编码可诱导抗病毒效应的蛋白质的嵌合链 【发明领域】
本发明涉及生物技术领域及制药工业，特别涉及获得嵌合核苷酸链，将其引入表达载体时可产生能够引发血清特异性体液免疫应答并防止登革(Dengue)病毒-此时开始引述为DEN-感染的蛋白质，避免可导致出血及该类型病理所述临床并发症的血清特异性病毒免疫扩增的效应。
现有技术
登革病毒(DEN)是包膜病毒，其脂质膜包含其三种结构性蛋白质中的两种：包膜蛋白质(E)和膜蛋白质(M)。E蛋白质覆盖由第3种结构性蛋白质-核心蛋白质-组成的20面体(icosaedric)核壳。该病毒属于黄病毒(Flaviviridae)家族，存在4种不同的血清型。由属于覆蚊亚属(Stegomia)家族的蚊子埃及伊蚊(Aedes aegypti)传播给人。据认为该病毒在人体中产生的疾病是良性，被描述为登革热(Dengue Fever，DF)或典型性登革(Classical Dengue)，直至出现了更为严重的形式，有时甚至致命，其特征在于出血性发热和休克，命名为出血性登革热及登革休克综合症(Hemorrhagic Dengue Fever andDengue Shock Syndrome，HDF/DSS)(Hammon WMc.New hemorrhagicfever in children in the Philippines and Thailand.Trans AssocPhysicians 1960；73：140-155)。已经进行的若干流行病学研究证明，两种不同病毒血清型的连续感染是危险因素(KouríGP，Guzmán MG，Brave JR.Why dengue hemorrhagic fever in Cuba)2.An integralanalysis.Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1987；72：821-823)。可由免疫强化解释这种现象，即通过靶细胞(单核细胞)地Fc受体进入细胞的病毒-抗体复合物增多，从而增加病毒感染(halstead SB.Pathogenesis of dengue：challenges to molecular biology.Science 1988；239：476-481)。
已经开发了不同技术产生减毒活疫苗，但由于它们能够恢复毒力、病毒性互相干扰以及基因组间重组，目前这些疫苗发挥可能的作用尚有许多未解决问题。另外，可以获得重组抗原，作为亚单位疫苗的可能组分(Feighny，R.，Borrous，J.和Putnak R.Dengue type-2 virusenvelope protein made using recombinant baculovirus protectsmice against virus challenge.Am.J.Trop.Med.Hyg.1994.50(3).322-328；Deubel，V.，Staropoli，I.，Megret，F.等人，Affinity-purified dengue-2 virus envelope glycoproteininduces neutralizing antibodies and protective immunity inmice. Vaccine.1997.15，1946-1954)。
该病毒的主要抗原是包膜蛋白质DENe。该蛋白质是病毒表面的主要成分，据认为介导病毒与细胞受体结合(A Heinz FX，Berge R，TumaW等人.A topological and functional model of epitopes on thestructural glycoprotein of tick-borne encephalitis virusdefined by monoclonal antibodies.Virology.1983；126：525)。该蛋白质与蜱传脑炎病毒(tick borne encephalitis virus，TBE)具有结构同源性(Rey，F.A.，Heinz，F.X.，Mandl，C.等人.Theenvelope glycoprotein from tick borne encephalitis virus at 2A°resolution.Nature 1995；375：291-298)，各血清型之间也具有结构保守性。
昆虫细胞利用杆状病毒系统为载体，构成了表达不同异源基因最常用的系统之一。这些载体已经用于表达几种日本脑炎病毒(Encephalitis Japanese virus，JEV)的结构性与非结构性蛋白质DEN-1、DEN-2和DEN-4(Matsuura Y，Miyamoto M，Soto T等人.Characterization of japanese encephalitis virus envelopeprotein expressed by recombinant baculoviruses.Virology 1989；173：677-682；Deubel V，Bordier M，Megret F等人.Processing，secretion and immunoreactivity of carboxy terminally truncateddengue-2 envelope proteins expressed in insect cell byrecombinant baculoviruses.Virology 1991；180：440-447；PutnakR，Feighny R，Burrous J等人.Dengue 1 virus envelopeglycoprotein gene expressed in recombinant baculovirus elicitvirus neutralization antibodies in mice and protects them fromvirus challenge.Am J Trop Med Hyg 1991；45：159-167；FeighnyR，Burrous J，Putnak R.Dengue type 2 virus envelope proteinmade using recombinant baculovirus protects mice against viruschallenge.Am J Trop Med Hyg 1994；50：322-328)。使用的另一系统是表达E蛋白质不同变体的黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)细胞(PCT/US96/07627)。尽管使用这些系统所表达的蛋白质获得了适当的功能性反应，但这意味着开发放大生产工艺的高额费用；因此，酵母表达已经成为生产黄病毒重组结构性蛋白质的另选方案。然而，就巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达的DENe蛋白质而言(PCT/US96/07627；Sugrue R.J.，Fu H.，Howe J.，Chan Y.Expressionof the Dengue virus structural proteins in Pichia pastoris leadsto the generation of virus-like particles.J Virol.1997.78，1861-1866)，分泌型或细胞内的表达水平均低，妨碍纯化过程。
同时，在细菌中获得了DENe蛋白质的几种变体。其中之一是与大肠杆菌(E.coli)色氨酸代谢蛋白质融合(TrpE)的JEV E蛋白质的C末端部分。该蛋白质产生为包涵体，可使用免疫检测技术由中和单克隆抗体(Mabs)识别。然而该蛋白质的纯制剂不能产生中和抗体并防护病毒性攻击(Mason P.W.，Zogel M.V.，Semproni A.R.等人.Theantigenic structure of dengue type 1 virus envelope and NS1protein expressed in E.coli.J Gen Virol.1990.71：2107-2114)。此外，制备了另一构建体(Srivastava A.K.，Morita K.，Matsuo S.等人.Japanese encephalitis virus fusion protein with proteinA expressed in E.coli confers protection in mice.MicrobiolImmunol.1991.35：863-870)，其中包含与E蛋白质C末端片段融合的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aurius)蛋白A，后接JEV非结构性蛋白质的N末端片段NS1。在此情况下的融合蛋白质可溶，便于通过亲和层析纯化。利用该纯化蛋白质免疫小鼠，得到高中和抗体滴度，也抑制血细胞凝集并防护JEV的病毒性攻击。使用与金黄色葡萄球菌蛋白A融合的DEN-2的DENe区，获得了类似结果(Srivastava A.K.，Putnak R.J.，Warren R.L.，Hoke C.H.Mice immunized witha dengue type 2 virus E and NS1 fusion protein made inEscherichia coli are protected against lethal dengue virusinfection.Vaccine.1995.13：1251-1258)；然而，由于存在与人免疫球蛋白G(IgG)具有高亲和力的蛋白A，这些制剂不可能用于人体。
最后，已经报道了名为MBP-DomB的融合蛋白质，其包含DEN-2 DENe蛋白质B结构域和大肠杆菌麦芽糖结合蛋白质(maltose bindingprotein，MBP)(Simmons M.，Nelson W.M.，Wu S.J.，Hayes C.G.Evaluation of the protective efficacy of a recombinant dengueenvelope B domain fusion protein against dengue 2 virusinfection in mice.Am J Trop Med Hyg.1998.58：655-662)。该蛋白质变体在小鼠中具有免疫源性，可激发中和抗体。
在我们的情况中，本发明有赖于获得嵌合序列，例如第一种情况，DENe蛋白质的一个区域的编码序列与脑膜炎球菌(Neisseriameningitidis)具有脱氢酶活性的突变蛋白质(MDH)的N末端片段相连；第二种情况，DENe蛋白质的一个区域的编码序列与MDH蛋白质完整基因的不同位置相连，以及第三种情况，两种不同病毒血清型的DENe蛋白质的两个片段与MDH蛋白质相同编码基因融合产生嵌合序列。将这些嵌合链插入合适的载体，可在细菌的细胞质中产生不溶性嵌合蛋白质。这些蛋白质可激发高水平的抗DEN中和抗体，是病毒性血细胞凝集的抑制剂，并保护免疫小鼠抵抗病毒攻击。
针对上述蛋白质的不溶性，实现了容易放大的体外折叠方法、表达和纯化方法，优于Simmons等人，1998所用方法。另一方面，利用这些蛋白质免疫小鼠产生抗体，在中和、抑制血细胞凝集以及ELISA水平证明了抗体的血清型特异性，所用剂量低于Simmons等人，1998所使用的。以上事实构成了有关大肠杆菌表达能够刺激功能性免疫应答的不溶性DENe蛋白质的第一份报告。
此外，鉴于利用二聚体变体所获得的结果，有可能利用相同分子产生针对两种不同病毒血清型的血清型特异性抗体，能够中和病毒感染并保护小鼠抵抗病毒攻击。
在EMBL数据库中检索MDH蛋白质与其它序列的同源性，显示其前110个氨基酸与二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(丙酮酸脱氢酶复合物的E2酶以及α-酮戊二酸脱氢酶(α-cetoglutarate dehydrogenase))的硫辛酸结合结构域区和柔性铰链高度相似，该蛋白质的其余部分与所述复合物的E3酶硫辛酰胺脱氢酶(LPDH)高度相似(Stephens，P.E；H.M.Darlinson和J.R.Guest.，1983.The Pyruvate dehydrogenasecomplex of E.coli.Eur.J.Biochem.133：155-162。
另一方面，还发现原发性胆汁性肝硬化(Primary BiliaryCirrhosis，PBC)患者产生特异性针对这些蛋白质共有的硫辛酸结合位点的抗线粒体自身抗体(Gershwin ME，Mackay IR，Sturgess A，Coppel RL.Identification and specificity of a cDNA encodingthe 70KDa mitochondrial antigen recognized in primary biliarycirrhosis.J Immunol 1987：138：3525-31)。因此，我们决定突变蛋白质内该区域，避免以嵌合蛋白质免疫人体时的任何自身免疫应答。本发明的MDH突变蛋白质用于I期临床试验，表明在人体中安全并具有免疫源性，也不被PBC患者的血清识别(Pérez，A.，F.Dickinson，Z.Cinza，A.Ruíz，T.Serrano，J.Sosa，S.González，Y.Gutiérrez，C.Nazábal，O.Gutiérrez，D.Guzmán，M.Díaz，M.Delgado，E.Caballero，G.A.Alvarez，A.Martín，G.Guillén，R.Silva.Safety and preliminary immunogenicity of therecombinant outer membrane protein of Neisseria meningitidisin human volunteers.Biotech.Appl.Biochem.34：121-125)。然而，尚未证明MBP可能用于人体(Simmons M.，Nelson W.M.，Wu S.J.，Hayes C.G.Evaluation of the protective efficacy of arecombinant dengue envelope B domain fusion protein againstdengue 2 virus infection in mice.Am J Trop Med Hyg.1998.58：655-662)。
发明详述
本发明描述了获得嵌合核苷酸链，在引入表达载体时，可产生能够诱导血清特异性体液免疫应答并防护登革病毒感染的嵌合蛋白质，例如，每一病毒血清型登革病毒的DENe蛋白质的一个区域的编码序列与脑膜炎球菌具有脱氢酶活性的突变蛋白质(MDH)的N末端片段相连；第二种情况，DENe蛋白质的一个区域的编码序列与MDH蛋白质完整基因的两个不同位置相连：其中一个位点位于MDH蛋白质结构性结构域(硫辛酸结合结构域以及该基因3’末端)的编码序列，以及第三种情况，两种不同病毒血清型DEN-2和DEN-4的DENe蛋白质的两个片段在MDH基因的两个不同位置形成嵌合序列：其一位于硫辛酸结合结构域编码序列的特定位点(血清型4)，另一位于MDH基因3’末端(血清型2)。即为所谓的嵌合构建体。
在细菌细胞质中获得不溶的嵌合蛋白质。利用固定化的金属亲和层析(IMAC)进行纯化过程，以获得纯蛋白质供免疫源性研究。
分析抗原性结果证实，所有重组嵌合蛋白质对超免疫腹水液(hyperimmune ascitic liquids，HMAF)抗DEN强有力识别，融合完整MDH基因时较高，证明MDH对DENe蛋白质区的折叠具有积极作用。使用血清型2时，获得的所有蛋白质可由血清型特异性中和抗体(3H5)识别，同样融合完整MDH基因以及二聚体蛋白质时较高。还观察到在每种情况下，同源血清型HMAF的识别显著高于异源血清型HMAF，证明血清型特异性表位暴露，因而可用于登革病毒以及血清分型的诊断方法。
将所有重组嵌合蛋白质免疫小鼠，可获得中和及保护性应答。利用融合MDH完整基因的序列以及二聚体蛋白质获得的中和滴度最高，而与该片段在DENe蛋白质中的位置无关。这显示了MDH介导对免疫应答的免疫增强剂效应，可以根据由所获抗原性结果反映出的对DENe蛋白质折叠的影响进行解释。还首次证明，与现有技术相反，这些蛋白质的不溶性并不影响其产生合适免疫应答的能力。
各种情况下产生的免疫应答在病毒中和、血细胞凝集抑制以及ELISA中均具有血清型特异性(针对所免疫的同源血清型的抗体)。产生血清型特异性抗体意味着它们不能识别可促进免疫增强现象的异源血清型病毒的抗原决定簇。该特征对于开发针对登革病毒的候选疫苗极其重要，因为引起出血性登革热(Hemorrhagic Dengue Fever，HDF)的原因之一即为抗体识别异源血清型。
此外表明，只利用其中一种嵌合蛋白质免疫以后，可诱导针对两种病毒血清型的抗体，因此仅使用两种我们所获得的重组嵌合蛋白质，即可形成针对四种血清型的候选疫苗制剂。
根据该脂肪酸与赖氨酸(K)的ε-氨基共价结合，去除序列ETDKAT中的硫辛酸结合位点，获得突变型MDH蛋白质(Tuaillon N，Andre C，Briand JP等人.Alipoyl synthetic octadecapeptide ofdihvdrolipoamide acetyltransferase specifically recognized byanti-M2 autoantibodies in Primary Biliary Cirrhosis.JImmunol 1992；148：445-50)。
使用一对引物通过PCR扩增N-末端区(从IpdA基因的起始密码子到硫辛酸结合位点，135bp)和蛋白质的C-末端(从硫辛酸结合位点到该基因3’端)进行诱变，从而消除产生自身免疫反应的可能性，如人体临床试验所证实。
生物材料的保藏
根据布达佩斯公约(Budapest Treaty)，质粒PLL1、PLL2、PLL3、PLH1、PLH2、PLH3，PAZ1、PAZ2、PAZ3、PID1、PID2和PID3保藏于Belgian Coordinated collection of Microorganism -BCCMTM，LMBP-COLLECTION，其日期及登录号(未决)。
附图描述
图1.E2片段的克隆策略以获得PLL1。
DENe2：DEN-2包膜蛋白质的片段。
N-端：编码MDH蛋白质前45个氨基酸的核苷酸序列。
图2.E2片段的克隆策略以获得PLL2。
DENe2：DEN-2包膜蛋白质的片段。
MDH：脱氢酶突变体。
图3.E2片段的克隆策略以获得PLL3。
DENe2：DEN-2包膜蛋白质的片段。
MDH：脱氢酶突变体。
图4.E1片段的克隆策略以获得PLH1。
DENe1：DEN-1包膜蛋白质的片段。
N-端：编码MDH蛋白质前45个氨基酸的核苷酸序列。
图5.E1片段的克隆策略以获得PLH2。
DENe1：DEN-1包膜蛋白质的片段。
N-端：编码MDH蛋白质前45个氨基酸的核苷酸序列。
图6.E1片段的克隆策略以获得PLH3。
DENe1：DEN-1包膜蛋白质的片段。
MDH：脱氢酶突变体。
图7.E3片段的克隆策略以获得PAZ1。
DENe3：DEN-3包膜蛋白质的片段。
N-端：编码MDH蛋白质前45个氨基酸的核苷酸序列。
图8.E3片段的克隆策略以获得PAZ2。
DENe3：DEN-3包膜蛋白质的片段。
MDH：脱氢酶突变体。
图9.E3片段的克隆策略以获得PAZ3。
DENe3：DEN-3包膜蛋白质的片段。
MDH：脱氢酶突变体。
图10.E4片段的克隆策略以获得PID1。
DENe4：DEN-4包膜蛋白质的片段。
N-端：编码MDH蛋白质前45个氨基酸的核苷酸序列。
图11.E4片段的克隆策略以获得PID2。
DENe4：DEN-4包膜蛋白质的片段。
MDH：脱氢酶突变体。
图12.E4片段的克隆策略以获得PID3。
DENe4：DEN-4包膜蛋白质的片段。
MDH：脱氢酶突变体。
图13.获得PD4D2的克隆策略。
DENe4：DEN-4包膜蛋白质的片段。
DENe2：DEN-2包膜蛋白质的片段。
MDH：脱氢酶突变体。
实施例
实施例1.获得PLL1
利用序列表中序列号1和序列号2所示寡核苷酸，从DEN-2病毒株基因型Jamaica(Deubel V.，Kinney R.M.，Trent D.W.Nucleotidesequence and deduced amino acid sequence of the nonstructuralproteins of Dengue type 2 virus，Jamaica genotype：Comparativeanalysis of the full-length genome.Virology 1988.165：234-244)中扩增编码DEN-2病毒包膜蛋白质286-426氨基酸的核苷酸序列(Sec.Id.No.22)。
利用XbaI/BamHI消化pM108 His质粒，产生包含编码MDH的N末端区和6个组氨酸序列的核苷酸序列(序列号23)的载体。连接以后，通过限制性酶消化来分析可能的重组子，测序阳性克隆以验证连接。利用所选名为pLL1的克隆(图1以及序列号24)转化感受态细胞W3110(Hill C.W.，Harnish B.W.1982.Transposition of achromosomal segment bounded by redundant rRNA genes inEscherichia coli.J Bacteriology.149：449-457)。菌落在LuriaBertani(LB)培养基中生长以后，对细胞裂解物进行SDS-PAGE。结果获得25kDA条带，占总细胞蛋白质的10％。所获蛋白质的大小相当于MDH蛋白质N末端区以及DEN-2病毒DENe蛋白质片段大小的总和。该蛋白质在免疫印迹中可由HMAF中包含的抗DEN-2多克隆抗体(PA)识别。将该蛋白质命名为PLL1(序列号25)。
实施例2.纯化PLL1蛋白质
转化pLL1的大肠杆菌菌株于37℃生长，获得的生物质通过弗氏压碎器(French press)裂解。所获重组蛋白质主要为伴有细胞裂解沉淀的不溶性形式。利用6M脲从沉淀中提取蛋白质，将包含PLL1蛋白质的上清上样G-25柱，以便去除离液剂。然后将获得的组分上样存在Cu++离子的螯合-琼脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。利用50mM咪唑洗脱该蛋白质，将获得的体积上样G-25柱，最终获得处于配制缓冲液NaCl100mM、KCl2 2mM、Na2HPO4 10mM、pH7.2、KH2PO4 1mM(PBS)中的蛋白质。该制剂供免疫学研究之用。
实施例3.PLL1的抗原性特征
通过不同多克隆血清和/或小鼠单克隆抗体以及针对登革的人阳性血清进行识别，鉴定纯化的PLL1组分的特征(表1)。
表1.PLL1蛋白质对单克隆和多克隆抗体的反应性。
Abs**
特异性*** PLL1*
HMAF DEN-1 +
HMAF DEN-2 ++
HMAF DEN-3 -
HMAF DEN-4 -
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT +
*总计使用10μg纯化的PLL1。按+至++评价获得的信号强度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀释使用。
***EEE：马脑炎病毒(Equine Encephalitis virus)。YFV：黄热病毒(Yellow Fever virus)。SLV：圣路易斯脑炎病毒(Saint LouisEncephalitis virus)。NT：中和特异性血清型。
在斑点印迹中，利用HMAF抗DEN-2获得的识别最强。此结果与该克隆区域属于血清型2的事实相符。针对其它血清型的HMAF的识别低于血清型2的情况，按DEN-1、DEN-3和DEN-4降序排列。由其它黄病毒、如黄热病毒以及圣路易斯脑炎病毒产生的抗体完全没有任何识别作用。另一方面，Mab 3H5确实具有反应性。通过Western印迹的识别有赖于二硫键，因为还原样品则信号丢失。最后，测定了针对抗DEN-2的3个高滴度和3个低滴度人血清的反应性，Western印迹和斑点印迹均获得了显著信号。
实施例4.由PLL1产生的抗体应答的特征
利用处于弗氏佐剂中的35ug纯化的PLL1 i.p免疫总计25只Balb/c小鼠，10只动物于4次剂量后取血，通过ELISA评价抗DEN抗体。获得了针对DEN-2的高抗体滴度，未获得针对其它血清型的反应性(表2和表5)。此外，进行了血细胞凝集抑制分析(HIA)，只发现针对DEN-2的阳性滴度(表3和表5)。最后，进行了体外中和分析，获得针对DEN-2的中和滴度为1∶320。然而，未发现针对其它血清型病毒感染的中和作用(表4和表5)。这些结果表明，PLL1可激发高度血清型特异性的抗体。
表2.PLL1免疫小鼠所获血清的抗DEN-2抗体滴度。小鼠抗DEN-2滴度PLL1抗DEN-2滴度PBS对照(-) 1 1/128 000 ＜1∶100 2 1/64 000 ＜1∶100 3 1/64 000 ＜1∶100 4 1/128 000 ＜1∶100 5 1/32 000 ＜1∶100 6 1/32 000 ＜1∶100 7 1/64 000 ＜1∶100 8 1/32 000 ＜1∶100 9 1/128 000 ＜1∶100 10 1/512 000 ＜1∶100
表3.PLL1免疫动物血清的HI滴度。小鼠抗DEN-2的HI*滴度PLL1抗DEN-2的HI滴度PBS C(-) 1 ＜1∶5 ＜1∶5 2 ＞1∶640 ＜1∶5 3 1∶320 ＜1∶5 4 1∶320 ＜1∶5 5 ＞1∶640 ＜1∶5 6 ＞1∶640 ＜1∶5 7 ＞1∶640 ＜1∶5 8 1∶320 ＜1∶5 9 ＞1∶640 ＜1∶5 10 ＜1∶5 ＜1∶5
*HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
表4.PLL1免疫动物血清的病毒中和分析。小鼠抗DEN-2的中和滴度*PLL1抗DEN-2的中和滴度PBS C(-) 1 1∶320 ＜1∶5 2 1∶320 ＜1∶5 3 1∶320 ＜1∶5 4 1∶320 ＜1∶5 5 1∶80 ＜1∶5 6 1∶160 ＜1∶5 7 1∶320 ＜1∶5 8 1∶40 ＜1∶5 9 1∶160 ＜1∶5 10 1∶320 ＜1∶5
*中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
表5.利用PLL1免疫动物血清通过ELISA、HI以及病毒中和进行的针对所有病毒血清型的交叉反应性分析。血清混合物*ELISA(抗DEN-1)ELISA(抗DEN-2)ELISA(抗DEN-3 )ELISA(抗DEN-4) 1(PLL1) ＜1/100 ＞1∶128 000 ＜1/100 ＜1/100 2(PLL1) ＜1/100 1∶128 000 ＜1/100 ＜1/100血清混合物*HI**抗DEN-1HI抗DEN-2HI抗DEN-3HI抗DEN-4 PLL1 ＜1/5 ＞1/320 ＜1/5 ＜1/5血清混合物*抗DEN-1的中和滴度***抗DEN-2的中和滴度抗DEN-3的中和滴度抗DEN-4的中和滴度 1(PLL1) ＜1∶5 1∶320 ＜1∶5 ＜1∶5 2(PLL1) ＜1∶5 1∶160 ＜1∶5 ＜1∶5
*每种混合物由三种血清形成。
**HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
***中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
实施例5.获得PLL2
利用序列表中序列号1和序列号3所示寡核苷酸，从DEN-2病毒株基因型Jamaica(Deubel V.，Kinney R.M.，Trent D.W.Nucleotidesequence and deduced amino acid sequence of the nonstructuralproteins of Dengue type 2 virus，Jamaica genotype：Comparativeanalysis of the full-length genome.Virology 1988.165：234-244)中扩增编码DEN-2病毒包膜蛋白质286-426氨基酸的核苷酸序列(Sec.Id.No.22)。
利用XbaI/EcoRI消化pM84 His质粒，产生包含编码MDH蛋白质和6个组氨酸序列的核苷酸序列(序列号26)的载体。该消化使得可以在MDH蛋白质结构性结构域编码区内插入PCR扩增片段。连接以后，通过限制性酶消化来分析可能的重组子，测序阳性克隆以验证连接。利用所选名为pLL2的克隆(图2和序列号27)转化感受态细胞MM294(Hanahan D.1983.Studies on transformation of Escherichia coliwith plasmids.J.Mol.Biol.166：557-580)。菌落在LB培养基中生长以后，对细胞裂解物进行SDS-PAGE。结果获得80kDA条带，占总细胞蛋白质的10％。所获蛋白质的大小相当于MDH蛋白质以及DEN-2病毒DENe蛋白质片段大小的总和。该蛋白质在免疫印迹中可由HMAF抗DEN-2识别，命名为PLL2(序列号28)。
实施例6.纯化PLL2蛋白质
转化pLL2的大肠杆菌菌株于37℃生长，获得的生物质通过弗氏压碎器裂解。获得可溶性及不溶性两种形式的重组蛋白质。使用预先连接Cu++离子的螯合-琼脂糖FF柱从可溶性组分中进行金属离子亲和层析。使用15mM咪唑洗柱，100mM咪唑洗脱蛋白质。另一方面，利用8M脲提取伴有不溶性组分的蛋白质，将包含PLL2蛋白质的上清上样G-25柱，以便去除离液剂。然后将获得的组分上样存在Cu++离子的螯合-琼脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。利用100mM咪唑洗脱该蛋白质。最后将每种形式蛋白质的纯净组分上样G-25柱，获得处于配制缓冲液NaCl 100mM、KCl2 2mM、Na2HPO4 10mM、pH7.2、KH2PO4 1mM(PBS)中的蛋白质。该制剂供免疫学研究之用。
实施例7.PLL2的抗原性特征
利用不同多克隆血清和/或小鼠单克隆抗体以及针对登革的人阳性血清进行识别，鉴定纯化的PLL2组分的特征(表6)。
在斑点印迹中，利用HMAF抗DEN-2获得的识别最强。针对其它血清型的HMAF的识别低于血清型2的情况，按DEN-1、DEN-3和DEN-4降序排列。由其它黄病毒、如黄热病毒以及圣路易斯脑炎病毒产生的抗体完全没有任何识别作用。尽管如此，利用斑点印迹和Western印迹均观察到Mab 3H5的较高反应性(甚至高于利用PLL1所获反应性)。与PLL1结果相反，在样品中存在还原剂时，Mab 3H5的识别不变，表明这两种蛋白质可能构象不同。最后，测定了针对抗DEN-2的3个高滴度和3个低滴度人血清的反应性，通过Western印迹和斑点印迹均获得了显著信号。
表6.PLL2蛋白质对单克隆和多克隆抗体的反应性。
Abs**
特异性*** PLL2 sol，ins*
HMAF DEN-1 ++
HMAF DEN-2 +++
HMAF DEN-3 -
HMAF DEN-4 -
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT +++
*总计使用10μg纯化的PLL2。按+至++评价获得的信号强度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀释使用。
***EEE：马脑炎病毒。YFV：黄热病毒。SLV：圣路易斯脑炎病毒。NT：中和特异性血清型。
实施例8.由PLL2产生的抗体应答的特征
利用处于弗氏佐剂中的35ug纯化的PLL2i.p免疫总计25只Balb/c小鼠，10只动物于4次剂量后取血，通过ELISA评价抗DEN抗体。获得了针对DEN-2的高抗体滴度，未获得针对其它血清型的反应性(表7和表10)。此外，进行了血细胞凝集抑制分析(HI)，只发现针对DEN-2的阳性滴度(表8和表10)。最后，进行了体外中和分析，获得针对DEN-2的中和滴度为1∶1280。与利用PLL1所获结果类似，未发现针对其它血清型病毒感染的中和作用(表9和表10)。另一方面，利用PLL2两种变体所获结果类似，表明蛋白质溶解状态不影响其产生功能性抗体的能力。
表7.可溶性及不溶性PLL2免疫小鼠所获血清的抗DEN-2抗体滴度。小鼠抗DEN-2滴度(PLL2)抗DEN-2滴度PBS C(-)PLL2 s PLL2 ins 1＞1∶128 0001∶64000＜1∶100 21∶128 000＞1∶128 000＜1∶100 3＞1∶128 0001∶128 000＜1∶100 4＞1∶128 000＞1∶128 000＜1∶100 51∶64 000＞1∶128 000＜1∶100 6＞1∶128 0001∶128 000＜1∶100 71∶64000＞1∶128 000＜1∶100 8＞1∶128 0001∶64000＜1∶100 9＞1∶128 0001∶64000＜1∶100 101∶128 000＞1∶128 000＜1∶100
表8.可溶性及不溶性PLL2免疫动物血清的HI滴度。小鼠抗DEN-2的HI*滴度(PLL2)抗DEN-2的HI滴度PBS C(-) PLL2 s PLL2 ins 1 ＞1∶640 ＞1∶640 ＜1∶5 2 ＞1∶640 ＞1∶640 ＜1∶5 3 1∶320 ＞1∶640 ＜1∶5 4 ＞1∶640 1∶320 ＜1∶5 5 1∶320 ＜1∶5 ＜1∶5 6 ＞1∶640 ＞1∶640 ＜1∶5 7 ＞1∶640 1∶320 ＜1∶5 8 ＜1∶5 1∶320 ＜1∶5 9 1∶320 ＞1∶640 ＜1∶5 10 ＞1∶640 ＞1∶640 ＜1∶5
*HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
表9.可溶性及不溶性PLL2免疫动物血清的病毒中和分析。小鼠抗DEN-2的中和滴度*(PLL2)抗DEN-2的中和滴度PBS C(-) PLL2 s PLL2 ins 1 ＞1∶1280 ＞1∶1280 ＞1∶1280 2 ＞1∶1280 ＞1∶1280 ＜1∶5 3 ＞1∶1280 1∶640 ＜1∶5 4 1∶640 ＞1∶1280 ＜1∶5 5 1∶640 1∶640 ＜1∶5 6 ＞1∶1280 ＞1∶1280 ＜1∶5 7 ＞1∶1280 ＞1∶1280 ＜1∶5 8 ＞1∶1280 ＞1∶1280 ＜1∶5 9 ＞1∶1280 ＞1∶1280 ＜1∶5 10 ＞1∶1280 ＞1∶1280 ＜1∶5
*中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
表10.利用可溶性及不溶性PLL2免疫动物的血清通过ELISA、HI以及病毒中和进行的针对所有病毒血清型的交叉反应性分析。血清混合物*ELISA(抗DEN-1)ELISA(抗DEN-2)ELISA(抗DEN-3)ELISA(抗DEN-4) 1(PLL2 sol.) ＜1/100＞1∶128 000 ＜1/100 ＜1/100 2(PLL2 sol.) ＜1/1001∶64000 ＜1/100 ＜1/100 1(PLL2 ins.) ＜1/1001∶64000 ＜1/100 ＜1/100 2(PLL2 ins.) ＜1/100＞1∶128 000 ＜1/100 ＜1/100血清混合物*HI**抗DEN-1HI抗DEN-2HI抗DEN-3HI抗DEN-4 PLL2 sol. ＜1/5 ＞1/320 ＜1/5 ＜1/5 PLL2 ins. ＜1/5 ＞1/320 ＜1/5 ＜1/5血清混合物*中和滴度***抗DEN-1中和滴度抗DEN-2中和滴度抗DEN-3中和滴度抗DEN-4 1(PLL2) ＜1∶5 1∶320 ＜1∶5 ＜1∶5 2(PLL2) ＜1∶5 1∶160 ＜1∶5 ＜1∶5
*每种混合物由三种血清形成。
**HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
***中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
实施例9.获得PLL3
利用序列表中序列号4和序列号5所示寡核苷酸，从DEN-2病毒株基因型Jamaica(Deubel V.，Kinney R.M.，Trent D.W.Nucleotidesequence and deduced amino acid sequence of the nonstructuralproteins of Dengue type 2 virus，Jamaica genotype：Comparativeanalysis of the full-length genome.Virology 1988.165：234-244)扩增编码DEN-2病毒包膜蛋白质286-426氨基酸的核苷酸序列(Sec.Id.No.22)。
利用BamHI/BamHI消化pD4质粒，产生包含编码MDH蛋白质和6个组氨酸序列且没有终止密码子的核苷酸序列(序列号29)的载体。该消化使得可以在MDH蛋白质C末端区之后融合PCR扩增片段。连接以后，通过限制性酶消化来分析可能的重组子，测序阳性克隆以验证连接。利用所选名为pLL3的克隆(图3和序列号30)转化感受态细胞W3110。菌落在LB培养基中生长以后，对细胞裂解物进行SDS-PAGE。结果获得80kDA条带，占总细胞蛋白质的20％。所获蛋白质的大小相当于MDH蛋白质与DEN-2病毒DENe蛋白质片段大小的总和。该蛋白质在免疫印迹中可由HMAFI抗DEN-2识别，命名为PLL3(序列号31)。
实施例10.纯化PLL3蛋白质
转化pLL2的大肠杆菌菌株于37℃生长，获得的生物质通过弗氏压碎器裂解。获得可溶性及不溶性两种形式的重组蛋白质。利用6M脲从不溶性组分中提取蛋白质，将包含PLL3蛋白质的上清上样G-25柱，以便去除离液剂。然后将获得的组分上样存在Cu++离子的螯合-琼脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。使用30mM咪唑洗柱，100mM咪唑洗脱蛋白质。最后将纯净的蛋白质组分上样G-25柱，获得处于配制缓冲液(PBS)中的蛋白质。该制剂供免疫学研究之用。
实施例11.PLL3的抗原性特征
利用不同多克隆血清和/或小鼠单克隆抗体以及针对登革的人阳性血清进行识别，鉴定纯化的PLL3组分的特征(表11)。
在斑点印迹中，利用HMAF抗DEN-2获得的识别最强。针对其它血清型的HMAF的识别低于血清型2的情况，按DEN-1、DEN-3和DEN-4降序排列。由其它黄病毒、如黄热病毒以及圣路易斯脑炎病毒产生的抗体完全没有任何识别作用。尽管如此，利用斑点印迹和Western印迹均观察到Mab 3H5的高反应性(类似于利用PLL2所获反应性)。与PLL1结果相反，在样品中存在还原剂时，Mab 3H5的识别不变，表明这两种蛋白质可能构象不同。最后，测定了针对抗DEN-2的3个高滴度和3个低滴度人血清的反应性，通过Western印迹和斑点印迹均获得了显著信号。这些结果类似于利用PLL2所获结果。
表11.PLL3蛋白质对单克隆和多克隆抗体的反应性。
Abs**
特异性*** PLL3*
HMAF DEN-1 ++
HMAF DEN-2 +++
HMAF DEN-3 -
HMAF DEN-4 -
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT +++
*总计使用10μg纯化的PLL3。按+至++评价所获得的信号强度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀释使用。
***EEE：马脑炎病毒。YFV：黄热病毒。SLV：圣路易斯脑炎病毒。NT：中和特异性血清型。
实施例12.由PLL3产生的抗体应答的特征
利用处于弗氏佐剂中的35ug纯化的PLL3 i.p免疫总计25只Balb/c小鼠，10只动物于4次剂量后取血，通过ELISA评价抗DEN抗体。获得了针对DEN-2的高抗体滴度，未获得针对其它血清型的反应性(表12和表15)。此外，进行了血细胞凝集抑制分析(HI)，只发现针对DEN-2的阳性滴度(表13和表15)。最后，进行了体外中和分析，获得针对DEN-2的中和滴度为1∶1280(表14)。未发现针对其它血清型病毒感染的中和作用(表15)。使用这三种测试，检测到高水平的血清型特异性抗体，与利用PLL2蛋白质免疫后获得的抗体类似。
表12.PLL3免疫小鼠所获血清的抗DEN-2抗体滴度。小鼠抗DEN-2滴度(PLL3)抗DEN-2滴度PBS C(-) 1 1∶128 000 ＜1∶100 2 ＞1∶128 000 ＜1∶100 3 ＞1∶128 000 ＜1∶100 4 1∶64 000 ＜1∶100 5 ＞1∶128 000 ＜1∶100 6 1∶64 000 ＜1∶100 7 ＞1∶128 000 ＜1∶100 8 ＞1∶128 000 ＜1∶100 9 1∶128 000 ＜1∶100 10 ＞1∶128 000 ＜1∶100
表13.PLL3免疫动物血清的HI滴度。小鼠抗DEN-2的HI*滴度(PLL3)抗DEN-2的HI滴度PBS C(-) 1 ＞1∶640 ＜1∶5 2 1∶320 ＜1∶5 3 1∶320 ＜1∶5 4 ＞1∶640 ＜1∶5 5 1∶320 ＜1∶5 6 ＞1∶640 ＜1∶5 7 ＞1∶640 ＜1∶5 8 ＞1∶640 ＜1∶5 9 1∶320 ＜1∶5 10 ＞1∶640 ＜1∶5
*HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
表14.PLL3免疫动物血清的病毒中和分析。小鼠中和滴度抗DEN-2PLL3中和滴度抗DEN-2PBS C(-) 1 ＞1∶1280 ＜1∶5 2 ＞1∶1280 ＜1∶5 3 ＞1∶1280 ＜1∶5 4 1∶640 ＜1∶5 5 ＞1∶1280 ＜1∶5 6 ＞1∶1280 ＜1∶5 7 ＞1∶1280 ＜1∶5 8 ＞1∶1280 ＜1∶5 9 1∶640 ＜1∶5 10 ＞1∶1280 ＜1∶5
*中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
表15.利用PLL3免疫动物血清通过ELISA、HI以及病毒中和进行的针对所有病毒血清型的交叉反应性分析。血清混合物*ELISA(抗DEN-1)ELISA(抗DEN-2)ELISA(抗DEN-3)ELISA(抗DEN-4)1(PLL3)＜1/100＞1∶128 000＜1/100＜1/1002(PLL3)＜1/100＞1∶128 000＜1/100＜1/100血清混合物*HI**抗DEN-1HI抗DEN-2HI抗DEN-3HI抗DEN-4PLL3＜1/5＞1/320＜1/5＜1/5血清混合物*中和滴度***抗DEN-1中和滴度***抗DEN-2中和滴度***抗DEN-3中和滴度***抗DEN-41(PLL3)＜1∶5＞1∶1280＜1∶5＜1∶52(PLL3)＜1∶5＞1∶1280＜1∶5＜1∶5
*每种混合物由三种血清形成。
**HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
***中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
实施例13.获得PLH1
利用序列表中序列号6和序列号7所示寡核苷酸，从DEN-1病毒株基因型(Chu M.C.，O’Rourke E.J.，Trent D.W.Geneticrelatedness among structural protein genes of dengue 1 Virusstrains.J.Gen.Virol.1989.70：1701-1712)扩增编码DEN-1病毒包膜蛋白质286-426氨基酸的核苷酸序列(Sec.Id.No.32)。
利用XbaI/BamHI消化pM108 His质粒，产生包含编码MDH的N末端区和6个组氨酸序列的核苷酸序列(序列号23)的载体。连接以后，通过限制性酶消化来分析可能的重组子，测序阳性克隆以验证连接。利用所选名为pLH1的克隆(图4和序列号33)转化感受态细胞W3110。菌落在LB培养基中生长以后，对细胞裂解物进行SDS-PAGE。结果获得25kDA条带，占总细胞蛋白质的10％。所获蛋白质的大小相当于MDH蛋白质N末端区与DEN-1病毒DENe蛋白质片段大小的总和。在免疫印迹中，该蛋白质可由HMAF中包含的抗DEN-1多克隆抗体(PA)识别。将该蛋白质命名为PLH1(序列号34)。
实施例14.纯化PLH1蛋白质
转化pLH1的大肠杆菌菌株于37℃生长，将获得的生物质通过弗氏压碎器裂解。所获重组蛋白质主要为伴随细胞裂解沉淀的不溶性形式。利用7M脲从沉淀中提取蛋白质，将包含PLH1蛋白质的上清上样G-25柱，以便去除离液剂。然后将获得的组分上样存在Cu++离子的螯合-琼脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。利用60mM咪唑洗脱蛋白质，将获得的体积上样G-25柱，最终获得处于配制缓冲液(PBS)中的蛋白质。该制剂供免疫学研究之用。
实施例15.PLH1的抗原性特征
利用不同多克隆血清和/或小鼠单克隆抗体以及针对登革的人阳性血清进行识别，鉴定纯化的PLH1组分的特征(表16)。
在斑点印迹中，利用HMAF抗DEN-1获得的识别最强。针对其它血清型的HMAF的识别低于血清型1的情况。由其它黄病毒、如黄热病毒以及圣路易斯脑炎病毒产生的抗体完全没有任何识别作用。最后，测定了针对抗DEN-1的3个高滴度和3个低滴度人血清的反应性，通过Western印迹和斑点印迹均获得了显著信号。
表16.PLH1蛋白质对单克隆和多克隆抗体的反应性
Abs**
特异性*** PLH1
HMAF DEN-1 ++
HMAF DEN-2 +
HMAF DEN-3 -
HMAF DEN-4 -
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
*总计使用10μg纯化的PLH1。按+至++评价所获得的信号强度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀释使用。
***EEE：马脑炎病毒。YFV：黄热病毒。SLV：圣路易斯脑炎病毒。NT：中和特异性血清型。
实施例16.由PLH1产生的抗体应答的特征
利用处于弗氏佐剂中的35ug纯化的PLH1 i.p免疫总计25只Balb/c小鼠，10只动物于4次剂量后取血，通过ELISA评价抗DEN抗体。获得了针对DEN-1的高抗体滴度，未获得针对其它血清型的反应性(表17和表20)。此外，进行了HI分析，只发现针对DEN-1的阳性滴度(表18和表20)。最后，进行了体外中和分析，获得针对DEN-1的中和滴度为1∶320。然而，未发现针对其它血清型病毒感染的中和作用(表19和表20)。这些结果表明，PLH1可激发高度血清型特异性的抗体。
表17.PLH1免疫小鼠所获血清的抗DEN-1抗体滴度。小鼠抗DEN-1滴度(PLH1)抗DEN-1滴度PBS C(-) 1 1/64 000 ＜1∶100 2 1/128 000 ＜1∶100 3 1/64 000 ＜1∶100 4 1/32 000 ＜1∶100 5 1/32 000 ＜1∶100 6 1/64 000 ＜1∶100 7 1/128 000 ＜1∶100 8 1/64 000 ＜1∶100 9 1/128 000 ＜1∶100 10 1/128 000 ＜1∶100
表18.PLH1免疫动物血清的HI滴度。小鼠抗DEN-1的HI*滴度(PLH1)抗DEN-1的HI*滴度PBS C(-) 1 ＞1∶640 ＜1∶5 2 1∶320 ＜1∶5 3 ＞1∶640 ＜1∶5 4 ＞1∶640 ＜1∶5 5 ＞1∶640 ＜1∶5 6 1∶320 ＜1∶5 7 1∶40 ＜1∶5 8 1∶320 ＜1∶5 9 ＞1∶640 ＜1∶5 10 ＜1∶5 ＜1∶5
*HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
表19.PLH1免疫动物血清的病毒中和分析。小鼠抗DEN-1的中和滴度*(PLH1)抗DEN-1的中和滴度*PBS C(-) 1 1∶80 ＜1∶5 2 1∶320 ＜1∶5 3 1∶40 ＜1∶5 4 1∶320 ＜1∶5 5 1∶80 ＜1∶5 6 1∶160 ＜1∶5 7 1∶320 ＜1∶5 8 1∶320 ＜1∶5 9 1∶320 ＜1∶5 10 1∶320 ＜1∶5
*中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
表20.利用PLH1免疫动物血清通过ELISA、HI以及病毒中和进行的针对所有病毒血清型的交叉反应性分析。血清混合物*ELISA(抗DEN-1)ELISA(抗DEN-2)ELISA(抗DEN-3)ELISA(抗DEN-4)1(PLH1)1∶128 000＜1/100＜1/100＜1/1002(PLH1)＞1∶128 000＜1/100＜1/100＜1/100血清混合物*HI**抗DEN-1HI抗DEN-2HI抗DEN-3HI抗DEN-4PLH1＞1∶320＜1/5＜1/5＜1/5血清混合物*中和滴度***抗DEN-1中和滴度***抗DEN-2中和滴度***抗DEN-3中和滴度***抗DEN-41(PLH1)1∶160＜1∶5＜1∶5＜1∶52(PLH1)1∶320＜1∶5＜1∶5＜1∶5
*每种混合物由三种血清形成。
**HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
***中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
实施例17.获得PLH2
利用序列表中序列号6和序列号8所示寡核苷酸，从DEN-1病毒株基因型(Chu M.C.，O’Rourke E.J.，Trent D.W.Geneticrelatedness among structural protein genes of dengue 1 virusstrains.J.Gen.Virol.1989.70：1701-1712)扩增编码DEN-1病毒包膜蛋白质286-426氨基酸的核苷酸序列(Sec.Id.No.32)。
利用XbaI/EcoRI消化pM84 His质粒，产生包含编码MDH蛋白质和6个组氨酸序列的核苷酸序列(序列号26)的载体。该消化使得可以在MDH蛋白质结构性结构域编码区内插入PCR扩增片段。连接以后，通过限制性酶消化来分析可能的重组子，测序阳性克隆以验证连接。利用所选名为pLH2的克隆(图5和序列号35)转化感受态细胞MM294。菌落在LB培养基中生长以后，对细胞裂解物进行SDS-PAGE。结果获得80kDA条带，占总细胞蛋白质的20％。所获蛋白质的大小相当于MDH蛋白质与DEN-1病毒DENe蛋白质片段大小的总和。该蛋白质在免疫印迹中可由HMAF抗DEN-1识别，命名为PLH2(序列号36)。
实施例18.纯化PLH2蛋白质
转化pLH2的大肠杆菌菌株于37℃生长，将获得的生物质通过弗氏压碎器裂解。获得可溶性及不溶性两种形式的重组蛋白质。利用7M脲提取伴随不溶性组分的蛋白质，将包含PLH2蛋白质的上清上样G-25柱，以便去除离液剂。然后将获得的组分上样存在Cu++离子的螯合-琼脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。使用40mM咪唑洗柱，100mM咪唑洗脱蛋白质。最后将纯净组分上样G-25柱，获得处于配制缓冲液(PBS)中的蛋白质。该制剂供免疫学研究之用。
实施例19.PLH2的抗原性特征
利用不同多克隆血清和/或小鼠单克隆抗体以及针对登革的人阳性血清进行识别，鉴定纯化的PLH2组分的特征(表21)。
在斑点印迹中，利用HMAF抗DEN-1获得的识别最强(高于利用PLH1所获识别)。针对其它血清型的HMAF的识别低于血清型1的情况。由其它黄病毒、如黄热病毒以及圣路易斯脑炎病毒产生的抗体完全没有任何识别作用。最后，测定了针对抗DEN-1的5个高滴度和3个低滴度人血清的反应性，通过Western印迹和斑点印迹均获得了显著信号。
表21.PLH2蛋白质对单克隆和多克隆抗体的反应性。
Abs**
特异性*** PLH2
HMAF DEN-1 +++
HMAF DEN-2 +
HMAF DEN-3 -
HMAF DEN-4 -
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
*总计使用10μg纯化的PLH2。按+至++评价所获得的信号强度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀释使用。
***EEE：马脑炎病毒。YFV：黄热病毒。SLV：圣路易斯脑炎病毒。NT：中和特异性血清型。
实施例20.由PLH2产生的抗体应答的特征
利用处于弗氏佐剂中的20ug纯化的PLH2 i.p免疫总计25只Balb/c小鼠，10只动物于4次剂量后取血，通过ELISA评价抗DEN抗体。获得了针对DEN-1的高抗体滴度，未获得针对其它血清型的反应性(表22和表25)。此外，进行了HI分析，只发现针对DEN-1的阳性滴度(表23和表25)。最后，进行了体外中和分析，获得针对DEN-1的中和滴度为1∶1280(表24)。未发现针对其它血清型病毒感染的中和作用。(表25)。
表22.PLH2免疫小鼠所获血清的抗DEN-1抗体滴度。小鼠抗DEN-1滴度(PLH2)抗DEN-1滴度PBS C(-) 1 1∶128 000 ＜1∶100 2 ＞1∶128 000 ＜1∶100 3 1∶64000 ＜1∶100 4 ＞1∶128 000 ＜1∶100 5 1∶128 000 ＜1∶100 6 1∶64000 ＜1∶100 7 ＞1∶128 000 ＜1∶100 8 1∶128 000 ＜1∶100 9 ＞1∶128 000 ＜1∶100 10 ＞1∶128 000 ＜1∶100
表23.PLH2免疫动物血清的HI滴度。小鼠抗DEN-1的HI*滴度(PLH2)抗DEN-1的HI滴度PBS C(-) 1 ＜1∶5 ＜1∶5 2 ＞1∶640 ＜1∶5 3 1∶320 ＜1∶5 4 1∶320 ＜1∶5 5 ＞1∶640 ＜1∶5 6 ＞1∶640 ＜1∶5 7 ＞1∶640 ＜1∶5 8 1∶320 ＜1∶5 9 ＞1∶640 ＜1∶5 10 ＜1∶5 ＜1∶5
*HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
表24.PLH2免疫动物血清的病毒中和分析。小鼠抗DEN-1的中和滴度*(PLH2)抗DEN-1的中和滴度*C(-) 1 ＞1∶1280 ＜1∶5 2 ＞1∶1280 ＜1∶5 3 ＞1∶1280 ＜1∶5 4 ＞1∶1280 ＜1∶5 5 ＞1∶1280 ＜1∶5 6 ＞1∶1280 ＜1∶5 7 ＞1∶1280 ＜1∶5 8 ＞1∶1280 ＜1∶5 9 1∶640 ＜1∶5 10 ＞1∶1280 ＜1∶5
*中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
表25.利用PLH2免疫动物血清通过ELISA、HI以及病毒中和进行的针对所有病毒血清型的交叉反应性分析。血清混合物*ELISA(抗DEN-1)ELISA(抗DEN-2)ELISA(抗DEN-3)ELISA(抗DEN-4)1(PLH2)1∶64 000＜1/100＜1/100＜1/1002(PLH2)＞1∶128 000＜1/100＜1/100＜1/100血清混合物*HI**抗DEN-1HI抗DEN-2HI抗DEN-3HI抗DEN-4PLH2＞1/320＜1/5＜1/5＜1/5血清混合物*抗DEN-1中和滴度***抗DEN-2的中和滴度抗DEN-3的中和滴度抗DEN-4的中和滴度1(PLH2)＞1∶1280＜1∶5＜1∶5＜1∶52(PLH2)＞1∶1280＜1∶5＜1∶5＜1∶5
*每种混合物由三种血清形成。
**HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
***中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
实施例21.获得PLH3
利用序列表中序列号9和序列号10所示寡核苷酸，从DEN-1病毒株(Chu M.C.，O’Rourke E.J.，Trent D.W.Genetic relatedness amongstructural protein genes of dengue 1 virus strains.J.Gen.Virol.1989.70：1701-1712)扩增编码DEN-1病毒包膜蛋白质286-426氨基酸的核苷酸序列(Sec.Id.No.32)。
利用BamHI/BamHI消化pD4质粒，产生包含编码MDH蛋白质和6个组氨酸序列、并且没有终止密码子的核苷酸序列(序列号29)的载体。该消化使得可以在MDH蛋白质C末端区之后融合PCR扩增片段。连接以后，通过限制性酶消化来分析可能的重组子，测序阳性克隆以验证连接。利用所选名为pLH3的克隆(图6和序列号37)转化感受态细胞W3110。菌落在LB培养基中生长以后，对细胞裂解物进行SDS-PAGE。结果获得80kDA条带，占总细胞蛋白质的20％。所获蛋白质的大小相当于MDH蛋白质与DEN-1病毒DENe蛋白质片段大小的总和。该蛋白质在免疫印迹中可由HMAF抗DEN-1识别，命名为PLH3(序列号38)。
实施例22.纯化PLH3蛋白质
转化pLH3的大肠杆菌菌株于37℃生长，将获得的生物质通过弗氏压碎器裂解。获得可溶性及不溶性两种形式的重组蛋白质。利用6M脲从不溶性组分中提取蛋白质，将包含PLH3蛋白质的上清上样G-25柱，以便去除离液剂。然后将获得的组分上样存在Cu++离子的螯合-琼脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。使用30mM咪唑洗柱，250mM咪唑洗脱蛋白质。最后将纯净的蛋白质组分上样G-25柱，获得处于配制缓冲液(PBS)中的蛋白质。该制剂供免疫学研究之用。
实施例23.PLH3的抗原性特征
利用不同多克隆血清和/或小鼠单克隆抗体以及针对登革的人阳性血清进行识别，鉴定纯化的PLH3组分的特征(表26)。
在斑点印迹中，利用HMAF抗DEN-1获得的识别最强。针对其它血清型的HMAF的识别低于血清型1的情况。由其它黄病毒、如黄热病毒以及圣路易斯脑炎病毒产生的抗体完全没有任何识别作用。最后，测定了针对抗DEN-1的3个高滴度和3个低滴度人血清的反应性，通过Western印迹和斑点印迹均获得了显著信号。
表26.PLH3蛋白质对单克隆和多克隆抗体的反应性。
Abs**
特异性*** PLH3
HMAF DEN-1 +++
HMAF DEN-2 +
HMAF DEN-3 -
HMAF DEN-4 -
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
*总计使用10μg纯化的PLH3。按+至++评价所获得的信号强度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀释使用。
***EEE：马脑炎病毒。YFV：黄热病毒。SLV：圣路易斯脑炎病毒。NT：中和特异性血清型。
实施例24.由PLH3产生的抗体应答的特征
利用处于弗氏佐剂中的20ug纯化的PLH3 i.p免疫总计25只Balb/c小鼠，10只动物于4次剂量后取血，通过ELISA评价抗DEN抗体。获得了针对DEN-1的高抗体滴度，未获得针对其它血清型的反应性(表27和表30)。此外，进行了HI分析，只发现针对DEN-1的阳性滴度(表28和表30)。最后，进行了体外中和分析，获得针对DEN-1的中和滴度为1∶1280(表29)。未发现针对其它血清型病毒感染的中和作用(表30)。
表27.PLH3免疫小鼠所获血清的抗DEN-1抗体滴度。小鼠抗DEN-1滴度PLH3抗DEN-1滴度PBS对照(-) 1 1∶64 000 ＜1∶100 2 ＞1∶128 000 ＜1∶100 3 1∶64 000 ＜1∶100 4 ＞1∶128 000 ＜1∶100 5 1∶128 000 ＜1∶100 6 1∶128 000 ＜1∶100 7 1∶128 000 ＜1∶100 8 ＞1∶128 000 ＜1∶100 9 1∶64 000 ＜1∶100 10 ＞1∶128 000 ＜1∶100
表28.PLH3免疫动物血清的HI滴度。小鼠抗DEN-1的HI*滴度PLH3抗DEN-1的HI滴度PBS C(-) 1 1∶320 ＜1∶5 2 ＞1∶640 ＜1∶5 3 ＞1∶640 ＜1∶5 4 1∶320 ＜1∶5 5 1∶320 ＜1∶5 6 ＞1∶640 ＜1∶5 7 1∶320 ＜1∶5 8 ＜1∶5 ＜1∶5 9 ＞1∶640 ＜1∶5 10 ＞1∶640 ＜1∶5
*HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
表29.PLH3免疫动物血清的病毒中和分析。小鼠中和滴度*抗DEN-1PLH3中和滴度*抗DEN-1PBS C(-) 1 ＞1∶1280 ＜1∶5 2 ＞1∶1280 ＜1∶5 3 ＞1∶1280 ＜1∶5 4 1∶640 ＜1∶5 5 1∶640 ＜1∶5 6 ＞1∶1280 ＜1∶5 7 ＞1∶1280 ＜1∶5 8 ＞1∶1280 ＜1∶5 9 ＞1∶1280 ＜1∶5 10 ＞1∶1280 ＜1∶5
*中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
表30.利用PLH3免疫动物血清通过ELISA、HI以及病毒中和进行的针对所有病毒血清型的交叉反应性分析。血清混合物*ELISA(抗DEN-1)ELISA(抗DEN-2)ELISA(抗DEN-3)ELISA(抗DEN-4)1(PLH3)1∶128 000＜1/100＜1/100＜1/1002(PLH3)＞1∶128 000＜1/100＜1/100＜1/100血清混合物*HI**抗DEN-1HI抗DEN-2HI抗DEN-3HI抗DEN-4PLH3＞1/320＜1/5＜1/5＜1/5血清混合物*抗DEN-1中和滴度***抗DEN-2的中和滴度抗DEN-3的中和滴度抗DEN-4的中和滴度1(PLH3)＞1∶1280＜1∶5＜1∶5＜1∶52(PLH3)＞1∶1280＜1∶5＜1∶5＜1∶5
*每种混合物由三种血清形成。
**HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
***中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
实施例25.获得pAZ1
利用序列表中序列号11和序列号12所示寡核苷酸，从DEN-3病毒株基因型(Osatomi K.，Sumiyoshi H.Complete nucleotidesequence of dengue type 3 virus genome RNA.Virology.1990.176(2)：643-647)扩增编码DEN-3病毒包膜蛋白质286-426氨基酸的核苷酸序列(Seq.39)。
利用XbaI/BamHI消化pM108 His质粒，产生包含编码MDH的N末端区和6个组氨酸序列的核苷酸序列(序列号23)的载体。连接以后，通过限制性酶消化来分析可能的重组子，测序阳性克隆以验证连接。利用所选名为pAZ1的克隆(图7和序列号40)转化感受态细胞W3110。菌落在LB培养基中生长以后，对细胞裂解物进行SDS-PAGE。结果获得25kDA条带，占总细胞蛋白质的10％。所获蛋白质的大小相当于MDH蛋白质N末端区与DEN-3病毒DENe蛋白质片段大小的总和。在免疫印迹中，该蛋白质可由HMAF中包含的抗DEN-3多克隆抗体(PA)识别。将该蛋白质命名为PAZ1(序列号41)。
实施例26.纯化PAZ1蛋白质
转化pAZ1的大肠杆菌菌株于37℃生长，将获得生物质通过弗氏压碎器裂解。所获重组蛋白质主要为伴随细胞裂解沉淀的不溶性形式。利用7M脲从沉淀中提取蛋白质，将包含PLH1蛋白质的上清上样G-25柱，以便去除离液剂。然后将获得的组分上样存在Cu++离子的螯合-琼脂糖FF柱(Pharmacia， UK)。利用60mM咪唑洗脱蛋白质，将获得的体积上样G-25柱，最终获得处于配制缓冲液(PBS)中的蛋白质。该制剂供免疫学研究之用。
实施例27.PAZ1的抗原性特征
利用不同多克隆血清和/或小鼠单克隆抗体以及针对登革的人阳性血清进行识别，鉴定纯化的PAZ1组分的特征(表31)。
在斑点印迹中，利用HMAF抗DEN-3获得的识别最强。针对其它血清型的HMAF的识别低于血清型3的情况。由其它黄病毒、如黄热病毒以及圣路易斯脑炎病毒产生的抗体完全没有任何识别作用。最后，测定了针对抗DEN-3的3个高滴度和3个低滴度人血清的反应性，通过Western印迹和斑点印迹均获得了显著信号。
表31.PAZ1蛋白质对单克隆和多克隆抗体的反应性。
Abs**
特异性*** PAZ1
HMAF DEN-1 -
HMAF DEN-2 +
HMAF DEN-3 ++
HMAF DEN-4 +
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
*总计使用10μg纯化的PAZ1。按+至++评价所获得的信号强度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀释使用。
***EEE：马脑炎病毒。YFV：黄热病毒。SLV：圣路易斯脑炎病毒。NT：中和特异性血清型。
实施例28.由PAZ1产生的抗体应答的特征
利用处于弗氏佐剂中的35ug纯化的PAZ1 i.p免疫总计25只Balb/c小鼠，10只动物于4次剂量后取血，通过ELISA评价抗DEN抗体。获得了针对DEN-1的高抗体滴度，未获得针对其它血清型的反应性(表32和表35)。此外，进行了HI分析，只发现针对DEN-3的阳性滴度(表33和表35)。最后，进行了体外中和分析，获得针对DEN-3的中和滴度为1∶320。然而，未发现针对其它血清型病毒感染的中和作用(表34和表35)。这些结果表明，PAZ1可激发高度血清型特异性的抗体。
表32.PAZ1免疫小鼠所获血清的抗DEN-3抗体滴度。小鼠抗DEN-3滴度PAZ1抗DEN-3滴度PBS对照(-) 1 1/64 000 ＜1∶100 2 1/128 000 ＜1∶100 3 1/32 000 ＜1∶100 4 1/64 000 ＜1∶100 5 1/64 000 ＜1∶100 6 1/128 000 ＜1∶100 7 1/64 000 ＜1∶100 8 1/64 000 ＜1∶100 9 1/128 000 ＜1∶100 10 1/128 000 ＜1∶100
表33.PAZ1免疫动物血清的HI滴度。 小鼠抗DEN-3的HI*滴度PAZ1抗DEN-3的HI滴度PBS C(-) 1 ＞1∶640 ＜1∶5 2 1∶320 ＜1∶5 3 1∶320 ＜1∶5 4 1∶640 ＜1∶5 5 ＜1/5 ＜1∶5 6 1∶320 ＜1∶5 7 ＜1/5 ＜1∶5 8 1∶320 ＜1∶5 9 ＞1∶640 ＜1∶5 10 ＞1∶640 ＜1∶5
*HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
表34.PAZ1免疫动物血清的病毒中和分析。小鼠抗DEN-3的中和滴度PAZ1抗DEN-3的中和滴度PBS C(-) 1 1∶160 ＜1∶5 2 1∶320 ＜1∶5 3 1∶320 ＜1∶5 4 1∶320 ＜1∶5 5 1∶40 ＜1∶5 6 1∶40 ＜1∶5 7 1∶320 ＜1∶5 8 1∶320 ＜1∶5 9 1∶160 ＜1∶5 10 1∶320 ＜1∶5
*中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
表35.利用PAZ1免疫动物血清通过ELISA、HI以及病毒中和进行的针对所有病毒血清型的交叉反应性分析。血清混合物*ELISA(抗DEN-1)ELISA(抗DEN-2)ELISA(抗DEN-3)ELISA(抗DEN-4)1(PAZ1)＜1/100＜1/1001∶64 000＜1/1002(PAZ1)＜1/100＜1/100＞1∶128 000＜1/100血清混合物*HI**抗DEN-1HI抗DEN-2HI抗DEN-3HI抗DEN-4PAZ1＜1/5＜1/5＞1∶320＜1/5血清混合物*抗DEN-1中和滴度***抗DEN-2的中和滴度抗DEN-3的中和滴度抗DEN-4的中和滴度1(PAZ1)＜1∶5＜1∶51∶320＜1∶52(PAZ1)＜1∶5＜1∶51∶320＜1∶5
*每种混合物由三种血清形成。
**HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
***中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
实施例29.获得pAZ2
利用序列表中序列号11和序列号13所示寡核苷酸，从DEN-3病毒株(Osatomi K.，Sumiyoshi H.Complete nucleotide sequence ofdengue type 3 virus genome RNA.Virology.1990.176(2)：643-647)扩增编码DEN-3病毒包膜蛋白质286-426氨基酸的核苷酸序列(序列号39)。
利用XbaI/EcoRI消化pM84 His质粒，产生包含编码MDH蛋白质和6个组氨酸序列的核苷酸序列(序列号26)的载体。该消化使得可以在MDH蛋白质结构性结构域编码区内插入PCR扩增片段。连接以后，通过限制性酶消化来分析可能的重组子，测序阳性克隆以验证连接。利用所选名为pAZ2的克隆(图8和序列号42)转化感受态细胞MM294。菌落在LB培养基中生长以后，对细胞裂解物进行SDS-PAGE。结果获得80kDA条带，占总细胞蛋白质的20％。所获蛋白质的大小相当于MDH蛋白质与DEN-3病毒DENe蛋白质片段大小的总和。该蛋白质在免疫印迹中可由HMAF抗DEN-3识别，命名为PAZ2(序列号43)。
实施例30.纯化PAZ2蛋白质
转化pAZ2的大肠杆菌菌株于37℃生长，将获得的生物质通过弗氏压碎器裂解。获得可溶性及不溶性两种形式的重组蛋白质。利用7M脲提取伴随不溶性组分的蛋白质，将包含PAZ2蛋白质的上清上样G-25柱，以便去除离液剂。然后将获得的组分上样存在Cu++离子的螯合-琼脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。使用40mM咪唑洗柱，100mM咪唑洗脱蛋白质。最后将纯净组分上样G-25柱，获得处于配制缓冲液(PBS)中的蛋白质。该制剂供免疫学研究之用。
实施例31.PAZ2的抗原性特征
利用不同多克隆血清和/或小鼠单克隆抗体以及针对登革的人阳性血清进行识别，鉴定纯化的PAZ2组分的特征(表36)。
在斑点印迹中，利用HMAF抗DEN-3获得的识别最强(高于利用PAZ1所获识别)。针对其它血清型的HMAF的识别低于血清型3的情况。由其它黄病毒、如黄热病毒以及圣路易斯脑炎病毒产生的抗体完全没有任何识别作用。最后，测定了针对抗DEN-3的5个高滴度和3个低滴度人血清的反应性，通过Western印迹和斑点印迹均获得了显著信号。
表36.PAZ2蛋白质对单克隆和多克隆抗体的反应性。
Abs**
特异性*** PAZ2
HMAF DEN-1 -
HMAF DEN-2 -
HMAF DEN-3 +++
HMAF DEN-4 +
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
*总计使用10μg纯化的PAZ2。按+至++评价所获得的信号强度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀释使用。
***EEE：马脑炎病毒。YFV：黄热病毒。SLV：圣路易斯脑炎病毒。NT：中和特异性血清型。
实施例32.由PAZ2产生的抗体应答的特征
利用处于弗氏佐剂中的20ug纯化的PAZ2 i.p免疫总计25只Balb/c小鼠，10只动物于4次剂量后取血，通过ELISA评价抗DEN抗体。获得了针对DEN-3的高抗体滴度，未获得针对其它血清型的反应性(表37和表40)。此外，进行了HI分析，只发现针对DEN-3的阳性滴度(表38和表40)。最后，进行了体外中和分析，获得针对DEN-3的中和滴度为1∶1280(表39)。未发现针对其它血清型病毒感染的中和作用(表40)。
表37.PAZ2免疫小鼠所获血清的抗DEN-3抗体滴度。小鼠抗DEN-3滴度PAZ2抗DEN-3滴度PBS对照(-) 1 ＞1∶128 000 ＜1∶100 2 1∶128 000 ＜1∶100 3 ＞1∶128 000 ＜1∶100 4 ＞1∶128 000 ＜1∶100 5 1∶128 000 ＜1∶100 6 ＞1∶128 000 ＜1∶100 7 1∶64000 ＜1∶100 8 ＞1∶128 000 ＜1∶100 9 1∶64000 ＜1∶100 10 ＞1∶128 000 ＜1∶100
表38.PAZ2免疫动物血清的HI滴度。小鼠抗DEN-3滴度PAZ2抗DEN-3滴度PBS 1 ＞1∶640 ＜1∶5 2 1∶320 ＜1∶5 3 ＞1∶640 ＜1∶5 4 ＞1∶640 ＜1∶5 5 ＞1∶640 ＜1∶5 6 1∶320 ＜1∶5 7 ＜1∶5 ＜1∶5 8 1∶320 ＜1∶5 9 ＞1∶640 ＜1∶5 10 ＞1∶640 ＜1∶5
*HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
表39.PAZ2免疫动物血清的病毒中和分析。 小鼠抗DEN-3的中和滴度PAZ2抗DEN-3的中和滴度PBS C(-) 1 ＞1∶1280 ＜1∶5 2 ＞1∶1280 ＜1∶5 3 ＞1∶1280 ＜1∶5 4 ＞1∶1280 ＜1∶5 5 ＞1∶1280 ＜1∶5 6 1∶640 ＜1∶5 7 ＞1∶1280 ＜1∶5 8 1∶640 ＜1∶5 9 ＞1∶1280 ＜1∶5 10 1∶640 ＜1∶5
*中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
表40.利用PAZ2免疫动物血清通过ELISA、HI以及病毒中和进行的针对所有病毒血清型的交叉反应性分析。血清混合物* ELISA (抗DEN-1) ELISA (抗DEN-2) ELISA (抗DEN-3) ELISA (抗DEN-4) 1(PAZ2) ＜1/100 ＜1/100 ＞1∶128 000 ＜1/100 2(PAZ2) ＜1/100 ＜1/100 ＞1∶128 000 ＜1/100血清混合物*HI**抗DEN-1HI抗DEN-2HI抗DEN-3HI抗DEN-4 PAZ2 ＜1/5 ＜1/5 ＞1/320 ＜1/5血清混合物*抗DEN-1中和滴 度***抗DEN-2的中 和滴度抗DEN-3的中 和滴度抗DEN-4的中 和滴度 1(PAZ2) ＜1∶5 ＜1∶5 ＞1∶1280 ＜1∶5 2(PAZ2) ＜1∶5 ＜1∶5 ＞1∶1280 ＜1∶5
*每种混合物由三种血清形成。
**HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
***中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
实施例33.获得pAZ3
利用序列表中序列号14和序列号15所示寡核苷酸，从DEN-3病毒株(Osatomi K.，Sumiyoshi H.Complete nucleotide sequence ofdengue type 3 virus genome RNA.Virology.1990.176(2)：643-647)扩增编码DEN-3病毒包膜蛋白质286-426氨基酸的核苷酸序列(序列号39)。
利用BamHI/BamHI消化pD4质粒，产生包含编码MDH蛋白质和6个组氨酸序列并且没有终止密码子的核苷酸序列(序列号29)的载体。该消化使得可以在MDH蛋白质C末端区之后融合PCR扩增片段。连接以后，通过限制性酶消化来分析可能的重组子，测序阳性克隆以验证连接。利用所选名为pAZ3的克隆(图9和序列号44)转化感受态细胞W3110。菌落在LB培养基中生长以后，对细胞裂解物进行SDS-PAGE。结果获得80kDA条带，占总细胞蛋白质的20％。所获蛋白质的大小相当于MDH蛋白质与DEN-3病毒DENe蛋白质片段大小的总和。该蛋白质在免疫印迹中可由HMAF抗DEN-3识别，命名为PAZ3(序列号45)。
实施例34.纯化PAZ3蛋白质
转化pAZ3的大肠杆菌菌株于37℃生长，将获得的生物质通过弗氏压碎器裂解。获得可溶性及不溶性两种形式的重组蛋白质。利用7M脲从不溶性组分中提取蛋白质，将包含PAZ3蛋白质的上清上样G-25柱，以便去除离液剂。然后将获得的组分上样存在Cu++离子的螯合-琼脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。使用45mM咪唑洗柱，230mM咪唑洗脱蛋白质。最后将纯净的蛋白质组分上样G-25柱，获得处于配制缓冲液(PBS)中的蛋白质。该制剂供免疫学研究之用。
实施例35.PAZ3的抗原性特征
利用不同多克隆血清和/或小鼠单克隆抗体以及针对登革的人阳性血清进行识别，鉴定纯化的PAZ3组分的特征(表26)。
在斑点印迹中，利用HMAF抗DEN-3获得的识别最强。针对其它血清型的HMAF的识别低于血清型3的情况。由其它黄病毒、如黄热病毒以及圣路易斯脑炎病毒产生的抗体完全没有任何识别作用。最后，测定了针对抗DEN-3的3个高滴度和3个低滴度人血清的反应性，通过Western印迹和斑点印迹均获得了显著信号。
表41.PAZ3蛋白质对单克隆和多克隆抗体的反应性。
Abs**
特异性*** PAZ3
HMAF DEN-1 -
HMAF DEN-2 -
HMAF DEN-3 +++
HMAF DEN-4 +
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
*总计使用10μg纯化的PAZ3。按+至++评价所获得的信号强度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀释使用。
***EEE：马脑炎病毒。YFV：黄热病毒。SLV：圣路易斯脑炎病毒。NT：中和特异性血清型。
实施例36.由PAZ3产生的抗体应答的特征
利用处于弗氏佐剂中的20ug纯化的PAZ3 i.p免疫总计25只Balb/c小鼠，10只动物于4次剂量后取血，通过ELISA评价抗DEN抗体。获得了针对DEN-3的高抗体滴度，未获得针对其它血清型的反应性(表42和表45)。此外，进行了HI分析，只发现针对DEN-3的阳性滴度(表43和表45)。最后，进行了体外中和分析，获得针对DEN-3的中和滴度为1∶1280(表44)。未发现针对其它血清型病毒感染的中和作用(表45)。
表42.PAZ3免疫小鼠所获血清的抗DEN-3抗体滴度。 小鼠DEN-3滴度PAZ3抗DEN-3滴度PBS对照(-) 1 ＞1∶128 000 ＜1∶100 2 1∶128 000 ＜1∶100 3 ＞1∶128 000 ＜1∶100 4 1∶128 000 ＜1∶100 5 1∶128 000 ＜1∶100 6 ＞1∶128 000 ＜1∶100 7 ＞1∶128 000 ＜1∶100 8 1∶128 000 ＜1∶100 9 1∶128 000 ＜1∶100 10 ＞1∶128 000 ＜1∶100
表43.PAZ3免疫动物血清的HI滴度。 小鼠抗DEN-3的HI*滴度 PAZ3抗DEN-3的中和滴度PBS C(-) 1 ＞1∶640 ＜1∶5 2 ＞1∶640 ＜1∶5 3 1∶320 ＜1∶5 4 ＜1∶5 ＜1∶5 5 ＞1∶640 ＜1∶5 6 ＜1∶5 ＜1∶5 7 1∶320 ＜1∶5 8 ＞1∶640 ＜1∶5 9 ＞1∶640 ＜1∶5 10 1∶320 ＜1∶5
*HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
表44.PAZ3免疫动物血清的病毒中和分析。 小鼠中和滴度抗DEN-3PAZ3中和滴度抗DEN-3PBS C(-) 1 ＞1∶1280 ＜1∶5 2 1∶640 ＜1∶5 3 ＞1∶1280 ＜1∶5 4 ＞1∶1280 ＜1∶5 5 ＞1∶1280 ＜1∶5 6 ＞1∶1280 ＜1∶5 7 ＞1∶1280 ＜1∶5 8 ＞1∶1280 ＜1∶5 9 ＞1∶1280 ＜1∶5 10 ＞1∶1280 ＜1∶5
*中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
表45.利用PAZ3免疫动物血清通过ELISA、HI以及病毒中和进行的针对所有病毒血清型的交叉反应性分析。血清混合物* ELISA (抗DEN-1) ELISA (抗DEN-2) ELISA (抗DEN-3) ELISA (抗DEN-4) 1(PAZ3) ＜1/100 ＜1/100 ＞1∶128 000 ＜1/100 2(PAZ3) ＜1/100 ＜1/100 1∶128 000 ＜1/100血清混合物*HI**抗DEN-1HI抗DEN-2HI抗DEN-3HI抗DEN-4 PAZ3 ＜1/5 ＜1/5 ＞1/320 ＜1/5血清混合物*抗DEN-1中和滴 度***抗DEN-2的中 和滴度抗DEN-3的中 和滴度抗DEN-4的中 和滴度 1(PAZ3) ＜1∶5 ＜1∶5 ＞1∶1280 ＜1∶5 2(PAZ3) ＜1∶5 ＜1∶5 ＞1∶1280 ＜1∶5
*每种混合物由三种血清形成。
**HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
***中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
实施例37.获得pID1
利用序列表中序列号17和序列号18所示寡核苷酸，从DEN-4病毒株基因型(Zhao B.，Mackow E.R.，Buckler-White A.J.，MarkoffL.，Chancock R.M.，Lai C.-J.，Makino Y.Cloning full-lengthDengue type 4 viral DNA sequences：Analysis of genes coding forstructural proteins.Virology 1986.155：77-88)扩增编码DEN-4病毒包膜蛋白质286-426氨基酸的核苷酸序列(序列号46)。
利用XbaI/BamHI消化pM108 His质粒，产生包含编码MDH的N末端区和6个组氨酸序列的核苷酸序列(序列号23)的载体。连接以后，通过限制性酶消化来分析可能的重组子，测序阳性克隆以验证连接。利用所选名为pID1的克隆(图10和序列号47)转化感受态细胞W3110。菌落在Luria Bertani(LB)培养基中生长以后，对细胞裂解物进行SDS-PAGE。结果获得25kDA条带，占总细胞蛋白质的10％。所获蛋白质的大小相当于MDH蛋白质N末端区与DEN-4病毒DENe蛋白质片段大小的总和。在免疫印迹中，该蛋白质可由HMAF中包含的抗DEN-4多克隆抗体(PA)识别。将该蛋白质命名为PID1(序列号48)。
实施例38.纯化蛋白质PID1
转化pID1的大肠杆菌菌株于37℃生长，将获得的生物质通过弗氏压碎器裂解。所获重组蛋白质主要为伴随细胞裂解沉淀的不溶性形式。利用6M脲从沉淀中提取蛋白质，将包含PID1蛋白质的上清上样G-25柱，以便去除离液剂。然后将获得的组分上样存在Cu++离子的螯合-琼脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。利用60mM咪唑洗脱蛋白质，将获得的体积上样G-25柱，最终获得处于配制缓冲液(PBS)中的蛋白质。该制剂供免疫学研究之用。
实施例39.PID1的抗原性特征
利用不同多克隆血清和/或小鼠单克隆抗体以及针对登革的人阳性血清进行识别，鉴定纯化的PID1组分的特征(表46)。
在斑点印迹中，利用HMAF抗DEN-4获得的识别最强。针对其它血清型的HMAF的识别低于血清型4的情况。由其它黄病毒、如黄热病毒以及圣路易斯脑炎病毒产生的抗体完全没有任何识别作用。最后，测定了针对抗DEN-4的3个高滴度和3个低滴度人血清的反应性，通过Western印迹和斑点印迹均获得了显著信号。
表46.PID1蛋白质对单克隆和多克隆抗体的反应性。
Abs**
特异性*** PID1
HMAF DEN-1 -
HMAF DEN-2 -
HMAF DEN-3 +
HMAF DEN-4 ++
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
*总计使用10μg纯化的PID1。按+至++评价所获得的信号强度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀释使用。
***EEE：马脑炎病毒。YFV：黄热病毒。SLV：圣路易斯脑炎病毒。NT：中和特异性血清型。
实施例40.由PID1产生的抗体应答的特征
利用处于弗氏佐剂中的35ug纯化的PID1 i.p免疫总计25只Balb/c小鼠，10只动物于4次剂量后取血，通过ELISA评价抗DEN抗体。获得了针对DEN-1的高滴度抗体，未获得针对其它血清型的反应性(表47和表50)。此外，进行了HI分析，只发现针对DEN-4的阳性滴度(表48和表50)。最后，进行了体外中和分析，获得针对DEN-4的中和滴度为1∶320。然而，未发现针对其它血清型病毒感染的中和作用(表49和表50)。这些结果表明，PID1可激发高度血清型特异性的抗体。
表47.PID1免疫小鼠所获血清的抗DEN-4抗体滴度。 小鼠抗DEN-4滴度PID1抗DEN-4滴度PBS对照(-) 1 1/128 000 ＜1∶100 2 1/128 000 ＜1∶100 3 1/64 000 ＜1∶100 4 1/64 000 ＜1∶100 5 1/128 000 ＜1∶100 6 1/32 000 ＜1∶100 7 1/128 000 ＜1∶100 8 1/32 000 ＜1∶100 9 1/128 000 ＜1∶100 10 1/128 000 ＜1∶100
表48.PID1免疫动物血清的HI滴度。 小鼠抗DEN-4的HI*滴度PID1抗DEN-4的HI滴度PBS C(-) 1 1∶320 ＜1∶5 2 1∶320 ＜1∶5 3 1∶640 ＜1∶5 4 1∶40 ＜1∶5 5 ＜1/5 ＜1∶5 6 1∶320 ＜1∶5 7 1∶640 ＜1∶5 8 1∶640 ＜1∶5 9 1∶40 ＜1∶5 10 1∶320 ＜1∶5
*HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
表49.PID1免疫动物血清的病毒中和分析。 小鼠抗DEN-4中和 滴度 PID1抗DEN-4的中 和滴度 PBS C(-) 1 1∶320 ＜1∶5 2 1∶80 ＜1∶5 3 1∶320 ＜1∶5 4 1∶320 ＜1∶5 5 1∶160 ＜1∶5 6 1∶320 ＜1∶5 7 1∶320 ＜1∶5 8 1∶320 ＜1∶5 9 1∶160 ＜1∶5 10 1∶40 ＜1∶5
*中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
表50.利用PID1免疫动物血清通过ELISA、HI以及病毒中和进行的针对所有病毒血清型的交叉反应性分析。血清混合物* ELISA (抗DEN-1) ELISA (抗DEN-2) ELISA (抗DEN-3) ELISA (抗DEN-4) 1(PID1) ＜1/100 ＜1/100 ＜1/100 1∶64 000 2(PID1) ＜1/100 ＜1/100 ＜1/100 ＞1∶128 000血清混合物*HI**抗DEN-1HI抗DEN-2HI抗DEN-3HI抗DEN-4 PID1 ＜1/5 ＜1/5 ＜1/5 ＞1∶320血清混合物*抗DEN-1中和滴 度***抗DEN-2的中 和滴度抗DEN-3的中 和滴度抗DEN-4的中 和滴度 1(PID1) ＜1∶5 ＜1∶5 ＜1∶5 1∶160 2(PID1) ＜1∶5 ＜1∶5 ＜1∶5 1∶320
*每种混合物由三种血清形成。
**HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
***中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
实施例41.获得pID2
利用序列表中序列号16和序列号18所示寡核苷酸，从DEN-4病毒株(Zhao B.，Mackow E.R.，Buckler-White A.J.，Markoff L.，Chancock R.M.，Lai C.-J.，Makino Y.Cloning full-length Denguetype 4 viral DNA sequences：Analysis of genes coding forstructural proteins.Virology 1986.155：77-88)扩增编码DEN-4病毒包膜蛋白质286-426氨基酸的核苷酸序列(序列号46)。
利用XbaI/EcoRI消化pM84 His质粒，产生包含编码MDH蛋白质和6个组氨酸序列的核苷酸序列(序列号26)的载体。该消化使得可以在MDH蛋白质结构性结构域编码区内插入PCR扩增片段。连接以后，通过限制性酶消化来分析可能的重组子，测序阳性克隆以验证连接。利用所选名为pID2的克隆(图11和序列号49)转化感受态细胞MM294。菌落在LB培养基中生长以后，对细胞裂解物进行SDS-PAGE。结果获得80kDA条带，占总细胞蛋白质的20％。所获蛋白质的大小相当于MDH蛋白质与DEN-4病毒DENe蛋白质片段大小的总和。该蛋白质在免疫印迹中可由HMAF抗DEN-4识别，命名为PID2(序列号50)。
实施例42.纯化PID2蛋白质
转化pID2的大肠杆菌菌株于37℃生长，将获得的生物质通过弗氏压碎器裂解。获得可溶性及不溶性两种形式的重组蛋白质。利用6M脲提取伴随不溶性组分的蛋白质，将包含PID2蛋白质的上清上样G-25柱，以便去除离液剂。然后将获得的组分上样存在Cu++离子的螯合-琼脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。使用30mM咪唑洗柱，250mM咪唑洗脱蛋白质。最后将纯净组分上样G-25柱，获得处于配制缓冲液(PBS)中的蛋白质。该制剂供免疫学研究之用。
实施例43.PID2的抗原性特征
利用不同多克隆血清和/或小鼠单克隆抗体以及针对登革的人阳性血清进行识别，鉴定纯化的PID2组分的特征(表51)。
在斑点印迹中，利用HMAF抗DEN-4获得的识别最强(高于利用PID1所获识别)。针对其它血清型的HMAF的识别低于血清型4的情况。由其它黄病毒、如黄热病毒以及圣路易斯脑炎病毒产生的抗体完全没有任何识别作用。最后，测定了针对抗DEN-3的5个高滴度和3个低滴度人血清的反应性，通过Western印迹和斑点印迹均获得了显著信号。
表51.PID2蛋白质对单克隆和多克隆抗体的反应性。
Abs**
特异性*** PID2
HMAF DEN-1 -
HMAF DEN-2 -
HMAF DEN-3 +
HMAF DEN-4 +++
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
*总计使用10μg纯化的PID2。按+至++评价所获得的信号强度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀释使用。
***EEE：马脑炎病毒。YFV：黄热病毒。SLV：圣路易斯脑炎病毒。NT：中和特异性血清型。
实施例44.由PID2产生的抗体应答的特征
利用处于弗氏佐剂中的20ug纯化的PID2 i.p免疫总计25只Balb/c小鼠，10只动物于4次剂量后取血，通过ELISA评价抗DEN抗体。获得了针对DEN-4的高抗体滴度，未获得针对其它血清型的反应性(表52和表55)。此外，进行了HI分析，只发现针对DEN-4的阳性滴度(表53和表55)。最后，进行了体外中和分析，获得针对DEN-4的中和滴度为1∶1280(表54)。未发现针对其它血清型病毒感染的中和作用(表55)。
表52.PID2免疫小鼠所获血清的抗DEN-4抗体滴度。 小鼠抗DEN-4滴度PID2抗DEN-4滴度PBS对照(-) 1 1∶64000 ＜1∶100 2 ＞1∶128 000 ＜1∶100 3 1∶128 000 ＜1∶100 4 ＞1∶128 000 ＜1∶100 5 1∶64000 ＜1∶100 6 ＞1∶128 000 ＜1∶100 7 ＞1∶128 000 ＜1∶100 8 ＞1∶128 000 ＜1∶100 9 ＞1∶128 000 ＜1∶100 10 1∶128 000 ＜1∶100
表53.PID2免疫动物血清的HI滴度。 小鼠抗DEN-4的HI*滴度(PID2)抗DEN-4的HI滴度PBS C(-) 1 1∶320 ＜1∶5 2 1∶320 ＜1∶5 3 1∶640 ＜1∶5 4 1∶40 ＜1∶5 5 ＜1/5 ＜1∶5 6 1∶320 ＜1∶5 7 1∶640 ＜1∶5 8 1∶640 ＜1∶5 9 1∶40 ＜1∶5 10 1∶320 ＜1∶5
*HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
表54.PID2免疫动物血清的病毒中和分析。 小鼠抗DEN-4的中 和滴度 PID2抗DEN-4的中 和滴度 PBS C(-) 1 ＞1∶1280 ＜1∶5 2 ＞1∶1280 ＜1∶5 3 ＞1∶1280 ＜1∶5 4 ＞1∶1280 ＜1∶5 5 1∶640 ＜1∶5 6 ＞1∶1280 ＜1∶5 7 ＞1∶1280 ＜1∶5 8 ＞1∶1280 ＜1∶5 9 1∶640 ＜1∶5 10 ＞1∶1280 ＜1∶5
*中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
表55.利用PID2免疫动物血清通过ELISA、HI以及病毒中和进行的针对所有病毒血清型的交叉反应性分析。血清混合物* ELISA (抗DEN-1) ELISA (抗DEN-2) ELISA (抗DEN-3) ELISA (抗DEN-4) 1(PID2) ＜1/100 ＜1/100 ＜1/100 ＞1∶128 000 2(PID2) ＜1/100 ＜1/100 ＜1/100 1∶64 000血清混合物*HI**抗DEN-1HI抗DEN-2HI抗DEN-3HI抗DEN-4 PID2 ＜1/5 ＜1/5 ＜1/5 ＞1/320血清混合物*抗DEN-1中和滴 度***抗DEN-2的中 和滴度抗DEN-3的中 和滴度抗DEN-4的中 和滴度 1(PID2) ＜1∶5 ＜1∶5 ＜1∶5 ＞1∶1280 2(PID2) ＜1∶5 ＜1∶5 ＜1∶5 ＞1∶1280
*每种混合物由三种血清形成。
**HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
***中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
实施例45.获得pID3
利用序列表中序列号19和序列号20所示寡核苷酸，从DEN-4病毒株(Zhao B.，Mackow E.R.，Buckler-White A.J.，Markoff L.，Chancock R.M.，Lai C.-J.，Makino Y.Cloning full-length Denguetype 4 viral DNA sequences：Analysis of genes coding forstructural proteins.Virology 1986.155：77-88)扩增编码DEN-4病毒包膜蛋白质286-426氨基酸的核苷酸序列(序列号46)。
利用BamHI/BamHI消化pD4质粒，产生包含编码MDH蛋白质和6个组氨酸序列并且没有终止密码子的核苷酸序列(序列号29)的载体。该消化使得可以在MDH蛋白质C末端区之后融合PCR扩增片段。连接以后，通过限制性酶消化来分析可能的重组子，测序阳性克隆以验证连接。利用所选名为pID3的克隆(图12和序列号51)转化感受态细胞W3110。菌落在LB培养基中生长以后，对细胞裂解物进行SDS-PAGE。结果获得80kDA条带，占总细胞蛋白质的20％。所获蛋白质的大小相当于MDH蛋白质与DEN-4病毒DENe蛋白质片段大小的总和。该蛋白质在免疫印迹中可由HMAF抗DEN-4识别，命名为PID3(序列号52)。
实施例46.纯化蛋白质PID3
转化pID3的大肠杆菌菌株于37℃生长，将获得的生物质通过弗氏压碎器裂解。获得可溶性及不溶性两种形式的重组蛋白质。利用6M脲从不溶性组分中提取蛋白质，将包含PID3蛋白质的上清上样G-25柱，以便去除离液剂。然后将获得的组分上样存在Cu++离子的螯合-琼脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。使用45mM咪唑洗柱，200mM咪唑洗脱蛋白质。最后将纯净的蛋白质组分上样G-25柱，获得处于配制缓冲液(PBS)中的蛋白质。该制剂供免疫学研究之用。
实施例47.PID3的抗原性特征
利用不同多克隆血清和/或小鼠单克隆抗体以及针对登革的人阳性血清进行识别，鉴定纯化的PID3组分的特征(表56)。
在斑点印迹中，利用HMAF抗DEN-4获得的识别最强。针对其它血清型的HMAF的识别低于血清型4的情况。由其它黄病毒、如黄热病毒以及圣路易斯脑炎病毒产生的抗体完全没有任何识别作用。最后，测定了针对抗DEN-4的3个高滴度和3个低滴度人血清的反应性，通过Western印迹和斑点印迹均获得了显著信号。
表56.PID3蛋白质对单克隆和多克隆抗体的反应性。
Abs**
特异性*** PID3
HMAF DEN-1 -
HMAF DEN-2 -
HMAF DEN-3 +
HMAF DEN-4 +++
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
*总计使用10μg纯化的PID3。按+至++评价所获得的信号强度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀释使用。
***EEE：马脑炎病毒。YFV：黄热病毒。SLV：圣路易斯脑炎病毒。NT：中和特异性血清型。
实施例48.由PID3产生的抗体应答的特征
利用处于弗氏佐剂中的20ug纯化的PAZ3 i.p免疫总计25只Balb/c小鼠，10只动物于4次剂量后取血，通过ELISA评价抗DEN抗体。获得了针对DEN-4的高抗体滴度，未获得针对其它血清型的反应性(表57和表60)。此外，进行了HI分析，只发现针对DEN-4的阳性滴度(表58和表60)。最后，进行了体外中和分析，获得针对DEN-4的中和滴度为1∶1280(表59)。未发现针对其它血清型病毒感染的中和作用(表60)。
表57.PID3免疫小鼠所获血清的抗DEN-4抗体滴度。 小鼠抗DEN-4滴度(PID3)抗DEN-4滴度PBS对照(-) 1 ＞1∶128 000 ＜1∶100 2 ＞1∶128 000 ＜1∶100 3 ＞1∶128 000 ＜1∶100 4 1∶64 000 ＜1∶100 5 1∶64 000 ＜1∶100 6 ＞1∶128 000 ＜1∶100 7 1∶128 000 ＜1∶100 8 ＞1∶128 000 ＜1∶100 9 1∶128 000 ＜1∶100 10 ＞1∶128 000 ＜1∶100
表58.PID3免疫动物血清的HI滴度。 小鼠抗DEN-4的HI*滴度 PID3抗DEN-4的HI滴度 PBS C(-) 1 ＞1∶640 ＜1∶5 2 1∶320 ＜1∶5 3 ＞1∶640 ＜1∶5 4 ＞1∶640 ＜1∶5 5 ＜1∶5 ＜1∶5 6 ＞1∶640 ＜1∶5 7 1∶320 ＜1∶5 8 ＞1∶640 ＜1∶5 9 1∶320 ＜1∶5 10 ＞1∶640 ＜1∶5
*HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
表59.PID3免疫动物血清的病毒中和分析。 小鼠抗DEN-4中和 滴度* PID3抗DEN-4的中 和滴度 PBS C(-) 1 ＞1∶1280 ＜1∶5 2 ＞1∶1280 ＜1∶5 3 ＞1∶1280 ＜1∶5 4 ＞1∶1280 ＜1∶5 5 ＞1∶1280 ＜1∶5 6 ＞1∶1280 ＜1∶5 7 ＞1∶1280 ＜1∶5 8 1∶640 ＜1∶5 9 ＞1∶1280 ＜1∶5 10 ＞1∶1280 ＜1∶5
*中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
表60.利用PID3免疫动物血清通过ELISA、HI以及病毒中和进行的针对所有病毒血清型的交叉反应性分析。血清混合物*ELISA(抗DEN-1)ELISA(抗DEN-2)ELISA(抗DEN-3)ELISA(抗DEN-4)1(PID3)＜1/100＜1/100＜1/100＞1∶128 0002(PID3)＜1/100＜1/100＜1/1001∶128 000血清混合物*HI**抗DEN-1HI抗DEN-2HI抗DEN-3HI抗DEN-4 PID3 ＜1/5 ＜1/5 ＜1/5 ＞1/320血清混合物*抗DEN-1中和滴 度***抗DEN-2的中 和滴度抗DEN-3的中 和滴度抗DEN-4的中 和滴度 1(PID3) ＜1∶5 ＜1∶5 ＜1∶5 ＞1∶1280 2(PID3) ＜1∶5 ＜1∶5 ＜1∶5 ＞1/1280
*每种混合物由三种血清形成。
**HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
***中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
实施例49.获得pD4D2
利用序列表中序列号16和序列号21所示寡核苷酸，从DEN-4病毒株(Zhao B.，Mackow E.R.，Buckler-White A.J.，Markoff L.，Chancock R.M.，Lai C.-J.，Makino Y.Cloning full-length Denguetype 4 viral DNA sequences：Analysis of genes coding forstructural proteins.Virology 1986.155：77-88)扩增编码DEN-4病毒包膜E蛋白质286-426氨基酸的核苷酸序列(序列号46)。
利用Xba/XbaI消化pLL3质粒，产生载体，其中包含MDH基因外加位于该基因3’区的6个组氨酸序列以及位于3’末端的DEN-2E片段序列。结果获得了融合同一MDH基因的血清型2和4E蛋白质的两个区域。连接以后，通过限制性酶消化来分析可能的重组子，测序阳性克隆以验证连接。利用所选名为pD4D2的克隆(图13和序列号53)转化感受态细胞MM294。菌落在LB培养基中生长以后，对细胞裂解物进行SDS-PAGE。结果获得110kDA条带，占总细胞蛋白质的20％。所获蛋白质的大小相当于MDH蛋白质与登革病毒DENe蛋白质的两个片段的总和。该蛋白质可由HMAF中包含的抗DEN-2和抗DEN-4多克隆抗体识别。将该蛋白质命名为PD4D2(序列号54)。
实施例50.纯化PD4D2蛋白质
转化pD4D2的大肠杆菌菌株于37℃生长，将获得的生物质通过弗氏压碎器裂解。获得的重组蛋白质为可溶性或不溶性形式。利用6M脲从沉淀中提取蛋白质，将包含PD4D2蛋白质的上清上样G-25柱，以便去除离液剂。然后将获得的组分上样存在Cu++离子的螯合-琼脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。使用30mM咪唑进行洗涤步骤，由250mM咪唑洗脱蛋白质。最后将纯净组分上样G-25柱，获得处于配制缓冲液(PBS)中的蛋白质，用于免疫学研究。
实施例51.PD4D2的抗原性特征
利用不同多克隆血清和/或小鼠单克隆抗体以及针对登革的人阳性血清进行识别，鉴定纯化的PD4D2组分的特征(表61)。
在斑点印迹中，利用HMAF抗DEN-2和抗DEN-4获得的识别最强。两种其它血清型的识别低于血清型2和4的情况。由其它黄病毒、如黄热病毒以及圣路易斯脑炎病毒产生的抗体完全没有任何识别作用。另一方面，Mab 3H5确实具有反应性，与利用PLL2和PLL3所获得的反应性类似。最后，测定了针对抗DEN-2和DEN-4的高、低滴度人血清的反应性，通过Western印迹和斑点印迹均获得了显著信号。
表6 1.PD4D2蛋白质对单克隆和多克隆抗体的反应性。
Abs**
特异性*** PD4D2
HMAF DEN-1 -
HMAF DEN-2 +++
HMAF DEN-3 -
HMAF DEN-4 +++
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
*总计使用10μg纯化的PD4D2。按+至++评价所获得的信号强度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀释使用。
***EEE：马脑炎病毒。YFV：黄热病毒。SLV：圣路易斯脑炎病毒。NT：中和特异性血清型。
实施例52.由PD4D2产生的抗体应答的特征
利用处于弗氏佐剂中的20ug纯化的PD4D2 i.p免疫总计25只Balb/c小鼠，10只动物于4次剂量后取血，通过ELISA评价抗DEN抗体。获得了针对DEN-2和DEN-4的高抗体滴度，未获得针对其它血清型的反应性(表62和表65)。此外，进行了血细胞凝集抑制分析(HI)，只发现针对DEN-2和DEN-4的阳性滴度(表63和表65)。最后，进行了体外中和分析，获得针对DEN-2的中和滴度＞1∶1280，针对DEN-4的中和滴度＞1∶1280(表64)。未发现针对其它血清型病毒感染的中和作用(表65)。
表62.PD4D2免疫小鼠所获血清的抗DEN-2和DEN-4抗体滴度。 小鼠 ELISA滴度 (PD4D2) ELISA滴度 PBS C(-)抗DEN-4抗DEN-2抗DEN-4抗DEN-2 1＞1∶128 000＞1∶128 000＜1∶100＜1∶100 21∶128 0001∶128 000＜1∶100＜1∶100 3＞1∶128 000＞1∶128 000＜1∶100＜1∶100 4＞1∶128 000＞1∶128 000＜1∶100＜1∶100 51∶64 000＞1∶128 000＜1∶100＜1∶100 6＞1∶128 0001∶128 000＜1∶100＜1∶100 71∶64 000＞1∶128 000＜1∶100＜1∶100 8＞1∶128 000＞1∶128 000＜1∶100＜1∶100 9＞1∶128 0001∶128 000＜1∶100＜1∶100 101∶128 000＞1∶128 000＜1∶100＜1∶100
表63.PD4D2免疫动物血清的HI滴度。小鼠 HI滴度 (PD4D2) HI滴度 PBS C(-) 抗DEN-4 抗DEN-2 抗DEN-4 抗DEN-2 1 ＞1∶640 ＞1∶640 ＜1∶5 ＜1∶5 2 ＞1∶640 ＞1∶640 ＜1∶5 ＜1∶5 3 ＞1∶640 1∶320 ＜1∶5 ＜1∶5 4 ＞1∶640 ＞1∶640 ＜1∶5 ＜1∶5 5 1∶320 1∶640 ＜1∶5 ＜1∶5 6 ＞1∶640 ＞1∶640 ＜1∶5 ＜1∶5 7 ＞1∶640 ＞1∶640 ＜1∶5 ＜1∶5 8 1∶320 1∶320 ＜1∶5 ＜1∶5 9 1∶320 1∶320 ＜1∶5 ＜1∶5 10 ＞1∶640 ＞1∶640 ＜1∶5 ＜1∶5
*HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
表64.PD4D2免疫动物血清的病毒中和分析。 小鼠 中和滴度* (PD4D2) 中和滴度 PBS C(-) 抗DEN-4 抗DEN-2 抗DEN-4 抗DEN-2 1 ＞1∶1280 ＞1∶1280 ＜1∶5 ＜1∶5 2 ＞1∶1280 ＞1∶1280 ＜1∶5 ＜1∶5 3 1∶1280 1∶1280 ＜1∶5 ＜1∶5 4 ＞1∶1280 ＞1∶1280 ＜1∶5 ＜1∶5 5 1∶640 1∶1280 ＜1∶5 ＜1∶5 6 ＞1∶1280 ＞1∶1280 ＜1∶5 ＜1∶5 7 ＞1∶1280 ＞1∶1280 ＜1∶5 ＜1∶5 8 1∶640 ＞1∶1280 ＜1∶5 ＜1∶5 9 ＞1∶1280 ＞1∶1280 ＜1∶5 ＜1∶5 10 ＞1∶1280 ＞1∶1280 ＜1∶5 ＜1∶5
*中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
表65.利用PD4D2免疫动物血清通过ELISA、HI以及病毒中和进行的针对所有病毒血清型的交叉反应性分析。 血清混合物* ELISA (抗DEN-1) ELISA (抗DEN-2) ELISA (抗DEN-3) ELISA (抗DEN-4) 1(PD4D2) ＜1/100 ＞1∶128 000 ＜1/100 1∶64 000 2(PD4D2) ＜1/100 ＞1∶128 000 ＜1/100 ＞1∶128 000血清混合物*HI**抗DEN-1HI抗DEN-2HI抗DEN-3HI抗DEN-4 PD4D2 ＜1∶5 ＞1∶320 ＜1∶5 ＞1∶320血清混合物*抗DEN-1的中和滴度***抗DEN-2的中和滴度抗DEN-3的中和滴度抗DEN-4的中和滴度 1(PD4D2) ＜1∶5 ＞1∶1280 ＜1∶5 ＞1∶1280 2(PD4D2) ＜1∶5 ＞1∶1280 ＜1∶5 ＞1∶1280
*每种混合物由三种血清形成。
**HI滴度可定义为能够抑制针对8个血细胞凝集病毒单位的鹅红血球血细胞凝集的最高稀释度。
***中和滴度可定义为使病毒噬斑数减少50％的最高血清稀释度。
实施例53.保护性分析
为评价利用各种所分析的变体免疫小鼠所引起的对同源致死性DEN攻击的保护作用，每组使用15只小鼠。每只小鼠通过颅内(intracraneal)接种接受一个100 LD50剂量的致死性DEN，观察21天，研究致死百分率。利用4种病毒性制剂(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)免疫每组15只小鼠，用作阳性对照。这些对照组的全部小鼠存活，阴性对照组在攻击后7-11天开始生病；从而获得100％的死亡率。最后，利用所研究的融合蛋白质免疫的各组具有80％-100％的保护作用，在所有情况下均具有相对于对照组的显著性差异(表66)。
表66.利用所分析的蛋白质变体免疫的小鼠在同源致死性登革病毒攻击下的存活百分率。免疫原存活百分率* PBS 0 DEN-1 100 DEN-2 100 DEN-3 100 DEN-4 100 PLL1 86 PLL2 100 PLL3 100 PLH1 80 PLH2 100 PLH3 100 PAZ1 80 PAZ2 100 PAZ3 100 PID1 86 PID2 100 PID3 100 PD4D2 100(DEN-4) 100(DEN-2)
*按(存活小鼠数)/(小鼠总数)计算。攻击后21天取得幸存者数据。就利用pD4D2免疫的小鼠而言，15只受到DEN-4攻击，15只受到DEN-2攻击。
实施例54.淋巴增殖性反应
利用包含DEN-2E片段的嵌合蛋白质(PLL1、PLL2和PLL3)免疫的各组以及安慰剂组的动物，在最后一次给药15天以后处死。然后收集动物的脾脏，研究其针对登革病毒4种血清型的淋巴细胞增殖性反应。表67显示所得刺激指数的结果，证明获得了血清型特异性应答。
表67.PLL1、PLL2和PLL3免疫小鼠的淋巴细胞针对4种登革病毒血清型的刺激指数。 PLL1 PLL2 PLL3 C(-) DEN-1 1.3* 1.0 0.8 1.2 DEN-2 12.5 10.3 8.9 1.4 DEN-3 1.0 1.6 1.8 1.4 DEN-4 1.7 1.5 1.7 1.1 对照抗原 1.1 1.0 1.3 0.9 PHA** 13.3 16.5 11.1 12.0
*刺激指数：自发合成DNA的样品每分钟计数与对照每分钟计数之比(cocient)。
**促分裂原(mitogen)：植物凝集素(Phytohemagglutinin)。
序列表
<110>CENTER FOR GENETIC ENGINEERING AND BIOTECNOLOGY
<120>编码可诱导抗病毒效应的蛋白质的嵌合链
<130>Dengue
<140>
<141>
<160>54
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(25)
<223>扩增DENe-2片段的Xba-I引物的序列
<400>1
cttctagaca ggctgcgcat ggaca 25
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(29)
<223>扩增DENe-2片段的Bam-HI引物的序列
<400>2
gtggatcctt accctcccag gcttccaaa 29
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(25)
<223>扩增DENe-2片段的Eco-RI引物的序列
<400>3
atgaattcac gcctcccaga gatcc 25
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(21)
<223>扩增DENe-2片段的Bam-HI引物的序列
<400>4
cttggatcca ggctgagaat g 21
<210>5
<211>31
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(31)
<223>扩增DENe-2片段的Bam-HI引物的序列
<400>5
gaggatcctt aaccacccag agacccaaaa t 31
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(25)
<223>扩增DENe-1片段的Xba-I引物的序列
<400>6
cttctagaca ggctcaaaat ggata 25
<210>7
<211>28
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(28)
<223>扩增DENe-1片段的Bam-HI引物的序列
<400>7
gaggatcctt acccgccaat agaaccga 28
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(25)
<223>扩增DENe-1片段的Eco-RI引物的序列
<400>8
acgaattcac ccctcctata gatcc 25
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(24)
<223>扩增DENe-1片段的Bam-HI引物的序列
<400>9
acaccttgga tccagactaa aaat 24
<210>10
<211>26
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(26)
<223>扩增DENe-1片段的Bam-HI引物的序列
<400>10
ccggatccgt gaattaccca cctata 26
<210>11
<211>29
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(29)
<223>扩增DENe-3片段的Xba-I引物的序列
<400>11
tttctagata gactcaagat ggacaaatt 29
<210>12
<211>28
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(28)
<223>扩增DENe-3片段的Bam-HI引物的序列
<400>12
gaggatcctt aaccacccac tgaaccaa 28
<210>13
<211>25
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(25)
<223>扩增DENe-3片段的Eco-RI引物的序列
<400>13
aagaattcac accacccaca gatcc 25
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(23)
<223>扩增DENe-3片段的Bam-HI引物的序列
<400>14
acttaggatc cagactcaag atg 23
<210>15
<211>26
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(26)
<223>扩增DENe-3片段的Bam-HI引物的序列
<400>15
gaggatcctt aaccacccac tgaacc 26
<210>16
<211>30
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(30)
<223>扩增DENe-4片段的Xba-I引物的序列
<400>16
cttctagaca aagtgcgtat ggagaaattg 30
<210>17
<211>28
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(28)
<223>扩增DENe-4片段的Bam-HI引物的序列
<400>17
gaggatcctt aaccaccaac agaaccaa 28
<210>18
<211>25
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(25)
<223>扩增DENe-4片段的Eco-RI引物的序列
<400>18
atgaattcag tccaccaacg ctacc 25
<210>19
<211>27
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(27)
<223>扩增DENe-4片段的Bam-HI引物的序列
<400>19
ggccatctag gatccaaagt gcgtatg 27
<210>20
<211>28
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(28)
<223>扩增DENe-4片段的Bam-HI引物的序列
<400>20
gaggatcctt agccaccaac cgaaccaa 28
<210>21
<211>26
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>引物-结合
<222>(1)..(26)
<223>扩增DENe-4片段的Xba-I引物的序列
<400>21
attctagaag accaccaacg gaacca 26
<210>22
<211>429
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(426)
<223>编码DEN-2包膜蛋白的286-426位氨基酸的核苷酸序列
<400>22
gacaggctga gaatggacaa actacagctc aaaggaatgt catactctat gtgtacagga 60
aagtttaaaa ttgtgaagga aatagcagaa acacaacatg gaacaatagt tatcagagta 120
caatatgaag gggacggctc tccatgtaag atcccttttg agataatgga tttggaaaaa 180
agacacgtct taggtcgcct gattacagtt aacccgatcg taacagaaaa agatagccca 240
gtcaacatag aagcagaacc tccattcgga gacagctaca tcatcatagg agtagagccg 300
ggacaattga aactcaactg gtttaagaaa ggaagttcca tcggccaaat gtttgagaca 360
acaatgagag gagcgaagag aatggccatt ttaggtgaca cagcctggga ttttggatcc 420
ctgggagga 429
<210>23
<211>168
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(168)
<223>编码MDH头45个氨基酸的核苷酸序列
<400>23
atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60
aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120
ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagac 168
<210>24
<211>603
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(603)
<223>质粒pLL1中编码quimeric蛋白的核苷酸序列
<400>24
atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60
aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120
ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagacag gctgcgcatg 180
gacaaactac agctcaaagg aatgtcatac tctatgtgta caggaaagtt taaaattgtg 240
aaggaaatag cagaaacaca acatggaaca atagttatca gagtacaata tgaaggggac 300
ggctctccat gtaagatccc ttttgagata atggatttgg aaaaaagaca cgtcttaggt 360
cgcctgatta cagttaaccc gatcgtaaca gaaaaagata gcccagtcaa catagaagca 420
gaacctccat tcggagacag ctacatcatc ataggagtag agccgggaca attgaaactc 480
aactggttta agaaaggaag ttccatcggc caaatgtttg agacaacaat gagaggagcg 540
aagagaatgg ccattttagg tgacacagcc tgggattttg gaagcctggg agggtaagga 600
tcc 603
<210>25
<211>195
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
<221>链
<222>(1)..(195)
<223>PLL1蛋白的氨基酸序列
<400>25
His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu
1 5 10 15
Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala
20 25 30
Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile
35 40 45
Thr Leu Asp Leu Asp Arg Leu Arg Met Agp Lys Leu Gln Leu Lys Gly
50 55 60
Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile
65 70 75 80
Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly
85 90 95
Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys
100 105 110
Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu
115 120 125
Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser
130 135 140
Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe
145 150 155 160
Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly
165 170 175
Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser
180 185 190
Leu Gly Gly
195
<210>26
<211>1851
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(1851)
<223>质粒pM84 His中的MDH的核苷酸序列
<400>26
atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60
aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120
ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagaa 180
gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcgatgaatt cgatggacgt acctgctgaa 240
gttgcaggcg tagtcaaaga agttaaagtt aaagtcggcg acaaaatctc tgaaggtggt 300
ttgattgtcg tcgttgaagc tgaaggcacg gcagccgctc ctaaagccga agcggctgcc 360
gccccggcgc aagaagcccc taaagctgcc gctcctgctc cgcaagccgc gcaattcggc 420
ggttctgccg atgccgagta cgacgtggtc gtattgggtg gcggtcccgg cggttactcc 480
gctgcatttg ccgctgccga tgaaggcttg aaagtcgcca tcgtcgaacg ttacaaaact 540
ttgggcggcg tttgcctgaa cgtcggctgt atcccttcca aagccttgtt gcacaatgcc 600
gccgttatcg acgaagtgcg ccacttggct gccaacggta tcaaataccc cgagccggaa 660
ctcgacatcg atatgcttcg cgcctacaaa gacggcgtag tttcccgcct cacgggcggt 720
ttggcaggta tggcgaaaag ccgtaaagtg gacgttatcc aaggcgacgg gcaattctta 780
gatccgcacc acttggaagt gtcgctgact gccggcgacg cgtacgaaca ggcagcccct 840
accggcgaga aaaaaatcgt tgccttcaaa aactgtatca ttgcagcagg cagccgcgta 900
accaaactgc ctttcattcc tgaagatccg cgcatcatcg attccagcgg cgcattggct 960
ctgaaagaag taccgggcaa actgctgatt atcggcggcg gcattatcgg cctcgagatg 1020
ggtacggttt acagcacgct gggttcgcgt ttggatgtgg ttgaaatgat ggacggcctg 1080
atgcaaggcg cagaccgcga tttggtaaaa gtatggcaaa aacaaaacga ataccgtttt 1140
gacaacatta tggtcaacac caaaaccgtt gcagttgagc cgaaagaaga cggcgtttac 1200
gttacctttg aaggcgcgaa cgcgcctaaa gagccgcaac gctacgatgc cgtattggtt 1260
gccgccggcc gcgcgcccaa cggcaaactc atcagcgcgg aaaaagcagg cgttgccgta 1320
accgatcgcg gcttcatcga agtggacaaa caaatgcgta ccaatgtgcc gcacatctac 1380
gccatcggcg acatcgtcgg tcagccgatg ttggcgcaca aagccgttca cgaaggccac 1440
gttgccgccg aaaactgcgc cggccacaaa gcctacttcg acgcacgcgt gattccgggc 1500
gttgcctaca cttcccccga agtggcgtgg gtgggcgaaa ccgaactgtc cgccaaagcc 1560
tccggccgca aaatcaccaa agccaacttc ccgtgggcgg cttccggccg tgcgattgcc 1620
aacggttgcg acaagccgtt taccaagctg atttttgatg ccgaaaccgg ccgcatcatc 1680
ggcggcggca ttgtcggtcc gaacggtggc gatatgatcg gcgaagtctg ccttgccatc 1740
gaaatgggct gcgacgcggc agacatcggc aaaaccatcc acccgcaccc gggcgaatcc 1800
atcggtatgg cggcggaagt ggcattgggt acttgtaccg acaaaaaaaa a 1851
<210>27
<211>2253
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(2253)
<223>质粒pLL2中的quimeric蛋白的核苷酸序列
<400>27
atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60
aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120
ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180
aggctgcgca tggacaaact acagctcaaa ggaatgtcat actctatgtg tacaggaaag 240
tttaaaattg tgaaggaaat agcagaaaca caacatggaa caatagttat cagagtacaa 300
tatgaagggg acggctctcc atgtaagatc ccttttgaga taatggattt ggaaaaaaga 360
cacgtcttag gtcgcctgat tacagttaac ccgatcgtaa cagaaaaaga tagcccagtc 420
aacatagaag cagaacctcc attcggagac agctacatca tcataggagt agagccggga 480
caattgaaac tcaactggtt taagaaagga agttccatcg gccaaatgtt tgagacaaca 540
atgagaggag cgaagagaat ggccatttta ggtgacacag cctgggattt tggatctctg 600
ggaggcgtga attcgatgaa ttcgatggac gtacctgctg aagttgcagg cgtagtcaaa 660
gaagttaaag ttaaagtcgg cgacaaaatc tctgaaggtg gtttgattgt cgtcgttgaa 720
gctgaaggca cggcagccgc tcctaaagcc gaagcggctg ccgccccggc gcaagaagcc 780
cctaaagctg ccgctcctgc tccgcaagcc gcgcaattcg gcggttctgc cgatgccgag 840
tacgacgtgg tcgtattggg tggcggtccc ggcggttact ccgctgcatt tgccgctgcc 900
gatgaaggct tgaaagtcgc catcgtcgaa cgttacaaaa ctttgggcgg cgtttgcctg 960
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cgcgcctaca aagacggcgt agtttcccgc ctcacgggcg gtttggcagg tatggcgaaa 1140
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gatttggtaa aagtatggca aaaacaaaac gaataccgtt ttgacaacat tatggtcaac 1560
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<210>28
<211>748
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
<221>链
<222>(1)..(748)
<223>PLL2的氨基酸序列
<400>28
His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu
1 5 10 15
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<210>29
<211>1821
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(1821)
<223>质粒pD4中的MDH的核苷酸序列
<400>29
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<210>30
<211>2259
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(2259)
<223>质粒pLL3中编码quimeric蛋白的核苷酸序列
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ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag ccgctcctaa agccgaagcg 300
gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360
ttcggcggtt ctgccgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420
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aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540
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ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780
gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840
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<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
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<222>(1)..(746)
<223>PLL3的氨基酸序列
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580 585 590
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<212>DNA
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<220>
<221>基因
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<220>
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<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
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<222>(1)..(174)
<223>PLH1的氨基酸序列
<400>34
His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu
1 5 10 15
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<210>35
<211>2253
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(2253)
<223>质粒PLH2中编码quimeric蛋白的核苷酸序列
<400>35
atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60
aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120
ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180
aggctcaaaa tggataaact gactttaaaa ggggtatcat atgtaatgtg cacagggtca 240
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tacgaaggaa cagatgcacc atgcaagatc cccttctcgt cccaagatga gaaaggagta 360
acccagaatg ggagattgat aacagccaac cccatagtca ttgacaaaga aaaaccagtc 420
aacattgaag cggagccacc ttttggtgag agctatattg tggtaggagc aggtgaaaaa 480
gctttgaaac taagctggtt caagaaggga agcagtatag ggaaaatgtt tgaagcaact 540
gcccgtggag cacgaaggat ggccatcctg ggagacaccg catgggactt cggatctata 600
ggaggggtga attcgatgaa ttcgatggac gtacctgctg aagttgcagg cgtagtcaaa 660
gaagttaaag ttaaagtcgg cgacaaaatc tctgaaggtg gtttgattgt cgtcgttgaa 720
gctgaaggca cggcagccgc tcctaaagcc gaagcggctg ccgccccggc gcaagaagcc 780
cctaaagctg ccgctcctgc tccgcaagcc gcgcaattcg gcggttctgc cgatgccgag 840
tacgacgtgg tcgtattggg tggcggtccc ggcggttact ccgctgcatt tgccgctgcc 900
gatgaaggct tgaaagtcgc catcgtcgaa cgttacaaaa ctttgggcgg cgtttgcctg 960
aacgtcggct gtatcccttc caaagccttg ttgcacaatg ccgccgttat cgacgaagtg 1020
cgccacttgg ctgccaacgg tatcaaatac cccgagccgg aactcgacat cgatatgctt 1080
cgcgcctaca aagacggcgt agtttcccgc ctcacgggcg gtttggcagg tatggcgaaa 1140
agccgtaaag tggacgttat ccaaggcgac gggcaattct tagatccgca ccacttggaa 1200
gtgtcgctga ctgccggcga cgcgtacgaa caggcagccc ctaccggcga gaaaaaaatc 1260
gttgccttca aaaactgtat cattgcagca ggcagccgcg taaccaaact gcctttcatt 1320
cctgaagatc cgcgcatcat cgattccagc ggcgcattgg ctctgaaaga agtaccgggc 1380
aaactgctga ttatcggcgg cggcattatc ggcctcgaga tgggtacggt ttacagcacg 1440
ctgggttcgc gtttggatgt ggttgaaatg atggacggcc tgatgcaagg cgcagaccgc 1500
gatttggtaa aagtatggca aaaacaaaac gaataccgtt ttgacaacat tatggtcaac 1560
accaaaaccg ttgcagttga gccgaaagaa gacggcgttt acgttacctt tgaaggcgcg 1620
aacgcgccta aagagccgca acgctacgat gccgtattgg ttgccgccgg ccgcgcgccc 1680
aacggcaaac tcatcagcgc ggaaaaagca ggcgttgccg taaccgatcg cggcttcatc 1740
gaagtggaca aacaaatgcg taccaatgtg ccgcacatct acgccatcgg cgacatcgtc 1800
ggtcagccga tgttggcgca caaagccgtt cacgaaggcc acgttgccgc cgaaaactgc 1860
gccggccaca aagcctactt cgacgcacgc gtgattccgg gcgttgccta cacttccccc 1920
gaagtggcgt gggtgggcga aaccgaactg tccgccaaag cctccggccg caaaatcacc 1980
aaagccaact tcccgtgggc ggcttccggc cgtgcgattg ccaacggttg cgacaagccg 2040
tttaccaagc tgatttttga tgccgaaacc ggccgcatca tcggcggcgg cattgtcggt 2100
ccgaacggtg gcgatatgat cggcgaagtc tgccttgcca tcgaaatggg ctgcgacgcg 2160
gcagacatcg gcaaaaccat ccacccgcac ccgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa 2220
gtggcattgg gtacttgtac cgacaaaaaa aaa 2253
<210>36
<211>727
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
<221>链
<222>(1)..(727)
<223>PLH2的氨基酸序列
<400>36
His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu
1 5 10 15
Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala
20 25 30
ValGlu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile
35 40 45
Thr Leu Asp Leu Asp Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln
50 55 60
His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Gln Gly Thr Asp Ala Pro
65 70 75 80
Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn
85 90 95
Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val
100 105 110
Asn Ile Glu Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly
115 120 125
Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Gln Cys Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser
130 135 140
Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala
145 150 155 160
Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Asn
165 170 175
Ser Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val Val Lys
180 185 190
Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly Leu Ile
195 200 205
Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala Glu Ala
210 215 220
Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro Ala Pro
225 230 235 240
Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp Val Val
245 250 255
Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala Ala Ala
260 265 270
Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr Leu Gly
275 280 285
Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Leu His
290 295 300
Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn Gly Ile
305 310 315 320
Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala Tyr Lys
325 330 335
Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys
340 345 350
Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu Asp Pro
355 360 365
His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu Gln Ala
370 375 380
Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys Asn Cys Ile Ile
385 390 395 400
Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile Pro Glu Asp Pro
405 410 415
Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val Pro Gly
420 425 430
Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met Gly Thr
435 440 445
Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met Met Asp
450 455 460
Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp Gln Lys
465 470 475 480
Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn Thr Lys Thr Val
485 490 495
Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu Gly Ala
500 505 510
Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val Ala Ala
515 520 525
Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu Lys Ala Gly Val
530 535 540
Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met Arg Thr
545 550 555 560
Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln Pro Met
565 570 575
Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu Asn Cys
580 585 590
Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile Pro Gly Val Ala
595 600 605
Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu Ser Ala
610 615 620
Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp Ala Ala
625 630 635 640
Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr Lys Leu
645 650 655
Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gly Ile Val Gly
660 665 670
Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu Ala Ile Glu Met
675 680 685
Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His Pro His Pro Gly
690 695 700
Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly Thr Cys Thr Asp
705 710 715 720
Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys
725
<213>大肠杆菌
<221>基因
<222>1..(2250)
<223质粒pLH3的编码quimeric蛋白的核苷酸序列
atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60
aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120
ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180
gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240
ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag ccgctcctaa agccgaagcg 300
gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360
ttcggcggtt ctgccgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420
tactccgctg catttgccgc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480
aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540
aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600
ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660
ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720
ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780
gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840
cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900
ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960
gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020
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gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200
ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260
gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320
atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380
ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440
ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500
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attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620
atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680
gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740
ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800
ccgcaaaaga aaaaaggatc cagactaaaa atggataaac tgactttaaa aggggtatca 1860
tatgtaatgt gcacagggtc attcaagtta gagaaggaag tggctgagac ccagcatgga 1920
actgttctag tgcaggttaa atacgaagga acagatgcac catgcaagat ccccttctcg 1980
tcccaagatg agaaaggagt aacccagaat gggagattga taacagccaa ccccatagtc 2040
attgacaaag aaaaaccagt caacattgaa gcggagccac cttttggtga gagctatatt 2100
gtggtaggag caggtgaaaa agctttgaaa ctaagctggt tcaagaaggg aagcagtata 2160
gggaaaatgt ttgaagcaac tgcccgtgga gcacgaagga tggccatcct gggagacacc 2220
gcatgggact tcggttctat aggtgggtaa 2250
<210>38
<211>724
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
<221>链
<222>(1)..(724)
<223>PLH3的氨基酸序列
<400>38
His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu
1 5 10 15
Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala
20 25 30
Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile
35 40 45
Thr Leu Asp Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val
50 55 60
Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly
65 70 75 80
Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala
85 90 95
Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro
100 105 110
Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp
115 120 125
Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala
130 135 140
Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu
165 170 175
Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn
180 185 190
Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala
195 200 205
Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met
210 215 220
Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu
225 230 235 240
Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu
245 250 255
Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys IIe Val Ala Phe Lys Asn Cys
260 265 270
Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile Pro Glu
275 280 285
Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val
290 295 300
Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met
305 310 315 320
Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met
325 330 335
Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp
340 345 350
Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn Thr Lys
355 360 365
Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu
370 375 380
Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val
385 390 395 400
Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu Lys Ala
405 410 415
Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met
420 425 430
Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln
435 440 445
Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu
450 455 460
Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile Pro Gly
465 470 475 480
Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu
485 490 495
Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp
500 505 510
Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr
515 520 525
Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gly Ile
530 535 540
Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu Ala Ile
545 550 555 560
Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His Pro His
565 570 575
Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly Thr Cys
580 585 590
Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys
595 600 605
Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr
610 615 620
Gln Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu
625 630 635 640
Lys Gly Val Thr Gln Asn Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr
645 650 655
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660 665 670
Ser Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Gln Cys Trp
675 680 685
Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg
690 695 700
Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly
705 710 715 720
Ser Ile Gly Gly
<210>39
<211>426
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(426)
<223>编码DEN-3包膜蛋白的286-426位氨基酸的核苷酸序列
<400>39
agactcaaga tggacaaatt gaaactcaag gggatgagct atgcaatgtg cttgaatacc 60
tttgtgttga agaaagaagt ctccgaaacg cagcatggga caatactcat taaggttgag 120
tacaaagggg aagatgcacc ctgcaagatt cctttctcca cggaggatgg acaagggaaa 180
gctcacaatg gcagactgat cacagccaat ccagtggtga ccaagaagga ggagcctgtc 240
aacattgagg ctgaacctcc ttttggggaa agtaatatag taattggaat tggagacaaa 300
gccctgaaaa tcaactggta caggaaggga agctcgattg ggaagatgtt cgaggccact 360
gccagaggtg caaggcgcat ggccatcttg ggagacacag cctgggactt tggatcagtg 420
ggtggt 426
<210>40
<211>615
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(615)
<223>质粒pAZ1中编码quimeric蛋白的核苷酸序列
<400>40
atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60
aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120
ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagat 180
agactcaaga tggacaaatt gaaactcaag gggatgagct atgcaatgtg cttgaatacc 240
tttgtgttga agaaagaagt ctccgaaacg cagcatggga caatactcat taaggttgag 300
tacaaagggg aagatgcacc ctgcaagatt cctttctcca cggaggatgg acaagggaaa 360
gctcacaatg gcagactgat cacagccaat ccagtggtga ccaagaagga ggagcctgtc 420
aacattgagg ctgaacctcc ttttggggaa agtaatatag taattggaat tggagacaaa 480
gccctgaaaa tcaactggta caggaaggga agctcgattg ggaagatgtt cgaggccact 540
gccagaggtg caaggcgcat ggccatcttg ggagacacag cctgggactt tggttcagtg 600
ggtggttaag gatcc 615
<210>41
<211>194
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
<221>链
<222>(1)..(194)
<223>PAZ1的氨基酸序列
<400>41
His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu
1 5 10 15
Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala
20 25 30
Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile
35 40 45
Thr Leu Asp Leu Asp Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Lys Leu Lys Gly
50 55 60
Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val
65 70 75 80
Ser Glu Thr His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu
85 90 95
Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys
100 105 110
Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys Lys
115 120 125
Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn
130 135 140
Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Arg
145 150 155 160
Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala
165 170 175
Arg Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val
180 185 190
Gly Gly
<210>42
<211>2253
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(2253)
<223>质粒PAZ2中的编码quimertic蛋白的核苷酸序列
<400>42
atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60
aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120
ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagat 180
agactcaaga tggacaaatt gaaactcaag gggatgagct atgcaatgtg cttgaatacc 240
tttgtgttga agaaagaagt ctccgaaacg cagcatggga caatactcat taaggttgag 300
tacaaagggg aagatgcacc ctgcaagatt cctttctcca cggaggatgg acaagggaaa 360
gctcacaatg gcagactgat cacagccaat ccagtggtga ccaagaagga ggagcctgtc 420
aacattgagg ctgaacctcc ttttggggaa agtaatatag taattggaat tggagacaaa 480
gccctgaaaa tcaactggta caggaaggga agctcgattg ggaagatgtt cgaggccact 540
gccagaggtg caaggcgcat ggccatcttg ggagacacag cctgggactt tggatctgtg 600
ggtggtgtga attcgatgaa ttcgatggac gtacctgctg aagttgcagg cgtagtcaaa 660
gaagttaaag ttaaagtcgg cgacaaaatc tctgaaggtg gtttgattgt cgtcgttgaa 720
gctgaaggca cggcagccgc tcctaaagcc gaagcggctg ccgccccggc gcaagaagcc 780
cctaaagctg ccgctcctgc tccgcaagcc gcgcaattcg gcggttctgc cgatgccgag 840
tacgacgtgg tcgtattggg tggcggtccc ggcggttact ccgctgcatt tgccgctgcc 900
gatgaaggct tgaaagtcgc catcgtcgaa cgttacaaaa ctttgggcgg cgtttgcctg 960
aacgtcggct gtatcccttc caaagccttg ttgcacaatg ccgccgttat cgacgaagtg 1020
cgccacttgg ctgccaacgg tatcaaatac cccgagccgg aactcgacat cgatatgctt 1080
cgcgcctaca aagacggcgt agtttcccgc ctcacgggcg gtttggcagg tatggcgaaa 1140
agccgtaaag tggacgttat ccaaggcgac gggcaattct tagatccgca ccacttggaa 1200
gtgtcgctga ctgccggcga cgcgtacgaa caggcagccc ctaccggcga gaaaaaaatc 1260
gttgccttca aaaactgtat cattgcagca ggcagccgcg taaccaaact gcctttcatt 1320
cctgaagatc cgcgcatcat cgattccagc ggcgcattgg ctctgaaaga agtaccgggc 1380
aaactgctga ttatcggcgg cggcattatc ggcctcgaga tgggtacggt ttacagcacg 1440
ctgggttcgc gtttggatgt ggttgaaatg atggacggcc tgatgcaagg cgcagaccgc 1500
gatttggtaa aagtatggca aaaacaaaac gaataccgtt ttgacaacat tatggtcaac 1560
accaaaaccg ttgcagttga gccgaaagaa gacggcgttt acgttacctt tgaaggcgcg 1620
aacgcgccta aagagccgca acgctacgat gccgtattgg ttgccgccgg ccgcgcgccc 1680
aacggcaaac tcatcagcgc ggaaaaagca ggcgttgccg taaccgatcg cggcttcatc 1740
gaagtggaca aacaaatgcg taccaatgtg ccgcacatct acgccatcgg cgacatcgtc 1800
ggtcagccga tgttggcgca caaagccgtt cacgaaggcc acgttgccgc cgaaaactgc 1860
gccggccaca aagcctactt cgacgcacgc gtgattccgg gcgttgccta cacttccccc 1920
gaagtggcgt gggtgggcga aaccgaactg tccgccaaag cctccggccg caaaatcacc 1980
aaagccaact tcccgtgggc ggcttccggc cgtgcgattg ccaacggttg cgacaagccg 2040
tttaccaagc tgatttttga tgccgaaacc ggccgcatca tcggcggcgg cattgtcggt 2100
ccgaacggtg gcgatatgat cggcgaagtc tgccttgcca tcgaaatggg ctgcgacgcg 2160
gcagacatcg gcaaaaccat ccacccgcac ccgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa 2220
gtggcattgg gtacttgtac cgacaaaaaa aaa 2253
<210>43
<211>747
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
<221>链
<222>(1)..(747)
<223>PAZ2的氨基酸序列
<400>43
His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu
1 5 10 15
Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala
20 25 30
Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile
35 40 45
Thr Leu Asp Leu Asp Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Lys Leu Lys Gly
50 55 60
Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val
65 70 75 80
Ser Glu Thr His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu
85 90 95
Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys
100 105 110
Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys Lys
115 120 125
Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn
130 135 140
Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Arg
145 150 155 160
Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala
165 170 175
Arg Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val
180 185 190
Gly Gly Val Asn Ser Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala
195 200 205
Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu
210 215 220
Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro
225 230 235 240
Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala
245 250 255
Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu
260 265 270
Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala
275 280 285
Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr
290 295 300
Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys
305 310 315 320
Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala
325 330 335
Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu
340 345 350
Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala
355 360 365
Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln
370 375 380
Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala
385 390 395 400
Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys
405 410 415
Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile
420 425 430
Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys
435 440 445
Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu
450 455 460
Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val
465 470 475 480
Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys
485 490 495
Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn
500 505 510
Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr
515 520 525
Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val
530 535 540
Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu
545 550 555 560
Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys
565 570 575
Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val
580 585 590
Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala
595 600 605
Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile
610 615 620
Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr
625 630 635 640
Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe
645 650 655
Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro
660 665 670
Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly
675 680 685
Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu
690 695 700
Ala Ile Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His
705 710 715 720
Pro His Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly
725 730 735
Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys
740 745
<210>44
<211>2256
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(2256)
<223>质粒pAZ3中编码quimeric蛋白的核苷酸序列
<400>44
atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60
aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120
ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180
gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240
ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag ccgctcctaa agccgaagcg 300
gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360
ttcggcggtt ctgccgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420
tactccgctg catttgccgc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480
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ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660
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ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780
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ccgcaaaaga aaaaaggatc cagactcaag atggacaaat tgaaactcaa ggggatgagc 1860
tatgcaatgt gcttgaatac ctttgtgttg aagaaagaag tctccgaaac gcagcatggg 1920
acaatactca ttaaggttga gtacaaaggg gaagatgcac cctgcaagat tcctttctcc 1980
acggaggatg gacaagggaa agctcacaat ggcagactga tcacagccaa tccagtggtg 2040
accaagaagg aggagcctgt caacattgag gctgaacctc cttttgggga aagtaatata 2100
gtaattggaa ttggagacaa agccctgaaa atcaactggt acaggaaggg aagctcgatt 2160
gggaagatgt tcgaggccac tgccagaggt gcaaggcgca tggccatctt gggagacaca 2220
gcctgggact ttggttcagt gggtggttaa ggatcc 2256
<210>45
<211>744
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
<221>链
<222>(1)..(744)
<223>PAZ3的氨基酸序列
<400>45
His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu
1 5 10 15
Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala
20 25 30
Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile
35 40 45
Thr Leu Asp Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val
50 55 60
Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly
65 70 75 80
Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala
85 90 95
Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro
100 105 110
Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp
115 120 125
Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala
130 135 140
Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu
165 170 175
Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn
180 185 190
Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala
195 200 205
Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met
210 215 220
Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu
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Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu
245 250 255
Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys Asn Cys
260 265 270
Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile Pro Glu
275 280 285
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290 295 300
Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met
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Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met
325 330 335
Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp
340 345 350
Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn Thr Lys
355 360 365
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Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val
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Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu Lys Ala
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Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met
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435 440 445
Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu
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Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile Pro Gly
465 470 475 480
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485 490 495
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515 520 525
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530 535 540
Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu Ala Ile
545 550 555 560
Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His Pro His
565 570 575
Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly Thr Cys
580 585 590
Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Arg Leu Lys Met Asp
595 600 605
Lys Leu Lys Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe
610 615 620
Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr His Gly Thr Ile Leu Ile Lys
625 630 635 640
Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr
645 650 655
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660 665 670
Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro
675 680 685
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725 730 735
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740
<210>46
<211>426
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(426)
<223>编码DEN-4包膜蛋白的286-426位氨基酸的核苷酸序列
<400>46
aaagtccgta tggagaaatt gagaatcaag ggaatgtcat acacgatgtg ttcaggaaag 60
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aacatagaat tagaaccccc ctttggggac agctacatag tgataggtgt tggaaacagc 300
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ggtgga 426
<210>47
<211>615
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(615)
<223>质粒pID1中的编码quimeric蛋白的核苷酸序列
<400>47
atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60
aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120
ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180
aaagtgcgta tggagaaatt gagaatcaag ggaatgtcat acacgatgtg ttcaggaaag 240
ttttcaattg acaaagagat ggcagaaaca cagcatggga caacagtggt gaaagtcaag 300
tatgaaggtg ctggagctcc gtgtaaagtc cccatagaga taagagatgt aaacaaggaa 360
aaagtggttg ggcgtatcat ctcatccacc cctttggctg agaataccaa cagtgtaacc 420
aacatagaat tagaaccccc ctttggggac agctacatag tgataggtgt tggaaacagc 480
gcattaacac tccattggtt caggaaaggg agttccattg gcaagatgtt tgagtccaca 540
tacagaggtg caaaacgaat ggccattcta ggtgaaacag cttgggattt tggttccgtt 600
ggtggataag gatcc 615
<210>48
<211>192
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
<221>链
<222>(1)..(192)
<223>PID1的氨基酸序列
<400>48
His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu
1 5 10 15
Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala
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Ile Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly
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Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala Lys Arg
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Met Ala Ile Leu Gly Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly
180 185 190
<210>49
<211>2241
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(2241)
<223>质粒pID2中的编码quimeric蛋白的核苷酸序列
<400>49
atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60
aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120
ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagacaa agtccgtatg 180
gagaaattga gaatcaaggg aatgtcatac acgatgtgtt caggaaagtt ttcaattgac 240
aaagagatgg cagaaacaca gcatgggaca acagtggtga aagtcaagta tgaaggtgct 300
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ttggatgtgg ttgaaatgat ggacggcctg atgcaaggcg cagaccgcga tttggtaaaa 1500
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atcagcgcgg aaaaagcagg cgttgccgta accgatcgcg gcttcatcga agtggacaaa 1740
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ttggcgcaca aagccgttca cgaaggccac gttgccgccg aaaactgcgc cggccacaaa 1860
gcctacttcg acgcacgcgt gattccgggc gttgcctaca cttcccccga agtggcgtgg 1920
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ccgtgggcgg cttccggccg tgcgattgcc aacggttgcg acaagccgtt taccaagctg 2040
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gatatgatcg gcgaagtctg ccttgccatc gaaatgggct gcgacgcggc agacatcggc 2160
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acttgtaccg acaaaaaaaa a 2241
<210>50
<211>747
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
<221>链
<222>(1)..(747)
<223>PID2的氨基酸序列
<400>50
His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu
1 5 10 15
Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala
20 25 30
Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ile Val Ile Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg
145 150 155 160
Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala
165 170 175
Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val
180 185 190
Gly Gly Leu Asn Ser Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala
195 200 205
Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu
210 215 220
Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro
225 230 235 240
Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala
245 250 255
Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu
260 265 270
Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala
275 280 285
Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr
290 295 300
Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys
305 310 315 320
Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala
325 330 335
Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu
340 345 350
Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala
355 360 365
Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln
370 375 380
Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala
385 390 395 400
Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys
405 410 415
Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile
420 425 430
Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys
435 440 445
Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu
450 455 460
Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val
465 470 475 480
Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys
485 490 495
Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn
500 505 510
Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr
515 520 525
Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val
530 535 540
Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu
545 550 555 560
Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys
565 570 575
Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val
580 585 590
Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe
645 650 655
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660 665 670
Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly
675 680 685
Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu
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705 710 715 720
Pro His Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly
725 730 735
Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys
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<210>51
<211>2256
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<22l>基因
<222>(1)..(2256)
<223>质粒pID3中的编码quimeric蛋白的核苷酸序列
<400>51
atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60
aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120
ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180
gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240
ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag ccgctcctaa agccgaagcg 300
gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360
ttcggcggtt ctgccgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420
tactccgctg catttgccgc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480
aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540
aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600
ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660
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ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780
gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840
cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900
ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960
gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020
ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080
cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 1140
gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200
ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260
gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320
atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380
ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440
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attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620
atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680
gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740
ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800
ccgcaaaaga aaaaaggatc caaagtgcgt atggagaaat tgagaatcaa gggaatgtca 1860
tacacgatgt gttcaggaaa gttttcaatt gacaaagaga tggcagaaac acagcatggg 1920
acaacagtgg tgaaagtcaa gtatgaaggt gctggagctc cgtgtaaagt ccccatagag 1980
ataagagatg taaacaagga aaaagtggtt gggcgtatca tctcatccac ccctttggct 2040
gagaatacca acagtgtaac caacatagaa ttagaacccc cctttgggga cagctacata 2100
gtgataggtg ttggaaacag cgcattaaca ctccattggt tcaggaaagg gagttccatt 2160
ggcaagatgt ttgagtccac atacagaggt gcaaaacgaa tggccattct aggtgaaaca 2220
gcttgggatt ttggttcggt tggtggctaa ggatcc 2256
<210>52
<211>744
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
<221>链
<222>(1)..(744)
<223>PID3的氨基酸序列
<400>52
His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu
1 5 10 15
Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala
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Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly
65 70 75 80
Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala
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Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala
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Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr
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165 170 175
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Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala
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290 295 300
Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met
305 310 315 320
Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met
325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
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Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu Lys Ala
405 410 415
Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met
420 425 430
Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln
435 440 445
Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr
515 520 525
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530 535 540
Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu Ala Ile
545 550 555 560
Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His Pro His
565 570 575
Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly Thr Cys
580 585 590
Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Lys Val Arg Met Glu
595 600 605
Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe
610 615 620
Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val
625 630 635 640
Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu
645 650 655
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Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu
675 680 685
Arg Pro Leu Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu
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Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu
705 710 715 720
Ser Thr Tyr Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Glu Thr Ala
725 730 735
Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly
740
<210>53
<211>2694
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(2694)
<223>质粒pD4D2中的编码quimeric蛋白的核苷酸序列
<400>53
atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60
aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120
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cgctacgatg ccgtattggt tgccgccggc cgcgcgccca acggcaaact catcagcgcg 1680
gaaaaagcag gcgttgccgt aaccgatcgc ggcttcatcg aagtggacaa acaaatgcgt 1740
accaatgtgc cgcacatcta cgccatcggc gacatcgtcg gtcagccgat gttggcgcac 1800
aaagccgttc acgaaggcca cgttgccgcc gaaaactgcg ccggccacaa agcctacttc 1860
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gcttccggcc gtgcgattgc caacggttgc gacaagccgt ttaccaagct gatttttgat 2040
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ggcgaagtct gccttgccat cgaaatgggc tgcgacgcgg cagacatcgg caaaaccatc 2160
cacccgcacc cgaccttggg cgaatccatc ggtatggcgg cggaagtggc attgggtact 2220
tgtaccgacc tgcctccgca aaagaaaaaa ggatccgaca ggctgagaat ggacaaacta 2280
cagctcaaag gaatgtcata ctctatgtgt acaggaaagt ttaaaattgt gaaggaaata 2340
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gccattttag gtgacacagc ctgggatttt gggtctctgg gtggttaagg atcc 2694
<210>54
<211>891
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
<221>链
<222>(1)..(891)
<223>PD4D2的氨基酸序列
<400>54
His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu
1 5 10 15
Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala
20 25 30
Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile
35 40 45
Thr Leu Asp Leu Asp Lys Val Arg Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Arg Pro Leu Asp Ser Tyr
130 135 140
Ile Val Ile Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg
145 150 155 160
Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala
165 170 175
Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val
180 185 190
Gly Gly Leu Leu Glu Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala
195 200 205
Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu
210 215 220
Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro
225 230 235 240
Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala
245 250 255
Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu
260 265 270
Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala
275 280 285
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Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys
565 570 575
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580 585 590
Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala
595 600 605
Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile
610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro
660 665 670
Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly
675 680 685
Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu
690 695 700
Ala Ile Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His
705 710 715 720
Pro His Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly
725 730 735
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755 760 765
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785 790 795 800
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