支原体清除试剂及其应用 【技术领域】
本发明涉及支原体清除试剂及其应用。背景技术 支 原 体 是 细 胞 培 养 中 最 常 见、 不 易 被 察 觉 和 干 扰 实 验 结 果 的 污 染 物， 约有 30.3％～ 50.5％的细胞培养物中有支原体污染。培养细胞中支原体污染的来源包括 ： 所使 用的动物来源的一些产品如血清或已被支原体污染的细胞株系。细胞培养上清液中支原 体的浓度可达 107 个 /ml， 而培养的细胞看起来很正常， 在肉眼观察或普通光学显微镜下观 察， 受污染的细胞可无明显变化。 由于竞争营养及支原体有毒的代谢产物， 支原体污染可显 著影响培养细胞的生理活性， 使研究结果的真实性和可靠性大大下降。
多数支原体适合于偏碱条件下生存 (pH7.6-8.0)， 对酸耐受性差， 对热比较敏感， 对一般抗生素不敏感。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁， 对作用于细胞壁生物合成 的抗生素， 如 β- 内酰胺类、 万古霉素等完全不敏感， 对多粘菌素、 磺胺药物普遍耐药。对支 原体最具抑制活性， 临床常用干扰蛋白合成的抗生素四环素类、 大环内酯类和阻止 DNA 复 制的抗生素喹诺酮类 ； 氨基糖苷类、 氯霉素有较小抑制作用 ； 双萜烯类 -Tiamulin， 其活性 优于其它抗生素 ； 抗肿瘤类丝裂霉素 C、 放线菌素 D 也有突出的抑制作用。但是实验室细胞 培养不同于临床应用， 而且细胞培养中， 支原体很容易反复感染， 对于正在实验的重要细胞 株， 有必要尽快清除支原体。
发明内容 本发明的目的既是开发一种支原体清除试剂， 能有效地清除支原体， 不影响细胞 本身的代谢。
本发明的支原体清除试剂包括下列重量百分比的组分 ：
氟喹诺酮类抗生素 1.3-1.5％
四环素类衍生物 0.3-0.5％
大环内酯类抗生素 0.1-0.3％
缓冲液 97.7-98.3％。
较佳的， 所述氟喹诺酮类抗生素选自莫西沙星、 克林沙星和吉米沙星中的一种或 多种， 最佳的， 所述氟喹诺酮类抗生素为吉米沙星。
较佳的， 所述四环素类衍生物选自强力霉素、 米诺环素、 氢吡四环素、 替加环素中 的一种或多种， 最佳的， 所述四环素类衍生物为米诺环素。
较佳的， 所述大环内酯类抗生素选自阿奇霉素、 克拉霉素、 罗红霉素中的一种或多 种， 最佳的， 所述大环内酯类抗生素为阿奇霉素。
优选的， 所述缓冲液包括下列重量百分比的组分 ：
NaOH 0.2-0.6％
NaCl 0.9-1％
葡萄糖 5-8％
H2O 余量
本发明的支原体清除试剂在常温下为黄色液体状， 对光与热敏感， 使用与保存必 须避光， 避免反复冻融， 融化后如果出现结晶时为正常现象， 摇动储存管至结晶消失即可正 常使用。 本发明的支原体清除试剂短期内使用需避光于 4℃冰箱保存， 在此温度下其最高效 价能够维持 2-3 周， 如果需要长期保存使用需避光于 -20℃冰箱冻存， 在此温度下其最高效 价能够维持一年以上。
本发明还进一步公开了本发明的支原体清除试剂用于清除支原体及预防支原体 生长的用途， 尤其是去除及预防细胞培养中的支原体的用途。
本发明的支原体清除试剂在用于去除细胞培养中的支原体时， 只需将其加入无双 抗的细胞培养基中， 在随后的传代时使用该培养基培养， 持续一周基本可以清除支原体， 对 于污染严重的细胞可适当重复作用一个周期以达到最佳效果， 推荐工作浓度为 10ug/mL。 为 了维持清除效果， 可用 2 ～ 5ug/ml 的浓度进行维持预防。
本发明的支原体清除试剂， 其中主体抗生素属于氟喹诺酮类， 另外还包括四环素 类衍生物及部分大环内酯类抗生素， 用特制缓冲液混合而成， 能够最有效抑制并杀死支原 体， 作用周期短只需要一周便可全部杀死支原体， 不影响细胞本身的代谢， 并且经过处理的 细胞表面光滑， 黑色状颗粒基本消失， 细胞不会轻易被支原体重新感染。 附图说明
图1： 支原体清除试剂使用示意图 图2： 使用支原体清除试剂前后对照图 ： A： 处理前 DLD-1 细胞 白光视野 A’ ： 处理后 DLD-1 细胞 白光视野 B： 处理前 DLD-1 细胞 荧光视野 B’ ： 处理后 DLD-1 细胞 荧光视野 C： 处理前 Hela 细胞 白光视野 C’ ： 处理后 Hela 细胞 白光视野 D： 处理前 Hela 细胞 荧光视野 D’ ： 处理后 Hela 细胞 荧光视野 E： 处理前 MG-63 细胞 白光视野 E’ ： 处理后 MG-63 细胞 白光视野 F： 处理前 MG-63 细胞 荧光视野 F’ ： 处理后 MG-63 细胞 荧光视野 H： 处理前 SGC-7901 细胞 白光视野 H’ ： 处理后 SGC-7901 细胞 白光视野 I： 处理前 SGC-7901 细胞 荧光视野 I’ ： 处理后 SGC-7901 细胞 荧光视野 J： 处理前 SMMC-7721 细胞 白光视野 J’ ： 处理后 SMMC-7721 细胞 白光视野 K： 处理前 SMMC-7721 细胞 荧光视野 K’ ： 处理后 SMMC-7721 细胞 荧光视野 L： 处理前 Panc-1 细胞 白光视野 L’ ： 处理后 Panc-1 细胞 白光视野 M： 处理前 Panc-1 细胞 荧光视野 M’ ： 处理后 Panc-1 细胞 荧光视野 图3： 实施例 3 的巢式 PCR 检测结果 图4： 支原体清除比较巢式 PCR 检测结果 泳道上样说明 M： DL250+ 1： 污染的细胞上清， 未加入药物去除 2： 吉米沙星去除后的细胞上清3： 米诺环素去除后的细胞上清 4： 阿奇霉素去除后的细胞上清 5： Mycoplasma-OUT 去除后的细胞上清 6： 未加入 IC 与 PC 7： 只加入 IC 8： 只加入 PC具体实施方式
以下列举具体实例以进一步阐述本发明， 应理解， 实例并非用于限制本发明的保 护范围。
实施例 1 支原体清除试剂的配置
按下列配方配制 250ul 试剂 ( 各组分以重量百分比计 ) ：
配方 1 ： 吉米沙星 1.4％
米诺环素 0.4％
阿奇霉素 0.2％
缓冲液 98％
缓冲液配方 ：
NaOH 0.4％
Nacl 0.9％
葡萄糖 5％
H2O 93.7％
配方 2 ： 莫西沙星 1.3％
强力霉素 0.5％
克拉霉素 0.1％
缓冲液 98.1％
缓冲液配方 ：
NaOH 0.2％
Nacl 1.0％
葡萄糖 8％
H2O 90.8％
配方 3 ： 克林沙星 1.5％
替加环素 0.3％
罗红霉素 0.3％
缓冲液 97.9％
缓冲液配方 ：
NaOH 0.6％
Nacl 0.9％
葡萄糖 5％
H2O 93.5％配置方法
1. 缓冲液的配置
1) 超纯水 103.4kpa 蒸汽压温度达 121.3℃， 维持 15-20 分钟湿热灭菌备用
2) 按照以上配方称量各组分制剂
3) 用超纯水溶解以上制剂于 4℃保存
2. 按配方称量氟喹诺酮类抗生素、 四环素类衍生物和大环内酯类抗生素于 50ml 无菌离心管中， 用缓冲液避光溶解
3. 用 millipore 0.22um 孔径滤器过滤分装
4. 浓度 20mg/mL， 250ul/ 盒， 4℃保存
实施例 2 支原体清除试剂清除支原体效果试验
采用实施例 1 配方 1 制备的支原体清除试剂， 使用方法如图 1 所述， 包括如下步 骤：
1. 复苏细胞， 调整后进行种板， 6cm 盘中种植 1x106 个细胞 ；
2. 次日待细胞贴壁后， 按 2000x 比例将支原体清除试剂稀释到含 5％ FBS 无双抗 培养基中， 在随后的传代时使用该培养基培养 ； 3. 作用 7 天， 此过程中注意观察并记录细胞状态， 换液或传代时用含有支原体清 除试剂的培养基维持 ；
4.7 天后换成正常的不含抗生素的完全培养基培养 2 天， 每盘体积加至 4-5ml ；
5.2 天 后 吸 取 培 养 上 清 500ul， 进 行 PCR( 检 测 步 骤 详 见 吉 凯 基 因 GC-PCR Mycoplasma TestKit 操作手册 ) ；
6. 检测结果为阴性后的细胞扩大冻存保种或直接进行后续细胞学实验。
处理对象为实验室明确被支原体污染的 DLD-1 细胞、 Hela 细胞、 MG-63 细胞、 SGC-7901 细胞、 SMMC-7721 细胞和 Panc-1 细胞， 处理 7 天前后的细胞形态与感染效率比较 照片如图 2 所示。
由照片可见 ： 处理前细胞表面有碎片， 黑色颗粒状物质， 背景很脏， 部分细胞变圆， 感染效率较低 ； 处理后细胞表面碎片与黑色颗粒状物质消失， 背景干净， 细胞完全铺开， 且 感染效率明显增加。
实施例 3 支原体清除试剂清除支原体效果试验
实验器材 ：
超镜台 水浴锅 离心机 负 80 度冰箱 PCR 仪 电泳槽 凝胶成像仪 电泳仪
无菌 PCR 管 无菌 1.5ml EP 管 PCR 管架 无菌枪头 棉球
移液器 (1ml 200ul 10ul 2ul)
实验试剂 ：
无菌超纯水 待检样品 75％消毒酒精 去支原体喷雾剂 ( 实施例 1 制备 )
Germ-free test medium
巢式 PCR 支原体快速检测试剂盒 ( 上海吉盛制药公司 )
2％琼脂糖胶 EB 电泳缓冲液 Mark(DL250+)6x Loading Buffer
实验步骤 ：
参考实施 2 的方法使用支原体清除试剂。
采用下列方法使用巢式 PCR 支原体快速检测试剂盒 ：
1. 收集需要检测的样品， 负 80 度冰箱保存
2.95 度沸水浴中煮待检样品 5 ～ 10min， 12000 转每分钟离心 2min
3. 用 75％消毒酒精擦拭所有实验器材与物料， 再用去支原体喷雾剂喷洒重要物 料与器材， 均匀擦拭表面以彻底去除环境中的支原体
4. 取出 PCR 管若干， 1.5ml EP 管若干， 放置备用
5. 稀释引物， PC(Positive Control) 与 IC(Internal Control) 质粒 (IC 的作用是 与支原体的 DNA 序列形成竞争关系， 当没有支原体污染时， 可以扩增出条带， 当有污染时， 它被抑制不被扩增 ) 到适当浓度
6. 配置第一轮 PCR 体系总管， 然后每管 48ul 分装到事先准备的 PCR 管内， 其中需 添加水对照与 IC 对照
7. 加入待检样品， 振荡器上混匀后进行第一轮 PCR
8. 第一轮 PCR 结束后， 配置第二轮 PCR 体系总管， 然后每管 48ul 分装到事先准备 的 PCR 管内， 其中需添加 PC 对照
9. 加入第一轮 PCR 产物， 振荡器上混匀后进行第二轮 PCR
10. 结束后加入 Loading Buffer， 配置 2％琼脂糖胶， 上样进行电泳， 拍照 PCR 体 H2O 32ul 5X Buffer(Mg2+) 10ul dNTP 3ul Primer MIX 2.5ul Taq 酶 0.5ul Template 2ul 第一轮循环 第二轮循环 1 循环 94℃ for 2min 1 循环 94℃ for 2min 30 循环 cycle 94℃ for 30sec 30 循环 e 94℃ for 30sec 62℃ for 1min 53℃ for 30sec 72℃ for 1min 72℃ for 30sec 1 循环 72℃ for 10min 1 循环 72℃ for 10min 冷却至 4℃ 冷却至 4℃ 实验结果与分析 ： 结果如图 3 所示 上样编号 ： 1～3： 293T 细胞 ( 复苏后 ) ； 293T 细胞 ( 加药前 ) ； 293T 细胞 ( 加药后 ) 4～6： panc-1 细胞 ( 复苏后 ) ； panc-1 细胞 ( 加药前 ) ； panc-1 细胞 ( 加药后 ) 7～9： SGC-7901 细胞 ( 复苏后 ) ； SGC-7901 细胞 ( 加药前 ) ； SGC-7901 细胞 ( 加 10 ～ 12 ： H1299 细胞 ( 复苏后 ) ； H1299 细胞 ( 加药前 ) ； H1299 细胞 ( 加药后 ) 13 ～ 15 ： IC ； IC+PC ； PC7系：
药后 )
101851603 A CN 101851604
说明书6/7 页“复苏后” 的样品是上一轮 PCR 的剩余上清 ；
“加药前” 的样品是细胞复苏传了 4-5 传后， 用含有双抗的完全培养基培养到密度 达到 80 ～ 90％的细胞培养上清 ；
“加药后” 的样品是用药物处理一周后， 换成 Germ-free test medium 培养 2 天后 密度达 80 ～ 90％的细胞培养上清。
PCR 结果 ： 处理前与处理后的细胞上清形成鲜明对比， 达到预期的效果
1. 本次实验选择 293T、 panc-1、 SGC-7901、 H1299 四株细胞进行检测， 每株细胞设 置 3 组 ( 复苏后、 加药前、 加药后 )， 目的就是想看看细胞在复苏传代过程的污染深度情况， 用抗生素处理后的细胞是否还有支原体污染的可能。
2. 从 PCR 结果可以看出， 第一轮检测有污染的细胞确实受到支原体污染， 细胞在 加药处理后全部转成阴性， 说明本发明的支原体清除剂可以用来快速去除支原体的首选试 剂。
3. 本发明的支原体清除剂处理后的细胞， 外表面碎片消失， 细胞通体光滑， 折光度 好， 细胞贴壁更开， 生长速度显著提高， 初步实验证明转染与感染效率提高。
实施例 4 比较试验
对比方 1 ： 吉米沙星 4.2％ 缓冲液 余量 配方 ： NaOH 0.4％ Nacl 0.9％ 葡萄糖 5％ H2O 93.7％ 对比方 2 ： 米诺环素 1.2％ 缓冲液 余量 配方 ： NaOH 0.4％ Nacl 0.9％ 葡萄糖 5％ H2O 93.7％ 对比方 3 ： 阿奇霉素 0.6％ 缓冲液 余量 配方 ： NaOH 0.4％ Nacl 0.9％ 葡萄糖 5％ H2O 93.7％ 对比方 4 ： 实施例 1 的配方 1 实验过程 ：1. 将检测有污染的细胞进行种板 (6 孔板 )， 贴壁后培养 1-2 天
2. 按实施例 2 的方法各自加入相同体积的对比方 1-4 到孔板中进行去除
3. 作用一周后， 去培养上清按照实施例 3 的方法进行 PCR 检测， 结果如图 4 所示。
实验分析 ：
对比方 1-3 中各自成分单独使用时对污染细胞的支原体都不能很好的去除干净， 而第五泳道的对比方 4 去除后的细胞培养上清检测是阴性， 说明将氟喹诺酮类抗生素、 四 环素类衍生物和大环内酯类抗生素合用后， 在清除支原体上发生了协同作用， 使得清除支 原体的效果均优于单独使用各药物。 且本试剂中采用的缓冲液比常规缓冲液起到了更好的 保护细胞的作用。 该结果表明， 本发明的组方将氟喹诺酮类抗生素、 四环素类衍生物和大环 内酯类抗生素合用后， 在清除支原体上发生了协同作用， 使得清除支原体的效果均优于单 独使用各药物。且本试剂中采用的缓冲液比常规缓冲液起到了更好的保护细胞的作用。