羧酸酯酶的重组表达.pdf

羧酸酯酶的重组表达
    【技术领域】
     本发明涉及生物技术领域。背景技术 羧酸酯酶能够水解羧酸酯， 从而产生羧酸 ( 盐 ) 和醇。羧酸酯酶属于水解酶超家 族。已经在从原核细胞到真核细胞的多种物种中鉴定出了羧酸酯酶。
     发明内容 在一个方面中， 本公开内容提供了一种用于产生蛋白质的方法， 包括将经改造而 表达编码羧酸酯酶或其变体之基因的真核细胞在适于表达该羧酸酯酶或其变体的条件下 进行培养。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了一种用于产生蛋白质的方法， 包括将经改造 而表达编码微生物羧酸酯酶或其变体之基因的真核细胞在适于表达该微生物羧酸酯酶或 其变体的条件下进行培养。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了一种用于产生蛋白质的方法， 包括将经改造 而表达编码羧酸酯酶或其变体之基因的丝状真菌细胞在适于表达该羧酸酯酶或其变体的 条件下进行培养。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了表达载体， 其包含编码羧酸酯酶或其变体的 基因以及能促进该羧酸酯酶或其变体在真核细胞中表达的调节序列， 其中所述调节序列与 该基因可操纵地连接。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了包含表达载体的真核细胞， 所述表达载体包 含编码羧酸酯酶或其变体的基因以及能促进该羧酸酯酶或其变体在真核细胞中表达的调 节序列， 其中所述调节序列与该基因可操纵地连接。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了组合物， 其包含真核细胞以及该真核细胞所 表达的羧酸酯酶或其变体。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了组合物， 其包含丝状真菌细胞以及该丝状真 菌细胞所表达的羧酸酯酶或其变体。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了组合物， 其包含通过本公开内容的方法所产 生的分离的羧酸酯酶或其变体。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了使用本公开内容之组合物的方法。
     以上概述仅用于说明， 而并非旨在以任何方式进行限制。 除了上述说明的各方面、 实施方案和特征以外， 其它方面、 实施方案和特征在参考附图和下文的详细说明之后将是 很明显的。
     附图说明
     图 1 显示质粒 pIGF 的示意图。图 2 显示质粒 pYG1.2 的示意图。
     图 3 显示来自以下菌株的培养基凝胶电泳结果 ： 转化有 pYG1.2-CarE-his 的黑曲 霉 (Aspergillus niger)M54(L2) ； 转化有 pYG1.2 的黑曲霉 M54(L3) ； 以及未转化的黑曲霉 M54(L4)。蛋白分子量标志物示于 L1。L2 中所示的约 29.0KD 的条带是羧酸酯酶的条带。
     图 4 显 示 以 下 菌 株 所 表 达 的 羧 酸 酯 酶 的 Western 印 迹 结 果 ： 转化有 pPIC9K-CarE-His 的 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 (Pichia pastoris)GS115(L4) ； 以及转化有 pYG1.2-CarE-His 的黑曲霉 M54(L5)。 在以下阴性对照中未检测到羧酸酯酶的表达 ： 转化有 pPIC9K 的巴斯德毕赤酵母 GS115(L3) ； 未转化的黑曲霉 M54(L6) ； 转化有 pYG1.2 的黑曲霉 M54(L7)。阳性对照 ( 含有 His 标签的蛋白质 ) 示于 L1， 蛋白标志物示于 L2。
     图 5 显示转化有 pPIC9K-CarE-His 的巴斯德毕赤酵母 GS115 所表达羧酸酯酶的凝 胶电泳结果， 其中在培养 24 小时 (L3)、 48 小时 (L4) 和 72 小时 (L5) 后采样。蛋白标志物 示于 L1， 转化有 pPIC9K 的巴斯德毕赤酵母 GS115 的培养基示于 L2。
     图 6 显示在培养的不同时间点从培养基中分离的羧酸酯酶的酶活性。
     图 7 显示在不同 pH 值下测量的重组羧酸酯酶的相对酶活性。
     图 8 显示在以不同温度将羧酸酯酶处理 10 或 30 分钟后在 37℃下测量的重组羧酸 酯酶的相对酶活性。
     图 9 显示在不同温度下测量的重组羧酸酯酶的相对酶活性。具体实施方案
     在下文的详细描述中， 将参考构成本文一部分的附图。 在附图中， 相似的符号一般 指代相似的部分， 除非其上下文有其他明确表述。 在具体实施方案、 附图和权利要求中描述 的说明性实施方案并无限制之意。 可以利用其他实施方案、 进行其他改动， 而不偏离本文之 主题的构思或范围。
     本公开内容涉及用于产生羧酸酯酶及其变体的重组方法、 可用于重组产生羧酸酯 酶及其变体的表达载体和宿主细胞。 本公开内容还涉及包含所述重组产生的羧酸酯酶及其 变体的组合物以及使用该组合物的方法。
     在一个方面中， 本公开内容提供了一种用于产生蛋白质的方法， 所述方法包括将 经改造而表达编码羧酸酯酶或其变体之基因的真核细胞在适于表达该羧酸酯酶或其变体 的条件下进行培养。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了一种用于产生蛋白质的方法， 所述方法包括 将经改造而表达编码羧酸酯酶或其变体之基因的丝状真菌细胞在适于表达该羧酸酯酶或 其变体的条件下进行培养。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了一种用于产生蛋白质的方法， 所述方法包括 将经改造而表达编码微生物羧酸酯酶或其变体之基因的真核细胞在适于表达该微生物羧 酸酯酶或其变体的条件下进行培养。
     在某些实施方案中， 该方法还可包括从真核细胞培养物中分离所述羧酸酯酶或其 变体。在某些实施方案中， 该方法还可包括将含有编码羧酸酯酶或其变体之基因的表达载 体引入所述真核细胞中。
     真核细胞真核细胞是组织成包裹在膜中的复杂结构 ( 尤其包括含有遗传物质的与膜结合 的核 ) 的细胞。本公开内容的真核细胞包括但不限于真菌细胞、 原生生物细胞、 动物细胞和 植物细胞。
     真菌细胞可包括但不限于酵母细胞和丝状真菌细胞。
     本公开内容的酵母细胞可根据其系统发生特征而归为子囊真菌亚门 (Ascomycota) 和担子真菌亚门 (Basidiomycota)。酵母细胞的说明性实例包括但不仅 限于毕赤酵母属物种如安格斯毕赤酵母 (Pichia angusta)、 巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)、 异 常 毕 赤 酵 母 (Pichia anomala)、 树 干 毕 赤 酵 母 (Pichia stipitis)、 甲 醇 毕 赤 酵 母 (Pichia methanolica) 和 季 也 蒙 毕 赤 酵 母 (Pichia guilliermondii) ； 汉 逊 酵 母 属 (Hansenula) 物 种 如 异 常 汉 逊 酵 母 (Hansenula anomala)、 多形汉逊酵母 (Hansenulapolymorpha)、 温奇汉逊酵母 (Hansenula wingei)、 杰丁汉逊酵母 (Hansenula jadinii) 和 土 星 汉 逊 酵 母 (Hansenula saturnus) ； 酵 母 属 (Saccharomyces) 如 酿 酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae)、贝 酵 母 (Saccharomyces bayanus)、布 拉 酵 母 (Saccharomyces boulardii) ； 假 丝 酵 母 属 (Candida) 物 种 如 白 假 丝 酵 母 (Candida albicans)、 Candidamethylica、 波 氏 假 丝 酵 母 (Candida boidinii)、 热带假丝酵母 (Candidatropicalis)、 Candida wickerhamii、 麦芽糖假丝酵母 (Candida maltosa) 和光滑 假丝酵母 (Candida glabrata)、 光滑球拟酵母 (Torulopsis glabrata) ； 以及克鲁维酵母菌 属 (Kluyveromyces) 物种和裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces) 物种。
     在一些实施方案中， 所述酵母细胞为巴斯德毕赤酵母、 多形汉逊酵母、 酿酒酵母或 光滑球拟酵母中的一种或多种。在一些实施方案中， 所述酵母细胞为巴斯德毕赤酵母。在 一些实施方案中， 所述酵母细胞为巴斯德毕赤酵母菌株 GS115 细胞、 巴斯德毕赤酵母菌株 KM71 细胞或巴斯德毕赤酵母菌株 MC100-3 细胞中的一种或多种。在一些实施方案中， 所述 酵母细胞为多形汉逊酵母菌株 ATCC34438 细胞。
     丝状真菌可包括但不仅限于以多细胞丝的形式生长的任何微小真菌 (microscopic fungi) 物 种。 在 一 些 实 施 方 案 中， 所述丝状真菌细胞包括但不仅限 于 支 顶 孢 属 (Acremonium)、 曲 霉 属 (Aspergillus)、 镰 刀 菌 属 (Fusarium)、 腐质霉属 (Humicola)、 毛 霉 属 (Mucor)、 毁 丝 霉 属 (Myceliophthora)、 链 孢 霉 属 (Neurospora)、 青 霉 属 (Penicillium)、 梭 孢 壳 菌 属 (Thielavia)、 弯 颈 霉 属 (Tolypocladium) 和 木 霉 属 (Trichoderma) 中的多个物种。
     在一些实施方案中， 所述丝状真菌细胞为泡盛曲霉 (Aspergillusawamori)、 臭曲 霉 (Aspergillus foetidus)、 日本曲霉 (Aspergillusjaponicus)、 构巢曲霉 (Aspergillus nidulans)、 黑曲霉 (Aspergillus niger) 或米曲霉 (Aspergillus oryzae) 细胞。在一个 说明性实施方案中， 所述丝状真菌细胞为黑曲霉 ATCC 12049 菌株细胞。在另一个说明性实 施方案中， 所述丝状真菌细胞为米曲霉 RIB40 菌株细胞。
     原生生物细胞可包括但不仅限于原生动物细胞和藻类细胞。
     动物细胞可包括但不仅限于哺乳动物细胞、 鸟类细胞、 两栖类细胞和昆虫细 胞。动物细胞的说明性实例包括猪肝细胞、 人胚肾 293(HEK293) 细胞、 中国仓鼠卵巢细 胞 (CHO)、 斑 马 鱼 PAC2 细 胞、 非 洲 爪 蟾 (Xenopuslaevis)A6 肾 上 皮 细 胞、 秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditis elegans) 细胞和果蝇细胞。植物细胞可包括但不限于薄壁组织细胞、 厚角细胞和厚壁组织细胞。植物细胞的 说明性实例为烟草 BY-2 细胞、 毛曼陀罗 (Datura innoxia) 细胞系和 SB-1 细胞系。
     在一些实施方案中， 本公开内容的真核细胞可带有导致与野生型菌株相比发 生表型改变的一种或多种突变。真核细胞中的突变可以是天然或非天然的。天然突变 可在进化过程中自发形成。非天然突变可以使用本领域已知方法人工产生。在一个说 明性实例中， 可以通过使细胞接触物理诱变剂 ( 如 UV 照射 ) 或化学诱变剂 ( 如羟胺和 溴化乙锭 ) 来产生突变 ( 参阅如 Hopwood， The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology(J.R.Norris 和 D.W.Ribbons 编 辑 )1970， 363-433， Academic Press， New York)。在另一个说明性实例中， 可通过基因缺失技术 ( 如同源重组 ) 来产生突变， 以破 坏一种或多种靶基因的表达 ( 参阅如 Alberts 等， Chapter 5 ： DNAReplication， Repair， and Recombination， Molecular biology of the cell， 2002， 845， Garland Science. New York)。 在 另 一 个 说 明 性 实 例 中， 可以通过基因修饰技术 ( 如聚合酶链式反应 (PCR)) 来产生突变 ( 参阅如 Botstein 等， Strategies and applications of in vitro mutagenesis， Science 1985， vol 229， No.4719， 1193-1201 ； Lo 等， Specific amino acid substitutions in bacterioopsin ： Replacement of a restriction fragment in the structural gene by syntheticDNA fragments containing altered codons， Proc.Natl. Acad.Sci.USA 1985， vol 81， No.8， 2285-2289 ； Youngman 等， Genetic transposition and insertionalmutagenesis in Bacillus subtilis with Streptococcus faecalis transposon Tn917， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1983， vol 80， No.8， 2305-2309)。 在一些实施方案中， 本公开内容的真核细胞可带有使其无法合成细胞生长所必需 物质的一种或多种突变。 突变可发生在参与氨基酸、 核苷酸、 糖、 脂肪酸、 维生素和其它必需 物质的合成和 / 或代谢的基因中。
     在一些实施方案中， 所述真核细胞可以是突变体酵母细胞， 其在分别参与尿苷、 色 氨酸、 腺苷和亮氨酸合成的 ura、 trp、 ade 和 leu 基因中带有突变 (Agaphonov 等， Isolation and characterization of the LEU2 gene ofHansenula polymorpha， Yeast 1994， vol 10， 509-513 ； Bogdanova 等， Plasmideorganization during integrative transformation in Hansenula polymorpha， Yeast 1995， vol 11， 343-353 ； Merckelbach 等， Cloning and sequencing of theura3 locus of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha and its use forthe generation of a deletion by gene replacement， Appl.Microbiol. Biotechnol.1993， vol 40， 361-364)。
     在 一 些实 施方案中， 所述真 核细胞可以 是缺 失 pyrG 基因 功能 的突 变体丝 状 真菌细胞 ( 例如黑曲霉菌株 )， 它们无法合成尿苷， 因此不能在无尿苷的培养基上生长 (Liu 等， Construction of pyrG auxotrophic Aspergillusniger strain， Journal of microbiology 2001， vol 21， No.3， 15-16)。在一个说明性实施方案中， 所述真核细胞是黑 曲霉 M54， 该菌株在 2009 年 6 月 14 日按照 《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩 斯条约》 ( 布达佩斯条约 ) 的规定和条件保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 保藏号为 CCTCC M 209121。
     在 另 一 个 说 明 性 实 施 方 案 中， 所述真核细胞是营养缺陷型米曲霉突变体菌 株， 例 如 缺 失 argB 基 因 的 米 曲 霉 M-2-3， 该 菌 株 无 法 合 成 精 氨 酸， 因此不能在无精氨
     酸 的 培 养 基 上 生 长 (Gomi 等， Integrative transformation ofAspergillus oryzae with a plasmid containing the Aspergillus nidulans argBgene.Agric Biol Chem.1987， vol 51， 2549-2555)， 还例如缺失 niaD 基因的米曲霉， 其缺少硝酸还原酶， 因 此无法在以硝酸盐作为唯一氮源的培养基上生长 (Unkles 等， The development of a homologous transformation systemfor Aspergillus oryzae based on the nitrate assimilation pathway ： Aconvenient and general selection system for filamentous fungaltransformation， Molecular and General Genetics1989， vol 218， No.1， 99-104)。
     羧酸酯酶及其变体
     本文使用的术语 “羧酸酯酶” 指能将羧酸酯水解成羧酸 ( 盐 ) 和醇的酶多肽。羧 酸酯酶可以是野生型羧酸酯酶或其任何变体。野生型羧酸酯酶的变体与野生型羧酸酯酶 的氨基酸序列和 / 或氨基酸修饰不同， 但仍有将羧酸酯水解成羧酸 ( 盐 ) 和醇的能力。变 体可具有野生型羧酸酯酶的一个或多个氨基酸替换、 添加、 缺失、 插入、 截短、 修饰 ( 如磷酸 化、 糖基化、 标记等 ) 或其任何组合。变体可包括野生型羧酸酯酶的天然变体以及人工多肽 序列， 例如通过化学合成或重组方法获得的多肽序列。 变体可包括野生型羧酸酯酶的片段、 突变体、 杂合体、 类似物和衍生物。变体可含有非天然氨基酸残基。 已经从大量物种 ( 包括但不仅限于动物、 昆虫、 植物和微生物 ) 中鉴定和分离了羧 酸酯酶。已经鉴定了来自许多物种的羧酸酯酶的核苷酸序列和氨基酸序列。
     在一个实施方案中， 所述羧酸酯酶来自微生物。术语 “微生物” 指除人、 动物和植 物以外的任何有生命的生物。微生物可包括但不限于原核生物如细菌、 原生动物、 真菌、 原 生生物和古细菌。微生物的说明性实例为大肠杆菌 (Escherichia coli)、 嗜热脂肪地芽孢 杆菌 (Geobacillusstearothermophilus)、 蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus)、 皱褶假丝酵 母 (Candida rugosa)、 恶性疟原虫 (Plasmodium falciparum)、 激烈火球菌 (Pyrococcus furiosus)、 肠道沙门氏菌 (Salmonella enterica) 和烟曲霉 (Aspergillus fumigatus)。
     已经从许多微生物中分离了羧酸酯酶， 并获得了其相应的核苷酸序列和氨基酸序 列。表 1 列出了微生物羧酸酯酶的说明性实例以及以 GenBank 登记号标明的其核苷酸及多 肽序列。
     表 1. 不同微生物的羧酸酯酶的说明性实例
     物种GenBank 氨基酸序列登 记号 BAD77330 (SEQ ID NO ： 1)GenBank 核苷酸序列登 记号 BA000043， 区域 ： 3067043..3067783 (SEQ ID NO ： 2)嗜热地芽孢杆菌 (Geob acillus kaustophilus) 高温烷烃芽孢杆菌 (Geobacillus thermoleovorans)AAG53982 (SEQ ID NO ： 3)AF327065 (SEQ ID NO ： 4)7101993861 A CN 101993865说明书NC_011294， 区域 ： 3548658..3549428 (SEQ ID NO ： 6) XM_750091 (SEQ ID NO ： 8)6/62 页肠道沙门氏菌 (Salmonella enterica)YP_002245400 (SEQ ID NO ： 5)烟曲霉XP_755184 (SEQ ID NO ： 7)
     在一个实施方案中， 所述羧酸酯酶来自细菌。细菌的说明性实例为大肠杆菌、 嗜 热脂肪地芽孢杆菌 (Geobacillus stearothermophilus)、 嗜热地芽孢杆菌、 硫矿硫化叶菌 (Sulfolobus solfataricus) 和高温烷烃芽孢杆菌。在另一个实施方案中， 所述羧酸酯酶 来自嗜热菌。 嗜热菌的说明性实例为嗜热脂肪地芽孢杆菌、 嗜热地芽孢杆菌、 硫矿硫化叶菌 和高温烷烃芽孢杆菌。在另一个实施方案中， 所述羧酸酯酶来自嗜热脂肪地芽孢杆菌。在 一些实施方案中， 所述羧酸酯酶或其变体与自嗜热脂肪地芽孢杆菌分离的羧酸酯酶的氨基 酸序列具有至少 70％的序列同一性。已经从嗜热脂肪地芽孢杆菌中鉴定了四种羧酸酯酶。 这四种羧酸酯酶的氨基酸序列和核苷酸序列以 SEQ ID NO ： 9-16 示于下文表 2 中。
     表 2. 嗜热脂肪地芽孢杆菌的羧酸酯酶的说明性实例物种 GenBank 氨基酸序 列登记号 AAN81911 (SEQ ID NO ： 9) GenBank 核苷酸序列登记号嗜热脂肪地芽孢杆 菌
     AY186197.1， 区域 ： 1742...2485 (SEQ ID NO ： 10)此外， 表 3 列出了来自动物、 昆虫和植物的羧酸酯酶的一些说明性实例， 及其相应 核苷酸及氨基酸序列的 GenBank 登记号
     表 3. 不同物种的羧酸酯酶的说明性实例
     可以通过对野生型羧酸酯酶进行保守性替换来产生羧酸酯酶变体， 其中替换氨基 酸具有与天然氨基酸相似的结构或化学特性， 例如在残基的极性、 电荷、 溶解度、 疏水性、 亲 水性和 / 或两亲性方面具有相似性。还可以通过对野生型羧酸酯酶的氨基酸序列进行非 保守性替换或其它改变来产生变体， 只要该变体保留羧酸酯酶活性即可。关于有哪些以及 有多少氨基酸残基可以进行替换、 插入或缺失而不消除功能或生物活性方面的指导可以使
     用本领域所熟知的计算机软件来获得， 例如 STAR 软件 ( 参阅 Bauer 等， STAR ： predicting recombination sites from aminoacid sequence， BMC Bioinformatics， 2006， vol 7， 437)。
     在一些实施方案中， 本公开内容提供了与 SEQ ID NO ： 9、 11、 13 和 15 所示羧酸酯 酶的氨基酸序列中的一种或多种具有至少 70％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％氨基酸序列同一性的羧酸酯酶及其变体。
     就本文所述羧酸酯酶多肽序列而言， “百分比 ( ％ ) 氨基酸序列同一性” 定义为 候选序列中与特定羧酸酯酶多肽序列之氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比， 这在比对 序列并在必要时引入缺口以达到最高百分比序列同一性之后进行， 并且不把任何保守性替 换认为是序列同一性的一部分。为确定百分比氨基酸序列同一性而进行的比对可通过本 领域中的多种方式来实现， 例如使用公众可用的计算机软件如 BLAST、 BLAST-2、 ALIGN 或 Megalign(DNASTAR) 软件。 本领域技术人员能够确定用于测量比对的合适参数， 包括在所比 较序列的全长上实现最高比对所需的任何算法。
     在一些实施方案中， 本公开内容提供了编码羧酸酯酶或其变体的核苷酸序列， 其 与 SEQ ID NO ： 10、 12、 14 和 16 所示羧酸酯酶核苷酸序列中的一种或多种具有至少 70％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％核苷酸序列同一性。 就本文所述羧酸酯酶编码核苷酸序列而言， “核苷酸序列同一性百分比 (％ )” 定 义为候选序列中与目的羧酸酯酶核苷酸序列之核苷酸相同的核苷酸的百分比， 这在比对序 列并在必要时引入缺口以达到最高序列同一性百分比之后进行。 为确定核苷酸序列同一性 百分比而进行的比对可通过本领域中的多种方式来实现， 例如使用公众可用的计算机软件 如 BLAST、 BLAST-2、 ALIGN 或 Megalign(DNASTAR) 软件。
     在 一 个 实 施 方 案 中， 可 以 使 用 序 列 比 较 程 序 NCBI-BLAST2 来 测 定 氨 基 酸 序 列 同 一 性 百 分 比 和 核 苷 酸 序 列 同 一 性 百 分 比 (Altschul 等， Nucleic Acids Res.25 ： 3389-3402(1997))。 NCBI-BLAST2 序列比较程序可从 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 下载。 NCBI-BLAST2 使用若干检索参数， 其中所有这些检索参数均设置成默认值， 包括如 unmask ＝ yes， strand ＝ all， expected occurrences ＝ 10， minimum low complexitylength ＝ 15/5， multi-pass e-value ＝ 0.01， constant for multi-pass ＝ 25， dropoff for final gapped alignment ＝ 25 以及 scoringmatrix ＝ BLOSUM62。在使用 NCBI-BLAST2 进行氨基 酸 ( 或核苷酸 ) 序列比较的情况下， 给定氨基酸序列 A( 或给定核苷酸序列 A) 相对于给定氨 基酸序列 B( 或给定核苷酸序列 B)( 或者也可将其称为相对于给定氨基酸序列 B( 或给定核 苷酸序列 B) 而言具有一定氨基酸 ( 或核苷酸 ) 序列同一性百分比的给定氨基酸序列 A( 或 给定核苷酸序列 A)) 的氨基酸 ( 或核苷酸 ) 序列同一性百分比按如下进行计算 ： 100 乘以 分数 X/Y， 其中 X 是在 A 与 B 的程序比对中被序列比对程序 NCBI-BLAST2 评定为相同匹配物 的氨基酸 ( 或核苷酸 ) 的数目， Y 是 B 中氨基酸 ( 或核苷酸 ) 残基的总数。显然， 当序列 A 的长度与序列 B 的长度不等时， A 相对于 B 的序列同一性百分比并不等于 B 相对于 A 的序 列同一性百分比。
     在另一实施方案中， 还可如下所述通过使用 WU-BLAST-2 计算机程序来获得氨基 酸序列同一性百分比和核苷酸序列同一性百分比 (Altschul 等， Methods in Enzymology 266 ： 460-480(1996))。 所有 WU-BLAST-2 检索参数均设置成默认值。 当使用 WU-BLAST-2 时，
     给定氨基酸序列 A( 或核苷酸序列 A) 相对于给定氨基酸序列 B( 或给定核苷酸序列 B) 的氨 基酸 ( 或核苷酸 ) 序列同一性百分比按如下进行测定 ： 用 (a) 通过 WU-BLAST-2 测得的序列 A 与序列 B 之间匹配的相同氨基酸 ( 或核苷酸 ) 残基数除以 (b) 序列 B 的总残基数， 并 (c) 乘以 100。
     在一些实施方案中， 本公开内容提供了热稳定的羧酸酯酶。 本文使用的术语 “热稳 定的羧酸酯酶” 指在与等于或高于约 40℃的高温接触一段时间后能够保持水解羧酸酯基团 的可检测酶活性的羧酸酯酶。羧酸酯酶的酶活性可使用本领域已知的任何方法进行检测， 例如， 通过测量在给定的一组反应条件下底物的消失或者产物的形成。检测羧酸酯酶酶活 性的示例性方法为分光光度法、 放射性测量法、 比色法或基于高效液相色谱的方法。 羧酸酯 酶底物的说明性实例为乙酸萘酯 (NA)、 乙酸对硝基苯酯 (p-NPA)、 硫代丁酸甲酯 (MtB) 或 14C 标记的酯。可以使用相同的方法在相同条件下 ( 但无羧酸酯酶 ) 测量对照酶活性。如果羧 酸酯酶酶活性的数值高于对照酶活性的， 则认为它是可检测的。
     在一些实施方案中， 所述高温为约 40℃至约 100℃， 或者约 50℃至约 90℃， 或者约 50℃至约 70℃。 在一些实施方案中， 所述高温为约 50℃、 约 55℃、 约 60℃、 约 65℃、 约 70℃、 约 75℃、 约 80℃、 约 85℃或约 90℃。羧酸酯酶可接触所述高温的接触时间可由本领域技术 人员来确定。在一些实施方案中， 所述接触时间高达 10 分钟、 30 分钟、 1 小时、 2 小时、 3小 时、 4 小时、 5 小时、 6 小时、 12 小时、 1 天、 2 天、 3 天、 4 天、 5 天、 6 天、 7 天、 8 天、 9 天或 10 天。 在一些实施方案中， 所述接触时间为 30 分钟至 10 天， 或者 30 分钟至 5 天， 或者 30 分钟至 1 天， 或者 30 分钟至 6 小时， 或者 30 分钟至 2 小时、 1 小时至 2 小时或者 10 分钟至 30 分钟。 在一些实施方案中， 本公开内容提供了嗜热脂肪地芽孢杆菌的热稳定羧酸酯酶， 其具有 SEQ ID NO ： 9、 11、 13 和 15 所示的氨基酸序列。如图 8 所示， SEQ ID NO ： 9 的热稳定 羧酸酯酶的酶活性在该酶已与高温接触一段时间 ( 例如但不限于与 40℃、 50℃、 60℃、 70℃ 和 80℃分别接触 10 分钟或 30 分钟 ) 后仍可检测到。还测量了接触 37℃并在该温度下测 试的羧酸酯酶的酶活性作为标准参照。 样品和标准参照在其他方面均相同的条件下测试和 测量。与 60℃接触 10 分钟后， 该羧酸酯酶的酶活性可以为标准参照的将近 100％。与 70℃ 接触 30 分钟后， 该羧酸酯酶的酶活性可以为标准参照的 60％以上。
     表达载体和宿主细胞
     在一个方面中， 本公开内容提供了经改造而表达编码羧酸酯或其变体之基因的真 核细胞。
     本文使用的术语 “表达” 包括羧酸酯酶的产生中所涉及的一个或多个步骤， 包括但 不仅限于转录、 转录后修饰、 翻译、 翻译后修饰和分泌。本文使用的术语 “经改造而表达” 指 以宿主细胞中非天然的方式使该宿主细胞能够表达羧酸酯酶或其变体的一个或多个步骤。 在一些实施方案中， 术语 “经改造而表达” 包括将编码羧酸酯酶或其变体的外源基因引入宿 主细胞以在该宿主细胞中表达羧酸酯酶或其变体的一个或多个步骤。在一些实施方案中， 通过使宿主细胞接触诱变剂来改造该宿主细胞而使其表达突变的羧酸酯酶或者带有突变 的调节序列的羧酸酯酶。
     本文使用的术语 “基因” 指含有编码肽或多肽之信息的多聚核糖核苷酸或多聚脱 氧核糖核苷酸或者混合的多聚核糖核苷酸 - 多聚脱氧核糖核苷酸。其包括单链和双链的分 子， 即 DNA-DNA、 DNA-RNA 和 RNA-RNA 杂交体， 以及通过将碱基缀合到氨基酸骨架上形成的
     “蛋白质核酸” (protein nucleic acid， PNA)。基因包括天然多核苷酸或者由天然碱基或修 饰碱基形成的合成多核苷酸。术语 “基因” 还涵盖结构基因的编码区和位于 5′和 3′末端 编码区附近的用于 RNA 或多肽的转录或翻译的序列， 以及各个编码区段 ( 外显子 ) 之间的 间插序列 ( 内含子 )。
     术语 “肽” 或 “多肽” 指通过肽键或修饰的肽键彼此连接的氨基酸 ( 即， 在后一情况 下为肽的等构物 )， 并可含有除 20 种天然氨基酸以外的修饰氨基酸。术语 “肽” 或 “多肽” 还包括肽或多肽的片段、 基序等， 糖基化的肽或多肽， 以及其他修饰的肽或多肽。
     本文使用的术语 “编码” 指能够被转录成 mRNA 和 / 或翻译成肽或蛋白质。
     在一些实施方案中， 将编码羧酸酯酶或其变体的基因插入表达载体中， 以由宿主 细胞进行表达。
     本文使用的术语 “表达载体” 指核苷酸运载体， 其中可操纵地插入了编码肽或蛋白 质的基因， 从而可以表达所编码的肽或蛋白质。在一些实施方案中， 通过将编码羧酸酯酶 或其变体的基因插入到适于在真核细胞中表达的重组载体中来形成表达载体。 可用于构建 表达载体的核苷酸运载体的说明性实例包括但不限于质粒、 噬菌粒、 粘粒、 人工染色体 ( 如 酵母人工染色体、 细菌人工染色体或 P1 衍生的人工染色体 )、 噬菌体 ( 如 λ 噬菌体或 M13 噬菌体 )、 动物病毒 ( 如逆转录病毒、 腺病毒或乳多空病毒 ) 以及植物病毒 ( 如马铃薯 X 病 毒 )。许多真核表达载体以商品提供。对合适表达载体的选择在本领域技术人员的能力之 内。 在一些实施方案中， 所述表达载体是适于在酵母细胞中表达的载体。说明性实 例 为 pPIC3K(Invitrogen， Carlsbad， CA)、 pPIC9K(Invitrogen)、 pAO815(Invitrogen)、 pGAPZ(Invitrogen)、 pYC2/CT(Invitrogen)、 pYD1 酵母展示载体 (Invitrogen)、 pESC 载体 (Stratagene， La Jolla， CA)、 pESC-HIS 载体 (Stratagene) 和 pHIPX4(Gietl 等， Mutational analysis of theN-terminal topgenic signal of watermelon glyoxysomal malate dehydrogenaseusing the heterologous host Hansenula polymorpha.Proc.Natl.Acad. Sci.USA 1994， vol 91， 3151-3155)。在一些实施方案中， 所述表达载体是适于在酵母细胞 中表达的质粒。 在一些实施方案中， 所述表达载体是适于在巴斯德毕赤酵母中表达的质粒。 在一些实施方案中， 所述表达载体是 pPIC9K。
     在一些实施方案中， 所述表达载体是适于在丝状真菌细胞中表达的载体。说明性 实例为 pPTR(TaKaRa Bio Inc.， Shiga， Japan)、 pDG1(ATCC 目录号 53005)、 pAB366(ATCC 目 录 号 77134)、 pAB520(ATCC 目 录 号 77137)、质 粒 pYG1.2(Liu 等， Construction of recombinant expressionplasmid for Aspergillus niger ， Journal of Tongji University(Medical science)2001， vol 22， 1-3)、 pTAex3(Sakuradani 等， D6-Fatty acid desaturase from anarachidonic acid-producing Mortierella fungus Gene cloning and itsheterologous expression in a fungus， Aspergillus， Gene 1999， vol 238， 445-453)、 pSa123(Gomi 等， Integrative transformation of Aspergillus oryzaewith a plasmid containing the Aspergillus nidulans argB gene， Agric.Biol.Chem.1987， vol 51， 2549-2555)、 pNAN8142(Hiroyuki 等， Expression ofAspergillus oryzae Phytase Gene in Aspergillus oryzae RIB40 niaD， Journalof bioscience and bioengineering， 2006， Vol 102， No.6， 564-567)。在一些实施方案中， 所述表达载体是适于在丝状真菌细胞
     中表达的质粒。在一些实施方案中， 所述表达载体是适于在黑曲霉中表达的质粒。在一些 实施方案中， 所述表达载体是 pYG1.2。含有 pYG1.2 质粒的大肠杆菌 DH5α 菌株 ( 大肠杆菌 DH5α/pYG1.2) 在 2009 年 7 月 27 日按照布达佩斯条约的规定和条件保藏于中国武汉大学 的中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 保藏号为 CCTCC M 209165。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了表达载体， 其包含编码来自微生物的羧酸酯 酶或其变体的基因以及能促进该羧酸酯酶或其变体在真核细胞中表达的调节序列， 其中所 述调节序列与该基因可操纵地连接。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了表达载体， 其包含编码羧酸酯酶或其变体的 基因以及能促进该羧酸酯酶或其变体在丝状真菌细胞中表达的调节序列， 其中所述调节序 列与该基因可操纵地连接。
     在一些实施方案中， 所述羧酸酯酶或其变体的氨基酸序列与 SEQ IDNO ： 9、 11、 13 或 15 的氨基酸序列具有至少 70％的序列同一性。 在一些实施方案中， 所述羧酸酯酶或其变 体的氨基酸序列与 SEQ ID NO ： 9、 11、 13 或 15 的氨基酸序列具有至少 90％的序列同一性。 在一些实施方案中， 所述羧酸酯酶或其变体的核苷酸序列与 SEQ ID NO ： 10、 12、 14 或 16 的 核苷酸序列具有至少 70％的序列同一性。在一些实施方案中， 所述羧酸酯酶或其变体的核 苷酸序列与 SEQ ID NO ： 10、 12、 14 或 16 的核苷酸序列具有至少 90％的序列同一性。
     术语 “调节序列” 包括对于表达本公开内容的羧酸酯酶或其变体而言是必要或有 利的任何组分。 这些调节序列可包括但不限于启动子序列、 转录终止子、 前导序列和多腺苷 酸化序列。术语 “可操纵连接” 指基因序列以允许编码羧酸酯酶或其变体之基因表达的方 式与一个或多个调节序列直接或间接地连接或关联。 所述基因编码序列和所述一个或多个 调节序列可位于同一多核苷酸分子上， 并以允许编码羧酸酯酶或其变体之基因表达的方式 定位。所述基因编码序列和所述一个或多个调节序列可位于不同的多核苷酸分子上， 但该 调节序列能够发挥功能来影响编码羧酸酯酶或其变体之基因的表达。
     所述调节序列可含有适当的启动子序列。 本文使用的 “启动子序列” 指控制与其可 操纵连接的 DNA 序列转录的 DNA 区段。启动子序列包括足以进行 RNA 聚合酶的识别、 结合 和转录起始的特定序列。此外， 启动子序列可包括调节 RNA 聚合酶的这种识别、 结合和转录 起始活性的序列。这些序列可影响同一分子或不同分子上的转录。启动子序列的功能 ( 根 据调节的性质 ) 可以是组成型的， 或者可由刺激诱导。适于在真核细胞中进行转录控制的 任何启动子序列均可使用。在一些实施方案中， 所述启动子序列适于在酵母细胞和 / 或丝 状真菌细胞中进行转录控制。酵母细胞中合适的启动子序列的说明性实例为 TEF 启动子、 CYC 启动子、 ADH1 启动子、 3- 磷酸甘油激酶启动子、 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 (GAFDH 或 GAP) 启动子、 半乳糖激酶 (GAL1) 启动子、 半乳糖差向异构酶启动子和醇脱氢酶 (ADH1) 启动子。 丝状真菌细胞中合适的启动子序列的说明性实例为 α- 淀粉酶启动子、 葡萄糖淀粉酶启动 子、 醇脱氢酶启动子 (Kinghorn 等， Applied moleculargenetics of filamentous fungi， Springer press， 1992， 第 18 页 )。 在一些实施方案中， 所述启动子为诱导型启动子， 该启动 子能够应答于化学或物理刺激而开启或关闭羧酸酯酶的表达。 诱导型启动子的说明性实例 为 AOX1 启动子 ( 可由甲醇诱导 )、 GAL1 启动子 ( 可由半乳糖诱导 )、 CUP 启动子 ( 可由 Cu2+ 诱导 )(Wei Xiao， Yeast protocols， 第二版， Humana Press， 2005， p320) 和 alc A 启动子 ( 可由醇诱导 )。调节序列可含有适当的转录终止子序列， 该序列是被真核细胞 RNA 聚合酶识别以 终止转录的序列。终止子序列可与编码羧酸酯酶或其变体之核苷酸序列的 3′端可操纵地 连接。可在真核细胞中发挥功能的任何终止子序列均可用于本公开内容。在一些实施方案 中， 终止子序列可以是在酵母细胞或丝状真菌细胞中具有转录终止活性的核苷酸序列。
     调节序列还可含有适当的前导序列， 该序列是对于真核细胞的翻译具有重要性的 mRNA 非翻译区。前导序列可与编码羧酸酯酶或其变体之核苷酸序列的 5′端可操纵地连 接。可在真核细胞中发挥功能的任何前导序列均可用于本公开内容。在一些实施方案中， 前导序列可以是可在酵母细胞或丝状真菌细胞中发挥功能的核苷酸序列。
     调节序列还可含有多聚腺苷酸化序列， 这是可与羧酸酯酶基因序列的 3′端可操 纵连接的序列， 其在转录时被真核细胞识别成向所转录的 mRNA 添加多聚腺苷酸残基的信 号。可在真核细胞中发挥功能的任何多聚腺苷酸化序列均可用于本公开内容。在一些实施 方案中， 所述多聚腺苷酸化序列可在酵母细胞或丝状真菌细胞中发挥功能。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了表达载体， 其任选地还包含用于选择性鉴定 该表达载体的标志物基因。标志物基因是编码蛋白质的基因， 所述蛋白质可作为用于鉴定 包含该基因之细胞的选择标志物。 典型的标志物基因编码具有一个或多个以下特征的蛋白 质： i) 赋予对抗生素或其他有毒物质 ( 如氨苄青霉素、 新霉素、 氨甲喋呤等 ) 的抗性 ； ii) 对 营养缺陷进行回补 (complement) ； 以及 iii) 提供无法从培养基中获得的必要养分。 标志物 基因可以为诱导型或非诱导型的， 并且一般允许进行阳性选择。用于酵母宿主细胞的合适 标志物基因包括但不限于 Ade2、 His3、 Leu2、 Lys2、 Met3、 Trp1、 Ura3 以及新霉素或卡那霉素 或氨苄青霉素抗性基因。用于丝状真菌宿主细胞的合适标志物基因包括但不限于 amdS( 乙 酰胺酶 )、 argB( 鸟氨酸氨甲酰基转移酶 )、 bar( 膦丝菌素乙酰转移酶 )、 hygB( 潮霉素磷 酸转移酶 )、 niaD( 硝酸还原酶 )、 pyrG( 乳清苷 -5′ - 磷酸脱羧酶 )、 sC( 硫酸腺苷酰转移 酶 )、 trpC( 氨基苯甲酸合成酶 ) 以及它们的等同物。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了一种产生羧酸酯酶或其变体的方法， 其中所 表达的羧酸酯酶或其变体分泌到真核细胞的外面。在一些实施方案中， 编码羧酸酯酶或其 变体的基因与编码信号肽的信号序列连接。本文使用的术语 “信号肽” 指这样的氨基酸序 列， 其与羧酸酯酶或其变体连接， 并使得所表达的羧酸酯酶或其变体能够被转运 / 分泌到 细胞膜的外面。在一些实施方案中， 信号肽可以与羧酸酯酶或其变体的氨基端连接。在一 些实施方案中， 信号肽可被肽酶切割， 以从羧酸酯酶或其变体上除去该信号肽。
     信号序列可以是一种或多种天然存在的羧酸酯酶信号序列， 或者是加入羧酸酯酶 中的外源信号序列。在一些实施方案中， 所述信号序列可在酵母细胞和 / 或丝状真菌细胞 中发挥功能。可在酵母细胞中发挥功能的信号肽的说明性实例为鸡溶菌酶信号肽 (CLSP)、 酿酒酵母 α- 因子的信号肽和酿酒酵母转化酶的信号肽。可在丝状真菌细胞中发挥功能的 信号肽的说明性实例为米曲霉 TAKA 淀粉酶的信号肽、 黑曲霉中性淀粉酶的信号肽、 黑曲霉 葡萄糖淀粉酶的信号肽、 米赫根毛霉 (Rhizomucor miehei) 天冬氨酸蛋白酶的信号肽、 特异 腐质霉 (Humicola insolens) 纤维素酶的信号肽以及柔毛腐质霉 (Humicola lanuginosa) 脂肪酶的信号肽。
     本文使用的术语 “宿主细胞” 指对表达载体的转化、 转染、 转导等敏感的细胞。
     可以使用本领域中任何合适的方法将表达载体引入真核细胞中， 所述方法包括但不限于电穿孔 ； 氯化钙、 氯化锂、 乙酸锂 / 聚乙二醇、 磷酸钙、 DEAE- 葡聚糖、 脂质体介导的 DNA 摄入 ； 原生质球 (spheroplasting) ； 注射 ； 显微注射 ； 微粒轰击 ； 噬菌体感染 ； 病毒感染 或其他成熟的方法。 或者， 可对含有目的基因序列的表达载体进行体外转录， 并可通过熟知 的方法 ( 如注射 ) 将所得 mRNA 引入宿主细胞中 ( 参阅 Kubo 等， Location of aregion of the muscarinic acetylcholine receptor involved in selective effectorcoupling， FEBS Letts.1988， vol 241， 119)。
     在一些实施方案中， 可通过诸如以下的方法将表达载体引入酵母细胞中 ： 原生质 体 转 化 ( 参 阅 如 Spencer 等， Genetic manipulation ofnon-conventional yeasts by conventional and non-conventional methods.JBasic Microbiol.， 1988， vol 28， No.5， 321-333)、 感受态细胞转化 ( 参阅如 Gietz 等， Frozen competent yeast cells that can be transformed with highefficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method， Nat Protoc.2007 ； 2(1) ： 1-4)、 电穿孔 ( 参阅如 Suga 等， High-efficiency electroporation byfreezing intact yeast cells with addition of calcium， Curr Genet.， 2003， vol 43， No.3， 206-211) 或者通过细胞之间的接触进行接合 ( 参阅如 Nishikawa 等， Trans-kingdom conjugation offers a powerful gene targeting ： tool in yeast， 1998， Genetic Analysis ： Biomolecular Engineering， vol 14， No.3， 65-73)。 在一些实施方案中， 可通过原生质体转化将表达载体引入丝状真菌细胞中， 其包 括原生质体分离、 再生和融合的步骤 ( 参阅 Arora 等， Handbookof fungal biotechnology， 第二版， CRC Press， 2004， 第 9-24 页 )。 用于转化丝状真菌细胞的合适方法已描述于多种出 版物中 ( 参阅如 Ruiz 等， Strategies for the transformation of filamentous fungi， J Appl Microbiol.， 2002， vol 92， No.2， 189-195 ； Hynes 等， Genetic transformation offilamentous fungi， Journal of Genetics， 1996， vol 75， No.3， 297-311)。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了包含表达载体的真核细胞， 其中所述表达载 体中含有编码来自微生物的羧酸酯酶或其变体的基因以及能够促进所述羧酸酯酶或其变 体在真核细胞中表达的调节序列， 其中所述调节序列与该基因可操纵地连接。在一些实施 方案中， 所述真核细胞为酵母细胞。在一些实施方案中， 所述真核细胞为巴斯德毕赤酵母。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了包含表达载体的真核细胞， 所述表达载体中 含有编码羧酸酯酶或其变体的基因以及能够促进所述羧酸酯酶或其变体在丝状真菌细胞 中表达的调节序列， 其中所述调节序列与该基因可操纵地连接。 在一些实施方案中， 所述丝 状真菌细胞为黑曲霉。
     细胞培养
     经改造而表达本公开内容的羧酸酯酶或其变体的真核细胞可以在适于表达该羧 酸酯酶或其变体的条件下在任何合适的培养基中进行培养。例如， 所述细胞可通过摇瓶培 养、 实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵 ( 包括连续发酵、 分批发酵、 分批补料发 酵或固态发酵 ) 来进行培养。培养可在包含碳源、 氮源和无机盐的合适的营养培养基中进 行。合适的培养基可从商业供应商获得， 或者可使用市售的成分来制备。
     可以调节培养条件 ( 如温度、 pH、 孵育时间以及诱导物的存在 ) 以使得能够更高地 表达羧酸酯酶。 培养条件可由本领域技术人员进行调节。 在一些实施方案中， 可通过以下步 骤来确定培养条件 ： 在广泛的条件下培养经改造而表达羧酸酯酶或其变体的细胞， 测量羧
     酸酯酶或其变体的表达， 以及选择允许相对高水平地表达羧酸酯酶或其变体的培养条件。
     细胞培养中合适的温度、 pH 和孵育时间一般取决于宿主细胞。 在一些实施方案中， 培养温度可为约 20℃至约 80℃、 约 30℃至约 70℃、 约 30℃至约 60℃、 约 30℃至约 50℃或 者约 30℃至约 40℃。在一些实施方案中， 培养温度为约 20℃、 约 25℃、 约 30℃、 约 35℃、 约 37℃、 约 40℃、 约 50℃、 约 60℃、 约 70℃或约 80℃。
     在一些实施方案中， 培养 pH 可为约 2 至约 8.5、 约 3 至约 8.5、 约 4 至约 8.5、 约5 至约 8.5、 约 6 至约 8.5 或者约 7 至约 8.5。在一些实施方案中， 培养 pH 为约 2、 约 3、 约 4、 约 5、 约 6、 约 7、 约 8 或约 8.5。
     在一些实施方案中， 孵育时间可为至少 1 天、 至少 2 天、 至少 3 天或至少 4 天。在 一些实施方案中， 孵育时间可为 1 天至 10 天、 2 天至 9 天、 3 天至 8 天或者 4 天至 7 天。在 一些实施方案中， 孵育时间为 1 天、 2 天、 3 天、 4 天、 5 天、 6 天、 7 天、 8 天、 9 天或 10 天。
     在一些实施方案中， 可在诱导物存在下培养真核细胞， 所述诱导物可诱导羧酸酯 酶或其变体的表达。 可以基于与编码羧酸酯酶或其变体之基因可操纵连接的诱导型启动子 来选择诱导物。 在一个说明性实施方案中， 在甲醇存在下培养真核细胞， 以诱导与编码羧酸 酯酶或其变体之基因可操纵连接的 AOX1 启动子。在另一说明性实施方案中， 在半乳糖存在 2+ 下培养真核细胞， 以诱导 GAL1 启动子。 在另一说明性实施方案中， 在 Cu 存在下培养真核细 胞， 以诱导 CUP 启动子。在另一说明性实施方案中， 在一种或多种醇存在下培养真核细胞， 以诱导 alc A 启动子。细胞培养基中诱导物的量可由本领域技术人员进行调整， 以允许相 对更高水平地表达羧酸酯酶或其变体。
     可使用本领域的成熟技术来测定羧酸酯酶或其变体的表达水平。 在一些实施方案 中， 通过对所转录 mRNA 的量或所翻译蛋白质的量进行定量来测定羧酸酯酶或其变体的表 达水平
     在 一 个 说 明 性 实 施 方 案 中， 可 通 过 Northern 印 迹 分 析 来 测 定 mRNA 水 平 (Alwine 等， Method for detection of specific RNAs in agarose gels bytransfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes， Proc.Natl. Acad.Sci.USA 1977， vol 74， 5350-5354 ； Bird， Size separationand quantification of mRNA by northern analysis， Methods Mol.Biol.1998， vol 105， 325-36)。简言之， 从细胞中分离 poly(A)RNA， 通过凝胶电泳进行分离， 印迹到支持表面上 ( 例如硝酸纤维 素 或 Immobilon-Ny 转 移 膜 (Millipore Corp.， Bedford， Mass.))， 并 与 能 与 目 的 mRNA 杂交的标记 ( 例如荧光标记或放射性标记 ) 寡核苷酸探针一起孵育。在另一说明性实 施方 案 中， 可 通过定 量 RT-PCR( 综述参 阅 Freeman 等， Quantitative RT-PCR ： pitfalls and potential， Biotechniques 1999， vol 26， 112-122) 或半定量 RT-PCR 分析 (Ren 等， Lipopolysaccharide-induced expression of IP-10 mRNA in ratbrain and in cultured rat astrocytes and microglia， Mol.Brain Res.1998， vol59， 256-263) 来测定 mRNA 水 平。根据该技术， 从细胞中分离 poly(A)RNA， 用于合成 cDNA， 并将所得 cDNA 与 PCR 引物一 起孵育， 所述引物能与模板杂交并扩增该模板序列， 以产生与目的 mRNA 的细胞水平成正比 的 PCR 产物水平。
     在 一 个 说 明 性 实 例 中， 通过电泳 ( 如十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)) 来检测所表达的羧酸酯酶或其变体， 可以使用商品扫描仪 ( 例如 Bio-Rad 的GS-800 光密度计 ) 对 SDS-PAGE 上羧酸酯酶条带的光密度进行扫描， 以对蛋白质进行定量。 在另一说明性实例中， 使用特异性识别羧酸酯酶或其变体的抗体， 通过 Western 印迹分析 来检测所表达的羧酸酯酶或其变体。在另一说明性实施方案中， 通过使用底物测量其酶活 性来检测所表达的羧酸酯酶或其变体。
     可以使用本领域已知的方法来测定所表达羧酸酯酶的酶活性。 可以通过测量底物 的消失或产物的形成来表征酶活性。 所述测量可以是分光测量、 放射性测量、 比色测量或者 基于高效液相色谱的测量。羧酸酯酶反应的任何合适的底物均可使用。羧酸酯酶底物的说 明性实例为乙酸萘酯 (NA)、 乙酸对硝基苯酯 (p-NPA)、 硫代丁酸甲酯 (MtB) 或 14C 标记的酯。 在一个说明性实施方案中， 可通过对生色试剂 Fast Blue B 盐与 α- 萘酚之间所形成的复 合体 ( 其为底物 α- 萘基乙酸酯被羧酸酯酶水解的产物 ) 进行分光测量来定量羧酸酯酶的 酶活性。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了一种产生羧酸酯酶或其变体的方法， 其中所 述羧酸酯酶或其变体以至少约 12mg/L 以及高达 100mg/L 的量产生。在一些实施方案中， 羧 酸酯酶或其变体的产量为至少 12mg/L 或至少 15mg/L 或至少 17mg/L 或至少 19mg/L。在一 些实施方案中， 羧酸酯酶或其变体的产量为 1mg/L 至 100mg/L、 10mg/L 至 100mg/L、 15mg/L 至 100mg/L、 20mg/L 至 100mg/L、 30mg/L 至 100mg/L、 10mg/L 至 50mg/L、 15mg/L 至 50mg/L、 20mg/L 至 50mg/L 或 30mg/L 至 50mg/L。在一些实施方案中， 羧酸酯酶或其变体以约 1mg/L、 约 5mg/L、 约 10mg/L、 约 12mg/L、 约 15mg/L、 约 20mg/L、 约 30mg/L、 约 40mg/L、 约 50mg/L 或约 100mg/L 的量产生。
     分离所表达的羧酸酯酶
     可以使用本领域已知的标准方法从细胞培养基中分离所表达的羧酸酯酶或其变 体， 包括但不限于离心、 过滤、 萃取、 喷雾干燥、 蒸发或沉淀 ( 参阅 I.M.Rosenberg 编辑， Protein Analysis and Purification ： BenchtopTechniques， 1996， Birkhauser， Boston， Cambridge， Mass. ； Janson 等， Protein Purification， 1989， VCH Publish ers， New York))。
     还可以通过本领域已知的多种方法进一步纯化所表达的羧酸酯酶， 所述方法包括 但不限于色谱法 ( 如离子交换色谱、 亲和色谱、 疏水色谱、 色谱聚焦和尺寸排阻色谱 )、 电泳 法 ( 如制备型等电聚焦、 SDS-PAGE) 和差异性溶解度 ( 如硫酸铵沉淀 )。
     在一些实施方案中， 使用基于抗体的方法来分离和纯化所表达的羧酸酯酶或其变 体。可以使用本领域已知且已实践过的方法来产生和分离能与羧酸酯酶或其变体结合的 抗体。可以通过在与抗体缀合的固相基质上的色谱 ( 如免疫沉淀 ) 从细胞裂解物或培养 基上清液中纯化羧酸酯酶或其变体 ( 参阅 Harlow 等， Using Antibodies ： A Laboratory Manual， Cold SpringHarbor Laboratory， 1999， Cold Spring Harbor， N.Y.)。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了分离的羧酸酯酶或其变体。 本文使用的 “分离 的羧酸酯酶” 指其中基本不含有在本文所述生产方法中与其相关的其他细胞组分的羧酸酯 酶。 “基本不含有” 包括这样的羧酸酯酶制备物， 其中含有的不是目的羧酸酯酶或其变体的 其他细胞组分或其他污染物低于约 50％、 40％、 30％、 20％、 10％、 5％或 1％ ( 干重 )。在一 些实施方案中， 分离的羧酸酯酶中含有的不是目的羧酸酯酶或其变体的污染物低于 50％、 40％、 30％、 20％、 10％、 5％或 1％ ( 干重 )。含有所表达羧酸酯酶的组合物及其用途
     在另一个方面中， 本公开内容提供了一种包含真核细胞以及该真核细胞所表达的 羧酸酯酶或其变体的组合物。在一些实施方案中， 本公开内容提供了一种包含真核细胞以 及该真核细胞所表达的微生物羧酸酯酶或其变体的组合物。在一些实施方案中， 本公开内 容提供了一种包含丝状真菌细胞以及该丝状真菌细胞所表达的羧酸酯酶或其变体的组合 物。 在一个说明性实施方案中， 所述组合物直接得自细胞培养物， 所述细胞培养物中含有经 改造而表达编码羧酸酯酶或其变体之基因的真核细胞。 可对所述细胞培养物进行过滤或离 心或其他处理， 以除去培养基、 细胞碎片和 / 或其他不想要的物质。还可对所述细胞培养物 进行本领域技术人员认为适当的其他纯化处理， 以提高其中羧酸酯酶的浓度。所述组合物 可以液体形式或干燥固体形式制备。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了一种包含通过本文所述方法产生的分离的羧 酸酯酶或其变体的组合物。在一些实施方案中， 所述含有分离的羧酸酯酶或其变体的组合 物中包含的不是目的羧酸酯酶或其变体的污染物不高于 50％、 40％、 30％、 20％、 10％、 5％ 或 1％ ( 干重 )。
     本公开内容的组合物可用于多种生物、 农业和药物应用中。本公开内容的组合物 可用于将含有羧酸酯基团的化合物转化成无羧酸酯基团的化合物， 包括将所述含有羧酸酯 基团的化合物与羧酸酯酶或其变体一起孵育。在一个说明性实施方案中， 该组合物用于将 含有羧酸酯基团的前药转化成无羧酸酯基团的药物。在另一说明性实施方案中， 该组合物 用于将含有羧酸酯基团的杀虫剂转化成无羧酸酯基团的去毒性杀虫剂。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了一种使杀虫剂去毒性的方法， 所述方法包括 将杀虫剂与本文提供的组合物一起孵育。本文使用的 “杀虫剂” 指用于对害虫 ( 如昆虫 )、 植物病原体和杂草进行杀伤、 抵制或发挥对抗作用的化学药剂。一些杀虫剂的化学结构中 含有一个或多个羧酸酯基团。 利用羧酸酯酶对羧酸酯基团进行水解可将有毒的杀虫剂转化 成无毒物质。这可用于清除农产品 ( 如蔬菜和水果 ) 或环境 ( 如水和土壤 ) 中不想要的杀 虫剂残留。这还可用于在中毒事件中减轻或消除杀虫剂的毒效应。可通过羧酸酯酶去毒性 的杀虫剂的说明性实例为有机磷酸酯类杀虫剂、 氨基甲酸酯类杀虫剂和拟除虫菊酯类杀虫 剂。
     在一些实施方案中， 所述组合物可以经改造而表达羧酸酯酶或其变体之宿主细胞 的细胞提取物或培养物上清液的形式提供， 或者可以分离的羧酸酯酶或其变体的形式提 供。待使用组合物的量可由实施本方法的人员根据需要来确定。在一些实施方案中， 待使 用的所述组合物的量可取决于待去毒性的样品中所含杀虫剂的量和类型， 以及该组合物水 解该特定杀虫剂的酶活性。在一个说明性实施方案中， 将 0.1nmol 羧酸酯酶与含有 1nmol 的含羧酸酯基团之杀虫剂的样品一起孵育 ； 该羧酸酯酶在孵育 4 小时后降解了约 100％的 杀虫剂。在另一个说明性实施方案中， 将 0.1nmol 羧酸酯酶与含有 2nmol 的含羧酸酯基团 之杀虫剂的样品一起孵育 ； 该羧酸酯酶在孵育 6 小时后降解了约 85％的杀虫剂。
     孵育时间可由实施本方法的人员根据需要来确定。在一些实施方案中， 孵育时间 可为约 1 小时至 3 周、 约 3 小时至约 7 天以及约 4 小时至约 3 天， 例如约 1 小时、 约 1.5 小 时、 约 3 小时、 约 6 小时、 约 9 小时、 约 1 天、 约 3 天、 约 7 天、 约 9 天、 约 12 天、 约 15 天和约 3 周。本领域技术人员可对其他孵育条件 ( 如温度、 pH、 辅助因子的存在情况 ) 进行选择，从而以更高的百分比对杀虫剂进行去毒性。
     在一个实施方案中， 所处理样品中杀虫剂的量可减少至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 至少 80％或至少 90％。在一些实施方案中， 所处理样品中杀虫 剂的量可减少 30％至 100％、 40％至 90％、 50％至 80％或者 60％至 70％。在一些实施方案 中， 所处理样品中杀虫剂的量可减少 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 99％和 100％。
     在另一个方面中， 本公开内容提供了一种将前药转化成药物的方法， 所述方法 包括将该前药与本文提供的组合物一起孵育。一些前药中可含有使该前药无药物活性 的羧酸酯基团。本文所述羧酸酯酶能水解羧酸酯基团并将该无活性前药转化成活性药 物。在一个说明性实例中， 通过羧酸酯酶将伊立替康 ( 一种抗癌前药 ) 转化成活性药 物化合物 7- 乙基 -10- 羟基喜树碱 ( 一种拓扑异构酶 I 抑制剂 )(Yoon 等， Activation of a camptothecinprodrug by specific carboxylesterases as predicted by quantitativestructure-activity relationship and molecular docking studies， Mol CancerTher 2003， vol 2， 1171)。在另一个说明性实例中， 通过羧酸酯酶将前药奥塞米韦 转化成活性药物奥塞米韦羧酸酯 (Shi 等， anti-influenza viral prodrugoseltamivir is activated by carboxylesterase hce1 and the activation isinhibited by anti-platelet agent clopidogrel， J.Phar.Exp.Ther.2006， vol 319， 1477-1484)。 实施例 公开以下实施例以帮助理解本公开内容， 不应将其理解为以任何方式限制本发明 的范围， 本发明的范围由其后的权利要求书限定。
     材料和培养基
     1％琼脂糖凝胶 ： 400mg 琼脂糖、 39.2ml H2O、 0.8ml 50×TAE 和 1μg 溴化乙锭。
     LB 培养基 (1L) ： 10g 胰蛋白胨、 5g 酵母提取物、 10g NaCl， pH7.4。
     LB 平板 ： 含有 1.5％琼脂的 LB 培养基。
     RDB 平板 ： 1M 山梨醇、 2％葡萄糖、 1.34％酵母氮源 (YNB)、 2％琼脂、 4×10-5％生物 素和 0.005％氨基酸。
     YPD 培养基 ： 1％酵母提取物、 2％胰蛋白胨和 2％葡萄糖。
     YPD 平板 ： 1％酵母提取物、 2％胰蛋白胨、 2％葡萄糖和 2％琼脂粉。
     BMMY 培 养 基 ： 1 ％ 酵 母 提 取 物、 2 ％ 胰 蛋 白 胨、 100mM 磷 酸 钾 缓 冲 液 (pH 6.0)、 -5 1.34％ YNB、 4×10 ％生物素和 0.5％甲醇。
     MN 培养液 (400ml) ： 16ml MN 盐溶液 (250ml H2O 中的 37.5g 硝酸钠、 3.25g 氯化钾、 9.5g 磷酸二氢钾 )、 0.4ml 微量元素 ( 每 100ml 中含有 2.2g 七水合硫酸锌、 1.1g 硼酸、 0.5g 四水合氯化锰、 0.5g 七水合硫酸亚铁、 0.17g 六水合氯化钴、 0.16g 五水合硫酸铜、 0.15g 钼 酸钠、 5g 乙二胺四乙酸二钠， pH 6.5)、 6g 葡萄糖、 0.4g 酸水解酪蛋白、 8ml 50×MgSO4 溶液 (250ml H2O 中的 6.5g MgSO4·7H2O)， pH 6.5。
     MN+URI 培养液 (400ml) ： 0.4g 尿苷、 400ml MN 培养液。
     MN+SORB 琼脂培养基 (1L) ： 40ml MN 盐溶液、 1ml 微量元素、 10g 葡萄糖、 218.64g 山 梨醇、 15g 琼脂、 20ml 50×MgSO4 溶液， pH6.5。
     STC 缓冲液 (300ml) ： 65.6g 山梨醇、 0.36g Tris 碱、 2.2g CaCl2·2H2O， pH 7.5。
     PEG 溶液 (100ml) ： 60g PEG6000、 0.12g Tris、 0.74g CaCl2， pH7.5。
     NM 缓冲液 (500ml) ： 29.25g NaCl、 2.132g MES， pH 5.8。
     MM 缓冲液 (200ml) ： 59.15g MgSO4·7H2O、 0.8g MES， pH 5.8。
     6×SDS-PAGE 上样缓冲液 ： 300mM Tris-HCl(pH 6.8)、 12％ (w/v/)SDS、 0.6％ (w/ v) 溴酚蓝、 60％ (v/v) 甘油、 6％ (w/v)β- 巯基乙醇。
     PBST 缓冲液 ： 补充了 0.1(v/v)Tween 20 的 0.01M 磷酸盐缓冲盐水， pH 7.2。 -5
     MGY 培养基 ： 1.34％ YNB、 1％甘油、 4×10 ％生物素。
     酶稀释缓冲液 (100ml) ： 3.5g NaCl、 0.11g CaCl2、 1g 葡萄糖， pH5.8。
     溶壁酶 ： 0.2g 溶壁酶溶于酶稀释缓冲液中。
     BSA ： 12mg/ml BSA 溶于酶稀释缓冲液中。
     12 ％聚丙烯酰胺分离胶 (10ml) ： 4ml H2O、 3.3ml 30 ％聚丙烯酰胺、 2.5ml 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)、 0.1ml 10％ SDS、 0.1ml 10％ AP、 4μl TEMED。
     5％聚丙烯酰胺成层胶 (5ml) ： 3.44ml H2O、 0.83ml 30％聚丙烯酰胺、 0.63ml 0.5M Tris-HCl(pH 6.8)、 0.05ml 10％ SDS、 0.05ml 10％ AP、 4μl TEMED。
     所有的培养基和溶液均已灭菌。
     实施例 1 ： 在黑曲霉 M54 菌株中表达重组羧酸酯酶。
     通过 PCR 从嗜热脂肪地芽孢杆菌 CICC 20156 菌株 ( 购自中国上海的中国工业微 生物菌种保藏中心 ) 中扩增羧酸酯酶基因， 其中使用 CICC20156 菌株的基因组 DNA 作为模 板， 并使用以下引物 ： 正向引物 P1(SEQID NO ： 33) 和反向引物 P2(SEQ ID NO ： 34)。 该引物含 有来自 SEQ IDNO ： 9 所示的羧酸酯酶基因的序列。正向引物含有 Xba I 位点和 KEX2 位点， 而反向引物包含 HpaI 位点以及编码六聚组氨酸标签的核苷酸 (His-tag， His-tag 的编码序 列以波浪线标出 )， 所述六聚组氨酸标签由可用于亲和力纯化和抗体检测的六个组氨酸残 基组成。反向引物中含有与羧酸酯酶基因 3′末端核苷酸序列的一部分相连的 His-tag 编 码序列。使用引物 P1 和 P2 产生的 PCR 产物称为 CarE-his 基因 (SEQ ID NO ： 35)， 其编码 羧酸酯酶在 C 端与 His-tag 融合而成的融合蛋白。
     表 4. 引物 P1 和 P2 以及 CarE-his 基因的核苷酸序列。
     名称 P1
     序列 5’ CGTCTAGAAAGAGAATGATGAAAATTGTTCCGCCG 3’ (SEQ ID NO ：所述 PCR 在具有以下组成的 50μl 反应体系中进行 ： 5μl 10×Pfu 缓冲液 ( 天根 生化科技 ( 北京 ) 有限公司 )、 4μl dNTP 混合物 ( 天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 )、 1μl 正向引物 P1、 1μl 反向引物 P2、 1μl 模板 DNA、 1μl pfu DNA 聚合酶 ( 天根生化科技 ( 北 京 ) 有限公司 ) 和 37μl 双蒸水。PCR 中使用以下的循环 ： 95℃ 5 分钟， 然后是 95℃ 45 秒、 60℃ 45 秒和 72℃ 90 秒的 30 个循环 ； 其后是 72℃ 5 分钟。接着将 PCR 产物置于 1％琼脂 糖凝胶上进行电泳， 切下 780bp 的条带并使用凝胶提取试剂盒 ( 天根生化科技 ( 北京 ) 有 限公司 )， 根据生产商的说明进行凝胶提取。
     将纯化的 PCR 产物插入 pYG1.2 载体中， 该载体使用之前已公开的方法来构建 (Liu， Zhongbin 等， Construction of recombinant expressionplasmid for Aspergillus niger， Journal of Tongji University(medicalscience)， 2001， 22， vol 3， 1-3)。pYG1.2 载体含有来自黑曲霉 ATCC 12049 菌株的 pyrG 基因、 gla A 编码序列和调节序列。下面简 要描述产生 pYG1.2 载体的步骤。
     使用市售质粒 pUC18(Fermentas Inc.， Burlington， Canada) 来构建 pIGF 载体。 pUC18 载体含有赋予氨苄青霉素抗性的 β- 内酰胺酶基因。将 4.8kb 的片段插入 pUC18 载 体中， 以产生 pIGF 载体， 该片段含有 gla A 编码序列 ( 编码葡萄糖淀粉酶的前 498 个氨基 酸 )、 2.0kb 的上游调节序列 (gla A 的启动子 ) 和 2.3kb 的下游调节序列 (gla A 的终止子 序列 )。插入 gla A 编码序列来帮助提高靶蛋白的表达水平。图 1 显示了 pIGF 载体结构的 示意图。所插入的 gla A 编码序列中包含可用于产生与 gla A 的融合蛋白的 Xba I/Hap I 克隆位点 ( 示于图 1)。
     接着向 pIGF 载体中插入黑曲霉 ATCC12049 菌株的 pyrG 基因， 以产生 pYG1.2 载 体。以 pAB4.1 质粒 ( 该质粒含有来自黑曲霉 ATCC9029 菌株的 pyrG 基因， 由 Institute of
     Food Research， Norwich， UK 提供 ) 为模板作 PCR 获得含有 pyrG 基因保守序列的 600bp 片 32 段， 用 P 标记该片段， 并以其为探针作噬菌斑杂交 (Sambrook， J 等， A laboratory manual， New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989) 从 ATCC 12049 菌株的基因文库 中筛选出含 pyrG 基因的 9.8kb 的核酸片段， 进一步用 XhoI 消化以获得 2.3kb 的片段， 通过 限制性酶谱分析和 PCR 证实该片段含有 ATCC 12049 菌株的 pyrG 基因。
     将所得的 2.3kb 片段与经 XhoI 消化的 pIGF 载体之线性化片段连接在一起。将 连接产物转化进大肠杆菌 (E.coli)DH5α 中， 并挑取在含有氨苄青霉素的 LB 平板上生长 的克隆。进行 PCR 以鉴定含有所插入的 pyrG 基因的阳性克隆。增殖所鉴定的阳性克隆， 以提取质粒， 并将重组质粒测序以证实 pyrG 基因的成功插入。将一种证实后的质粒命名为 pYG1.2， 并用作以下分子克隆研究中的载体。pYG1.2 的示意图示于图 2。含有 pYG1.2 质粒 的大肠杆菌 DH5α 菌株 ( 大肠杆菌 DH5α/pYG1.2) 于 2009 年 7 月 27 日保藏于中国武汉大 学的 CCTCC。保藏号为 CCTCCM 209165。该保藏物将在布达佩斯条约的规定和条件下维持。 可通过常规质粒提取法从大肠杆菌 DH5α/pYG1.2 菌株中回收质粒 pYG1.2。
     为了将羧酸酯酶基因插入 pYG1.2 载体中， 将纯化的 CarE-his 基因产物和 pYG1.2 质粒分别同时用 XbaI 和 HpaI(New Englan Biolabs， Inc.， Ipswich， MA) 进行消化， 其后在 1％琼脂糖凝胶上进行电泳并通过凝胶提取进行纯化。使用 T4 连接酶 (Takara Bio.Inc.， Japan) 将消化的 CarE-his 基因产物与消化的 pYG1.2 片段连接在一起。
     通过以下步骤转化大肠杆菌 DH5α ： 将感受态大肠杆菌 DH5α 细胞与 20μl 连接 产物混合， 在冰上孵育 30 分钟， 42℃热激 90 秒， 在冰上孵育 5 分钟， 其后加入 200μl LB 培 养基并在 37℃下在摇床上孵育 45 分钟。用 50μl 所得细菌培养物接种含有氨苄青霉素的 LB 平板， 并在 37℃下孵育过夜。
     通过在与上述相同的 PCR 反应条件下使用个体大肠杆菌菌落作为模板进行 PCR， 对在含有氨苄青霉素的 LB 平板上生长的各个大肠杆菌菌落进行筛选。 通过在 1％琼脂糖凝 胶上进行电泳来表征 PCR 产物， 将显示 780bp 条带的阳性菌落在含有氨苄青霉素的 LB 培养 基中增殖过夜， 之后使用质粒提取试剂盒 ( 天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 )， 根据生产商 的说明进行质粒纯化。
     通过用 XbaI 和 HpaI 消化并随后进行电泳来表征所得的重组质粒。对阳性质粒 进行测序， 结果证实已将羧酸酯酶基因成功插入 pYG1.2 质粒中。将该重组质粒命名为 pYG1.2-CarE-his， 并用于后续的研究。
     使用黑曲霉 M54 菌株来表达羧酸酯酶。黑曲霉 M54 是一种 pyrG 缺陷型菌株， 其 不能在不含尿苷的培养基上生长。通过使黑曲霉 ATCC12049 菌株暴露于 UV 照射并筛选 pyrG 基因缺陷型菌株来获得黑曲霉 M54， 如上文所述 (Liu， Zhongbin 等， Construction of pyrGauxotrophic Aspergillus niger strain， Journal of microbiology， 2001， 21， vol 3， 15-16)。该菌株已在 2009 年 6 月 14 日保藏于中国武汉大学的 CCTCC。保藏号为 CCTCC M 209121。该保藏物将在布达佩斯条约的规定和条件下维持。
     使用质粒 pYG1.2-CarE-his 来转化黑曲霉 M54 的原生质体。 原生质体按以下制备 ： 8 以 4×10 的细胞密度用黑曲霉 M54 悬液接种含有 200ml MN+URI 培养液的 1L 瓶， 并在 30℃ 下以 200rpm 在摇床上孵育 24 小时 ； 收集经处理的细胞并将 1g 细胞 ( 湿重 ) 悬于 10ml 冰 冷的 MM 缓冲液中 ； 在 30℃下以 80rpm 轻柔摇动 10 分钟后向细胞悬液中加入 1ml 溶壁酶和0.5ml BSA， 然后以 50rpm 摇动 2 小时 ； 接着在 4℃下将悬液以 1500rpm 离心 2 分钟， 转移出 上清液并与 NM 缓冲液混合， 随后在 4℃下以 2500rpm 离心 10 分钟 ； 将沉淀与冰冷的 STC 缓 冲液混合至总体积 50ml， 其后在 4℃下以 2000rpm 离心 10 分钟， 获得乳白色原生质体， 接着 将其悬于 1ml 冰冷的 STC 缓冲液中。
     分别用 pYG1.2-CarE-his 质粒、 pYG1.2 质粒 ( 阳性对照 ) 和空白缓冲液 ( 阴性对 照 ) 转化原生质体。在 15ml 管中将 3.0μg 质粒 DNA 与 100μl 原生质体悬液混合， 并在室 温下孵育 25 分钟。将总体积 1250μl 的 PEG 溶液逐滴加入质粒与原生质体的混合物中并 轻柔混合， 随后在室温下孵育 20 分钟。加入冰冷的 STC 缓冲液将管充满， 其后轻柔混合直 至 PEG 溶液被完全稀释。在 4℃下以 2000rpm 离心 10 分钟后， 将细胞重悬于 300μl STC 缓 冲液中， 从其中取出 100μl 接种到不含尿苷的 MN+SORB 琼脂培养基平板上， 并在 30℃下孵 育 3 至 5 天， 以选择能在该选择培养基上生长的转化体。未转化的黑曲霉 M54 将不能在不 含尿苷的培养基上生长， 而用 pYG1.2-CarE-his 和 pYG1.2 转化的黑曲霉均能在不含尿苷的 培养基上生长， 表明所述质粒在黑曲霉 M54 中成功表达。
     使用 SDS-PAGE 来表征羧酸酯酶的表达。 在 30℃下， 将转化有 pYG1.2-CarE-his 的 黑曲霉 M54 在不含尿苷的 MN 培养液中以 200rpm 培养 5 天。接着取出该培养物的上清液并 通过电泳进行分析。 平行地对转化有 pYG1.2 的黑曲霉 M54 的上清液以及未转化黑曲霉 M54 的上清液进行分析， 作为阴性对照。将 15μl 上清液与 3μl 6× 上样 SDS-PAGE 缓冲液混 合并煮沸 5 分钟， 之后上样到 SDS-PAGE 胶上， 所述 SDS-PAGE 胶由 12％的聚丙烯酰胺分离胶 和 5％的聚丙烯酰胺成层胶组成。在 120V 下将样品恒压电泳 3 至 4 小时。接着在室温下用 考马斯亮蓝将胶染色 30 分钟并洗涤， 以显示蛋白质条带。在转化有 pYG1.2-CarE-his 的黑 曲霉 M54 的上清液的泳道中观察到了 29.0KD 的独特蛋白质条带， 而在阴性对照中则未观察 到 ( 图 3)。
     通过 Western 印迹进一步证实羧酸酯酶的表达。通过 SDS-PAGE 电泳对转化有 pYG1.2-CarE-his 的黑曲霉 M54 的上清液进行分离， 并通过施加 0.65mA/cm2 强度的电流而 将胶上的蛋白质向聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上转移 1 小时。用脱脂乳封闭 PVDF 膜， 其后在 4℃下与适当稀释的抗 his 抗体 (IgG 型抗体 ) 孵育过夜， 并在室温下与二抗 ( 抗 IgG 抗体 ) 孵育 90 分钟。用 PBST 洗涤后， 使 PVDF 膜与 X 光胶片接触适当的时间， 其后显影并照相。使 用未转化黑曲霉 M54 的上清液和转化有 pYG1.2 载体的黑曲霉 M54 的上清液作为阴性对照。 使用带 His 标签的组蛋白作为阳性对照。 在 pYG1.2-CarE-his 转化体中观察到了 29KD 的独 特条带， 而在阴性对照中则没有检测到条带 ( 图 4)， 这证实了羧酸酯酶在 pYG1.2-CarE-his 转化体中的表达。
     实施例 2 ： 在巴斯德毕赤酵母 GS115 中表达羧酸酯酶
     羧酸酯酶的 DNA 序列含有内部的 XhoI 位点 CTCGAG， 使用 PCR， 通过位点特异性沉 默突变将其改变成 CTCGAA( 以双线标出 )。分别使用 SEQ ID NO ： 36-37 所示的引物 P3 和 P4 以及 SEQ ID NO ： 38-39 所示的引物 P5 和 P6 进行两个独立的 PCR 反应， 其中 P3 含有 Xho I 位点、 KEX2 位点和 KEX1 位点， P4 和 P5 含有沉默突变， P6 含有 EcoRI 位点和 His-tag 的六 个组氨酸密码子 (His-tag 的编码序列以波浪线标出 )。PCR 条件与实施例 1 中所述相同。 在 1％琼脂糖凝胶上电泳后， 通过凝胶提取来纯化来自这两个独立反应的 PCR 产物。 来自这 两个反应的 PCR 产物具有重叠序列 ( 显示为表 5 中 P4 和 P5 的下划线部分 )， 这将允许这两种产物在一种产物的 5′末端和另一产物的 3′末端彼此结合。因此， 将这两种纯化的 PCR 产物混合在一起进行第三轮 PCR， 以产生将这两个模板组合在一起的 PCR 产物。将第三轮 PCR 的产物在 1％琼脂糖凝胶上进行电泳， 切下约 800bp 的条带并通过凝胶提取进行纯化。
     表 5. 引物 P3、 P4、 P5 和 P6 以及 CarE-his 基因的核苷酸序列。
     名称 P3序列 5’ CGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTATGATGAAAAT TGTTCCG 3’ (SEQ ID NO ： 36) 5’ CGCGCGCATATTCGAGGACGCCTTCGTAC 3’ (SEQ ID NO ： 37) 5’ CGTCCTCGAATATGCGCGCGAGTATAAAA 3’ (SEQ ID NO ： 38) 5’ CGGAATTCTTAATGGTGATGGTGATGGTGCCAATCTAACP4P5P6
     将纯化的最终 PCR 产物和 pBluescriptII-SKM(Stratagene， LaJolla， CA) 分别 同时使用 XhoI 和 EcoRI 进行消化， 其后在 1 ％琼脂糖凝胶中电泳并通过凝胶提取进行纯 化。pBluescriptII-SKM 含有赋予氨苄青霉素抗性的 β- 内酰胺酶基因。在将消化的 PCR 产物和消化的 pBluescriptII-SKM 片段连接之后， 按照与实施例 1 所述相同的方法用此 连接产物转化大肠杆菌 DH5α。使用 PCR 对在含有氨苄青霉素的 LB 平板上生长的各个大 肠杆菌菌落进行筛选， 并通过 PCR 将所鉴定的阳性菌落增殖， 其后纯化质粒。通过用 XhoI 和 EcoRI 消化纯化的质粒其后进行电泳来证实靶基因的插入。将所得的重组质粒命名为 pBluescriptII-SKM-CarE-his， 并用于以下的分子克隆实验。
     用 XhoI 和 EcoRI 消化质粒 pBluescriptII-SKM-CarE-his， 并与经相同限制性酶 消化的 pPIC9 质粒 (Invitrogen) 的片段连接。使用此连接产物转化大肠杆菌 DH5α， 以获 得按照与实施例 1 所述相同方法通过 PCR 和 XhoI 及 EcoRI 酶消化鉴定的阳性重组体菌落。 纯化来自阳性菌落的质粒并命名为 pPIC9-CarE-his。
     用 BamHI 和 EcoRI 消化质粒 pPIC9-CarE-his， 并将含有羧酸酯酶基因的片段与经 相同限制性酶消化的 pPIC9K 质粒 (Invitrogen) 片段连接。 pPIC9K 质粒带有卡那霉素抗性 基因， 其赋予宿主细胞对卡那霉素及与卡那霉素具有结构相似性的某些抗生素的抗性。使 用连接产物转化大肠杆菌 DH5α， 以获得按照与实施例 1 所述相同方法通过 PCR 和 BamHI 及 EcoRI 酶消化而鉴定的阳性重组体菌落。电泳结果显示出 1100bp 的靶标条带， 其对应于同 时含有羧酸酯酶基因以及从 pPIC9 质粒中引入的 α- 因子分泌信号序列的消化片段。将该 重组质粒命名为 pPIC9K-CarE-his 并用于后续的研究。
     用 BglII 消化 pPIC9K-CarE-his 质粒， 接着纯化以获得线性化的质粒 DNA。 将巴斯 德毕赤酵母 GS115 菌株的 80μl 悬液与所述线性化的质粒 DNA 混合， 并在冰冷的试管中平 衡 5 分钟， 其后以 1500v、 25μF 和 200Ω 进行电泳， 并立即加入 1ml 冰冷的 1M 山梨醇。将 混合物在冰上放置 2 至 3 小时， 接着接种到 RDB 平板上。将平板在 30℃下孵育 3 至 5 天。
     从 RDB 平 板 上 洗 下 所 有 菌 落， 并 用 YPD 培 养 基 稀 释 到 约 106 个 细 胞 /ml。 将 100μl 稀释的巴斯德毕赤酵母细胞接种到补充有不同浓度 (0.25mg/ml、 1mg/ml 和 2mg/ml) G418( 购自 Invitrogen， 是一种与卡那霉素结构相似的氨基糖苷抗生素 ) 的 YPD 平板上， 其 后在 30℃下孵育。
     挑取在补充有最高浓度 G418 的平板上生长的各个菌落， 并分别接种到 3ml MGY 培 养基中， 接着在 30℃下孵育并以 250rpm 摇动， 直至 OD600 达到 2 至 6。在室温下以 1500g 离心 5 分钟后， 将沉淀重悬于 3ml BMMY 培养基 ( 补充有 5‰甲醇 ) 中， 并在 30℃下孵育并 以 250rpm 摇动， 以诱导靶基因表达。每 24 小时向培养物中加入甲醇 (5‰ )， 同时对培养物 采样。96 小时后， 对不同时间间隔的样品进行 SDS-PAGE 分析。
     按照与实施例 1 所述相同的方法， 使用 SDS-PAGE 电泳和 Western 印迹对样品的上 清液进行分析。平行地对转化有 pPIC9K 载体的巴斯德毕赤酵母 GS115 的上清液进行分析， 作为阴性对照。从电泳和 Western 印迹获得的结果均显示， 在转化有 pPIC9K-CarE-his 的 巴斯德毕赤酵母 GS115 的上清液中存在 29.0KD 的独特蛋白质条带， 而在阴性对照中则不存 在 ( 图 4 和图 5)。
     挑 取 相 对 高 水 平 地 表 达 羧 酸 酯 酶 的 pPIC9K-CarE-his 转 化 体， 增殖并保存 于 -80℃。实施例 3 ： 表征羧酸酯酶的活性
     如下测定羧酸酯酶活性 ： 将 α- 萘基乙酸酯分别与转化的黑曲霉 M54 的上清液和 转化的巴斯德毕赤酵母 GS115 的上清液在 37℃ pH 7.0 孵育 10 分钟， 其后立即终止反应。 在 600nm 处测量吸光度。酶活性单位计算为每分钟从 0.03M α- 萘基乙酸酯溶液中释放 1μmol α- 萘酚所需的酶量。
     为了确定酶产生最高的孵育时间， 在孵育的第 1 天、 第 2 天、 第 3 天、 第 4 天、 第5 天和第 6 天在含有羧酸酯酶的培养物上清液中取样， 接着测量羧酸酯酶活性。如图 6 所示， 重组羧酸酯酶活性在已转化黑曲霉 M54 中在孵育 5 天后达到峰值， 在已转化巴斯德毕赤酵 母 GS115 中在孵育 4 天后达到峰值， 其后开始下降。通过凝胶成像分析系统测得， 在转化的 黑曲霉 M54 的第 5 天培养中所产生羧酸酯酶的量为 15.3mg/ml， 在转化的巴斯德毕赤酵母 GS115 的第 4 天培养物中所产生的量为 30.7mg/ml。结果提示， 在转化的黑曲霉 M54 和转化 的巴斯德毕赤酵母 GS115 中， 对于羧酸酯酶的产生而言合适的孵育时间分别为 5 天和 4 天。 转化的巴斯德毕赤酵母 GS115 中重组羧酸酯酶的产量高于转化的黑曲霉 M54 中的。
     为了测试羧酸酯酶活性的 pH 依赖性， 在 37℃下和 pH 值为 5 至 11 的缓冲液中， 将 含有由转化的黑曲霉 M54 和转化的巴斯德毕赤酵母 GS115 表达的羧酸酯酶的培养物上清 液与底物一起孵育 30 分钟， 其后进行酶促反应和活性测定。结果显示， 重组羧酸酯酶在 pH 8.0 下显示最高的酶活性 ( 将其定义为 100％相对酶活性 )， 在 6.0 至 8.5 的 pH 范围内显示 高于 75％的相对酶活性， 当 pH 低于 6.0 或高于 8.5 时活性下降 ( 图 7)。
     为了测定就羧酸酯酶活性而言合适的反应温度， 在 20℃至 80℃的温度下， 将含有 羧酸酯酶的培养物上清液与底物溶液在 pH 7.0 下孵育 30 分钟， 其后测定酶活性。转化的 黑曲霉 M54 和转化的巴斯德毕赤酵母 GS115 所表达的羧酸酯酶均在 60℃下显示出最高的酶 活性 ( 将其定义为 100％相对酶活性 )， 在 70℃和 80℃的更高温度下活性降低 ( 图 9)。
     为了测试重组羧酸酯酶的热稳定性， 将含有转化的黑曲霉 M54 和转化的巴斯德毕 赤酵母 GS115 所表达羧酸酯酶的培养物上清液分别在 40℃至 80℃的温度下孵育 10 分钟和 30 分钟， 随后在冰浴中冷却。将底物溶液加入酶孵育物中， 随后在 37℃下使酶促反应进行 10 分钟， 并进行活性测定。 结果显示， 在 60℃孵育 10 分钟后， 重组羧酸酯酶保留近 100％的 酶活性， 在 70℃孵育 30 分钟后则表现出约 60％的相对酶活性 ( 图 8)。
     实施例 4 ： 在多形汉逊酵母中表达来自嗜热地芽孢杆菌 HTA426 菌株的羧酸酯酶。
     使用从已知 DNA 序列中设计的引物， 通过 PCR 从嗜热地芽孢杆菌 HTA426 菌株 的 cDNA 文库中克隆来自嗜热地芽孢杆菌 HTA426 菌株的羧酸酯酶 ( 登记号 BA000043， SEQ ID NO ： 10)。 纯 化 PCR 产 物 并 用 适 当 的 限 制 性 酶 消 化， 接 着 与 pHIPX4 载 体 连 接 (Gietl 等， Mutationalanalysis of the N-terminal topogenic signal of watermelon glyoxysomalmalate dehydrogenase using the heterologous host Hansenula polymorpha.Proc Natl Acad Sci USA 1994， vol 91， 31513155)。在大肠杆菌 DH5α 中 增殖已插入羧酸酯酶基因的重组 pHIPX4 质粒， 接着线性化以使用电穿孔转化多形汉逊酵 母菌株 leu 1.1(Gleeson 等， Transformation of themethylotrophic yeast Hansenula polymorpha.J Gen Microbiol 1986， vol， 132， 3459-65)。
     使用无亮氨酸的培养基筛选已转化的汉逊酵母。 对在无亮氨酸培养基平板上生长 的单克隆进行孵育， 并以 α- 萘基乙酸酯作为底物， 使用酶测定来表征羧酸酯酶的表达。实施例 5 ： 在米曲霉中表达来自高温烷烃芽孢杆菌菌株的羧酸酯酶。
     使用从已知 DNA 序列中设计的引物， 通过 PCR 从高温烷烃芽孢杆菌菌株的 cDNA 文库中克隆来自高温烷烃芽孢杆菌菌株的羧酸酯酶 ( 登记号 AF327065， SEQ ID NO ： 4)。 纯化 PCR 产物并用适当的限制性酶消化， 接着与带有精氨酸合成基因的 pSal23 载体连 接 (Gomi 等， Integrativetransformation of Aspergillus oryzae with a plasmid containing theAspergillus nidulans argB gene.Agric.Biol.Chem.1987， vol 51， 2549-2555)。在大肠杆菌 DH5α 中增殖已插入羧酸酯酶基因的重组 pSal23 质粒， 接着线 性化以使用米曲霉 M-2-3 原生质体转化缺少精氨酸合成基因的米曲霉 M-2-3(Ozeki 等， Construction of a promoter probevector autonomously maintained in Aspergillus and characterization of promoter regions derived from A.niger and A.oryzae genomes.Biosci.Biotech.Biochem.1996， vol 60， 383-389)。
     使用无精氨酸的培养基筛选已转化的米曲霉。 对在无精氨酸培养基平板上生长的 单克隆进行孵育， 并以 α- 萘基乙酸酯作为底物， 使用酶测定来表征羧酸酯酶的表达。
     实施例 6 ： 纯化所表达的羧酸酯酶
     将转化有 pPIC9K-CarE-his 的巴斯德毕赤酵母 GS115 在 30℃下培养 4 天。收获 培养基并以 0.2μm 滤器过滤， 之后添加 NaAzide 至终浓度为 0.01％。向每升所收获的培 养基中加入 100ml 甘油、 30ml 5MNaCl、 10ml 1M 咪唑和 50ml Ni-NTA superflow 树脂， 其后 在室温下以 150rpm 进行回转运动 (Gyro-rotary motion)30 至 40 分钟。以 3750rpm 将树 脂珠离心 10 分钟。 将珠子装入柱中， 并用含有 50mM Tris(pH8.0)、 300mM NaCl、 10％甘油和 10mM 咪唑的洗涤缓冲液洗柱， 直至 280nm 的 UV 吸收稳定。接着用含有 50mM Tris pH 8.0、 300mM NaCl、 10％甘油和 250mM 咪唑的洗脱缓冲液将柱进行洗脱， 直至洗脱液中检测不到蛋 白质。通过电泳分析洗脱的级分， 以鉴定出含有单个靶蛋白条带的级分。收集靶标级分并 测试其量和酶活性。
     一般陈述
     对于本文使用的基本上任何复数和 / 或单数术语， 本领域技术人员能够就本文和 / 或本申请而言适当地将复数解读为单数和 / 或将单数解读为复数。
     本领域技术人员将会理解， 一般而言， 本文中， 尤其是所附权利要求书 ( 例如， 所 附权利要求书的正文 ) 中所用的术语通常意为 “开放式” 术语 ( 例如， 术语 “包括” 应该解 释为 “包括但不限于” ， 术语 “具有” 应该解释为 “至少具有” ， 等等 )。本领域技术人员还应 该明白， 有意引述权利要求的具体数目， 则该意图会在权利要求中明确地表述出来， 如果没 有这种表述， 则不存在该意图。例如， 为了便于理解， 下面所附的权利要求书中可使用引导 性短语 “至少一项” 及 “一项或多项” 来引述权利要求。然而， 不应将使用这种引导性短语 解释成通过不定冠词 “一” 引述权利要求即意味着将包含该权利要求引述的任何特定权利 要求限定为仅包含一项该引述的实施方案， 甚至在同一权利要求包含引导性短语 “一项或 多项” 或 “至少一项” 以及诸如 “一” 之列的不定冠词 ( 例如， “一” 应该解释成意味着 “至少 或 “一项或多项” ) 时也是如此 ； 这同样适用于使用 “所述” 、 “该” 等定冠词来引述权 一项” 利要求的情况。 此外， 即使明确表述了所引述权利要求的具体数目， 本领域技术人员也应该 认识到， 这种表述应该解释成意指至少是所表述的数目 ( 例如， 只说 “两项引述” ， 而没有其 它修饰语， 则意为至少两项引述， 或者说两项或更多项引述 )。另外， 当以马库什组的形式描述本发明的特征或方面时， 本领域技术人员会公认， 本文也因此描述了该马库什组的任何个体成员或亚组成员。
     本领域技术人员会理解， 对于任何及全部目的， 例如就提供书面描述而言， 本文公 开的所有范围还包括任何及全部可能的小范围及其小范围的组合。 任何列出的范围都可以 很容易地认为是对同一范围分成相等的至少两部分、 三部分、 四部分、 五部分、 十部分等而 进行了描述。 作为非限定性的实例， 本文所述的每个范围都可以容易地分为前三分之一、 中 间三分之一和后三分之一等。本领域技术人员还会理解， 所有诸如 “多达” “至少” 、 “多于” 、 、 “少于” 等的词语均包括所提到的数值， 并指可以如上所述分成小范围的范围。最后， 本领域 技术人员会理解， 范围包括每个个体成员。因此， 例如， 含有 1-3 个细胞的组是指含有 1 个、 2 个或 3 个细胞的组， 依此类推。
     本发明不仅限于本申请中所述的具体实施方案， 这些实施方案旨在举例说明本发 明的多个方面。对于本领域技术人员而言显而易见的是， 可以进行许多修改和改变， 而不 偏离其构思和范围。根据上文的描述， 本发明范围内除本文所列举以外的功能上等同的方 法和组合物对于本领域技术人员而言将是很明显的。 这些修改和改变旨在落入所附权利要 求书的范围内。 本发明仅受到所附权利要求书以及这些权利要求所赋予等同方案的全部范 围的限制。 应当理解， 本发明不受限于具体的方法、 试剂、 化合物组合物或生物体系， 它们当 然是可以变化的。 还应当理解， 本文使用的术语仅用于描述具体的实施方案， 而并非旨在限 制。
     本文中公开了多个方面和实施方式， 而其它方面和实施方式对于本领域技术人员 将是显而易见的。 本文中公开的多个方面和实施方式的目的在于举例说明， 并非旨在限定， 真正的范围和精神由下面的权利要求书表明。
     序列表
     <110> 同济大学
     <120> 羧酸酯酶的重组表达
     <130>32052.6509.US00
     <160>40
     <170>PatentIn version 3.5
     <210>1
     <211>246
     <212>PRT
     <213> 嗜热地芽孢杆菌 (Geobacillus kaustophilus)
     <400>1
     Met Lys Ile Val Pro Pro Lys Pro Phe Phe Phe Glu Ala Gly Glu Arg
     1 5 10 15
     Ala Val Leu Leu Leu His Gly Phe Thr Gly Asn Ser Ala Asp Val Arg
     20 25 30
     Met Leu Gly Arg Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Thr Cys His Ala Pro
     35 40 45
     Ile Tyr Lys Gly His Gly Val Pro Pro Glu Glu Leu Val His Thr Gly28101993861 A CN 101993865
     说明书60 Met Asn Gly Tyr Gln Phe Leu 75 Val Ala Gly Leu Ser Leu Gly 90 95 Thr Val Pro Ile Gln Gly Ile 105 110 Lys Ser Glu Glu Thr Met Tyr 125 Tyr Lys Lys Arg Glu Gly Lys 140 Glu Arg Phe Lys Gln Thr Pro 155 Leu Ile Ala Asp Val Arg Ala 170 175 Phe Val Val Gln Ala Arg His 185 190 Asn Ile Ile Tyr Asn Glu Ile 205 Tyr Glu Gln Ser Gly His Val 220 Leu His Glu Asp Ile Tyr Ala 23527/62 页50 55 Pro Asp Asp Trp Trp Gln Asp Val 65 70 Asn Lys Gly Tyr Glu Lys Ile Ala 85 Val Phe Ser Leu Lys Leu Gly Tyr 100 Thr Met Cys Ala Pro Met Tyr Ile 115 120 Gly Val Leu Glu Tyr Ala Arg Glu 130 135 Glu Glu Gln Ile Glu Gln Glu Met 145 150 Lys Thr Leu Lys Ala Leu Gln Glu 165 Leu Asp Leu Val Tyr Ala Pro Thr 180 Glu Met Ile Asn Pro Asp Ser Ala 195 200 Ser Pro Val Lys Gln Ile Lys Trp 210 215 Thr Leu Asp Gln Glu Lys Asp Gln 225 230 Leu Glu Ser Leu Asp Trp 245 <210>2 <211>741 <212>DNA <213> 嗜热地芽孢杆菌 <400>2 ttaccaatct aacgattcaa gaaatgcata atcaagcgta atcacatggc ctgattgctc aatttcgtta taaatgatgt tcgcgctgtc gacgacgaac gtcggtgcat aaaccaaatc ttgcaaggct ttcaacgtct tcatcggcgt ttgttcctct gatttccctt cccgcttttt gtacatcgtt tcttcgcttt tgatgtacat aggtacagtg tagcctaatt tgagagaaaa aattttttcg tagcctttgt ttttcaaaaa29Lys 80 Gly Val Glu Ser Met 160 His Asp Glu Ile Phe 240aatatcttca ataccatttg tggattgatc aaggtgggcg ttgtttgaac atactcgcgc cggcgcgcac tacgcctcca ctgatagccgtgcagctgat atttgtttga atctcatcat cgcacatcgg cgttccattt gcatactcga atcgtcacaa agcgacaatc ttcatgacgtctttttcttg ccggcgattc ggcgcgcttg caatgagttc cctgttcgat gcacaccttc tgccttgtat cagccacggc cttgccacca60 120 180 240 300 360 420 480 atcatccggt ccggtgtgga cgagctcttc cggcggcacg ccatgccctt tgtaaatcgg agcgtggcac gtataccctt tcgattccaa gaatcgccca agcatccgaa cgtcggcgga attgccggta aacccatgca aaagcagcac cgcccgctcc ccggcttcaa agaaaaacgg cttcggcgga acaattttca t <210>3 <211>246 <212>PRT <213> 高温烷烃地芽孢杆菌 (Geobacillus thermoleovorans) <400>3 Met Met Lys Ile Val Pro Pro Lys Pro Phe Phe Phe Glu Ala Gly Glu 1 5 10 15 Arg Ala Val Leu Leu Leu His Gly Phe Thr Gly Asn Ser Ala Asp Val 20 25 30 Arg Met Leu Gly Arg Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Thr Cys His Ala 35 40 45 Pro Ile Thr Lys Gly Met Val Pro Pro Glu Glu Leu Val His Thr Gly 50 55 60 Pro Asp Asp Trp Trp Gln Asp Val Met Asn Gly Tyr Gln Phe Leu Lys 65 70 75 80 Asn Lys Gly Tyr Glu Lys Ile Ala Val Ala Gly Leu Ser Leu Gly Gly 85 90 95 Val Phe Ser Leu Lys Leu Gly Tyr Thr Val Pro Ile Glu Gly Ile Val 100 105 110 Thr Met Cys Ala Pro Met Tyr Ile Lys Ser Glu Glu Thr Met Tyr Glu 115 120 125 Gly Val Leu Glu Tyr Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Arg Glu Gly Lys Ser 130 135 140 Glu Glu Gln Ile Glu Gln Glu Met Glu Arg Phe Lys Gln Thr Pro Met 145 150 155 160 Lys Thr Leu Lys Ala Leu Gln Glu Leu Ile Ala Asp Val Arg Ala His 165 170 175 Leu Asp Leu Val Tyr Ala Arg Thr Phe Val Val Gln Ala Arg His Asp 180 185 190 Lys Met Ile Asn Pro Asp Ser Ala Asn Ile Ile Tyr Asn Glu Ile Glu 195 200 205 Ser Pro Val Lys Gln Ile Lys Trp Tyr Glu Gln Ser Gly His Val Ile 210 215 220 Thr Leu Asp Gln Glu Lys Asp Gln Leu His Glu Asp Ile Tyr Ala Phe 225 230 235 24030600 660 720 Leu Glu Ser Leu Asp Trp 245 <210>4 <211>741 <212>DNA <213> 高温烷烃地芽孢杆菌 <400>4 atgatgaaaa ttgttccgcc gaagccgttt ttctttgaag ccggggagcg ggcggtgctg cttttgcatg ggtttaccgg caattccgcc gacgttcgga tgcttgggcg attcttggaa tcgaaagggt atacgtgcca cgctccgatt acaaagggca tggtgccgcc ggaagagctc gtccacaccg gaccggatga ttggtggcaa gacgtcatga acggctatca gtttttgaaa aacaaaggct acgaaaaaat tgccgtggct ggattgtctc ttggaggcgt attttctctc aaattaggct acactgtacc tatagaaggc attgtgacga tgtgcgcgcc gatgtacatc aaaagcgaag aaacgatgta cgaaggtgtg ctcgagtatg cgcgcgagta taaaaagcgg gaagggaaat cagaggaaca aatcgaacag gaaatggaac ggttcaaaca aacgccgatg aagacgttga aagccttgca agaactcatt gccgatgtgc gcgcccacct tgatttggtt tatgcacgca cgttcgtcgt ccaagcgcgc catgataaga tgatcaatcc agacagcgcg aacatcattt ataacgaaat tgaatcgccg gtcaaacaaa tcaaatggta tgagcaatca ggccatgtga ttacgcttga tcaagaaaaa gatcagctgc atgaagatat ttatgcattt cttgaatcgt tagattggta a <210>5 <211>256 <212>PRT <213> 肠道沙门氏菌 (Salmonella enterica) <400>5 Met Asn Asp Ile Trp Trp Gln Thr Tyr Gly Glu Gly Ash Cys His Leu 1 5 10 15 Val Leu Leu His Gly Trp Gly Leu Asn Ala Glu Val Trp His Cys Ile 20 25 30 Arg Glu Glu Leu Gly Ser His Phe Thr Leu His Leu Val Asp Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Gly Arg Ser Ser Gly Phe Gly Ala Met Thr Leu Glu Glu Met 50 55 60 Thr Ala Gln Val Ala Lys Asn Ala Pro Asp Gln Ala Ile Trp Leu Gly 65 70 75 80 Trp Ser Leu Gly Gly Leu Val Ala Ser Gln Met Ala Leu Thr His Pro 85 90 95 Glu Arg Val Gln Ala Leu Val Thr Val Ala Ser Ser Pro Cys Phe Ser 100 105 1103160 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 741101993861 A CN 101993865
     说明书Lys Pro Glu Ile Leu 125 Gln Arg Thr Val Glu 140 Thr Ala Arg Gln Asp 155 Pro Met Pro Asp Val 170 Thr Val Asp Leu Arg 185 Arg Leu Tyr Gly Tyr 205 Leu Leu Asp Thr Leu 220 Ala Ala His Ala Pro30/62 页Ala Arg Glu 115 Gln Gln Gln 130 Ala Leu Gln 145 Leu Lys Ser Asn Gly Gly Lys Asn Val 195 Leu Val Pro 210 Ser Thr SerGly Trp Pro Gly Ile 120 Leu Ser Asp Asp Phe 135 Thr Leu Gly Thr Glu 150 Val Val Leu Ala Gln 165 Leu Glu Ile Leu Lys 180 Asn Met Pro Phe Leu 200 Arg Lys Ile Ala Pro 215 Gln Ile Met Ala LysGly Gly Phe Arg Phe Leu Ala Arg Thr 160 Glu Val Leu 175 Glu Ala Leu 190 Leu Asp Gly Trp Pro His Phe Ile Ser225 230 His Pro Ala Ala Phe Cys Gln Ala 245 <210>6 <211>771 <212>DNA <213> 肠道沙门氏菌 <400>6 ttacagcgat gattttagcg tcatcagcgc cggcgcatgg gccgccttcg ccattatctg caaaggcgcg attttacgcg gcaccagacc catgttcaca tttttaagcg cttctcgtag attgagcacc tctacatccg gcataggctg atcctgacgc gccgtctccg tccctaacgt ctgaaaatcg tcgctaagct gctgctggaa ccacccctca cgcgcgctaa agcatggcga ttcagggtgg gtgagcgcca tctgactcgc gatagcctgg tccggcgcgt ttttcgctac gccaaacccc gagctgcgac catagcccgg gccgagttcc tcgcgaatgc aatgccatac cacaagatga caatttccct cgccgtaggt <210>7 <211>541 <212>PRT32235 240 Leu Met Thr Leu Lys Ser Ser Leu 250 255ctgacaaaac tgatgtactg gtccagataa atcgaccgtt cgccagcact ttgcagcgcc tccgccgagg agaggcgact caccaggccg ctgcgccgtc caagtcgacc ctccgcgttc ctgccaccaggccgccggat tgcggccata ccatacaaac tttaagattt acgcttttta agaaaacgct atttctggtt gtcaccagcg cccaggctcc atctcttcaa agatgcagcg aatccccatc atgtcattcagcgagataaa acgtatcgag gcaaaaacgg ccagtccgcc aggtgcgggc ccaccgtgcg ttattcccgg cctgaacgcg agccaagcca gcgtcatggc taaaatgcga cgtgcagcag t60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 <213> 烟曲霉 (Aspergillus fumigatus) <400>7 Met Val Ile Ser Thr Lys Tyr Ile Phe 1 5 Thr Phe Ser Leu Ser Ser Ala Tyr Glu 20 25 Tyr Gly Gln Phe Gln Gly Lys Tyr Asp 35 40 Phe Arg Lys Ile Pro Phe Ala Ala Pro 50 55 Arg Ala Pro Gln Pro Pro Leu Arg Ile 65 70 Asp Gln Asp Phe Asp Met Cys Pro Gln 85 Asp Cys Leu Tyr Leu Gly Leu Phe Ser 100 Ala Pro Ser Ser Ala Ser Arg 115 Gly Phe Ile Gln Gly Ser Ala 130 135 Pro Ile Leu Asn Val Thr Glu 145 150 Asn Tyr Arg Val Asn Ala Phe 165 Arg Ser Pro Thr Ser Asp Leu 180 Val Leu Lys Trp Val Gln Lys 195 Arg Asn Val Thr Ile Trp Gly 210 215 Ala Gln Val Leu Ala Asn Gly 225 230 Lys Ala Leu Val Ser Ser Pro 245 Ala Pro Glu Ala Glu Ala Ile 260Ala Leu Cys Val Leu 10 Asp Pro Leu Val Glu 30 Ser Thr Tyr Asn Leu 45 Pro Thr Gly Glu Asn 60 Thr His Gly Val Tyr 75 Arg Thr Val Asn Gly 90 Arg Pro Trp Asp AlaLeu Leu 15 Leu Asp Ser Tyr Arg Phe Asp Thr 80 Ser Glu 95 Thr Val105 Pro Val Leu Val Val 120 Ser Phe Thr Leu Pro 140 Leu Asn Asp Tyr Val 155 Gly Phe Leu Pro Gly 170 Asn Pro Gly Leu Leu 185 Tyr Ile His His Phe 200 Gln Ser Ala Gly Ala 220 Arg Gly Asn Gln Pro 235 Phe Trp Pro Lys Thr 250 Tyr Asp Gln Leu Val 265110 Phe Tyr Gly Gly 125 Pro Ser Ser Tyr Val Ile Tyr Pro 160 Lys Ala Ile Lys 175 Asp Gln Gln Tyr 190 Gly Gly Asp Pro 205 Gly Ser Val Val Lys Leu Phe Asp 240 Tyr Ala Tyr Asp 255 Thr Leu Thr Gly 270Cys Ala Asn Ala Thr Asp Ser Leu Ala Cys Leu Lys Ser Val Asp Val 275 280 285 Gln Thr Ile Arg Asp Ala Asn Leu Ile Ile Ser Ala Ser His Thr Tyr33101993861 A CN 101993865
     说明书300 Pro Val Ile Asp Gly Glu Phe 315 Ala Arg Arg Lys Ile Lys Thr 330 335 His Glu Gly Glu Asn Phe Leu 345 350 Thr Ala Gly Phe Asn Ser Ser 365 Gly Phe Leu Pro Gly Leu Ser 380 Lys Tyr Tyr Pro Pro Thr Gly 395 Thr Thr Leu Val Arg Ala Gly 410 415 Cys Pro Ala Tyr Trp Leu Thr 425 430 Gly Glu Tyr Thr Ile Ser Pro 445 Trp Asn Arg Val Asn Pro Ile 460 Gly Phe Ala Gly Ala Phe Gly 475 Ala His Lys Leu Thr Asn Ala 490 495 Lys Thr Gly Glu Glu Trp Val 505 510 Gln Val Ser Phe Leu Lys Glu 525 Glu Arg Val Pro Val 54032/62 页290 295 Asn Thr Ser Ser Tyr Thr Trp Ala 305 310 Gln Glu Ser Leu Thr Thr Ala Val 325 Phe Val Phe Gly Met Tyr Asn Thr 340 Ser Gly Leu Gly Lys Thr Ala Thr 355 360 Ala Ser Phe His Thr Trp Leu Thr 370 375 Lys His Ile Ala Leu Leu Glu Thr 385 390 Thr Glu Thr Ile Asp Leu Tyr Asn 405 Val Tyr Arg Asp Leu Val Leu Ala 420 Ala Ala Arg Arg Arg Gly Tyr Leu 435 440 Lys His Ala Ser Asp Thr Ile Tyr 450 455 Gln Thr Asp Pro Leu Ile Tyr Asp 465 470 Phe Phe Gln Thr Gly Asp Pro Asn 485 Glu Lys Gly Val Pro Val Leu Glu 500 Ala Pro Asp Gly Phe Ala Thr Ala 515 520 Cys Asp Phe Trp Glu Ser Val Gly 530 535 <210>8 <211>1626 <212>DNA <213> 烟曲霉 <400>8 atggtgatct caacgaagta tatatttgcc tctagcgcct acgaagatcc cctcgtcgag gactctacgt ataatctctc atacttccgc34Leu 320 His Pro Ala Pro Glu 400 Leu Ser Ala Gln Ser 480 Ser Ile Argctttgcgtcc tcttgctgac cttctcactc ctcgactatg ggcagttcca gggcaaatat aagatcccct ttgcggcgcc tccaacgggg60 120 gagaaccggt ttagagcccc tcagccacct ctaaggatca cgcatggcgt ctatgacact gatcaggact ttgacatgtg cccgcaacgc acggtcaatg gctccgaaga ctgcctctac cttggcctgt tctcacgacc gtgggatgct acagtggctc cctcgtctgc ttctagacca gtcctggtag tcttctacgg tggtggcttc atccaaggca gcgcttcgtt tacactacct ccgtcctcat atccaatcct gaacgtcacc gagctgaatg actatgtggt catctacccc aactaccggg tcaatgcatt tggtttcctt ccgggcaagg cgatcaagcg atctccaacg tctgatctca accccggcct cttggaccag cagtacgttc tcaagtgggt gcagaaatac attcaccact tcggcggtga ccctcgcaac gtcacgatct ggggccaatc cgccggcgcc ggctcagtgg ttgcgcaggt tctcgccaac ggacgaggca accaacccaa gctcttcgac aaagcgctcg tcagctcgcc cttctggcca aagacctacg cctacgacgc ccccgaagca gaagccatct acgaccagct tgtcactctc accggctgcg ccaatgccac cgactccctc gcctgcctga aatccgtcga cgtccagacc atccgcgacg caaacctcat catcagcgcc agccacacct acaacacaag ctcctacacc tgggcccccg tcatcgacgg cgaattcctc caagaatccc tcaccaccgc cgtcgcccgc cgcaaaatca aaacccactt cgtcttcggc atgtacaaca cccacgaggg cgagaacttc ctcccctccg gcctgggcaa gaccgctaca accgctgggt tcaactcctc tgctgctagc ttccacacct ggctgacggg cttcctgccg ggtctctcgc ccaagcacat cgccctcctc gaaaccaagt actacccgcc caccggcgaa acagagacaa tcgacctgta caacacgacg ctcgtccgcg cgggcctggt ctacagggat cttgtcctcg cctgtccggc gtactggctt acctcggccg caagacggag gggctatcta ggtgaatata cgatttcgcc ggctaagcac gcgagcgata ccatctattg gaaccgagtg aacccgatcc agcagactga tccactgatt tatgacggct tcgcaggcgc ttttgggagt ttcttccaga cgggcgatcc gaatgcgcat aagctgacga atgcgtcgga gaagggtgtg ccggttctcg agaagaccgg ggaggagtgg gtgattgctc cggatgggtt tgcaaccgcg caggtgtcgt ttttaaagga gaggtgtgat ttctgggagt cggtggggga gcgggttcct gtctga <210>9 <211>247 <212>PRT <213> 嗜热脂肪地芽孢杆菌 (Geobacillus stearothermophilus) <400>9 Met Met Lys Ile Val Pro Pro Lys Pro Phe Phe Phe Glu Ala Gly Glu 1 5 10 15 Arg Ala Val Leu Leu Leu His Gly Phe Thr Gly Asn Ser Ala Asp Val 20 25 30 Arg Met Leu Gly Arg Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Thr Cys His Ala 35 40 45 Pro Ile Tyr Lys Gly His Gly Val Pro Pro Glu Glu Leu Val His Thr 50 55 60 Gly Pro Asp Asp Trp Trp Gln Asp Val Met Asn Gly Tyr Glu Phe Leu35240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1626101993861 A CN 101993865
     说明书75 Ala Val Ala Gly Leu Ser 90 Tyr Thr Val Pro Ile Glu 105 110 Ile Lys Ser Glu Glu Thr 125 Glu Tyr Lys Lys Arg Glu 140 Met Glu Lys Phe Lys Gln 155 Glu Leu Ile Ala Asp Val 170 Thr Phe Val Val Gln Ala 185 190 Ala Asn Ile Ile Tyr Asn 205 Trp Tyr Glu Gln Ser Gly 220 Gln Leu His Glu Asp Ile 23534/62 页65 70 Lys Asn Lys Gly Tyr Glu Lys Ile 85 Gly Val Phe Ser Leu Lys Leu Gly 100 Val Thr Met Cys Ala Pro Met Tyr 115 120 Glu Gly Val Leu Glu Tyr Ala Arg 130 135 Ser Glu Glu Gln Ile Glu Gln Glu 145 150 Met Lys Thr Leu Lys Ala Leu Gln 165 His Leu Asp Leu Ile Tyr Ala Pro 180 Asp Glu Met Ile Asn Pro Asp Ser 195 200 Glu Ser Pro Val Lys Gln Ile Lys 210 215 Ile Thr Leu Asp Gln Glu Lys Asp 225 230 Phe Leu Glu Ser Leu Asp Trp 245 <210>10 <211>744 <212>DNA <213> 嗜热脂肪地芽孢杆菌 <400>10 atgatgaaaa ttgttccgcc gaagccgttt ctgttgcatg ggtttaccgg caattccgct tccaaaggct atacgtgcca tgcgcctatt ctcgtccaca ccgggccgga tgactggtgg aaaaacaagg gctacgaaaa aatcgccgtc ttgaaattag gttacactgt acctatagag atcaaaagcg aggaaacgat gtacgaaggc cgggaaggaa aatcagagga gcagatcgaa atgaagacgt taaaggcgct gcaggagctg atttatgccc cgacgtttgt tgtgcaggcg gcgaacatca tttataacga aattgaatcg3680 Leu Gly 95 Gly Ile Met Tyr Gly Lys Thr Pro 160 Arg Asp 175 Arg His Glu Ile His Val Tyr Ala 240ttctttgaag gatgttcgga tacaaaggac caagatgtca gccggactgt ggcattgtga gtgctcgagt caggagatgg atcgccgatg cgccatgatg ccggtcaaacccggggagcg tgctcgggcg acggcgtgcc tgaacggcta cgcttggagg cgatgtgcgc atgcgcgcga agaagttcaa tgcgtgacca agatgatcaa aaatcaagtgggcggtgctg ttttttagaa gcctgaggag cgagtttttg cgtattttca gccgatgtac gtataaaaag gcagacgccg tcttgatttg cccggacagc gtatgagcaa60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 tcaggccatg tgattacgct tgatcaagaa tttcttgaat cgttagattg gtaa <210>11 <211>176 <212>PRT <213> 嗜热脂肪地芽孢杆菌 <400>11 Lys Leu Gly Glu Lys Glu Leu Leu 1 5 Pro Val Pro Glu Glu Ala Ile Arg 20 Ser Ala Pro Thr Trp Gln Thr Trp 35 40 Phe Val Glu Gly Met Leu Arg Thr 50 55 Ala Asp Val Tyr Met Tyr Arg Phe 65 70 Gly Gln Leu Lys Ala Cys His Ala 85 Asn Leu His Gln Pro Gly Val Ala 100 Arg Glu Ala Ile Ala Asn Glu Met 115 120 Arg Thr Gly Asp Pro Asn Gly Ala 130 135 Tyr Thr Asn Glu Arg Lys Ala Ala 145 150 Val Glu Asp Asp Pro Phe Gly Arg 165 <210>12 <211>531 <212>DNA <213> 嗜热脂肪地芽孢杆菌 <400>12 aagcttggcg aaaaggaact tcttgaccga gaggccatcc gctattacaa agaaacggcg cttcgcatca tgacgtaccg cgtatttgtc gcggcgcaag gggcggatgt gtacatgtac ggccagctga aagcatgcca cgcgctcgag37aaagatcagc tgcatgaaga tatttatgca720 744Asp Arg Ile Asn Arg 10 Tyr Tyr Lys Glu Thr 25 Leu Arg Ile Met Thr 45 Ala Asp Ala Gln Ala 60 Asp Tyr Glu Thr Pro 75 Leu Glu Leu Pro Phe 90 Asn Phe Val Gly Asn 105 His Tyr Ala Trp Leu 125 His Leu Pro Glu Ala 140 Phe Val Phe Ser Ala 155 Glu Arg Ala Ala Trp 170Glu Val Gly 15 Ala Glu Pro 30 Tyr Arg Val Ala Gln Gly Val Phe Gly 80 Val Phe His 95 Arg Pro Glu 110 Ser Phe Ala Trp Pro Ala Ala Ser His 160 Gln Gly Arg 175atcaaccggg gagccgtcgg gaggggatgc cgctttgact ctgccgtttgaagtcgggcc cgcctacttg tgcggacggc atgagacgcc tgtttcacaaggtgccagaa gcaaacgtgg ggacgcccaa ggtgttcggc tctccatcag60 120 180 240 300101993861 A CN 101993865
     说明书aggcgatcgc acggtgctca tcttttcggc aaggacgcta caatgaaatg cttgccggaa cgccagccat g36/62 页ccgggcgtcg cgaatttcgt cggcaaccgg cattacgctt ggctctcgtt tgcccgcacc gcgtggccgg cgtatacgaa cgagcgcaag gtcgaggacg acccgttcgg ccgcgagcgg <210>13 <211>498 <212>PRT <213> 嗜热脂肪地芽孢杆菌 <400>13 Met Glu Arg Thr Val Val Glu Thr 1 5 Met Asn Glu Gly Val Phe Val Trp 20 Pro Val Gly Glu Arg Arg Phe Leu 35 40 Asp Gly Val Arg Glu 50 Ser Asp Pro Ile Phe 65 Ser Glu Asp Gly Leu 85 Lys Lys Arg Pro Val 100 Gly Ser Gly Ser Ser 115 Gly Asp Val Val Val 130 Phe Leu His Leu Gly 145 Asn Leu Gly Ile Leu 165 Asn Ile Ala Ala Phe 180 Glu Ser Ala Gly Ala 195 Ala Ser Gly Leu Pheccggagcgcg ggagacccga gcggcctttg gcggcatggc360 420 480 531Arg Tyr Gly Arg Leu 10 Lys Gly Ile Pro Tyr 25 Pro Pro Glu Pro Pro 45Arg Gly Glu 15 Ala Lys Ala 30 Asp Ala Trp Pro Pro 80 Gly Phe His Gly Gly 160 Glu Gly Glu SerAla Thr Ser Phe Gly 55 Ser Gly Leu Leu Gly 70 Tyr Leu Asn Ile Trp 90 Leu Phe Trp Ile His 105 Pro Trp Tyr Asp Gly 120 Val Thr Ile Asn Tyr 135 Asp Ser Phe Gly Glu 150 Asp Gln Val Ala Ala 170 Gly Gly Asp Pro Asp 185 Ala Ser Val Gly Val 200 Arg Arg Ala Met LeuPro Val Val Met Gln 60 Arg Met Ser Glu Ala 75 Ser Pro Ala Ala Asp 95 Gly Gly Ala Phe Leu 110 Thr Ala Phe Ala Lys 125 Arg Met Asn Val Phe 140 Ala Tyr Ala Gln Ala 155 Leu Arg Trp Val Lys 175 Asn Ile Thr Ile Phe 190 Leu Leu Ser Leu Pro 205 Gln Ser Gly Ser Gly210 215 220 Leu Leu Leu Arg Ser Pro Glu Thr Ala Met Ala Met Thr Glu Arg Ile 225 230 235 24038101993861 A CN 101993865
     说明书Gly Asp Arg Glu Arg 250 Ala Ala Leu Ser Leu 265 Gly Arg Val Leu Arg 285 Ala Ser Gly Ile Pro 300 Leu Phe Thr Leu Thr 315 Leu Leu Asp Arg Ile 330 Ile Arg Tyr Tyr Lys 345 Thr Trp Leu Arg Ile 365 Arg Thr Ala Asp Ala 380 Arg Phe Asp Tyr Glu 395 His Ala Leu Glu Leu 410 Val Ala Asn Phe Val 425 Glu Met His Tyr Ala 445 Gly Ala His Leu Pro 460 Ala Ala Phe Val Phe 475 Gly Arg Glu Arg Ala 49037/62 页Leu Asp Lys Ala Gly Ile Arg Pro 245 Ile Pro Ala Glu Glu Leu Leu Arg 260 Val Met Tyr Gly Pro Val Val Asp 275 280 Ile Glu Ala Leu Arg Tyr Gly Ala 290 295 Gly Val Thr Lys Asp Glu Tyr Asn 305 310 Trp Thr Lys Leu Gly Glu Lys Glu 325 Val Gly Pro Val Pro Glu Glu Ala 340 Glu Pro Ser Ala Pro Thr Trp Gln 355 360 Arg Val Phe Val Glu Gly Met Leu 370 375 Gln Gly Ala Asp Val Tyr Met Tyr 385 390 Phe Gly Gly Gln Leu Lys Ala Cys 405 Phe His Asn Leu His Gln Pro Gly 420 Pro Glu Arg Glu Ala Ile Ala Asn 435 440 Phe Ala Arg Thr Gly Asp Pro Asn 450 455 Pro Ala Tyr Thr Asn Glu Arg Lys 465 470 Ser His Val Glu Asp Asp Pro Phe 485 Gly Arg <210>14 <211>1497 <212>DNA <213> 嗜热脂肪地芽孢杆菌 <400>14 atggagcgaa ccgttgttga aacaaggtac39Leu Leu Ser 255 Gly Pro Gly 270 Arg His Pro Ile Leu Ile Asp Pro Ser 320 Asn Arg Glu 335 Glu Thr Ala 350 Met Thr Tyr Gln Ala Ala Thr Pro Val 400 Pro Phe Val 415 Gly Asn Arg 430 Trp Leu Ser Glu Ala Trp Ser Ala Ala 480 Ala Trp Gln 495ggacggttgc gcggggaaat gaatgaaggc60101993861 A CN 101993865
     说明书tcggtgagcg cgacatcgtt ggcggatgag cggatgggaa cgggttcttc tgacgatcaa aagcgtacgc tgaaggagaa cggccggagc ggcgcgccat tggcgatgac tgttgtcgat tgtacggtcc acggggcggc ttaccttgac accgggaagt cgtcggcgcc ggatgctgcg ttgactatga cgtttgtgtt agcgcgaggc acccgaacgg cctttgtctt catggcaagg ccggtttttg cggtcctgtc cgaggcgccg gaagcgcccg gccgtggtat ctaccgaatg gcaagccggg cattgcggcg ggcgagcgtc gttgcaaagc cgaacgcatt tcctgccgag ggtggtggat cagcggcatt ggatccgtca cgggccggtg tacttggcaa gacggcggac gacgccggtg tcacaatctc gatcgccaat tgctcacttg ttcggccgcc acgctag38/62 页gtttttgttt ggaaaggaat tccgtacgcg ccgccggagc cgcccgatgc gtgggatggg gtgatgcagc cgtcggatcc gattttcagc agcgaagacg ggctgtactt gaacatttgg gtgttgtttt ggattcacgg cggcgccttt gacgggacgg cgttcgcgaa acacggcgat aacgtgtttg gctttttgca tctcggtgat aatctcggca ttttggacca agtggcggcg tttggtggtg atccggacaa catcacgatt ggcgtgctgt tgtcgcttcc ggaggccagc ggttcgggat cgcttcttct ccgttcgccg cttgataagg ctggcatccg tccgggcgac gagctgctgc gggcggcgct gtcgctcggt ggccgcgtat tgcgccgcca tccgatcgaa ccgattctca tcggcgtgac gaaagacgag tggacaaagc ttggcgaaaa ggaacttctt ccagaagagg ccatccgcta ttacaaagaa acgtggcttc gcatcatgac gtaccgcgta gcccaagcgg cgcaaggggc ggatgtgtac ttcggcggcc agctgaaagc atgccacgcg catcagccgg gcgtcgcgaa tttcgtcggc gaaatgcatt acgcttggct ctcgtttgcc ccggaagcgt ggccggcgta tacgaacgag agccatgtcg aggacgaccc gttcggccgc <210>15 <211>226 <212>PRT <213> 嗜热脂肪地芽孢杆菌 <400>15 Met His Asn Asp Leu Ala Tyr Glu 1 5 Gly Glu Ala Gly Lys Lys Tyr Pro 20 Gly Tyr Asp Glu Gln Tyr Met Leu 35 40 Glu Phe Ile Leu Ile Gly Ile Arg 50 55 Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Leu Lys Glu 65 7040aaagcgccgg gtgcgggagg ggattgctcg tcgccggcgg ttgttcggtt gtcgttgtcg tcgttcggcg ctgcgctggg ttcggtgaat gggctgtttc gagaccgcga cgcgaacggc ccaggggtca gcgctccgct tacaacttgt gaccgaatca acggcggagc tttgtcgagg atgtaccgct ctcgagctgc aaccggccgg cgcaccggag cgcaaggcgg gagcgggcgg120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1497Tyr Asp Ile His Leu 10 Ala Val Phe Ala Leu 25 Thr Leu Val Lys Asp 45 Gly Asp Leu Pro Tyr 60 Tyr Gly Lys Pro Glu 75Pro Ser Gly 15 His Gly Ile 30 Leu Lys Glu Glu Asp Gly Arg Lys Met 80101993861 A CN 101993865
     说明书Lys His Phe Ile Glu 90 Arg Val Tyr Leu Ile 105 Leu Ala Leu Ile Leu 125 Gly Tyr Ile Pro Ser 140 Ser His Leu Ser Val 155 Pro Leu Asn Ile Gly 170 Gly Ala Val Lys Tyr 185 Asp Asn Gln Arg Asp 205 His Asn Ser Asn Lys 22039/62 页Phe Asp Asp Ser Ile Gly Lys Leu 85 Asn Gln Tyr Pro Ile Asp Ser Asp 100 Gln Gly Ala Ile Leu Ser Met Ser 115 120 Ile Lys Gly Ile Ala Ala Met Asn 130 135 Glu Glu Tyr Pro Leu Gln Pro Ile 145 150 Gln Gly Glu Ser Asp His Ile Phe 165 Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln His Ala 180 Pro Ala Gly His Glu Ile Ser Gln 195 200 Trp Leu Arg His Asp Ala Phe His 210 215 Pro Ala 225 <210>16 <211>681 <212>DNA <213> 嗜热脂肪地芽孢杆菌 <400>16 atgcataatg acttggcata tgaatatgac aaaaagtatc cggctgtttt cgcgttgcac actttagtga aagatttaaa agaagaattt tatgaagatg gatatgccta ttattatttg ttcgatgata gcataggcaa attaaagcac attgattccg atcgagtgta tttgatcggg ctcgccttga tactgggcga taaaattaaa tcgtttgtga aggaagaata tccgttgcag caaggcgaat cagatcatat ttttccttta cgccagcatg cgggggctgt gaagtatacc gacaaccaac gcgacatcgt ttcatggctg aaggcaacaa atcccgcatg a <210>17 <211>45441Tyr Ala Leu 95 Gly Phe Ser 110 Gly Asp Lys Phe Val Lys Phe Leu Thr 160 Gln Glu Asn 175 Thr Ile Tyr 190 Ile Val Ser Ala Thr Asnattcatcttc ggcatcgggt attttaatag aaagaatatg ttcattgaat tttagtcaag gggattgccg cctatcagtc aatattgggc atttatccgg cgtcatgatgcttctggcgg atgacgaaca gcattagagg gaaagccaga atgcattaaa gcgccatttt caatgaacgg acttgtctgt aggaaaatta caggacatga cattccatcaagaagcgggg atacatgctt ggatctcccg acggaaaatg ccaatatccg aagtatgtct atatatacca gtttctcacc tgaatacttg aatatcgcaa caattccaat60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 <212>PRT <213> 人 (Homo sapiens) <400>17 Glu His Cys Leu Tyr Leu 1 5 Lys Asn Arg Leu Pro Val 20 Val Gly Ala Ala Ser Thr 35 Asn Val Val Val Val Thr 50 Phe Ser Thr Gly Asp Glu 65 70 Gln Val Ala Ala Leu Arg 85 Gly Asn Pro Gly Ser Val 100 Ser Val Ser Val Leu Val 115 Arg Ala Ile Ser Glu Ser 130 Lys Gly Asp Val Lys Pro 145 150 Cys Lys Thr Thr Thr Ser 165 Thr Glu Glu Glu Leu Leu 180 Leu Trp Thr Tyr Arg Glu 195 Val Ile Asp Gly Met Leu 210 Glu Arg Asn Phe His Thr 225 230 Glu Phe Gly Trp Leu Ile 245 Glu Gly Gln Leu Asp Gln 260 Ile Pro Leu Phe Ala Ile 275Asn Ile Tyr Thr 10 Met Val Trp Ile 25 Tyr Asp Gly Leu 40 Ile Gln Tyr Arg 55 His Ser Arg Gly Trp Val Gln Asp 90 Thr Ile Phe Gly 105 Leu Ser Pro Leu 120 Gly Val Ala Leu 135 Leu Ala Glu Gln Ala Ala Met Val 170 Glu Thr Thr Leu 185 Thr Gln Arg Glu 200 Leu Leu Lys Thr 215 Val Pro Tyr Met Pro Met Gln Leu 250 Lys Thr Ala Met 265 Ala Lys Glu Leu 28042Pro Ala Asp Leu Thr 15 His Gly Gly Gly Leu 30 Ala Leu Ala Ala His 45 Leu Gly Ile Trp Gly 60 Asn Trp Gly His Leu 75 Asn Ile Ala Ser Phe 95 Glu Ser Ala Gly Gly 110 Ala Lys Asn Leu Phe 125 Thr Ser Val Leu Val 140 Ile Ala Ile Thr Ala 155 His Cys Leu Arg Gln 175 Lys Ile Gly Asn Ser 190 Ser Thr Leu Leu Gly 205 Pro Glu Glu Leu Gln 220 Val Gly Ile Asn Lys 235 Met Ser Tyr Pro Leu 255 Ser Leu Leu Gly Ser 270 Ile Pro Glu Ala Thr 285Lys Met Glu Phe Asp 80 Gly Glu His Lys Gly 160 Lys Tyr Thr Arg Gln 240 Ser Pro Glu101993861 A CN 101993865
     说明书Lys Lys Lys Asp Leu 300 Val Pro Ser Val Ile 315 Thr Tyr Met Tyr Glu 335 Lys Pro Lys Thr Val 350 Phe Gly Ala Pro Phe 365 Leu Ser Lys Met Val 380 Asn Pro Asn Gly Lys 395 Glu Gly Tyr Leu Gln41/62 页Lys Tyr Leu Gly Gly 290 Leu Asp Leu Ile Ala 305 Ala Arg Asn His Arg 325 Gln Tyr Arg Pro Ser 340 Gly Asp His Gly Asp 355 Lys Glu Gly Ala Ser 370 Lys Phe Trp Ala Asn 385 Leu Pro His Trp ProThr Asp Asp Thr Val 295 Asp Val Met Phe Gly 310 Asp Ala Gly Ala Pro 330 Phe Ser Ser Asp Met 345 Glu Leu Phe Ser Val 360 Glu Glu Glu Ile Arg 375 Phe Ala Arg Asn Gly 390 Glu Tyr Asn Gln LysIle Val 320 Phe Ile Leu Met Gly 400 Ile405 Gly Ala Asn Thr Gln Ala Ala Gln 420 Phe Trp Thr Asn Leu Phe Ala Lys 435 440 Thr Asp His Ile Glu Leu 450 <210>18 <211>1367 <212>DNA <213> 人 <400>18 ctgaacactg tctttacctc aatatttaca tgccggtgat ggtgtggatc cacggagggg atgggctggc ccttgctgcc catgaaaacg gcatctgggg attcttcagc acaggggatg accaggtggc tgccctgcgc tgggtccagg gctctgtgac catctttgga gagtcagcgg ctccattggc caagaacctc ttccaccggg ctgttctggt gaagaaaggt gatgtcaagc ggtgcaaaac caccacctct gctgctatgg410 415 Lys Leu Lys Asp Lys Glu Val Ala 425 430 Lys Ala Val Glu Lys Pro Pro Gln 445ctcctgcaga ggctgatggt tggtggtggt aacacagccg acaacattgc gaggagaaag ccatttctga ccttggctga ttcactgcctcttgaccaag gggtgcggca gaccattcaa ggggaactgg cagctttgga tgtctctgtt gagtggcgtg gcaaattgct gcgacagaagaaaaacaggc tcaacctatg tatcgcctgg ggtcacctgg gggaacccag cttgttttgt gccctcactt atcactgctg acggaagagg60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720agctcttgga gacgacattg aaaattggaa attcttatct ctggacttac agggagaccc agagagagtc aacccttctg ggcactgtga ttgatgggat gctgctgctg aaaacacctg aagagcttca acgtgaaagg aatttccaca ctgtccccta catggtcgga attaacaagcaggagtttgg ctggttgatt ccaatgcagt tgatgagcta tccactctcc gaagggcaac tggaccagaa gacagccatg tcactccttg gaagtcctat ccccttgttt gccattgcta aggaactgat tccagaagcc actgagaaat acttaggagg aacagacgac actgtcaaaa agaaagacct gatcctggac ttgatagcag atgtgatgtt tggtgtccca tctgtgattg tggcccggaa ccacagagat gctggagcac ccacctacat gtatgagttt cagtaccgtc caagcttctc atcagacatg aaacccaaga cggtgatagg agaccacggg gatgagctct tctccgtctt tggggcccca tttttaaaag agggtgcctc agaagaggag atcagactta gcaagatggt gatgaaattc tgggccaact ttgctcgcaa tggaaacccc aatgggaaag ggctgcccca ctggccagag tacaaccaga aggaagggta tctgcagatt ggtgccaaca cccaggcggc ccagaagctg aaggacaaag aagtagcttt ctggaccaac ctctttgcca agaaggcagt ggagaagcca ccccagacag accacataga gctgtga <210>19 <211>565 <212>PRT <213> 小鼠 (Mus musculus) <400>19 Met Trp Leu Cys Ala Leu Ser Leu Ile Ser Leu Thr Ala Cys Leu Ser 1 5 10 15 Leu Gly His Pro Ser Leu Pro Pro Val Val His Thr Val His Gly Lys 20 25 30 Val Leu Gly Lys Tyr Val Thr Leu Glu Gly Phe Ser Gln Pro Val Ala 35 40 45 Val Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Lys Pro Pro Leu Gly Ser Leu Arg 50 55 60 Phe Ala Pro Pro Glu Pro Ala Glu Pro Trp Ser Phe Val Lys His Thr 65 70 75 80 Thr Ser Tyr Pro Pro Leu Cys Tyr Gln Asn Pro Glu Ala Ala Leu Arg 85 90 95 Leu Ala Glu Arg Phe Thr Asn Gln Arg Lys Ile Ile Pro His Lys Phe 100 105 110 Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Thr 115 120 125 Gln Asn Ser Arg Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Leu 130 135 140 Val Ile Asp Gly Ala Ser Thr Tyr Asp Gly Val Pro Leu Ala Val His 145 150 155 160 Glu Asn Val Val Val Val Val Ile Gln Tyr Arg Leu Gly Ile Trp Gly 165 170 175 Phe Phe Ser Thr Glu Asp Glu His Ser Arg Gly Asn Trp Gly His Leu44780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 180 Asp Gln Val Ala Ala Leu His 195 Gly Gly Asn Pro Gly Ser Val 210 215 Glu Ser Val Ser Val Leu Val 225 230 His Arg Ala Ile Ala Gln Ser 245 Gly Arg Ala Ala Arg Pro Leu 260 Cys Lys Thr Thr Thr Ser Ala 275 Thr Glu Asp Glu Leu Leu Glu 290 295 Val Asp Phe Leu Gly Asp Pro 305 310 Val Ile Asp Gly Val Leu Leu 325 Glu Lys Ser Phe Asn Thr Val 340 Glu Phe Gly Trp Ile Ile Pro 355 Arg Lys Leu Glu Gln Lys Thr 370 375 Pro Ile Leu Asn Ile Ser Glu 385 390 Tyr Leu Gly Gly Thr Glu Asp 405 Asp Leu Ile Gly Asp Ile Met 420 Arg Ser His Arg Asp Ala Gly 435 Tyr Arg Pro Ser Phe Val Ser 450 455 Asp His Ala Asp Glu Leu Phe 465 470 Glu Gly Ala Ser Glu Glu Glu 485185 Trp Val Gln Asp Asn 200 Thr Ile Phe Gly Glu 220 Leu Ser Pro Leu Ala 235 Ser Val Ile Phe Asn 250 Ala Lys Lys Ile Ala 265 Ala Met Val His Cys 280 Val Ser Leu Lys Met 300 Arg Glu Ser Tyr Pro 315 Pro Lys Ala Pro Glu 330 Pro Tyr Met Val Gly 345 Met Phe Leu Asp Phe 360 Ala Ala Ser Ile Leu 380 Lys Leu Ile Pro Ala 395 Pro Ala Thr Met Thr 410 Phe Gly Val Pro Ser 425 Ala Pro Thr Tyr Met 440 Asp Asp Arg Pro Gln 460 Ser Val Trp Gly Ala 475 Ile Asn Leu Ser Asn 49045190 Ile Ala Asn Phe 205 Ser Ala Gly Gly Lys Asn Leu Phe 240 Pro Cys Leu Phe 255 Ala Leu Ala Gly 270 Leu Arg Gln Lys 285 Lys Phe Gly Thr Phe Leu Pro Thr 320 Glu Ile Leu Ala 335 Ile Asn Lys His 350 Pro Leu Ser Glu 365 Trp Gln Ala Tyr Ala Ile Glu Lys 400 Asp Leu Phe Leu 415 Val Ile Val Ser 430 Tyr Glu Tyr Gln 445 Glu Leu Leu Gly Pro Phe Leu Lys 480 Met Val Met Lys 495101993861 A CN 101993865
     说明书Asn Pro Asn Gly Glu 510 Glu Gly Tyr Leu Gln 525 Lys Asp Lys Glu Val 540 Ala Glu Arg Ser Ser 55544/62 页Phe Trp Ala Asn 500 Pro His Trp Pro 515 Val Pro Ala Gln 530 Trp Thr Glu Leu 545 Glu His Val Glu <2l0>20 <211>1698 <212>DNA <213> 小鼠 <400>20 atgtggctct tccttaccgc gaaggattct ggatctctga acttcctacc ttcaccaacc atttatactc ggaggtggac gaaaatgtgg gaggatgaac gtccaagaca tcagcaggag cacagggcca agacccttgg atggttcact aaatttggga gtgattgatg aacactgtcc tttttggact tggcaggcct tatttaggag gacattatgt ccaacctaca gaattgttagPhe Ala Arg Asn Gly 505 Glu Tyr Asp Gln Lys 520 Ala Ala His Arg Leu 535 Arg Ala Lys Glu Thr 550 Leu 565Gly Leu Ile Gly Asp Phe His Arg 560gtgctttgag ctgtggtaca cacagcctgt ggtttgctcc ctcctttgtg aaaggaagat ctgctgactt ttgtgataga ttgtagtggt acagccgggg acattgccaa gtgaaagtgt tcgctcagag ctaagaaaat gcctgcgcca ctgttgattt gagtgttgct cctacatggt tcccactctc acccaattct ggacagaaga tcggtgtccc tgtatgaata gagaccacgctctgatctct caccgttcat ggccgtcttc accagagcct ctaccaaaac cattccccac aacacagaac tggagcatca cattcagtat gaactggggt ctttgggggc ctctgttctt tagtgtcatt tgctgctctt gaagactgaa tcttggagac gccaaaggca gggcatcaac tgaaagaaaa taacatctct ccctgccaca atctgtaatc tcagtatcgc tgatgaactc46ctcactgctt ggcaaagtcc ctgggagtcc gcagagccct ccagaggcag aaattttctg agcaggttgc acctatgatg cgcctgggca cacttggacc aacccaggat gtgttaagcc ttcaatcctt gctggctgta gatgagctct cccagagaga ccagaagaga aagcatgagt ctggaacaga gaaaagctga atgacagacc gtgtcccgta ccaagttttg ttttctgtatgcttgagtct tggggaagta cctttgccaa ggagcttcgt cattgaggct aggactgtct ccgtgatggt gagtgcccct tctggggatt aggtggctgc ctgtgactat cactggccaa gcctttttgg aaaccaccac tggaggtctc gctatccctt ttctggctga ttggctggat agacagctgc ttccagcagc tgttcctgga gtcacagaga tatcagacga ggggagccccgggacaccca tgtcacctta gccccctctt gaagcacacc cgctgagcgc ctacctcaac gtggatacat ggctgtccat cttcagcaca actacattgg cttcggcgag gaacctcttc gagagctgcc ctccgctgcc actgaaaatg cctccctact gaagagtttc cattccaatg atccatcctg tattgaaaag cttgattgga tgctggagcc tagaccccag gtttttaaaa60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440101993861 A CN 101993865
     说明书tgatgaaatt attggccaga cccataggct cagagaggtc ctgggccaac atatgaccag gaaagacaag atcccatagg45/62 页gagggtgctt cagaagaaga gatcaacctc tttgctcgga atgggaaccc taatggtgaa aaggaaggat accttcagat tggagtccca gaagtggact tttggactga gctcagagcc gaacatgttg aactgtga <210>21 <211>553 <212>PRT <213> 非洲爪蟾 (Xenopus laevis) <400>21 Met Ala Leu Trp Ala Ser Leu Ala 1 5 Val Ser Gln Ala Ala Ser Leu Gly 20 Val Glu Gly Thr Ser Lys Lys Ile 35 40 Asp Val Phe Lys Gly Ile Pro Phe 50 55 Lys Ala Gln Leu His Pro Gly Trp 65 70 Phe Lys Glu Arg Cys Leu Gln Ser 85 Gly Asp Leu Asp Cys Leu Tyr Leu 100 Ser Ser Val Ser Thr Asn Leu Pro 115 120 Ala Phe Leu Leu Gly Ser Ser Gln 130 135 Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Leu Ala 145 150 Thr Leu Asn Tyr Arg Leu Gly Pro 165 Ser Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly 180 Ala Trp Val Lys Arg Asn Ile Ala 195 200 Ile Thr Ile Phe Gly Glu Ser Ala 210 215 Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly47agcaacatgg gggctgcctc gcacaggcag aaggaaacag1500 1560 1620 1680 1698Leu Ala Phe Ala Ser 10 Val Val Tyr Thr Glu 25 Gly Ile Leu Phe Pro 45 Ala Ala Pro Pro Lys 60 Ser Gly Thr Leu Lys 75 Thr Leu Thr Gln Thr 90 Asn Ile Trp Val Pro 105 Val Met Val Trp Ile 125 Gly Ala Asn Val Leu 140 Leu Arg Gly Asn Val 155 Leu Gly Phe Leu Ser 170 Leu Trp Asp Gln His 185 Ala Phe Gly Gly Asn 205 Gly Gly Ala Ser Val 220 Leu Ile Lys Arg AlaLeu Val Ala 15 Gly Gly Phe 30 Asn Tyr Ile Ala Phe Glu Ala Thr Asn 80 Asn Val Arg 95 Gln Thr Arg 110 Tyr Gly Gly Asp Asn Tyr Ile Val Val 160 Thr Gly Asp 175 Met Ala Ile 190 Pro Asp Asn Ser Leu Gln Ile Ser Gln101993861 A CN 101993865
     说明书235 Gln Ser Asn Pro Leu 255 Cys Pro Val His Asp 270 Asp Pro Lys Ala Val 285 Glu Tyr Pro Ala Val 300 Asp Phe Ile Pro Asp 315 Val Asp Tyr Met Ala 335 Gly Ile Asp Leu Pro 350 Ala Glu Val Tyr Asn 365 Ser Ala Leu Glu Thr 380 Asn Pro Glu Gln Glu 395 Asp Tyr Leu Phe Leu 415 Met Asn Ala Arg Ser 430 Thr Arg Met Pro Ile 445 Asp Leu Gln Tyr Val 460 Arg Pro Lys Asp Arg 475 Asn Phe Ala Ala Thr 495 Thr Asp Trp Leu Pro 510 Asn Asp Asn Met Ser 525 Tyr Val Lys Phe Trp 54046/62 页225 Ser Gly Val Gly Met 245 Trp Thr Thr Lys Val 260 Ala Ala Met Ala Asn 275 Leu Ala Tyr Lys Leu 290 Tyr Leu Gly Ile Ser 305 Pro Met Asn Leu Phe 325 Val Asn Asn Met Asp 340 Ile Asn Gln Pro Leu 355 Val Gln Gly Leu Thr 370 Tyr Asn Leu Tyr Thr 385 Met Lys Arg Thr Val 405 Pro Thr Gln Glu Ala 420 Arg Thr Tyr Asn Tyr 435 Pro Ser Trp Val Gly 450 Gly Lys Pro Phe Gln 465 Val Ser Ala Ala Met 485 Asp Pro Asn Gln Gly 500 Thr Thr His Leu Gly 515 Gln Ser Val Lys Gln 530230 Ser Pro Trp Ala Leu 250 Ala Glu Lys Val Gly 265 Cys Leu Arg Ile Ser 280 Asp Pro Ser Val Leu 295 Pro Val Ile Asp Gly 310 Ala Asn Ala Ala Asp 330 Ala His Leu Phe Ala 345 Gln Lys Ile Ser Glu 360 Leu Thr Lys Ile Ser 375 Ala Asn Trp Gly Pro 390 Ile Asp Leu Glu Thr 410 Leu Ala Leu His Ser 425 Val Phe Ser Leu Pro 440 Ala Asp His Ala Asp 455 Thr Pro Leu Ala Tyr 470 Ile Ala Tyr Trp Thr 490 Pro Ser Lys Val Pro 505 Gln Tyr Leu Glu Ile 520 Ser Leu Arg Ser Pro 53548240 Phe Thr Thr Tyr Glu 320 Gly Val Leu Ala Asn 400 Val Gly Tyr Phe Asp 480 Gly Tyr Tyr Ala101993861 A CN 101993865
     说明书Val47/62 页His Thr Tyr Arg Asn Met Ala Asn 545 550 <210>22 <211>1662 <212>DNA <213> 非洲爪蟾 <400>22 atggctcttt gggcttctct tgccctggca gcttcactgg gagtggttta caccgagggt gggatcctgt tcccgaatta cattgatgtt aaagcctttg agaaggcaca actgcaccca tttaaggaac ggtgcttaca atccacctta tgcctctacc tgaacatctg ggttcctcag gtcatggttt ggatctacgg tggggccttc ttggataact atctgtatga tggagaggag accttgaact acagactggg accattgggc ggcaactatg gactgtggga tcaacacatg gcatttggtg ggaaccctga taacatcacc gtctcccttc agaccctgtc tccatacaac agtggggtgg gcatgtcccc ttgggcactt gtggctgaaa aagttggatg tcctgttcat atttcagacc ctaaggctgt cactttagcc cccgctgttt actacttggg catctcccca ccaatgaatc tctttgctaa tgcggcggat gatgcacatt tgtttgcagg catagatctg tctgaggccg aagtctataa tctggtgcag ttggaaactg cctacaacct ttacacggcc atgaaaagaa ctgtcataga cttagagacg gcactggctc ttcactccat gaatgctcgg ttgccgactc gcatgcccat ttaccccagc cagtacgtgt tcgggaaacc cttccagact gtctctgccg ccatgattgc ctattggacc ggaccctcca aagtgcccac cgattggctg gaaatcaacg acaacatgtc ttaccaatct aaattctggg cccacactta ccgcaatatg <210>23 <211>556 <212>PRT <213> 鸡 (Gallus gallus)49tttgccagtc ggatttgtgg tttaagggca ggctggtcag acccaaacaa acccgctctt ttgctcggtt ctcgctctcc tttctgagta gccatcgcct atatttggag aaaggactga cagagcaacc gacacagccg tataaactgg gtcattgatg gtggattaca ccagttatca ggtttgaccc aactggggac gactatcttt agtggacgga tgggtcggag ccattggctt aactttgctg ccttacacca gtaaagcaga gccaacgtgttggtggcagt aaggtaccag tcccgtttgc gtacattaaa atgtccgtgg cagtgtccac catctcaggg gtggcaatgt ctggagactc gggtgaaaag agtctgctgg tcaagcgagc cacttttctg ctatggcaaa acccgtctgt gtgatttcat tggcaggtgt atcagcctct tgactaaaat ccaaccctga tcctggtccc cttacaacta ccgatcatgc acagacccaa caactggtga ctcaccttgg gtctacgttc aagtcccaggct caagaaaatt tgctccacca agccacaaac tgatttagac caacctacca ggccaacgtg cattgtggtg taaccttcct gaacattgct aggcgccagt catcagccag gaccacaaag ctgcttgagg cctggagtat tcctgatgaa aaacaacatg tcagaagatt ctccagtgcc gcaggagaat tacccaagag cgtgttctct agatgatttg ggatagagat ccccaaccaa ccagtacctg cccttatgtg60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1662101993861 A CN 101993865

    [1037] 说明书Ala Leu Cys Cys Cys 10 Val Leu Thr Glu Gly 30 Leu Phe Gly Ser Tyr 45 Pro Pro Lys Ala Leu 60 Thr Leu Lys Ala Lys 75 Thr Gln Thr Asp Val 90 Trp Ile Pro Gln Gly 110 Val Trp Ile Tyr Gly 125 Asn Phe Leu Asp Asn 140 Gly Asn Val Ile Val 155 Phe Leu Ser Thr Gly 170 Asp Gln His Met Ala 190 Gly Gly Asp Pro Asp 205 Ala Ser Val Ser Leu 220 Lys Arg Ala Ile Ser 235 Gln Lys Asp Pro Leu 250 Cys Pro Thr Asp Asn 270 Asp Pro Lys Ala Leu 285 Pro Gly Pro Leu Val 30048/62 页<400>23 Met Ala His Trp 1 Val Ala Gln Ala 20 Val Glu Gly Glu 35 Ile Phe Arg Gly 50 Pro Gln Pro His 65 Lys Asn Arg Cys Lys Glu Asp Cys 100 Glu Val Ser Thr 115 Phe Leu Leu Gly 130 Tyr Asp Gly Glu 145 Leu Asn Tyr Arg Asn Met Pro Gly 180 Trp Val Lys Arg 195 Thr Ile Phe Gly 210 Leu Ser Pro Lys 225 Gly Val Ser Leu Ala Lys Lys Val 260 Val Leu Ala Asn 275 Ala His His Val 290Ala Ile Leu Ser Phe 5 Ala Thr Leu Gly Val 25 Ser Lys Arg Arg Gly 40 Ile Pro Phe Ala Ala 55 Pro Gly Trp Asp Gly 70 Met Gln Met Thr Leu 85 Leu Tyr Leu Asn Ile 105 Asn Leu Pro Val Met 120 Gly Gly Gln Gly Ala 135 Glu Ile Ala Val Arg 150 Val Gly Pro Leu Gly 165 Asn Tyr Gly Leu Lys 185 Asn Ile Lys Ala Phe 200 Glu Ser Ala Gly Ala 215 Asn Ala Gly Leu Phe 230 Cys Ser Trp Val Ile 245 Gly Glu Gln Val Gly 265 Cys Leu Arg Ala Thr 280 Glu Leu Ile Ser Leu 29550Leu Gly 15 Gly Phe Val Asp Gln Asp Lys Phe 80 Arg Gly 95 Lys Arg Gly Ala Tyr Leu Val Thr 160 Asp Pro 175 Ile Ala Asn Ile Gln Ile Gln Ser 240 Thr Trp 255 Thr Thr Thr Leu His Thr101993861 A CN 101993865

    [1076] 说明书Gly Asp Phe 315 Asp Ile Asp 330 Ala Gly Phe 345 Ala Ser Asp Glu Arg Gly Asp Asn Pro 395 Thr Asp Tyr 410 His Lys Asn 425 Pro Ser Arg Asp Asp Leu Tyr Leu Pro 475 Thr Asn Phe 490 Pro Ile Thr 505 Ile Asn Asn Pro Tyr Val Ala Ser Thr 55549/62 页Leu Ser Ile Thr Pro Val Val Asp 305 310 Glu Asn Leu Phe Ala Asn Ala Ala 325 Asn Asn Met Asp Gly His Phe Phe 340 Asn Arg Pro Leu Gln Lys Ile Thr 355 360 Lys Gly Leu Thr Ala Asp Arg Gly 370 375 Asp Leu Tyr Thr Glu Leu Trp Gly 385 390 Lys Arg Thr Val Val Asp Leu Ala 405 Thr Gln Trp Thr Leu Asn Leu His 420 Thr Tyr Ser Tyr Leu Phe Ser Gln 435 440 Ser Trp Val Gly Ala Asp His Ala 450 455 Lys Pro Phe Ala Thr Pro Leu Gly 465 470 Ser Ser Ala Met Ile Ala Tyr Trp 485 Pro Asn Ser Gly Asn Ser Glu Val 500 Thr Glu Gly Gly Tyr Tyr Leu Glu 515 520 Ser Val Lys Gln Asn Leu Arg Thr 530 535 Val Tyr Leu Asn Leu Pro Leu Ile 545 550 <210>24 <211>1671 <212>DNA <213> 鸡 <400>24 atggctcact gggcgattct gagctttgcc gcaactctgg gtgtggtgct caccgaggga51Leu Pro Asp Met Pro 320 Tyr Ile Ala Gly Val 335 Asp Leu Pro Ala Ile 350 Val Tyr Asn Leu Val 365 Ala Asn Leu Thr Tyr 380 Glu Gln Gln Val Met 400 Ile Phe Leu Ile Pro 415 Ala Arg Ser Gly Lys 430 Met Pro Ile Tyr Pro 445 Gln Tyr Val Phe Gly 460 Lys His Arg Thr Val 480 Ala Arg Thr Gly Asp 495 Trp Pro Pro Tyr Thr 510 Lys Ile Asn Tyr Asn 525 Asn Tyr Trp Asn Ser 540 Serttgtgctgct gcctcggggt agcacaggcc ggttttgtgg aaggcgagag taaacgacgg60 ggactctttg ggagctatgt ggatatcttc agagggatcc cttttgctgc cccgccaaag gcactgcaag acccccaacc tcatcctggc tgggacggaa cactgaaagc aaaaaaattt aagaatcgct gcatgcagat gacacttacc caaactgatg tccgtgggaa ggaggactgc ctctatctga acatctggat ccctcaaggg aagagagaag tctccaccaa cttgccagtg atggtctgga tctacggtgg tgccttcctt cttggagggg gtcaaggagc caacttcctt gacaactacc tctatgatgg tgaggagatc gccgtgcggg gcaatgtgat tgtggtgacc ctcaactatc gtgtggggcc cctgggcttc ctcagcactg gagacccaaa catgccaggg aactacgggc tgaaggatca gcacatggct attgcctggg tgaagaggaa tatcaaggcc tttggaggcg acccagacaa catcaccatc tttggggagt cagctggtgc tgccagtgtc tccctgcaga tattgtcccc aaagaacgca ggtctgttca agagagccat cagccaaagc ggtgtcagtc tgtgcagctg ggtcatccaa aaggacccac tcacttgggc taaaaaggtt ggagagcagg tgggctgccc cacagacaac accacggtct tggccaactg cctccgtgcc actgacccca aagccctgac actggcccac cacgtggaac tgatctccct gcctggtccc ctggttcata cactctccat cactcctgtt gttgatggag acttcctccc tgacatgcca gagaacctct ttgccaatgc tgctgacatc gactacattg ctggggtcaa caacatggat ggacatttct ttgctggctt tgatttacct gctatcaacc gtccacttca gaaaatcact gcgagcgatg tctataactt ggtcaaagga ctaactgcag acaggggtga gagaggagcc aacttgacgt acgatctcta cacagagttg tggggtgaca acccagagca acaagtcatg aagagaacag tggtggacct ggctaccgac tacattttcc tgattcccac acagtggaca ctaaacctgc accacaagaa tgcccggagt ggcaagacat acagctactt gttctcccag ccatctcgaa tgcccatcta tccaagctgg gtaggggcag accacgctga tgacttgcag tacgtgtttg ggaaaccctt tgccacccct ctaggctacc tgcccaagca caggacagtc tcatctgcca tgattgctta ttggaccaat tttgccagga ctggtgaccc caacagtggg aattcagagg tgcccattac ctggccaccc tacaccactg agggtggtta ctacctggaa atcaacaaca aaataaacta taattcagtg aaacagaatc tgagaacccc atacgtgaac tactggaatt cagtctatct aaatctgcca ctgattgcca gcacatccta g <210>25 <211>544 <212>PRT <213> 黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster) <400>25 Met Ser Ile Phe Lys Arg Leu Leu Cys Leu Thr Leu Leu Trp Ile Ala 1 5 10 15 Ala Leu Glu Ser Glu Ala Asp Pro Leu Ile Val Glu Ile Thr Asn Gly 20 25 30 Lys Ile Arg Gly Lys Asp Asn Gly Leu Tyr Tyr Ser Tyr Glu Ser Ile 35 40 45 Pro Tyr Ala Glu His Pro Thr Gly Ala Leu Arg Phe Glu Ala Pro Gln 50 55 6052180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1671101993861 A CN 101993865

    [1154] 说明书Asn Ala Thr Gln Ser 75 Asn Glu Asn Asn Lys 95 Ile Tyr Lys Pro Lys 110 Leu Leu His Gly Gly 125 His Asp Ser Ile Met 140 Tyr Arg Leu Gly Pro 155 Pro Gly Asn Tyr Gly 175 Lys Lys Asn Ile Ala 190 Ile Gly His Ser Ala 205 Glu Asp Phe Lys His 220 Ala Leu Asp Pro Trp 235 Glu Leu Gly Arg Ile 255 Leu Lys Asp Cys Leu 270 Val Arg Ser Phe Leu 285 Pro Val Val Glu Pro 300 Pro Arg Ala Val Ile 315 Val Thr Tyr Thr Thr 335 Glu Arg Asn Lys Leu 350 Arg Trp Phe Asp Trp 365 Lys Thr Ile Lys Asp51/62 页Pro Tyr Ser His His 65 Val Glu Cys Met Gln 85 Met Gly Asp Glu Asp 100 Pro Asn Arg Ser Ser 115 Phe Met Phe Gly Ser 130 Glu Gly Thr Leu Leu 145 Gly Phe Ala Ser Thr 165 Lys Asp Gln Arg Leu 180 Phe Gly Gly Met Pro 195 Gly Ala Ser Ala His 210 Ala Lys Gly Ala Ile 225 Ile Gln Gln Gly Gly 245 Gly Cys Gly His Thr 260 Ser Lys Pro Ala Ser 275 Phe Ser Tyr Val Pro 290 Asp Ala Pro Asp Ala 305 Ser Gly Lys Phe Ala 325 Asp Gly Gly Tyr Asn 340 Gly Glu Ser Trp Ile 355 Pro Tyr Leu Leu PheTrp Thr Asp Val Phe 70 Trp Asn Gln Phe Ile 90 Cys Leu Thr Val Ser 105 Phe Pro Val Val Val 120 Gly Ser Ile Tyr Gly 135 Val Val Lys Ile Ser 150 Gly Asp Arg His Leu 170 Ala Leu Gln Trp Ile 185 Asp Asn Ile Val Leu 200 Leu Gln Leu Leu His 215 Ser Val Ser Gly Asn 230 Arg Arg Arg Ala Phe 250 Asn Val Ser Ala Glu 265 Asp Ile Val Ser Ala 280 Phe Ser Ala Phe Gly 295 Phe Leu Thr Glu Asp 310 Gln Val Pro Trp Ala 330 Ala Ala Gln Leu Leu 345 Asp Leu Leu Asn Asp 360 Tyr Arg Asp Ala Lys53Pro 80 Leu Lys Ala Arg Leu 160 Leu His Gly Leu Val 240 Val Lys Val Ser Lys 320 Glu Thr Ala Met101993861 A CN 101993865

    [1193] 说明书380 Gln Gln Tyr Leu Ala Asp Arg 395 Val Gln Arg Met Phe Thr Asp 410 415 Ala Ile Asp Leu His Arg Lys 425 430 Val Tyr Asp Asn Pro Thr Asp 445 Arg Thr Asp Val His Phe Gly 460 Ile Phe Asn Thr Ala Ala Tyr 475 Val Ile Ser Lys Lys Phe Ile 490 495 Asp Lys Gly Thr Leu Thr Phe 505 510 Asn Ser Lys Glu Tyr Gln Val 525 Asn Glu Glu Tyr Ala Arg Phe 54052/62 页370 375 Asp Asp Leu Ser Phe Asp Leu Arg 385 390 Phe Ser Val Glu Ser Tyr Trp Asn 405 Leu Phe Lys Asn Ser Val Pro Ser 420 Gly Lys Ser Pro Val Tyr Ser Phe 435 440 Gly Val Gly Gln Leu Leu Ser Asn 450 455 Val His Gly Asp Asp Phe Phe Leu 465 470 Ile Gly Ile Arg Pro Asp Glu Glu 485 Met Leu Glu Asp Phe Ala Leu Asn 500 Glu Cys Asn Phe Gln Asn Asn Val 515 520 Arg Ile Ser Arg Asn Ala Cys Lys 530 535 <210>26 <211>1635 <212>DNA <213> 黑腹果蝇 <400>26 atgagtatat tcaaacggct gttgtgcctg gaagctgatc ccttgattgt tgagataaca ttgtactaca gctacgaatc gattccctat gaagcacctc agccgtatag tcatcattgg gttgagtgca tgcagtggaa tcagtttata gattgcttaa cggtaagcat ctataagcca gtagtactcc tgcatggagg tgctttcatg tccattatgc gtgagggaac tttgcttgtg ggttttgcaa gtaccggcga tagacacttg ctggccctac aatggatcaa gaagaacatt gtgctcattg gtcactctgc aggcggtgct ttcaaacatt tggccaaagg agcgatttcg atacagcagg gtggacgacg acgtgcattt54Arg 400 Val Tyr Ser Thr Arg 480 Gly Gly Leu Proactttgctgt aatggaaaaa gccgagcatc actgatgttt aacgaaaaca aagaaaccca ttcggtagtg gtaaaaataa ccgggaaact gctcactttg tcggctcatt gtgagcggca gaactgggtcggatagcagc tccgtggcaa caactggtgc tcaatgccac ataagctgat atcggagcag gatccatata gctatcgtct atggtctaaa gtggaatgcc tgcagctgtt atgcattgga gtattgtcggtttagaatct agataatggg cctccgtttt gcagtctcca gggtgatgag ctttcctgtc tggacacgac tggaccattg ggatcaacgt agataatatt gcacgaggat tccttgggtc ttgtggacac60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780101993861 A CN 101993865

    [1232] 说明书agccggctag tcagtgcttt acccaagagc ccactgagga agagttggat atcgggacgc agtatctagc ctgatgttct aaagtccggt tttccaatcg tcaatacagc ttataggtat gtaatttcca cttgtaaaaa cgatatagtc tggacctgtt agtgattaag cgggggatac tgacctactc caagaaaacc agatcggcga tttcaagaat ttattctttt aacagatgta tgcataccgt gctggaggat aaataatgtg cgaggaatat53/62 页acaaatgtct ccgcagaact caaggactgc tctgctgtcc gaagcttcct tgtgttttcc gtggagccgt cagatgcacc agacgccttt agcgggaagt ttgcccaagt cccttgggct aacgctgctc agctgttgga aagaaacaaa aatgatcgat ggtttgattg ggcaccatac atcaaagata tggatgatct ttcatttgat ttcagtgtgg aaagttattg gaacgtgcag agcgtgccaa gtgcaataga tcttcaccga gtctacgata atcctaccga ttccggagtg cattttggta ctgtccacgg agatgacttt atcggcattc gtccggatga agaagttatt ttcgcactca acgataaggg aacattaaca aacagcaagg aatatcaagt gctgcgtatt gctcggtttc cctaa <210>27 <211>570 <212>PRT <213> 家蚕 (Bombyx mori) <400>27 Met Cys Thr Lys Phe Ala Val Leu 1 5 Val Arg Ala Tyr Ser Ser Pro Ala 20 Val Val Ala Gln Thr Glu Ser Gly 35 40 Ala Glu Ala Ser Thr Leu Tyr Ala 50 55 Lys Gln Pro Val Gly Glu Leu Arg 65 70 Pro Trp Thr Asp Tyr Leu Asp Ala 85 Gln Thr Asp Val Leu Tyr Gly Ser 100 Glu Ala Cys Ile Tyr Ala Asn Ile 115 120 Ala Ala Gly Glu Thr Pro Thr Lys 130 135 Ile His Gly Gly Gly Phe Ala Phe55ttgaagtcta tatgtaccct ctaaccgagg gtgacgtaca ttaactggcg ttgctcttct ctcaggcagc cgaatgttta aagtatggca ggtcaattgc ttcttgattt tcaaaaaagt tttggagaat tcacgaaacg840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1635Leu Tyr Tyr Val Ile 10 Ala Ser Pro Pro Ser 25 Trp Val Cys Gly Arg 45 Ser Phe Arg Gly Val 60 Phe Lys Glu Leu Gln 75 Thr Glu Glu Gly Pro 90 Leu Met Lys Pro His 105 His Val Pro Leu Asn 125 Pro Gly Leu Pro Ile 140 Gly Ser Gly Asp AlaVal Gly Ser 15 Ser Cys Asn 30 Thr Arg Arg Pro Tyr Ala Pro Ala Glu 80 Val Cys Tyr 95 Gly Met Asp 110 Ala Leu Pro Leu Val Phe Asp Leu Tyr101993861 A CN 101993865

    [1271] 说明书155 Val Val Ile Thr Phe 175 Leu Asp Thr Pro Lys 190 Thr Leu Leu Arg Trp 205 Pro Asp Asn Val Thr 220 His Leu Leu Thr Leu 235 Ile Leu Met Ser Gly 255 Ile Phe Ser Gln Ser 270 Asn Ser Thr Asn Pro 285 Val Glu Lys Leu Asn 300 Leu Thr Thr Phe Phe 315 Thr Ile Leu Asp Glu 335 Lys Asp Ile Pro Leu 350 Phe Gln His Arg Phe 365 Asn Pro Ala Ile Leu 380 Glu Thr Ile Ala Leu 395 Gly Ser Val Asp Leu 415 Tyr Lys Tyr Pro Ala 430 Asp Ala Pro Val Phe 445 Phe Lys Gln Ala Phe 46054/62 页145 Gly Pro Glu Tyr Leu 165 Tyr Arg Leu Asn Phe 180 Pro Gly Asn Asn Gly 195 Lys Arg Asn Ala Arg 210 Ala Gly Gln Ser Ala 225 Lys Ala Thr Glu Gly 245 Gly Thr Ser Thr Phe 260 Asn Lys Ile Leu Phe 275 Glu Ile His Glu Lys 290 Ala Asn Arg Ile Leu 305 Val Val Glu Thr Pro 325 Pro Asn Ile Leu Val 340 Ile Gly Phe Thr Asn 355 Gln Ile Asp Ile Val 370 Pro Ser Asn Leu Leu 385 Ser Asn Gln Ile Ser 405 Gly Phe Ile Asn Met 420 Lys Leu Ala Glu Lys 435 Tyr Gln Phe Ser Tyr 450150 Val Thr Arg Asn Val 170 Phe Gly Phe Phe Ser 185 Leu Arg Asp Met Val 200 Ala Phe Gly Gly Asn 215 Gly Ala Ala Ala Ala 230 Leu Val Ser Arg Ala 250 Phe Thr Thr Ser Pro 265 Ser Ile Leu Gly Val 280 Leu Val Ala Met Pro 295 Ile Asp Gln Ile Gly 310 His Pro Gly Ile Thr 330 Gln Gln Gly Arg Gly 345 Ser Glu Cys His Met 360 Ser Lys Ile Asn Glu 375 Tyr Ser Ser Thr Pro 390 Gln Arg Tyr Phe Asn 410 Cys Thr Asp Ser Tyr 425 Arg Ser Ala Ala Gly 440 Asp Gly Tyr Ser Val 45556160 Asn Val Val Leu Ser 240 Ala Ile Asp Glu Pro 320 Asp Ile Glu Val Val 400 Glu Met Leu His101993861 A CN 101993865

    [1310] 说明书Ala Asp Asp 475 Ser Ser Ser 490 Phe Val Thr 505 Thr Ala Trp55/62 页Leu His Phe Asn Gly Ala Gly His 465 470 Lys Val Asn Ser Ala Ser Gly Thr 485 Glu Met Lys Tyr Trp Met Thr Thr 500 Ser Ala Pro Met Cys Asp Glu Thr 515 520 Arg Glu Leu Gln Tyr Gln Asp Ile 530 535 Thr Ser Leu Thr Lys Glu Gln Leu 545 550 Ile His Asn Gly Gly Glu Ser Arg 565 <210>28 <211>1713 <212>DNA <213> 家蚕 <400>28 atgtgtacca aattcgctgt attactatat tcaagcccag cagcgtcgcc gccgtcgtcg tgggtgtgtg gccgtactcg ccgggcggaa gtgccttatg ccaagcaacc agtcggagaa ccatggaccg actacctaga tgccaccgag ctttatggaa gtctaatgaa acctcacggc catgtgcctt tgaacgccct gccggcagct atattagtct ttattcacgg aggtggcttc ggaccggagt atcttgtcac aagaaacgtt ttctttggat ttttctcatt ggatactcct atggtgactc tgctccgttg ggtgaagagg aacgtgacct tggcgggcca gagcgctggg aaggccactg aaggcttagt ttcaagggct ttctttacaa catctcctat cttctcccag ggcgtcaact ccactaatcc tgatgagata aaactgaatg aagccaacag aatattgatt gtggtagaaa caccgcatcc cggaattacc gtccagcaag gccgcggtaa agacataccc catatgttcc agcatagatt tgaacagatc gcaatcttag ttccttccaa tctactgtac57Leu Thr Tyr Val Leu 480 Gln Lys Ala Asp Asp 495 Asn Phe Met Arg Cys 510 Pro Pro Val Thr Pro 525 Ile Thr Pro Asn Leu Cys His Gln 540 Glu Met Lys Asn Phe Phe Asp Lys 555 560 Leu Lys 570tacgttatcg tgcaatgtgg gcaagcactt cttcgattta gaaggtccag atggatgagg ggtgagacgc gcgtttggat gttgtcatca aaagtccccg aacgccagag gccgctgctg atattgatga tccatcaaca cacgagaaac gatcaaatcg actatattag ttgattatag gatatagtat tcctcgactctgggctcagt tcgcgcagac tatacgccag aggaattaca tttgctacca catgcatcta ctacgaagcc ctggtgatgc cttttaacta gaaacaatgg cctttggagg ctcaccttct gcggtgctgg aaatcttgtt tcgtcgccat gccttaccac atgaagatcc gtttcacgaa ctaagatcaa ctgagacgataagggcatac ggagtcaggc tttccgggga accagcagag gacagacgtt cgccaatata tggtcttcca tgacctatat caggttgaat tcttagggac taatcctgac caccttatcc aacatccact ttccatcctt gccggttgaa ttttttccca aaatattctg ttctgaatgc tgaaaatcca tgctttggtc60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 tcgaatcaaa tcagccaaag atacttcaat ggtagcgtag atctggaggg ctttatcaat atgtgtaccg atagttacta caagtaccca gccatgaagt tggccgagaa gagatctgcg gcaggtgatg ctccggtatt tctgtaccag ttctcttacg acggttacag cgtgttcaag caagcctttc atttgcattt caacggtgct ggacacgcgg acgacttgac atacgtgctg aaagtgaatt ctgcgtcagg gactagttca tcacaaaaag cagacgatga aatgaaatat tggatgacga cgttcgtcac aaactttatg cgatgcagtg ctcctatgtg cgatgaaact acagcgtggc caccagttac accgcgggaa ctacaatacc aagacattat tacaccaaac ttatgccacc aaactagtct taccaaagaa caactcgaaa tgaagaattt cttcgataag atccataatg gaggtgaaag cagacttaag taa <210>29 <211>360 <212>PRT <213> 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) <400>29 Met Trp Thr Ser Lys Thr Ile Ser Phe Thr Leu Phe Ile Thr Thr Thr 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ser Cys Asn Ala Ser Ala Lys Ala Lys Thr Gln Pro Leu 20 25 30 Phe Pro Ala Ile Leu Ile Phe Gly Asp Ser Thr Val Asp Thr Gly Asn 35 40 45 Asn Asn Tyr Pro Ser Gln Thr Ile Phe Arg Ala Lys His Val Pro Tyr 50 55 60 Gly Ile Asp Leu Pro Asn His Ser Pro Asn Gly Arg Phe Ser Asn Gly 65 70 75 80 Lys Ile Phe Ser Asp Ile Ile Ala Thr Lys Leu Asn Ile Lys Gln Phe 85 90 95 Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Asn Leu Thr Asp Gln Glu Ile Val Thr 100 105 110 Gly Val Cys Phe Ala Ser Ala Gly Ala Gly Tyr Asp Asp Gln Thr Ser 115 120 125 Leu Thr Thr Gln Ala Ile Arg Val Ser Glu Gln Pro Asn Met Phe Lys 130 135 140 Ser Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ser Ile Val Gly Asp Lys Lys Ala Met 145 150 155 160 Lys Ile Ile Asn Asn Ala Leu Val Val Val Ser Ala Gly Pro Asn Asp 165 170 175 Phe Ile Leu Asn Tyr Tyr Glu Val Pro Ser Trp Arg Arg Met Tyr Pro 180 185 190 Ser Ile Ser Asp Tyr Gln Asp Phe Val Leu Ser Arg Leu Asn Asn Phe581260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1713101993861 A CN 101993865

    [1388] 说明书Cys Ile Gln Leu 265 Asp Gly Thr Glu Tyr 34557/62 页195 200 Val Lys Glu Leu Tyr Ser Leu Gly 210 215 Leu Pro Pro Met Gly Cys Leu Pro 225 230 Asn Val Leu Arg Phe Cys Leu Glu 245 Tyr Asn Gln Lys Leu Gln Lys Leu 260 Thr Gly Ser Lys Ile Leu Tyr Ser 275 280 Met Leu Gln Asn Pro Ser Lys Tyr 290 295 Cys Cys Gly Thr Gly Phe Leu Glu 305 310 Ser Ser Met Cys Gln Asn Arg Ser 325 His Pro Ser Glu Ala Thr Tyr Asn 340 Lys Ile Arg Gly Trp Leu Lys Ala 355 360 <210>30 <211>1083 <212>DNA <213> 拟南芥 <400>30 atgtggactt ctaaaaccat aagcttcact tgcaacgcat ctgcaaaggc caaaacgcaa gattcaacag tcgacacagg caacaataat catgttcctt acggaattga tctcccaaac aaaattttct ccgacataat cgcaaccaaa ttacaaccaa atctcaccga ccaagaaatt gccggttacg atgaccaaac cagtctcacg aatatgttca agagttacat tgctcgtctt aagatcataa acaatgcttt ggtggttgtg tattacgagg ttccctcatg gcgtcgcatg gttcttagta ggcttaacaa tttcgtgaag ttggtcggag gtttaccgcc aatgggatgt aacgtcctaa ggttttgctt ggaacaagag59205 Arg Lys Ile Leu Val Gly Gly 220 Gln Met Thr Ala Gln Phe Arg 235 240 Glu Asn Arg Asp Ser Val Leu 250 255 Pro Gln Thr Gln Ala Ser Leu 270 Val Tyr Asp Pro Met Met Glu 285 Phe Lys Glu Thr Thr Arg Gly 300 Ser Phe Met Cys Asn Ala Tyr 315 320 Phe Leu Phe Phe Asp Ser Ile 330 335 Ile Gly Asn Val Leu Asp Thr 350ctcttcatca ccgctattcc tacccttcac cactcaccta ctcaacatca gtaaccggag acacaagcga aagagtatcg agtgcagggc tatcctagca gagctttaca ttaccgattc aacagagactcaacaacact cagcgattct aaacaatctt acggaagatt aacagtttgt tctgtttcgc ttcgtgtctc taggagacaa ctaatgattt tttctgatta gcctaggttg aaatgactgc ctgttttatatctcgggtcc aatctttggt cagagctaaa ctcaaacggg tcctcctttc atcagcaggt ggaacaacca gaaagccatg catcttgaat ccaagatttt ccggaaaatt tcaattccgc caatcagaaa60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780101993861 A CN 101993865

    [1427] 说明书gaagcaagat gcaaatacgg gcttcatgtg actcgattca ttcgtgggtg cctttactct atttaaagag taatgcttat tccatctgaa gcttaaggct58/62 页cttcagaagc tcttacctca gacacaagca gatgtctatg accctatgat ggagatgctc acgacgagag gatgttgtgg aacagggttc tcttccatgt gtcagaatcg ctcggagttt gctacctaca attacattgg taatgttctg taa <210>31 <211>300 <212>PRT <213> 苹果 (Malus pumila) <400>31 Met Glu Pro Ile Asn Asp Glu Ile 1 5 Val Tyr Lys Asp Gly Arg Ile Glu 20 Pro Pro Ser Thr Asp Glu Ile Thr 35 40 Ile Gln Pro Glu Pro Ala Val Ser 50 55 His Glu Pro Ala Gln Lys Leu Pro 65 70 Gly Phe Ile Phe Glu Ser Ala Phe 85 Gly Arg Leu Ala Ala Glu Ala His 100 Gly Leu Phe Pro Asp Arg Pro Val 115 120 Ala Ala Leu Lys Trp Leu Ala Ser 130 135 Ser Trp Leu Asn Lys Tyr Ala Asp 145 150 Asp Ser Gly Gly Ala Asn Leu Ser 165 Ser Leu Gly Gln Pro Asp Leu Lys 180 Pro Phe Phe Gly Gly Leu Glu Glu 195 200 Cys Thr Glu Asn Gly Gly Leu Glu 210 21560tctcttacag caaaacccta ttggagacga ctgttctttg gatactaaga840 900 960 1020 1080 1083Ala Arg Glu Phe Arg 10 Ile Phe Tyr Lys Thr 25 Gly Val Gln Ser Lys 45 Ala Arg Ile Phe Leu 60 Val Leu Leu Tyr Leu 75 Ser Pro Ile Tyr His 90 Ala Val Val Val Ser 105 Pro Ala Cys Tyr Glu 125 His Ala Ser Gly Asp 140 Phe Asp Arg Leu Phe 155 His Tyr Leu Ala Val 170 Ile Gly Gly Val Val 185 Asp Asp Gln Met Phe 205 Asp Arg Arg Leu Arg 220Phe Phe Arg 15 Gln Lys Val 30 Asp Ile Thr Pro Lys Ile His Gly Gly 80 Asn Phe Val 95 Val Glu Tyr 110 Asp Ser Trp Gly Thr Glu Ile Gly Gly 160 Arg Val Gly 175 Leu Val His 190 Leu Tyr Met Pro Pro Pro101993861 A CN 101993865

    [1466] 说明书Gly Lys Met 235 Gly Gln Leu 250 Val Asp Val 265 Ser Asp Cys59/62 页Glu Asp Phe Lys Arg Leu Ala Cys 225 230 Ala Gly Asp His Leu Arg Gly Ala 245 Lys Lys Ser Glu Trp Gly Gly Ser 260 Gly His Val Phe His Leu Phe Asn 275 280 Leu Val Lys Lys Phe Gly Ser Phe 290 295 <210>32 <211>903 <212DNA <213> 苹果 <400>32 atggagccaa tcaacgacga gattgctcgt ggtcgcatag aaatattcta caagacacaa ggtgtccaat ccaaggacat cacaattcaa cttcccaaga tccacgagcc ggcccaaaag gggtttatct tcgagtctgc cttctctcct gctgaagccc acgcagtcgt agtgtccgtc cccgcttgct atgaagactc atgggcggcg gatggaaccg agtcgtggtt aaacaagtat gacagcggtg gagcaaattt gtcgcactat ccggatttga agattggtgg agttgtgctg gacgaccaaa tgtttctgta catgtgtacg aggccgcccc cagaggattt caaaaggcta gcgggagacc atctgagagg ggcgggccag tggggcggga gtgtcgacgt ggtggagcat tcggactgtg agaatgctgc ggacttggtg tag <210>33 <211>35 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引物 <400>33 cgtctagaaa gagaatgatg aaaattgttc61Leu Ile Phe Phe Ala 240 Tyr Tyr Glu Asp Leu 255 Val Glu His Gly Glu 270 Glu Asn Ala Ala Asp 285 Ile Asn Gln Lys 300gaatttcgct aaggtccccc cccgaacccg ctccccgttc atttatcaca gaatacgggt ctcaaatggc gctgactttg ttggctgtcc gtgcatccgt gagaacggtg gcttgcggga ctgtactatg ggtgaaggac aaaaaatttgtcttccgggt cttcgactga ccgtttctgc tcctctacct acttcgtcgg tgttcccgga tcgcgtccca accggttgtt gggtcgggtc tctttggggg ggttggagga agatgttgat aggacctgaa atgtgtttca gatccttcatgtacaaagac cgaaatcact ccgtatcttc ccacggcggt acgattggca tcgccccgta cgctagtggg tataggcggg cctcgggcaa cttggaggag tcgtaggctg atttttcgcg aaagagtgag cttgttcaat caaccaaaag60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 903cgccg<210>34 <211>46 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引物 <400>34 cggttaactt aatggtgatg <210>35 <211>762 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223>CarE-his <400>35 atgatgaaaa ttgttccgcc cttttgcatg ggtttaccgg tcgaaagggt atacgtgcca ctcgtccaca ccggaccgga aaaaacaaag gctacgaaaa ctcaaattag gctacactgt atcaaaagcg aagaaacgat cgggaaggga aatcagagga atgaagacgt tgaaagcctt gtttatgcac cgacgttcgt gcgaacatca tttataacga tcaggccatg tgattacgct tttcttgaat cgttagattg <210>36 <211>44 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引物 <400>36 cgctcgagaa aagagaggct <210>37 <211>29 <212>DNAgtgatggtgc caatctaacg attcaa46gaagccgttt caattccgcc cgctccgatt tgattggtgg aattgccgtg acctacacaa gtacgaaggt acaaatcgaa gcaagaactc cgtccaagcg aattgaatcg tgatcaagaa gcaccatcacttctttgaag gacgttcgga tacaaagggc caagacgtca gctggattgt ggcattgtga gtgctcgagt caggaaatgg attgccgatg cgccatgatg ccggtcaaac aaagatcagc catcaccattccggggagcg tgcttgggcg atggcgtgcc tgaacggcta cgcttggagg cgatgtgcgc atgcgcgcga aacggttcaa tgcgcgccca agatgatcaa aaatcaaatg tgcatgaaga gaggcggtgctg attcttggaa gccggaagag tcagtttttg cgtattttct gccgatgtac gtataaaaag acaaacgccg ccttgatttg tccagacagc gtatgagcaa tatttatgca60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 762gaagctatga tgaaaattgt tccg44<213> 人工序列 <220> <223> 引物 <400>37 cgcgcgcata ttcgaggacg <210>38 <211>29 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引物 <400>38 cgtcctcgaa tatgcgcgcg <210>39 <211>47 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引物 <400>39 cggaattctt aatggtgatg <210>40 <211>762 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 突变的 CarE-his <400>40 atgatgaaaa ttgttccgcc cttttgcatg ggtttaccgg tcgaaagggt atacgtgcca ctcgtccaca ccggaccgga aaaaacaaag gctacgaaaa ctcaaattag gctacactgt atcaaaagcg aagaaacgat cgggaaggga aatcagagga atgaagacgt tgaaagcctt gtttatgcac cgacgttcgt gcgaacatca tttataacgaccttcgtac29agtataaaa29gtgatggtgc caatctaacg attcaag47gaagccgttt caattccgcc cgctccgatt tgattggtgg aattgccgtg acctacacaa gtacgaaggc acaaatcgaa gcaagaactc cgtccaagcg aattgaatcg63ttctttgaag gacgttcgga tacaaagggc caagacgtca gctggattgt ggcattgtga gtcctcgaat caggaaatgg attgccgatg cgccatgatg ccggtcaaacccggggagcg tgcttgggcg atggcgtgcc tgaacggcta cgcttggagg cgatgtgcgc atgcgcgcga aacggttcaa tgcgcgccca agatgatcaa aaatcaaatgggcggtgctg attcttggaa gccggaagag tcagtttttg cgtattttct gccgatgtac gtataaaaag acaaacgccg ccttgatttg tccagacagc gtatgagcaa60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 tcaggccatg tgattacgct tgatcaagaa aaagatcagc tgcatgaaga tatttatgca tttcttgaat cgttagattg gcaccatcac catcaccatt aa720 762