木霉菌厚垣孢子的生产方法.pdf

一种木霉菌厚垣孢子的生产方法，利用从作物根表土壤分离获得的木霉菌，采用控制营养条件、添加形成厚垣孢子促进剂，调节温度、pH值、接菌量、供氧量及搅拌速度等技术参数控制发酵条件使其产生厚垣孢子，首先将取自作物根际的木霉菌纯化后转移至试管斜面内作母菌种，然后在三角瓶内振荡培养为液体菌种，再经生产罐发酵制成厚垣孢子悬浮液。本发明所得的厚垣孢子具有寿命长、防效高、耐储存等优点，其制剂比分生孢子制剂可提高商品货价期一年以上。

1.  一种木霉菌厚垣孢子的生产方法，其特征在于包括如下具体步骤：
1)斜面母菌种制备：取作物根表土壤5-10克，加无菌水50-100毫升，经振荡后稀释1000-10000倍成稀释液；取马铃薯150-200克、葡萄糖15-20克、孟加拉红0.04-0.07克、硫酸链霉素0.03-0.04克、琼脂17-20克、水1000毫升，配制成菌种培养液；将稀释液与菌种培养液按0.1-1∶10-15的比例一起倒入培养皿内制成培养基平板，然后在25-28℃下培养48小时，经分离获得木霉菌菌株，经纯化后转移至试管斜面内作斜面母菌种；
2)二级菌种制备：取马铃薯150-200克、葡萄糖或蔗糖15-25克、水1000毫升，调pH值为6-6.5，配制成二级发酵培养液，分装在250-1000毫升三角瓶中，装液量为100-500毫升，在121℃下灭菌20-30分钟，在无菌室内将斜面母菌种转入摇瓶，摇床转速为150-170转/分，发酵温度28-30℃，发酵时间为3-4天，得到二级菌种；
3)生产罐发酵：厚垣孢子培养基配方为：马铃薯150-200克，葡萄糖或蔗糖15-20克，磷酸二氢钾1-2克，硫酸镁0.5-1克，色氨酸2-4克，果糖2-4克，植物油2-4克，自来水1000毫升；将厚垣孢子培养基在121℃下灭菌30-40分钟，二级菌种接菌量为2-5％，发酵温度为25-28℃，pH值为5-6.5，供氧量150-200kpa，搅拌速度为120-150转/分，发酵时间5-7天，获得木霉菌厚垣孢子悬浮液。

2、  按权利要求1方法得到的木霉菌厚垣孢子的应用，其特征在于将木霉菌厚垣孢子悬浮液以1∶4-5的比例与载体硅藻土、轻质碳酸钙、草炭充分吸附后制成生防制剂，再拌土200倍用于防治植物土传病害。

木霉菌厚垣孢子的生产方法
技术领域
本发明涉及一种用于防治植物病害的生防真菌_木霉菌(Trichodermaharzianum)厚垣孢子地生产方法，确切的说是一种通过控制营养条件及发酵条件使木霉菌产生厚垣孢子的方法。
背景技术
随着越来越多的有毒化学农药逐渐被限制使用，世界各国都在加大生物农药的研究开发力度，大力提倡研制、开发对人、畜无毒、对环境无污染的微生物农药已成为热点。木霉菌作为一类有重要生防价值的拮抗性真菌，早在三十年代就已经发现对植物病原真菌有拮抗作用，其作用机制包括产生抗生素、重寄生作用、溶菌作用、竞争作用等。木霉菌强烈的竞争及生存能力在抑制病原菌尤其是土传病害的过程中起着重要作用，是一种很有开发利用价值的生防菌种。目前国际上已开发注册的木霉菌产品已有10多个。但大多为分生孢子制剂，如我国山东省民丰实业有限公司生产的木霉菌(Trichoderma sp.)产品特立克，也是由其分生孢子制成的可湿性粉剂。由于各种技术原因，如产品性能不稳定，有效含量低等原因影响了该类产品在市场上的竞争能力外，其主要原因还是目前现有产品大多为木霉菌的分生孢子制剂，在贮藏过程中易受环境因子的影响缩短孢子寿命，导致生物防治活性的下降，施入土壤后不能在作物根部定植形成有效群体，整体防病效果不佳。这在很大程度上制约了木霉菌生物农药的规模化生产与推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于防治植物病害的木霉菌厚垣孢子的生产方法，以克服分生孢子制剂的孢子存活期短，商品货价期短，以及由其所带来的防治效果不稳定等问题。
为实现这样的目的，本发明采用的生防菌是取自于作物根际的木霉菌，将其纯化后转移至试管斜面内作母菌种，在三角瓶内振荡培养为二级液体菌种，再经生产罐发酵制成厚垣孢子悬浮液。方法中采用控制营养条件、添加形成厚垣孢子促进剂，调节温度、pH值、接菌量、供氧量及搅拌速度等技术参数控制发酵条件使其产生厚垣孢子。
本发明的方法具体包括如下步骤：
1.斜面母菌种制备
取作物根表土壤5-10克，加无菌水50-100毫升，经振荡后稀释1000-10000倍成稀释液。取马铃薯150-200克、葡萄糖15-20克、孟加拉红0.04-0.07克、硫酸链霉素0.03-0.04克、琼脂17-20克、水1000毫升，配制成母菌种培养液。将稀释液与母菌种培养液按0.1-1∶10-15的比例一起倒入培养皿内制成培养基平板，然后在25-28℃下培养48小时，经分离获得木霉菌菌株，经纯化后转移至试管斜面内作斜面母菌种。
其中母菌种培养液的制作方法为：将马铃薯去皮后切成1厘米见方的小块，加1000毫升水煮沸20-30分钟，用纱布滤去马铃薯块，加入琼脂，加水补足1000毫升，然后加入葡萄糖及孟加拉红并使之完全溶化后装入三角瓶灭菌，在121℃下30灭菌分钟，倒平板前加入硫酸链霉素。
其中试管斜面采用常规PDA培养基(马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、水1000毫升)。
2、二级菌种制备
取马铃薯150-200克、葡萄糖或蔗糖15-25克、水1000毫升，调pH值为6-6.5，配制成二级发酵培养液，然后分装在250-1000毫升三角瓶中，装液量为100-500毫升。在121℃下灭菌20-30分钟，在无菌室内将斜面母菌种转入摇瓶，摇床转速为150-170转/分，发酵温度28-30℃，发酵时间为3-4天，得到二级菌种。
其中二级发酵培养液的制作方法为：将马铃薯去皮后切成1厘米见方的小块，加1000毫升水煮沸20-30分钟，用纱布滤去马铃薯块，加水补足1000毫升，然后加入葡萄糖或蔗糖并使之完全溶化后，调pH值为6-6.5，
3、生产罐发酵
所采用的厚垣孢子培养基配方为：马铃薯150-200克，葡萄糖或蔗糖15-20克，磷酸二氢钾1-2克，硫酸镁0.5-1克，色氨酸2-4克，果糖2-4克，植物油2-4克，自来水1000毫升。将厚垣孢子培养基在121℃下灭菌30-40分钟，二级菌种接菌量为1-5％，发酵温度为25-28℃，调pH值为5-6.5，供氧量150-200kpa(千帕斯卡)，搅拌速度为120-150转/分，发酵时间5-7天，获得木霉菌厚垣孢子悬浮液。
其中厚垣孢子培养基的制作方法是将马铃薯去皮后切成1厘米见方的小块，加2-4倍体积的水煮沸20-30分钟，用纱布滤去马铃薯块，倒入发酵灌中，装液量根据发酵罐的大小确定，然后加入葡萄糖或蔗糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、色氨酸、果糖等并使之完全溶化，加水补足至所需用量。
按照本发明所提供的厚垣孢子培养基配方，调节温度、PH值、接菌量、供氧量等技术参数，通过液体发酵的方法可使95％以上的菌丝形成厚垣孢子。这种获得的大量的木霉菌厚垣孢子是真菌菌丝细胞膨大，原生质浓缩，细胞壁增厚而形成的圆形休眠孢子，内部储藏有较多的脂类物质，用以抵抗不良环境，抗逆性、土壤中竞争力和繁殖速度均很强，而且存活时间长，将其接种在灭菌的硅藻土中，在室温下可保藏3年以上，孢子仍然能够萌发。
将本发明所得的木霉菌厚垣孢子悬浮液以1∶4-5的比例与硅藻土、轻质碳酸钙、草炭等载体充分吸附后制成生防制剂，比分生孢子制剂可提高商品货价期一年以上，施入土壤后可存活数年。将此生防制剂拌土200倍用于防治植物土传病害，相对防治效果达60-70％，与分生孢子制剂相比对植物土传病害的防治效果可提高15％以上。
本发明适用于大多数木霉菌株的发酵，方法简单易行，适合于大规模工厂化生产，市场前景广阔。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1
1、斜面母菌种制备
取作物根表土壤5克，加无菌水50毫升，经振荡后稀释1000倍成稀释液，取0.1毫升稀释液与10毫升母菌种培养液一起倒入培养皿内制成培养基平板，其中母菌种培养液取：马铃薯150克、葡萄糖20克、孟加拉红0.05克、硫酸链霉素0.03克、琼脂17克、水1000毫升，制作方法为：将马铃薯去皮后切成1厘米见方的小块，加1000毫升水煮沸20分钟，用纱布滤去马铃薯块，加入琼脂，加水补足1000毫升，然后加入葡萄糖及孟加拉红并使之完全溶化后装入三角瓶灭菌，在121℃下灭菌30分钟，倒平板前加入硫酸链霉素。在25℃下培养48小时，经分离获得木霉菌菌株，经纯化后转移至由PDA培养基(马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、水1000毫升)制成的试管斜面内作母菌种。
2、二级菌种制备
二级发酵所采用的液体发酵培养液配方为马铃薯150克、蔗糖20克、水1000毫升，制作方法是将马铃薯去皮后切成1厘米见方的小块，加1000毫升水煮沸20分钟，用纱布滤去马铃薯块，加水补足1000毫升，调pH值为6.5，装入500毫升三角瓶中，装液量为200毫升，在121℃下灭菌30分钟，在无菌室内将斜面母菌种转入摇瓶，摇床转速170转/分，发酵温度26℃，发酵时间为4天，得到二级菌种。
3、生产罐发酵
所采用的厚垣孢子培养基配方为：马铃薯150克，葡萄糖15克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，色氨酸2克，果糖4克，植物油2克，自来水1000毫升。制作方法是根据发酵灌的大小确定装液量，将马铃薯去皮后切成1厘米见方的小块，加3倍体积的水煮沸20分钟，用纱布滤去马铃薯块，倒入发酵灌中，然后加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、色氨酸、果糖等并使之完全溶化，加水补足至所需用量，调pH值为6，在121℃下灭菌30分钟，接菌量为3％，发酵温度为25-26℃，供氧量150kpa，搅拌速度为120转/分，发酵时间6天。可使95％以上的菌丝形成厚垣孢子。
将所得木霉菌厚垣孢子悬浮液以1∶4的比例与硅藻土吸附后制成生防制剂，200倍拌土防治瓜类枯萎病，相对防治效果达70％以上。
实施例2
1、斜面母菌种制备
取作物根表土壤10克，加无菌水100毫升，经振荡后稀释10000倍成稀释液，取1毫升稀释液与15毫升母菌种培养液一起倒入培养皿内制成培养基平板，其中母菌种培养液取：马铃薯200克、葡萄糖20克、孟加拉红0.06克、硫酸链霉素0.04克、琼脂20克、水1000毫升，制作方法为：将马铃薯去皮后切成1厘米见方的小块，加1000毫升水煮沸30分钟，用纱布滤去马铃薯块，加入琼脂，加水补足1000毫升，然后加入葡萄糖及孟加拉红并使之完全溶化后装入三角瓶灭菌，在121℃下30灭菌分钟，倒平板前加入硫酸链霉素。在28℃下培养48小时，经分离获得木霉菌菌株，经纯化后转移至由PDA培养基(马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、水1000毫升)制成的试管斜面内作母菌种。
2、二级菌种制备
二级发酵所采用的液体发酵培养基配方为马铃薯200克、葡萄糖15克、水1000毫升，制作方法同斜面母菌种制备。调pH值为6.5，装入500毫升三角瓶中，装液量为200毫升，在121℃下灭菌30分钟，在无菌室内将斜面母菌种转入摇瓶，摇床转速150转/分，发酵温度28℃，发酵时间为4天，得到二级菌种。
3、生产罐发酵
所采用的厚垣孢子培养基配方为：马铃薯200克，蔗糖20克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁1克，色氨酸4克，果糖2克，植物油4克，自来水1000毫升。制作方法是根据发酵灌的大小确定装液量，将马铃薯去皮后切成1厘米见方的小块，加4倍体积的水煮沸30分钟，用纱布滤去马铃薯块，倒入发酵灌中，然后加入蔗糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、色氨酸、果糖等并使之完全溶化，加水补足至所需用量，调pH值为6.5，在121℃下灭菌40分钟，接菌量为5％，发酵温度为27-28℃，供氧量200kpa，搅拌速度为150转/分，发酵时间7天。可使95％以上的菌丝形成厚垣孢子。
将所得木霉菌厚垣孢子悬浮液以1∶5的比例与轻质碳酸钙充分吸附后制成生防制剂，200倍拌土防治茄子黄萎病等土传病害，相对防治效果达65％以上。