-IFNγ-polyA 质 粒 ( 简写成 pSP72-oriP-IFNγ)。
4. 通过 SalI 和 SpeI 两个位点酶切将中间载体 pSP72 质粒上的表达框连接至母环 p2ФC31 上构建成 p2ФC31-oriP-IFNγ-polyA 质粒 ( 简写成 p2ФC31-oriP-IFNγ)。
5. 将母环重组体 p2ФC31-oriP-IFNγ 转化 E.coli Top10 菌株， 挑选单克隆接种 至 TB 培养基中培养过夜。在 20℃， 4000rpm 离心 20min 收集细胞， 用含 1.5％ L-arabinose 的 LB 培养基按 4 ∶ 1(v/v) 的比例重悬细胞， 32℃， 250rpm 振荡培养 4 小时后， 加入 1/2 体 积的含 1％ L-arabinose 的新鲜 LB 培养基 (pH8.0) 于 37℃继续培养 4 小时， 收集细菌， 提 取质粒 mc-oriP-IFNγ。 实施例 2
如图 3 所示， 荧光素酶报告基因分析 ：
将各重组体用脂质体 lipofectamine 2000 转染 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞， 按 24 孔板每孔转染 1 微克质粒的量转染， 按时间点收集细胞裂解后， 用荧 光素酶双报告基因试剂盒检测。实验分为以下各组 ： 1， pSP72-oriP-luci ； 2， pSP72-luci ； 3， p2ФC31-oriP-luci ； 4， p2ФC31-luci ； 5， mc-oriP-luci ； 6， mc-luci ； 7， p2ФC31 ； 8， 空白 对照。结果显示 oriP 启动子在 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞中特异性启动 luciferase 基因 的表达， 在 EB 病毒阴性的细胞中几乎不表达。而对照 CMV 启动子则在 EB 病毒阳性的鼻咽 癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞中都可启动 luciferase 基因的表达， 不具有靶向性。
实施例 3
如图 4 所示， ELISA 检测 IFNγ 的表达 ：
将各重组体用脂质体 lipofectamine 2000 转染 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞， 按 24 孔板每孔转染 1 微克质粒的量转染， 按时间点收集细胞上清 后用检测人 IFNγ 的 ELISA 试剂盒分析。实验分为以下各组 ： 1， pSP72-oriP-IFNγ ； 2， pSP72-IFNγ ； 3， p2ФC31-oriP-IFNγ ； 4， p2ФC31-IFNγ ； 5， mc-oriP-IFNγ ； 6， mc-IFNγ ； 7， p2ФC31 ； 8， 空白对照。结果显示 oriP 启动子在 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞中特异性启 动 IFNγ 基因的表达， 在 EB 病毒阴性的细胞中几乎不表达。而对照 CMV 启动子则在 EB 病 毒阳性的鼻咽癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞中都可启动 IFNγ 基因的表达， 不具有靶向性。
实施例 4
如图 5 所示， WST 分析结果 ：
将各重组体用脂质体 lipofectamine 2000 转染 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞， 按 24 孔板每孔转染 1 微克质粒的量转染， 按时间点加入 CCK-8 后
在 酶 标 仪 上 读 数 分 析。 实 验 分 为 以 下 各 组 ： 1， pSP72-oriP-IFNγ ； 2， pSP72-IFNγ ； 3， p2ФC31-oriP-IFNγ ； 4， p2ФC31-IFNγ ； 5， mc-oriP-IFNγ ； 6， mc-IFNγ ； 7， p2ФC31 ； 8， 空 白对照。结果显示靶向性重组体对 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞具有抑制生长的作用。而对 照非靶向性重组体则对 EB 病毒阳性的鼻咽癌细胞和 EB 病毒阴性的细胞都有杀伤， 不具有 靶向性。
实施例 5
如图 6 所示， 各重组体体内抑瘤结果分析 ：
建立 EB 病毒阳性的鼻咽癌移植瘤裸鼠模型和 EB 病毒阴性的鼻咽癌移植瘤裸鼠模 型， 将各重组体用脂质体 lipofectamine 2000 包裹混合， 采用瘤内注射的方式， 按每只老 鼠 15 微克质粒加 60 微升脂质体的量， 每周给药一次， 连续三周给药， 测量肿瘤体积和重量。 结果显示靶向性重组体对 EB 病毒阳性的鼻咽癌移植瘤具有抑制生长的作用。而对照非靶 向性重组体则对 EB 病毒阳性的鼻咽癌移植瘤和 EB 病毒阴性的鼻咽癌移植瘤都有杀伤， 不 具有靶向性。9102373232 A CN 102373235
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