一株环境安全的以葡萄糖为底物发酵产 2,3- 丁二醇枯草 芽孢杆菌的选育 技术领域 一株环境安全的以葡萄糖为底物发酵产 2， 3- 丁二醇枯草芽孢杆菌的选育， 属于 生物工程中发酵技术领域。
背景技术 2， 3- 丁二醇， 英文名为 2， 3-butanediol， 简写为 2， 3-BDO， 是无色结晶或液体， 熔 点 23-27℃， 沸点 170-182℃， 具有吸水性， 能与水和醇相互混溶， 能溶于醇和醚。
2， 3-BDO 是一种重要的化工原料和医药前体， 例如它可以脱水形成 1， 3- 丁二烯， 可用于合成橡胶、 聚酯和聚亚胺酯 ； 酯化形式的 2， 3-BDO 是合成聚亚胺的前体， 可应用于药 物、 化妆品、 洗液等。此外 2， 3-BDO 还可作为风味物质添加到白酒和奶油中。2， 3-BDO 可以 通过化学合成法和微生物生产法两种， 由于 2， 3- 丁二醇结构特殊， 化学法生产 2， 3- 丁二醇 主要是以石油裂解时产生的四碳类碳氢化合物在高温高压下水解得到， 成本高、 过程繁琐、 不易操作， 所以一直很难实现大规模的工业化生产。 随着石油价格的日益攀升， 用微生物发 酵法生产 2， 3- 丁二醇并对其衍生物进行开发研究逐渐引起了人们的关注。发酵法生产 2， 3- 丁二醇有许多优点 ： 首先在成本上具有优势， 化学法生产成本比较高 ； 其次， 发酵法具有 对环境友好的特征， 2， 3- 丁二醇作为有机合成中间体取代了许多的化合物和其它石化产品 的市场， 前景广阔， 社会、 环境效益显著， 非常有利于该产品的广泛应用 ； 第三由于发酵法生 产 2， 3- 丁二醇是以可再生资源为原料的， 因此本身摆脱了对石化原料的依赖， 具有很好的 应用前景。目前， 2， 3- 丁二醇的工业化主要是发酵法， 有关研究国外进行的较早， 取得的成 绩比较显著， 国内研究还处于初级阶段， 国内外发酵法产 2， 3- 丁二醇的研究常用的菌种大 都是克雷伯氏菌， 而克雷伯氏菌具有潜在的致病性， 限制了其工业化的应用。
本发明筛选到以葡萄糖为底物高产 2， 3- 丁二醇的微生物菌株， 对该菌进行了鉴 定， 确定其为枯草芽孢杆菌， 是环境安全菌株具有较大的工业应用前景， 对其发酵条件进行 了初步研究， 在 5L 发酵罐上的产量可以达到 61.7g/L， 为微生物发酵法产 2， 3- 丁二醇的工 业化提供了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供 ： 从自然界的土壤中筛选到能够以葡萄糖为底物发酵产 2， 3- 丁二醇的菌株， 并对其进行了形态学与遗传学方面的鉴定， 将该菌命名为 6-7。对发酵 产物进行了定性定量鉴定， 为微生物发酵法生产 2， 3- 丁二醇的工业化提供了有益的指导。
本发明的技术方案 ： 一种通过微生物发酵产 2， 3-BDO 的方法， 是在初始发酵培养 基中， 以从自然界土壤中筛选的菌株为生产菌株， 控制温度 37℃， 摇床发酵 72h， 通过气质 联用定性检测发酵液中物质成分然后再通过液相色谱定量检测发酵液中物质的含量， 筛选 出能以葡萄糖为底物发酵产 2， 3-BDO 的菌株。本发明成功筛选到一株能以葡萄糖为底物发 酵产 2， 3-BDO 的菌株， 通过 16S rDNA 鉴定， 将其命名为 Bacllius subtilis 6-7， 已保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 ： CTCC M 2009200。
主要试剂 ：
2， 3-BDO 购自美国 Sigma-Aldrich 公司
2， 3-BDO 分析方法的确定 ：
2， 3-BDO 标 样 在 Sugarpakl 糖 柱 上 通 过 液 相 色 谱 进 行 分 析， 不同构型的 2， 3-BDO 保 留 时 间 分 别 为 19.3min 和 22.5min。 所 用 液 相 色 谱 仪 为 Waters， 糖柱 Sugarpakl(6.5mmid×300mm)。
确定具体色谱条件为 ： 糖柱 Sugarpakl(6.5mmid×300mm)) ； 柱温 ： 85 ℃ ； 流动相 ： 纯水 ； 流速 0.4ml/min ； 进样量为 10μL ； 检测器 ： 示差折光检测器。
目的菌株的筛选 ： 将采集到的样品在种子培养基 ( 葡萄糖 20g/L， 酵母膏 5g/L， 蛋 白胨 10g/L， 氯化钠 10g/L pH 7.0) 中富集， 37℃ 150r/min 摇床 l0h， 取不同稀释度稀释涂 布培养。挑单菌落在平板分离培养基 ( 酵母膏 5g/L， 蛋白胨 10g/L， 氯化钠 10g/L， 琼脂粉 18g/LpH 7.0) 上进行划线分离， 37℃培养 1d-2d， 镜检， 待试菌株保藏于斜面保藏培养基， 作初筛备用 ； 将用种子培养基培养到对数期的种子， 按 5％接种量加入到含有 15％葡萄糖 的发酵培养基中， 然后置于 37℃、 150r/min 条件下振荡培养 72h。 收集发酵液， 离心， 取上清 液以备检测。 目的菌株的鉴定 ： 采用 16S rDNA 测序， 将该序列与美国国家生物信息中心 (NCBI) 收 录 的 DNA 序 列 进 行 比 对， 结 果 表 明 其 与 Bacillus subtilis strain BIHB332 的 16S rDNA 序列相似性最高， 为 99％， 为 Bacillus subtilis 的一个亚种， 将其命名为 ： Bacillus subtilis 6-7。
产物的定性检测 ： 采用气质联用 (GC-MS) 来鉴定产物中是否含有 2， 3-BDO。分别 测定 2， 3-BDO 标样 GC-MS 图谱， 发酵液用乙酸乙酯萃取后的 GC-MS 图谱， 并进行图谱分析， 确定转化液中是否含有 2， 3-BDO。
产物的定量检测 ： 用液相色谱法 (HPLC) 检测发酵液中产物 2， 3-BDO 的生成量
本发明的有益效果 ： 以从自然界土壤中筛选的菌株作为供试菌株， 将出发菌株在 斜面培养基上活化后， 接种于装有 50mL 种子培养基的 250mL 的三角瓶中， 37 ℃， 150r/min 的摇床上培养 7h， 然后按 5％接种量加入初始发酵培养基中， 37℃， 150r/min 的摇床上发酵 72h。收集发酵液， 离心， 取上清液以备检测 ； 取 2ml 上清液， 用 2ml 三氯乙酸去除蛋白， 离心 过有机膜， 用液相色谱法 (HPLC) 检测发酵液中 2， 3-BDO 含量。国内用微生物发酵法产 2， 3-BDO 还处于初级阶段， 本发明为微生物法发酵产 2， 3-BDO 奠定基础。
将较廉价底物葡萄糖转化成具有附加价值较高的 2， 3-BDO， 其是重要的化工原料 和医药中间体 ； 同时用微生物法生产 2， 3-BDO， 其较之化学生产法具有反应条件温和、 原料 利用率高、 产品纯度高及工艺简单、 易于控制等优点， 同时有利于环境保护， 易于推广应用。
附图说明
图 1 菌株 (Bacillus subtilis)6-7 电镜图片 图 22， 3-BDO 标准品 GC-MS 图谱 图 3 图 2 中 3.37min 处解图结果 图 4 图 2 中 3.55min 处解图结果图 56-7 以葡萄糖为底物 72h 发酵液的 GC-MS 图谱
图 6 图 5 中 3.37min 处解图结果
图 7 图 5 中 3.5min 处解图结果
图 82， 3-BDO 标准品 HPLC 图谱
图 96-7 以葡萄糖为底物 72h 发酵液 HPLC 图谱
具体实施方法
实施例 1 ： 菌株的筛选 ：
目的菌株的筛选 ： 将采集到的样品在种子培养基 ( 葡萄糖 20g/L， 酵母膏 5g/L， 蛋 白胨 10g/L， 氯化钠 10g/L pH 7.0) 中富集， 37℃ 150r/min 摇床 10h， 取不同稀释度稀释涂 布培养。挑单菌落在平板分离培养基 ( 酵母膏 5g/L， 蛋白胨 10g/L， 氯化钠 10g/L， 琼脂粉 18g/LpH 7.0) 上进行划线分离， 37℃培养 1d-2d， 镜检， 待试菌株保藏于斜面保藏培养基， 作初筛备用。
将用种子培养基培养到对数期的种子， 按 5％接种量加入到含有 15％葡萄糖的发 酵培养基中， 然后置于 37℃、 150r/min 条件下振荡培养 72h。 收集发酵液， 离心， 取上清液以 备检测。
实施例 2 ： 2， 3-BDO 定性检测 ：
取 2ml 上清液， 用 2ml 乙酸乙酯进行萃取， 然后采用气质联用 (GC-MS) 鉴定萃取液 中是否含有 2， 3-BDO。气质联用检测条件 ： 采用的色谱柱温控程序为 ： 首先在 60℃下保温 1min， 然后以 6℃ /min 的升温速率升至 90℃并保持 2min， 最后以 30℃ /min 的升温速率升至 180℃， 恒温 2min。进样口温度为 250℃， 进样量为 1μL， 载气为高纯氦气， 载气流量 1.2mL/ min， 检测器温度为 240℃ ；
TraceMS 质谱条件 ： EI+ 轰击源， 全扫描方式， 扫描质量范围为 30 ～ 500amu， 发射 电流为 200μA， 电子能量为 70eV， 质谱检测谱库为 NIRT98 谱库 ；
标准品 2， 3- 丁二醇标准品 GC-MS 图谱及解图结果如图 1、 图 2 和图 3 所示， 菌株发 酵液 GC-MS 图谱如图 5、 图 6 和图 7 所示。
实施例 3 ： 菌株的合成 2， 3- 丁二醇能力检测 ：
将实施例 1 获得的发酵液中 2， 3- 丁二醇含量采用液相色谱测定。Waters 液相色 谱仪， 糖柱 Sugarpakl(6.5mmid×300mm)) ； 柱温 ： 85 ℃ ； 流动相 ： 纯水， 流速 0.4ml/min ； 进 样量为 10μL ； 检测器 ： 示差折光检测器。不同构型的 2， 3-BDO 保留时间分别为 19.3min 和 22.5min。
2， 3-BDO 标准品 HPLC 图如图 6 所示， 6-7 以葡萄糖为底物 72h 发酵液 HPLC 图谱如 图 12 所示 ；
筛选到的一株枯草芽孢发酵 72h 后， 发酵液中葡萄糖留量为 1.5g/L 左右， 2， 3- 丁 二醇含量为 50g/L 左右。
实施例 4 ： 5L 发酵罐的初步放大实验 ：
将用种子培养基培养到对数期的种子， 按 5％接种量加入到含有葡萄糖为 15％发 酵培养基的发酵罐中， 发酵条件为温度 ： 37℃、 转速 ： 350r/min、 通气量 ： 1L/min， 发酵 72h。 收集发酵液， 离心， 取上清液测得 2， 3- 丁二醇含量为 61.7g/L。