一种修饰的小干扰核酸及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种修饰的小干扰核酸及其制备方法。背景技术 RNA 干扰 (RNA interference， RNAi) 是由双链 RNA(double-stranded RNA， dsRNA) 分子在 mRNA 水平关闭同源基因的表达或使该基因表达沉默的现象。 RNA 干扰技术又被形象 地称为基因敲低 (knock-down) 或基因沉默 (gene silencing)， 是一种典型的转录后基因 调控方法， 又称转录后基因沉默 (post-transcriptional gene silencing， PTGS)。最早有 关 RNA 干扰的报道出现在 1990 年， 由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的 RNA 干扰现象， 以后又在线虫、 果蝇、 斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了 RNA 干扰现 象。 1999 年， Hamilton 和 Baulcombe 在发生 RNA 干扰的植物中检测到了长度为 21-25 个核苷 酸的 RNA 片段， 这些 RNA 片断被证明是 RNA 干扰所必需的， 被称为小干扰核酸 (siRNA)。 双链 siRNA 与细胞源性的相关酶和蛋白质形成 RNA 诱导的沉默复合体 (RNA-induced silencing complex， RISC)。在 RNA 干扰过程中， 双链 siRNA 中的正义链被排除出复合体， 反义链指导 RISC 结合到靶 mRNA 的同源位点， 然后由复合物中的核糖核酸酶 III 降解靶 mRNA， 从而关闭 靶基因的表达。
但是， 由于小干扰核酸 (siRNA) 的稳定性较差， 在体内容易被核酸酶降解， 因此人 们对合成的 siRNA 进行化学修饰， 以增加 siRNA 的血清稳定性， 从而有效地抑制目的基因的 表达。
目前， 由于人们对 siRNA 在血清中的降解过程和机制缺乏足够的了解， 只能依靠 各自的经验随机地选择 siRNA 分子中的多个核苷酸进行化学修饰。这种修饰策略虽然能很 好地提高 siRNA 分子的血清稳定性， 但由于缺乏理论的指导， 通常在 siRNA 分子中引入了过 量的修饰， 增加了修饰后的 siRNA 的潜在细胞毒性， 并在很多情况下降低了 siRNA 的生物学 活性， 因而制约了修饰后的 siRNA 在体内的应用。
另外， 在 siRNA 中盲目地在核苷酸中引入大量修饰的做法， 也限制了一些具有较 好稳定效果， 但细胞毒性相对较大的修饰方法在体内研究中的应用。
因此， 设计具有针对性的修饰方案， 通过最少的修饰来实现最优的稳定性目的是 目前迫切需要解决的问题。
发明内容 本发明的目的在于克服现有的 siRNA 的修饰方案中存在盲目地引入大量的修饰 从而导致得到的修饰的小干扰核酸细胞毒性大问题， 提供一种血清稳定的、 具有良好生物 活性的且细胞毒性较低的修饰的小干扰核酸。
本发明提供了一种修饰的小干扰核酸， 其包括第一片段和第二片段， 并且所述第 一片段和第二片段能够形成双链区域， 所述第一片段包括至少一个连续的 CA 序列或 UG 序 列， 所述第二片段包括至少一个与所述第一片段的 CA 序列或 UG 序列互补的连续的 UG 序列
或 CA 序列， 所述第一片段的 CA 序列或 UG 序列与所述第二片段的 UG 序列或 CA 序列形成 CA/ UG 位点， 其中， 所述 CA/UG 位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的， 该修饰使修饰的小干扰 核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸。
本发明通过对 CA/UG 位点进行特异性的修饰， 从而在仅引入少量修饰的情况下， 即可达到增加修饰后的小干扰核酸的血清稳定性的目的， 从而降低了修饰后的小干扰核酸 分子的潜在的细胞毒性， 以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响。 具体实施方式
本发明提供了一种修饰的小干扰核酸， 其包括第一片段和第二片段， 并且所述第 一片段和第二片段能够形成双链区域， 所述第一片段包括至少一个连续的 CA 序列或 UG 序 列， 所述第二片段包括至少一个与所述第一片段的 CA 序列或 UG 序列互补的连续的 UG 序列 或 CA 序列， 所述第一片段的 CA 序列或 UG 序列与所述第二片段的 UG 序列或 CA 序列形成 CA/ UG 位点， 其中， 所述 CA/UG 位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的， 该修饰使修饰的小干扰 核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸。
本发明的发明人对小干扰核酸分子在体内的降解过程进行了细致的研究， 发现在 CA/UG 位点中仅引入少量修饰的情况下， 即可提高修饰的小干扰核酸分子的稳定性， 大大降 低了由于随机地引入大量的修饰而导致的潜在细胞毒性较高， 以及修饰对小干扰核酸的生 物学活性的影响。
根据本发明， 所述的 “第一片段” 是指具有与基因编码链的序列全部或部分同源的 序列的核苷酸片段， 所述 “第二片段” 是指具有与基因编码链的序列互补的序列的核苷酸片 段。所述 “互补” 是指两个核苷酸在杂交条件下能够配对， 例如， 腺嘌呤 (A) 与胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U) 之间能够配对， 以及胞嘧啶 (C) 与鸟嘌呤 (G) 之间的配对。
根据本发明， 所述小干扰核酸分子的标靶可以为各种基因， 例如， 可以将在细胞 内的功能有待分析的基因作为标靶， 也可以将需要抑制其表达的基因作为标靶， 例如， 可 以以与疾病或紊乱相关的基因作为标靶， 如癌基因、 病毒基因、 细胞膜表面受体基因、 细 胞核受体基因或细胞信号传导通路上的基因等。本领域的技术人员根据其标靶基因， 能 够设计得到小干扰核酸分子 (siRNA)， 例如， 将目的基因的靶标序列或目的基因在 NCBI Genbank 中的序列号输入各种小干扰核酸设计程序， 如 Insert Design Tool for the shRNA Vectors(Ambion)、 shRNA Explorer(Gene Link)、 siDirect(Yuki Naito et al.University of Tokyo)、 SiRNA at Whitehead(Whitehead Institute for Biomedical Research)， BLOCK-iT RNAi Designer(invitrogen)、 RNAi Design(IDT)， RNAi Explorer(Gene Link)、 siRNA Target Finder(Ambion)、或 siSearch(Stockholm Bioinformatics Center) 等， 该设计程序将会根据设计者的要求和 siRNA 的设计原则， 针对所提供的基因或序列设计 siRNA。并且， 有些程序能够对设计好的 siRNA 做全基因组或 mRNA 转录组的同源性分析， 从 而设计出对靶基因或靶序列特异的 siRNA。上述提及的 siRNA 设计程序及其涉及的原则为 本领域技术人员所公知， 其全部内容在此一并引入作为参考。
根据本发明， 所述修饰的小干扰核酸包括多个 CA/UG 位点， 并且该多个 CA/UG 位点 中的至少一个核苷酸是经过修饰的。
此外， 所述 CA/UG 位点中， 只有反义链中的胞嘧啶核苷酸是经过修饰的。在这种情况下， 不但能够提高所述修饰的小干扰核酸的稳定性、 维持其生物活性， 还可以进一步减少 在修饰的小干扰核酸分子中引入的修饰数量， 从而进一步地降低修饰引起的小干扰核酸的 潜在细胞毒性。
根据本发明的一个方面， 所述修饰的小干扰核酸中， 除了所述 CA/UG 位点中的核 苷酸以外， 其它核苷酸是未经过修饰的。 在这种情况下， 不但能够提高所述修饰的小干扰核 酸的稳定性、 维持其生物活性， 还可以使在修饰的小干扰核酸分子中引入的修饰数量最小 化， 从而进一步地降低修饰引起的小干扰核酸的潜在细胞毒性。
根据本发明的另一个方面， 所述修饰的小干扰核酸中， 所述第一片段还可以包括 至少一个连续的 UA 序列， 所述第二片段还可以包括至少一个连续的与所述第一片段的 UA 序列互补的 UA 序列， 所述第一片段的 UA 序列与所述第二片段的 UA 序列形成 UA/UA 位点， 并且， 所述 UA/UA 位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的， 该修饰使 UA/UA 位点被修饰的小 干扰核酸的稳定性高于 UA/UA 位点未被修饰的小干扰核酸。本发明的发明人意外地发现， 当所述修饰的小干扰核酸的含有 CA/UG 位点和 UA/UA 位点时， 除了对 CA/UG 位点进行特异 性的修饰以外， 对 UA/UA 位点中的至少一个核苷酸进行特异性修饰， 不但能够降低细胞的 毒性， 还能够进一步提高含有 CA/UG 位点和 UA/UA 位点的小干扰核苷酸的稳定性。 在本发明的一种实施方式中， 本发明提供的修饰的小干扰核酸除了包括 CG/CA 位 点以外， 还可以多个 UA/UA 位点， 并且该多个 UA/UA 位点中的至少一个核苷酸是经过修饰 的。在优选的情况下， 所述 UA/UA 位点中， 只有一个尿嘧啶核苷酸是经过修饰的。
在一个优选的实施方式中， 本发明提供的修饰的小干扰核酸中， 除了所述 CA/UG 位点和 UA/UA 位点中的核苷酸以外， 其它核苷酸是未经过修饰的。在这种情况下， 不但能够 提高所述修饰的小干扰核酸的稳定性、 维持其生物活性， 还可以使在修饰的小干扰核酸分 子中引入的修饰数量最小化， 从而进一步地降低修饰引起的小干扰核酸的潜在细胞毒性。
根据本发明， 所述修饰的小干扰核酸可以为单链分子也可以为双链分子。
当所述修饰的小干扰核酸为单链分子时， 所述第一片段和第二片段之间的互补区 域形成双链区域。
当所述修饰的小干扰核酸为双链分子时， 该修饰的小干扰核酸包括正义链和反义 链， 所述正义链可以为连续的核苷酸链， 也可以为不连续的核苷酸链 ； 所述反义链为连续的 核苷酸链。
根据本发明的一个方面， 本发明提供的修饰的小干扰核酸包括正义链和反义链， 且所述正义链和反义链为连续的核苷酸链， 所述第一片段位于正义链， 所述第二片段位于 反义链。
根据本发明的另一个方面， 本发明提供的修饰的小干扰核酸包括正义链和反义 链， 所述正义链是包括两个或两个以上的正义链部分的不连续的核苷酸链 ； 所述反义链为 连续的核苷酸链 ； 所述第一片段位于一个或多个正义链部分， 所述第二片段位于反义链。
本发明中， 术语 “正义链” 是指当所述修饰的小干扰核酸为双链分子时， 具有与基 因编码链的序列全部或部分同源的序列的核苷酸片段， 所述 “第二片段” 是指指当所述修饰 的小干扰核酸为双链分子时， 具有与基因编码链的序列互补的序列的核苷酸片段。 并且， 当 所述修饰的小干扰核酸为双链分子且所述正义链和反义链为连续的核苷酸链时， 术语 “正 义链” 和 “第一片段” 可以互换使用， 术语 “反义链” 和 “第二片段” 可以互换使用。
本发明中， 术语 “正义链部分” 是指当所述正义链为不连续的核苷酸时， 用于组成 正义链的一部分核苷酸链 ； 在所述正义链中， 该正义链的所有正义链部分的总长度与所述 正义链的长度相等， 并且， 当所述正义链部分中包括 UA/UA 位点时， 术语 “正义链部分” 与 “第一片段” 可以互换使用。
根据本发明， 所述修饰的小干扰核酸可以由核糖核苷酸组成， 也可以为包括核糖 核苷酸和至少一个脱氧核糖核苷酸的杂合分子。
根据本发明， 术语 “潜在细胞毒性” 是指由于对核苷酸分子进行修饰而造成的对细 胞的毒性作用。
本发明中， 所述修饰的方式为本领域技术人员所公知， 例如， 本发明对所述小分子 干扰核酸进行的化学修饰为以下的一种或几种 ：
(1) 对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰 ；
(2) 对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的的修饰 ；
(3) 对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中碱基的修饰。
所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰， 包括硫代磷酸修饰 (Phosphorthioate) 和硼烷化磷酸盐修饰 (Boranophosphate)。如图所示分别用硫和硼烷 置换磷酸二酯键中的氧。两种修饰都能稳定小分子干扰核酸的结构， 保持碱基配对的高特 异性和高亲和力。而硼烷化磷酸盐修饰的小干扰核酸的疏水性强， 易于在血浆中形成水合 蛋白， 对人体的毒副作用低于硫代磷酸酯。
硫代磷酸修饰 硼烷化磷酸盐修饰
所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中羟基 (2′ -OH) 的修饰。在核糖的羟基位置引 入某些取代基如甲氧基或氟后， 使血清核糖核酸酶不易识别小干扰核酸， 增加了小干扰核 酸的稳定性。使小干扰核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。对核苷酸戊糖中羟基的修 饰包括 2′ - 氟修饰 (2′ -fluro modification) ； 2′ - 氧甲基修饰 (2′ -OME) ； 2′ - 甲氧 乙基修饰 (2′ -MOE) ； 2， 4′ - 二硝基苯酚修饰 (2′ -DNP modification) ； 锁核酸 (LNA) ； 2′ - 氨基修饰 (Amina modification) ； 2′ - 脱氧修饰 (2′ -Deoxy modification) 等等。
2′ - 氟修饰2′ - 氧甲基修饰
2′ - 甲氧乙基修饰2， 4′ - 二硝基苯酚修饰
锁核酸2′ - 氨基修饰2′ - 脱氧修饰
所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰， 如在尿嘧啶的 5 位点引入溴或碘的 5′ - 溴尿嘧啶 (5′ -bromo-uracil) 和 5′ - 碘尿嘧啶 (5′ -iodo-uracil) 修饰是常使 用的碱基修饰方法， 其他还有 N3- 甲基脲嘧啶 (N3-methyl-uracil) 修饰， 2， 6- 二氨基嘌呤 (2， 6-diaminopurine) 修饰等。
5′ - 溴尿嘧啶5′ - 碘尿嘧啶N3- 甲基脲嘧啶 2， 6- 二氨基嘌呤
优选情况下， 所述修饰为对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的 2’ -OH 的 修饰。进一步优选为， 所述修饰为所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的 2’ -OH 被甲 氧基或氟取代。上述修饰均可以增加所述小干扰核酸的血清稳定性， 增强其对血清核酸酶 水解的抵抗能力。
本发明还提供了一种修饰的小干扰核酸的制备方法， 其中， 该方法包括 ： 根据未修 饰的小干扰核酸的核苷酸序列， 并使用经过修饰核苷酸替代所述未修饰的小干扰核酸的核 苷酸序列中相应位置的核苷酸， 来合成修饰的小干扰核酸， 使得到的修饰的小干扰核酸包 括第一片段和第二片段， 并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域， 所述第一片段 包括至少一个连续的 CA 序列或 UG 序列， 所述第二片段包括至少一个与所述第一片段的 CA 序列或 UG 序列互补的连续的 UG 序列或 CA 序列， 所述第一片段的 CA 序列或 UG 序列与所述 第二片段的 UG 序列或 CA 序列形成 CA/UG 位点， 其中， 所述 CA/UG 位点中的至少一个核苷酸 是经过修饰的， 该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸。优选情况 下， 使得到的修饰的小干扰核酸的 CA/UG 位点中， 只有反义链中的胞嘧啶核苷酸是经过修 饰的。
根据本发明的一个方面， 本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法可以包 括： 根据未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列， 并使用经过修饰核苷酸替代所述未修饰的小 干扰核酸的核苷酸序列中相应位置的核苷酸， 来合成修饰的小干扰核酸， 使得到的修饰的 小干扰核酸包括一个 CA/UG 位点， 并且该一个 CA/UG 位点中的至少一个核苷酸是经过修饰 的。优选情况下， 使得到的修饰的小干扰核酸的 CA/UG 位点中， 只有反义链中的胞嘧啶核苷 酸是经过修饰的。
根据本发明的另一个方面， 本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法可以 包括 ： 根据未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列， 并使用经过修饰核苷酸替代所述未修饰的 小干扰核酸的核苷酸序列中相应位置的核苷酸， 来合成修饰的小干扰核酸， 使得到的修饰 的小干扰核酸包括多个 CA/UG 位点， 并且该多个 CA/UG 位点中的至少一个核苷酸是经过修
饰的。优选情况下， 使得到的修饰的小干扰核酸的 CA/UG 位点中， 只有反义链中的胞嘧啶核 苷酸是经过修饰的。
在一种优选的情况下， 本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得到的 修饰的小干扰核酸中， 除了所述 CA/UG 位点中的核苷酸以外， 其它核苷酸是未经过修饰的。
在另一种优选的情况下， 本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得到 的修饰的小干扰核酸的第一片段还包括至少一个连续的 UA 序列， 修饰的小干扰核酸的第 二片段还包括至少一个连续的与所述第一片段的 UA 序列互补的 UA 序列， 所述第一片段的 UA 序列与所述第二片段的 UA 序列形成 UA/UA 位点， 并且， 所述 UA/UA 位点中的至少一个核 苷酸是经过修饰的， 该修饰使 UA/UA 位点被修饰的小干扰核酸的稳定性高于 UA/UA 位点未 被修饰的小干扰核酸。
根据本发明的一个方面， 本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得到 的修饰的小干扰核酸除了包括 CA/UG 位点以外， 还包括一个 UA/UA 位点， 并且， 所述 UA/UA 位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的， 该修饰使 UA/UA 位点被修饰的小干扰核酸的稳定 性高于 UA/UA 位点未被修饰的小干扰核酸。
根据本发明的另一个方面， 本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得 到的修饰的小干扰核酸除了包括 CA/UG 位点以外， 还包括多个 UA/UA 位点， 并且， 所述 UA/UA 位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的， 该修饰使 UA/UA 位点被修饰的小干扰核酸的稳定 性高于 UA/UA 位点未被修饰的小干扰核酸。 本发明中， 本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得到的修饰的小干 扰核酸的结构为本领域技术人员所公知， 可以为各种小干扰核酸的存在结构。
例如， 根据本发明的一个方面， 本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法 使得到的修饰的小干扰核酸可以为发夹结构的单链分子， 所述第一片段和第二片段之间的 互补区域形成双链区域。
根据本发明的另一个方面， 本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得 到的修饰的小干扰核酸可以包括正义链和反义链， 所述正义链和反义链为连续的核苷酸 链， 所述第一片段位于正义链， 所述第二片段位于反义链。
根据本发明的另一个方面， 本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得 到的修饰的小干扰核酸可以包括正义链和反义链， 所述正义链是包括两个或两个以上的正 义链部分的不连续的核苷酸链 ； 所述反义链为连续的核苷酸链 ； 所述第一片段位于一个或 多个正义链部分， 所述第二片段位于反义链。
根据本发明的另一个方面， 本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得 到的修饰的小干扰核酸可以为为包括核糖核苷酸和至少一个脱氧核糖核苷酸的杂合分子。
本发明中， 合成小干扰核酸的方法可以为各种常规的小干扰核酸的合成方法， 或者委托专门从事核酸合成的生物技术公司合成， 如委托上海吉玛制药技术有限公司 (GenePharma)、 广州锐博生物科技有限公司、 或英俊生物技术有限公司 (invitrogen) 进行 合成。
一般来说， 用于合成小干扰核酸的方法包括以下四个过程 ： (1) 寡聚核糖核苷酸 的合成 ； (2) 脱保护 ； (3) 纯化分离 ； (4) 脱盐。
例如， 具有 SEQ ID NO ： 1 所示核苷酸序列的小干扰核酸化学合成的具体步骤如
下： (1) 寡聚核糖核苷酸的合成 ： 在自动 DNA/RNA 合成仪 ( 例如， Applied Biosystems EXPEDITE8909) 上设定合成 1 毫摩尔的 RNA， 同时设定每个循环的偶联时间为 10-15 分钟， 起始物为固相连接的 5’ -O- 对二甲氧基 - 胸苷支持物， 第一个循环在固相支持物上连接一 个碱基， 然后在第 n 次 (19 ≥ n ≥ 2) 循环中， 在第 n-1 次循环所连接的碱基上连接一个碱 基， 重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。
(2) 脱保护
将连接有小干扰核酸的固相支持物加入到试管中， 并在此试管中加入 1 毫升的乙 醇 / 乙胺 ( 体积比为 1 ∶ 3)， 然后密封， 置于 55-70℃温箱中， 孵育 2-30 小时， 取出连接有 小干扰核酸的固相支持物并用双蒸水淋洗 2 次 ( 每次 1 毫升 )， 收集洗脱液， 并在室温下干 燥 30 分钟。然后， 加入 1 毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液 (1M)， 室温放置 4-12 小时， 再 加入 2 毫升乙醇， 收集沉淀即得到小干扰核酸的粗产物。
(3) 纯化分离
将得到的小干扰核酸的粗产物溶解于 2 毫升浓度为 1 摩尔 / 毫升的乙酸铵水溶液 中， 然后通过 C18 高压液相色谱进行分离， 得到纯化的小干扰核酸产物。
(4) 脱盐
用浓度为 75 重量％的乙醇水溶液洗涤纯化的小干扰核酸产物 2-4 次 ( 每次 2 毫 升 )， 除去盐份， 并室温下干燥。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在 1-2 毫 升的缓冲液中 (10mM Tris， pH ＝ 7.5-8.0， 50mM NaCl)， 将此溶液加热至 95℃， 然后缓缓将 此溶液冷却至室温， 并维持室温 16-22 小时， 得到含有小干扰核酸的溶液。
上文中给出多种实施方式的目的仅为示例性地对本发明进行说明， 而不是为了限 制本发明的范围。
下面结合实施例进一步说明本发明， 除非特别说明， 本发明所用到的试剂、 培养基 均为市售商品。
实施例 1
选 取 下 表 1-55 中 的 基 因 为 靶 基 因， 并委托上海吉玛制药技术有限公司 (GenePharma) 合成表 1-55 中的 siRNA。
实施例 2
通过以下方法分别对表 1-55 中所示的 siRNA 进行血清稳定性检测、 基因沉默效率 检测和细胞毒性检测 ：
1. 血清稳定性检测
将 4μL 浓度为 20μM 的未修饰的和不同化学修饰小干扰核酸加入到含有 4μL 胎 牛血清和 32μL 1×PBS 溶液中， 血清的终浓度为 10％； 在 37℃条件下将反应体系孵育一定 的时间后取样， 一般为 0， 3 和 6 小时 ； 每次取 10μL 样本并进行液氮速冻， 以立即中止血清 核酸酶对 siRNA 的作用， 然后将样本保存于 -80℃条件下备用。
配 置 20 ％ 的 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶， 将 3μL 的 上 样 缓 冲 液 (30mM EDTA， 36 ％ 甘 油， 0.06％溴酚蓝 ) 与 siRNA 的降解样本进行混合， 然后上样， 在 80mA 的恒流条件下电泳。电 泳结束后， 用 1×Sybr Gold 染料 (Invitrogen， Cat.11494) 进行 10 分钟的染色后照相， 结 果如表 1-55 所示。
2. 基因沉默效率检测
将在 DMEM 培养基 (10 ％ FBS， 2mM L- 谷氨酰胺， 100 个单位 / 毫升的青霉素和 100μg/ml 的链霉素 ) 中培养的人胚胎肾细胞 (HEK293) 接种到 24 孔板中 (1×105 细胞 /0.5ml 培养基 / 孔 )。待细胞生长 24 小时后， 细胞的融合度为 50％左右时， 将培养基换为 Opti-MEM 培养基 (Gibco 公司 )。然后将带有 siRNA 分离靶位点的重组萤火虫荧光素酶报 告质粒和 pRL-TK( 编码海肾萤光素酶 ) 的对照质粒 (Promega 公司， Madison WI， USA) 与化 学合成的 siRNA 通过 Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司， 美国 ) 进行细胞转染， 每孔含 0.17g 重组质粒和 0.017g pRL-TK 对照质粒， siRNA 的终浓度为 13nM。每种 siRNA 平行转 染三个复孔， 以只转染同样量的两种报告基因质粒， 不转染 siRNA 的三个复孔作为对照。4 小时后再将转染介质换成 1ml DMEM 培养基 (10％ FBS， 2mM L- 谷氨酰胺， 100 个单位 / 毫升 的青霉素和 100μg/ml 的链霉素 )。24 小时后收获细胞， 以 10μl 细胞裂解液细胞， 利用双 荧光素酶报告基因分析系统 (Dual-Luciferase Assay System， Promega 公司 ) 和酶标仪 (Novostar， BMG Labtechnologies GmbH， Germany) 测定两种荧光酶的活性， 以未转染 siRNA 的孔中的报告基因的表达量作为标准对照， 通过以下公式计算得到 siRNA 对靶位点的沉默 效率， 结果如表 2 所示。每种 siRNA 每次实验平行做 3 个复孔， 每个实验重复 2 次， 结果如 表 1-55 所示。 沉默效率＝ ( 实验组 Firefly 荧光素酶的表达量 / 实验组 Renilla 荧光素酶表达 量 )/( 对照组 Firefly 荧光素酶的表达量 / 对照组 Renilla 荧光素酶表达量 )
3、 修饰 siRNA 的细胞毒性检测
将在 DMEM 培养基 (10 ％ FBS， 2mM L- 谷氨酰胺， 100 个单位 / 毫升的青霉素和 100μg/ml 的链霉素 ) 中培养的人胚胎肾细胞 (HEK293) 接种到 24 孔板中 (1×105 细胞 / 孔)； 待细胞生长 24 小时后， 细胞的融合度为 50％左右时， 将培养基换为 Opti-MEM 培养基 (Gibco 公司 ) ； 然后将化学合成的 siRNA 通过 Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司， 美 国 ) 进行细胞转染， siRNA 的终浓度为 13nM， 每种 siRNA 平行转染三个复孔， 无 siRNA 的三 个转染复孔作为对照 ； 4 小时后再将转染介质换成 1ml DMEM 培养基 (10％ FBS， 2mML- 谷氨 酰胺， 100 个单位 / 毫升的青霉素和 100μg/ml 的链霉素 ) ； 24 小时后吸去培养液， 用 PBS 洗 涤一次， 每孔加 1ml PBS 和 10μl MTT( 噻唑蓝 ) 染液， 在 37℃ 5％ CO2 的二氧化碳培养箱中 培养 4-6 小时 ； 每孔加 0.1ml 酸化异丙醇， 在振荡器上振荡混匀， 让还原产物充分溶解 ； 酶 联免疫检测仪测定 570nm 处各孔 A 值， 并按照以下公式计算细胞生长抑制率， 结果如表 1-55 所示。
细胞生长抑制率 ( ％ ) ＝ ( 对照组平均 A 值 - 实验组平均 A 值 )/ 对照组平均 A 值 ×100％。
表1
表2
表3表4
表5
表6
表7
表8表9
表 10
表 11
表 12
表 13表 14
表 15
表 16
表 17
表 18表 19
表 20
表 21
表 22
表 23表 24
表 25
表 26
表 27
表 28表 29
表 30
表 31
表 32
表 33表 34
表 35
表 36
表 37
表 38表 39
表 40
表 41
表 42
表 43表 44
表 45
表 46
表 47
表 48表 49
表 50
表 51
表 52
表 53表 54
表 55在上表 1-55 中 ：
黑体字母表示的 “A” 、 “U” 、 “G” 或” C” 字母表示经过修饰的核苷酸 ；
“+” 表示经血清孵育后， siRNA 主带完全消失， 可见明显的降解条带 ；
“++” 表示经血清孵育后， siRNA 主带虽有降解但仍清晰可见， 可见明显的降解条 带；
“+++” 表示经血清孵育后， siRNA 主带清晰未见降解， 未见明显的降解条带。
另外， 从上表 1-55 中可以看出， 与经过随机修饰的小干扰核酸相比， 本发明提供 的小干扰核酸在提高了稳定性的同时， 还显著地降低了小干扰核酸的细胞毒性， 并且对小 干扰核酸的表达抑制效率基本没有影响， 由此可见， 本发明在仅引入少量修饰的情况下， 即 可达到增加修饰后的小干扰核酸的血清稳定性的目的， 从而降低了修饰后的小干扰核酸分 子的潜在的细胞毒性， 以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学 <120> 一种修饰的小干扰核酸及其制备方法 <130>I10552PKU <160>10 <170>PatentIn version 3.3 <210>1 <211>1500 <212>DNA <213> 人类 (Homo sapiens BIC) <400>1 gccgagcccg ggcccagcgc cgcctgcagc ctcgggaagg gagcggatag cggagccccg agccgcccgc agagcaagcg cggggaacca aggagacgct cctggcactg cagataactt gtctgcattt caagaacaac ctaccagaga ccttacctgt caccttggct ctcccaccca atggagatgg ctctaatggt ggcacaaacc aggaagggga aatctgtggt ttaaattctt tatgcctcat cctctgagtg ctgaaggctt gctgtaggct gtatgctgtt aatgctaatc gtgatagggg tttttgcctc caactgactc ctacatatta gcattaacag tgtatgatgc ctgttactag cattcacatg gaacaaattg ctgccgtggg aggatgacaa agaagcatga gtcaccctgc tggataaact tagacttcag gctttatcat ttttcaatct gttaatcata atctggtcac tgggatgttc aaccttaaac taagttttga aagtaaggtt atttaaaaga tttatcagta gtatcctaaa tgcaaacatt ttcatttaaa tgtcaagccc atgtttgttt ttatcattaa cagaaaatat attcatgtca ttcttaattg caggttttgg cttgttcatt ataatgttca taaacacctt tgattcaact gttagaaatg tgggctaaac acaaatttct ataatatttt tgtagttaaa aattagaagg actactaacc tccagttata tcatggattg tctggcaacg ttttttaaaa gatttagaaa ctggtacttt cccccaggta acgattttct gttcaggcaa cttcagttta aaattaatac ttttatttga ctcttaaagg gaaactgaaa ggctatgaag ctgaattttt ttaatgaaat atttttaaca gttagcaggg taaataacat ctgacagcta atgagatatt ttttccatac aagataaaaa gatttaatca aaaaatttca tatttgaaat gaagtcccaa atctaggttc aagttcaata gcttagccac ataatacggt tgtgcgagca gagaatctac ctttccactt ctaagcctgt ttcttcctcc atatggggat aatactttac aaggttgttg tgaggcttag atgagataga gaattattcc ataagataat caagtgctac attaatgtta tagttagatt aatccaagaa ctagtcaccc tactttatta gagaagagaa aagctaatga tttgatttgc agaatattta aggtttggat ttctatgcag tttttctaaa taaccatcac ttacaaatat gtaaccaaac gtaattgtta gtatatttaa tgtaaacttg ttttaacaac tcttctcaac attttgtcca ggttattcac tgtaaccaaa taaatctcat gagtctttag ttgatttaaa ataaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa <210>2 <211>6047 <212>DNA <213> 人类 (Homo sapiens kazrin)3560 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500101851619 A CN 101851620
说cgatcgctgc ccgcctcgcc accggcgctg acaggtagag cctctctcgc ccgcatcgat cacggccacc gggagccgcg ccagcttgga ccttctccgg gtcctctgag gctagccaga cgagaagaca ggagcagctc ggtcaaagcg ccaagccaag caaccggatg gaccaaggac caaccaggag acagactctc cccctgccac gtcgtccaca cgacagtccc tcttgaagac cgtcttcgcc cagccagtgc ccggctgcag cgtccaggcc gaacgtgaag tggggtgtgc tgccgaggca ggcctggctg tgatgggcgg caagaagttc cagcagggag ggtgtggacc agacaacctg tgccgaggcc明书33/46 页<400>2 ggggtctcgg cctccccccg tgccggagga ggaggacaca ctctttgtca agctcgcgct gagccgaact gcccgggccc tggagaaccc aggaagttca agggcggcaa aggagcagga gcttaaaggg agagccgcga gcgaggatgc agctgcggcg acctcaagga tagctacgct tgctcaatgg ggcagagtca tcagggtgag aaggcgaccg tctgcaacgg cactagagga ccatctcccg atgactcgga agcagatgga aggcgggcac cctgcacgga agctgggcct actaccgtga gggtggccaa accacctggt tgaacgtgtc aagtgaactt ttgaccccgt aggagtacgc ccacattcaatcctcctcct accgccgcgg ccggtgcctg ccgggggtgc ccccaggcca ggggcggtcc aaccggagac gccagcgcct gcgcaagtgc cagatgaagg gtcctctcgg gccaaagaag gacctggtga cgagacttca ctggccaagg gaggccacag aaggagctgg gtccccaagc tgggtggtgc taccactcac tcccggcagc ccgagcgaca ggcccagttc caaaaacgga agagggaagc agccccacgc caggtggagc tggctggagg agcgggaagg agctccctgc ggccgcagcc aatgacattg atgctgaatt caccaggtca gccctccagg aaccagcggg accaacagcg atggccactgccttctcctc ctcttttttc tcctccgcct ctagggctgg aggcgccgct gtcattcctg ggggtcgggg cgcgggcgaa gccgggccgc ccggccgcgc gccccccgcg catcatgcag aaatcctgag catgatggaa gacaataagc agtcggccag ccaggaggtg accaacctgc tggcggaact gagcggcggc ggcggccccg cggcggcggg ggactcggcg gcgacgaaca tcctgcggga agaagtgtcg cggctccagg agatgttggc gaaggacctg gaggagtcgc ccaccgagct cagggtccag ctggcccaga ccttgcaggc catgaaagct gatcggaagc gccagatgca gcagctgtat gccacactgg tccgcaacta tgagcagcac cgcaaggaga agaaggacct gctggagcgt gagaagtggg accacgccac ggcactgcgc tcccagctgg aggccgagct ggccatggcc aaacagtcct ggcattccct cgccatgccg ggcgagacgg aggcggacct cccgctgacc gcagccatcc acccccctca ccctgcggac cggcaagcgg cctctgtcat ctccgacgca tctgccgccg tcaactcccc tcgacaccgg acacactccc agaagaacct gcacaaccct attgtacagt aaaagaagaa agagaagatg ggattcggct agcggaagtc cctcgacccc ggcctctttg ggcagagcct cagcctgtcg gaaggcgagg tggtgaggac cacccctatg tcccactgga tggtgatggc catgcctatg tacgtcaagg tgctgctgag cctgagtgac gaggacctgc accggcgcaa gctgcgcctg gccatcgagg tgtccaaagc tgccgagctg gaccatcact gcctgtccca gtactcccag gcctttcaga ccctgatgaa gcgagacctg gagaagcacc gcatcctgct ggggatcgag ctgctgtacc agcgccgggc ccgctgcgag acgcagaaca tgctcaagtg ggttcgagac atcgacctga gcgtccatgg tgctgtgctg gtgctggagc ccctgggcat ccccagtggg aagcacatcc60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 228036101851619 A CN 101851620
说cctggcagag tgagcgtttt gaacagcagc cttcagcagc cggagacgat ggaggtcacc aaggaagaga gaggatgtcc gcccaggaga agctggagat acaggctcca aacggagctg caggggggac agtgctgcct atcttaccct atgcaaaatc tgtttgccga aggagtgggg agctattggg gtggtttggc agtgtggcaa acctttgttg accgagacac ttttcttgac gcctcgatgt cacttgctaa gtagctaatt aggttgaagc cctccaacag actcaagcct gacggatgca ccatgatgct aacaggtgtc cctctcatgg gaccgtggtg tctagttggt caggtggtga catgacattc ggtgagacct明书cccagccaac ctccagcgtc ccggctgccc tgactatggc acagtgccgt ctccaccaga cgttctcact cgatggactc gtcttgggtg agtgtccggc tggagcagcc cagttcccta cccagtgcat ggcgggggtt gacttggctc tgacacatgg ctgagtgggg gagatgcaga cgacggcccc cactatctgc gggaaatgct acataggtga atttggtatt ggcttcttcc gttccctccc acctctcagg tgatatagag gaaatgttta cccatgagca cagatgacag cgggttatca tgcactgggg gcgtgtgttc acttgagaat gcagcctttc tcctaagggc ctttgttgag gaagctgcag ggtctctccc tccacaggca acgcgggcag ctggggaaga tctcttcaaa ctggaaggct cccaacgtga gtacatagcg tgcggtttca ggccatggac cctgcctcca aagcagtccc aaacaccctt tggcagagcc ggggaactct actgaatctc gggtggacgt agccggtgaa tatcctatca atatggtgaa actccgtgac tgacattgtt catagctcac ggtggggaga cagtggcctc agggacatcg agacaatggg ctagttcgct atgttcagac cagccttgaa ccacgtgatg aagcgagtca cttgagtttc ttcaacctgg tacacctctc ttgctgtctg acacttctga actccaaatt tccacagctc aagccacatc34/46 页tccggagaca tccgggaggc gaaaggagga taggaagggg acgaagattg acaacagcct gagacccagg gccgcaggct gctccacagc tttcctgttc tccaggatac tggagcctta ccggcgggag gggtgcagga cggctacagc tcttgggaga attgaagagc tgatccgtgc ccagaatgaa tctctggcct agtggtatgg aacccaacaa caatgtccta accccagccc acctctctgt tgaggattaa aagttatggg ccaactcttt ctgccaagag aaccagtttg attagggaag cttgttggaa caagattcac caaattgttt tcatgccgaa agaccaaatg tcctgggccc ccattatctt agaaaggagagagatgagcg ggaacgcccc ggtctcaagt aaagatcccg gacccccaga aacgtgtaag agccagatgg cttgctcctg gagaagacac gggcccagag cctcagagtg ccaaggtggg cccaacccca cttgccgaga tgactgagaa cttccacctg tccacccagg cttagcagcc acaacaggat tttactgaga tgagtttggg tgatgtccct aaactccaca ctgccactgt cttcatctac tatctgtaac tcccatttac agtgtgcaaa ggctcaagaa tcgggcctca ttgcgattct cgacctcctt agcctctgag gggaagccga ttccccctaa agacaggtgg atctctggca ggcctcatcc ccctccaaccccgtcttcca ctggcagggc acaaggctgg atttccatga gcaggctgga gaactggtgg ccccaggtgt ggcaaaatcc cagcccacct gacctgtcac accgtcactg aggaggccca caccccagcg cgtcggacag cttgggtcct aaaagctctg agtggctacg acatttctag cggggatgac ttccaaaccc gtctggggca gtcacctgaa gagcaaaatc tatgctgtgt gatacttctg acaatttgta aacacagaaa aggaagaaaa acatataaat gttcattgac gcttacacat caaggccgtt aaccctcaaa gctctgatga tgacataaac atgtttggcc tgtggcttgg atagggtcct tggtgccaca2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 462037101851619 A CN 101851620
说gacctgggac agttattccc ttgaaaccaa agacaagtgg ggaggccagc tgccatcaca tggagctggt cagattgagt gcaagaagaa agaggggcca cttggtccct ggaaagctgt ctttctgacc ttttggaaat ggagaagcca明书aggcagcaac agcagggcac aatggcactt gagacagtat aaccgcgaat ctccccatcc tggttgttaa acctgaaacg gagagactca tacatcctgt ggacctgggg ggagaaggca ccctttgtcc ctgttttcag aaagtggaga agcaacgtgc ttgaatgcag acatggttcg tgcccaaaat gcctcttttg ctgacagcca attaacaacc tcaactctgc agctgattgt ccaagcagcc acgatgtgga cctgcctggt ttggctgagc accccaggct gaagggcgtc35/46 页cagcctggat ccaggcaggc agctgatgat atcttgctgg gttcacagca gtttaaatta ggtgagcatt tccacagtat ttcaaggtcg cacaggctac cgagtgtggt tgcacttctt agactctcag cggacctttc gcagaggaggcccagaaact acagagtgag cgttcaccca acaattgggg aggcctgagg accctctttc ttctcaacat gagctttgtc cagaaggcgg gctccagaac gcagggcaat tgtagcttgt cccaggagcc ctgtctgtct cacaacaatcgccgtttggg ccagaattgt acttgtcaga gtcactggca caacacgggc acccatgagg gaggatgggt tgctggaaaa agacttggca agtgaccagc gtgggcatct gcctgtgggt tctgcgaggc gttggcatcg tggacccaat4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520tctacacagc ccggccagcg tggagggccc caggacaggg acccaaaagc ttgacgtcac 5580 tgaacagggc tgggtactgg cagaacagga agatttggcc agaggtgacc tcagtgttcc 5640 ctccaggggc atccaggccc ctctgacctg gggagaagaa ggcccatgct caggcccacc 5700 tccctcttcc catcagagcc catgcgtcct gggcaccacc acttccactc tgcttttcga 5760 ggctccggag ggctcttcct gctgtgaaag gaaaggagaa gaaagcctgt gggcaatggc 5820 aacctctgag tctggcattc ttgccaatgg ctggccagcg aggagaatct cccgagccct 5880 gacacacaaa ggcattttgt ggctgcagag gaaatgggtt ggctctgaac aaagatgcag 5940 tttctagggc cgtggcccca aatcgcttcc ccgagagtga attttaacac tgtaacaata 6000 aatactactg cacagcactt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 6047 <210>3 <211>2413 <212>DNA <213> 人类 (Homo sapiens CDKN1B) <400>3 cttcttcgtc agcctccctt ccaccgccat attgggccac taaaaaaagg gggctcgtct 60 tttcggggtg tttttctccc cctcccctgt ccccgcttgc tcacggctct gcgactccga 120 cgccggcaag gtttggagag cggctgggtt cgcgggaccc gcgggcttgc acccgcccag 180 actcggacgg gctttgccac cctctccgct tgcctggtcc cctctcctct ccgccctccc 240 gctcgccagt ccatttgatc agcggagact cggcggccgg gccggggctt ccccgcagcc 300 cctgcgcgct cctagagctc gggccgtggc tcgtcggggt ctgtgtcttt tggctccgag 360 ggcagtcgct gggcttccga gaggggttcg ggctgcgtag gggcgctttg ttttgttcgg 420 ttttgttttt ttgagagtgc gagagaggcg gtcgtgcaga cccgggagaa agatgtcaaa cgtgcgagtg tctaacggga gccctagcct ggagcggatg gacgccaggc aggcggagca ccccaagccc tcggcctgca ggaacctctt cggcccggtg gaccacgaag agttaacccg38480 540 ggacttggag aagcactgca gagacatgga agaggcgagc cagcgcaagt ggaatttcga 660 ttttcagaat cacaaacccc tagagggcaa gtacgagtgg caagaggtgg agaagggcag 720 cttgcccgag ttctactaca gacccccgcg gccccccaaa ggtgcctgca aggtgccggc 780 gcaggagagc caggatgtca gcgggagccg cccggcggcg cctttaattg gggctccggc 840 taactctgag gacacgcatt tggtggaccc aaagactgat ccgtcggaca gccagacggg 900 gttagcggag caatgcgcag gaataaggaa gcgacctgca accgacgatt cttctactca 960 aaacaaaaga gccaacagaa cagaagaaaa tgtttcagac ggttccccaa atgccggttc 1020 tgtggagcag acgcccaaga agcctggcct cagaagacgt caaacgtaaa 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ttctaaatcc 1920 ctcgatattt ttaaagatct gtaagtaact tcacattaaa aaatgaaata ttttttaatt 1980 taaagcttac tctgtccatt tatccacagg aaagtgttat ttttcaagga aggttcatgt 2040 agagaaaagc acacttgtag gataagtgaa atggatacta catctttaaa cagtatttca 2100 ttgcctgtgt atggaaaaac catttgaagt gtacctgtgt acataactct gtaaaaacac 2160 tgaaaaatta tactaactta tttatgttaa aagatttttt ttaatctaga caatatacaa 2220 gccaaagtgg catgttttgt gcatttgtaa atgctgtgtt gggtagaata ggttttcccc 2280 tcttttgtta aataatatgg ctatgcttaa aaggttgcat actgagccaa gtataatttt 2340 ttgtaatgtg tgaaaaagat gccaattatt gttacacatt aagtaatcaa taaagaaaac 2400 ttccatagct att 2413 <210>4 <211>600 <212>DNA <213> 黑猩猩 (Pan troglodytes SOD2) <400>4 atgaagcaca gcctccccga cctgccctac gactacggcg ccctggaacc tcacatcaac 60 gcgcagatca tgcagctgca ccacagcaag caccacgcgg cctacgtgaa taacctgaac 120 gtcaccgagg agaagtacca ggaggcgttg gccaagggag atgttacagc ccagatagct 180cttcagcctg cactgaagtt caatggtggt ggtcatatca atcatagcat tttctggaca aacctcagcc ctaacggtgg tggagaaccc aaaggggagt tgctggaagc catcaaacgt gactttggtt cctttgacaa gtttaaggag aagctgacgg ctgcatctgt tggtgtccaa ggctcaggtt ggggttggct tggtttcaat aaggaacggg gacacttaca aattgctgct tgtccaaatc aggatccact gcaaggaaca acaggcctta ttccactgct ggggattgat gtgtgggagc acgcttacta ccttcagtat aaaaatgtca ggcctgatta tctaaaagct atttggaatg taatcaactg ggagaatgta actgaaagat acatggcttg caaaaagtaa <210>5 <211>3233 <212>DNA <213> 恒河猴 (Macaca mulatta calcium-sensing receptor) <220> <221>misc_feature <222>(2570)..(2654) <223>n is a， c， g， or t <400>5 aaaacttctg ggagcctcca aactcctagc tgtcttgtcc ctcgccctgg agagaaggca gaaccatggc attttattgc tgcttctggg tcctcttggc actcacctgg cacacctctg cctatgggcc cgaccagcga gcccaaaaga aaggggacat tatacttggc gggctctttc ctattcattt tggagtagca gctaaagatc aagatctcaa atcaaggccg gagtctgtgg aatgcatcag gtataatttc cgtgggtttc gctggttaca ggctatgata tttgccatag aggagataaa cagcagccca gcccttcttc ccaacttgac gctgggatac aggatatttg acacttgcaa caccgtttct aaggccttgg aagccaccct gagttttgtt gctcaaaaca aaattgattc tttgaacctt gatgagttct gcaactgctc agagcacatt ccctctacga ttgctgtggt gggagcaact ggctcaggcg tctccacggc agtggcaaat ctgctggggc tcttctacat tccccaggtc agttacgcct cctccagcag actccttagc aacaagaatc aattcaagtc cttcctccga accatcccca atgatgagca ccaggccact gccatggcag acatcattga gtatttccgc tggaactggg tgggcacaat tgcagctgat gatgactatg ggcggccagg gattgagaag ttccgagagg aagctgagga aagggacatc tgcattgact tcagtgaact catctcccag tactctgatg aggaagagat ccagcatgtg gtggaggtga ttcaaaattc cacggccaaa gtaatcgtgg ttttctccag tggcccagac cttgagcccc tcatcaagga gattgtccgg cgcaatatca caggcaagat ctggctggcc agtgaggcct gggccagctc ctccctgatc gccatgcccg agtacttcca cgtggttgga ggcaccattg gatttgctct gaaggctggg cagatcccag gctttcggga attcctgaag aaggtccatc ccaggaagtc tgtccacaat ggttttgcca aggagttttg ggaagaaaca tttaactgcc acctccaaga aggtgccaaa ggacctttac ctgtggacac ctttctgaga ggtcacgaag aaagtggagg caggtttagc aacagttcga cagccttccg acccctctgt acaggggatg agaacatcag cagtgttgag accccttaca tagattacac acatttacgg atatcctaca atgtgtactt agcagtctac tccattgccc atgccttgca agatatatat acctgcttac40240 300 360 420 480 540 60060 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380101851619 A CN 101851620
说明书caagaaagtt tatgggggag caactggcac cgtctatgcc gttctccagg agggatcatt gtacagcgat tgagaaccac tgggattgca tgtgtttatc ccttctcctc ccaggactgg ctcgtgcatc cagcttccac cttcatgcag caaccacgag cctgggcttc caagtcccgg catcttcttc tgtctctgcn nnnnnnnnnn gcgttgcagc caacgtctcc ctccatcagc gcagcagccg ctcactgagc gaactccctg gctgcagtgc agtgggtgga agtgtccagt actgcattca gaggcgtggc caggtgacct ctctccccag aagaagggag gaggtgccct gagggggagc gagacagatg acctcctgca ctcaccctct aagttccgca ttctccctgc acttgccgcc ctggtgaaaa cgcaagtggt attgtcatct ctggaggatg ctgatcggct aagctgccag attgtctgga nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn accgcagctc cgcaagcggt agcaagagca ctgccaagat ttcgatgagc gaggcccaga ggggaagcgg gaccaccggc tcacagagct taa38/46 页ctgggagagg gctcttcacc aacggctcct aggtcctgaa gcacctacgg cacctaaact ttgatgagtg tggtgacctg gtggggaact aggatggctc catcgtgttt aaggaagtcg aaagactctt catcaacgag gagaaaatcc tctccaactg cagccgagac tgtctggcag ccacctgctg ctttgagtgt gtggagtgtc ccagtgcctg taacaagtgc ccagatgact ttgccaagga gatcgagttt ctgtcgtgga ttgccgtgct gggcattttc ctgacagcct acacgcccat cgtcaaggcc acgaaccgag tctgctgctt ctccagctcc ctgttcttca tgcgccaacc ggcctttggc atcagcttcg ccaaccgtgt cctcctggtg tttgaggcca gggggctcaa cctgcagttt ctgctggttt gtgtgatctg gctctacacc gcgcccccct agatcatctt catcacgtgc cacgagggct acacctgcct gctggctgcc atctgcttct agaacttcaa tgaagccaag ttcatcacct tctccttcat tccagcctat gccagcacct nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnccatcc cgcaacacca acgctttcaa ggtggctgcc cgggccacgc ccagcagcct tgggggctcc actggatcca acagcgaaga cccattccca cagcccgaga gcaagcagaa ggtcatcttc ggcagtggca ctcagaagaa cgccatggcc cacaggaatt aaagcagcga tacgctggcc cgacaccagg actcagatct gagcgtccaa gaaacaggtc cagaggtgga ggtccctgaa gagttgtccc ttgtcatcag cggtggagga agcactgtta <210>6 <211>2694 <212>DNA <213> 犬 (Canis BCL2-related) <400>6 gggggggggg ggccggactc aactctactg ctcaggagcg gctggctggc ggcggctggc aagagaaacg cagtaatccg gactcaactcgtgcagacat ttaccaacaa attccatcat ggtattacaa tgtggagtgg ggaccaggaa ctgatgggga tctggtccaa cagagccctt ttgtgctggg agctctccta ttggggagcc tgctctgcat agatccccac tcctctgcac caagctaccg cactcatggc tctttgcctt tcagcatgct acggcaagtt nnnnnnnnnn tcgaggaggt tgcgccgcag ccccctcctc ggcagaagca cggtcacctt ctacacacca cattactccc tgcaaggacc cagcacttgt cagaaaatgt1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3233tggagtcggg gccatccctc atttttctca tggcggcagg agctggcaat gtttggcctc tactgtgggg gggccgggct gggggccggc60 120 18041101851619 A CN 101851620
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