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用于欧洲油菜的新杂交系统.pdf

上传人：000****221 文档编号：1663195 上传时间：2018-07-02 格式：PDF 页数：131 大小：7.95MB
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摘要
申请专利号：

CN200880020023.1

 申请日：

2008.06.13
公开号：

CN101861390A

 公开日：

2010.10.13
当前法律状态：

终止

 有效性：

无权
法律详情：

专利权的视为放弃IPC(主分类):C12N 5/04放弃生效日:20101013|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/82申请日:20080613|||公开
IPC分类号：

C12N15/82

 主分类号：

C12N15/82
申请人：

先正达参股股份有限公司
发明人：

冈瑟·施蒂韦; 斯蒂芬·普莱尼斯; 马里·科克; 约翰尼斯·J·L·吉伦
地址：

瑞士巴塞尔
优先权：

2007.06.13 EP 07290741.3
专利代理机构：

北京市柳沈律师事务所 11105

 代理人：

张文辉
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内容摘要

本发明涉及一种欧洲油菜(Brassica napus)核条件性雄性不育系统。本发明的实施方案提供了预基础(雄性不育)雌性系(MsMsrfrf)、(雄性能育)保持系(msmsrfrf)、(雄性不育)基础雌性系(Msmsrfrf)和杂交系。进一步提供了用于生产那些品系的方法。本发明的进一步的实施方案涉及与不育性、能育性和保持系等位基因相关的标记，以及那些标记在提供杂交系统中的应用。

权利要求书

1： 一种生产或繁殖具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜品系的种子的方 法， 所述方法包括步骤 a) 提供具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物， 该基因型可获得自在 保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子， 其中所述条件性雄性不育欧洲油菜植物是 ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育等位基 因 (Ms 等位基因 ) 是纯合的， 和 v. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的保持系等位基因 (rf 等位基因 ) 是纯合的， 和 vi. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度时优势雄性不育， 和 vii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度时恢复优势雄性能育表型， b) 将所述条件性雄性不育欧洲油菜植物暴露于高于 35℃的温度至少 4 小时， 和 c) 将在步骤 (b) 中获得的热处理的条件性雄性不育欧洲油菜植物暴露于低于 33℃的 温度， 直至雄性能育花发育， 和 d) 使具有在步骤 (c) 中获得的所述雄性能育花的欧洲油菜植物自花传粉， 让种子发 育， 并收获种子， 其中所收获的种子特征在于它们是具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不 育欧洲油菜品系的种子。
2： 一种生产具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜品系的种子的方法， 所 述方法包括步骤 a) 提供作为雌性植株的具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜品系， 其 基因型可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子， 其中所述具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜雌性植株是 ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育等位基 因 (Ms) 是纯合的， 和 iii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保持系 等位基因 (rf 等位基因 ) 是纯合的， 和 iv. 在低于 28℃的温度下， 优势雄性不育， 和 v. 在高于 35℃的温度下， 恢复雄性能育表型， 和 b) 提供作为雄性植株的具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物， 其基因型可 获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子， 其中所述具有基因型 msmsrfff 的 欧洲油菜植物是 i. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子的能育等位基因 (ms 等位基因 ) 是纯合的， 和 ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保持系 等位基因 (rf 等位基因 ) 是纯合的， 和 iii. 优势雄性能育， 以及 c) 使步骤 b) 的雄性植株传粉给步骤 a) 的雌性植株， 让种子发育， 并收获种子， 其中收 获的种子特征在于它们是具有基因型 Msmsrfff 的条件性雄性不育欧洲油菜品系的种子。
3： 根据权利要求 2 的生产或繁殖具有基因型 Msmsrfff 的条件性雄性不育欧洲油菜品 系的种子的方法， 其中所述雄性植株系和所述雌性植株系基于基本上相同的遗传背景。 2
4： 根据权利要求 2 或 3 的生产或繁殖具有基因型 Msmsrfff 的条件性雄性不育欧洲油 菜品系的种子的方法， 其中所述雄性植株系和所述雌性植株系是通过将 Ms、 ms 和 / 或 rf 等 位基因基因渗入欧洲油菜近交系中， 然后通过与所述欧洲油菜近交系至少一次回交所提供 的。
5： 权利要求 4 的方法， 其中所述基因渗入包括选自分离和转化、 常规育种、 谱系选择 (pedigree breeding)、 杂交、 自花传粉、 单倍性、 双单倍体技术、 胚拯救、 单粒传法、 标记辅 助育种、 诱导突变和回交的方法。
6： 一种生产欧洲油菜的雄性能育杂种种子的方法， 所述方法包括步骤 a) 提供作为雌性植株的具有基因型 Msmsrfff 或 MsMsrfff 的条件性雄性不育欧洲油菜 植物， 其中所述条件性雄性不育欧洲油菜雌性植株是 v. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育等位基 因 (Ms 等位基因 ) 是杂合或纯合的， 和 vi. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保持系 等位基因 (Rf 等位基因 ) 是纯合的， 和 vii. 在低于 28℃的温度下优势雄性不育， 和 viii. 在高于 35℃的温度下恢复雄性能育表型， 和， b) 提供作为雄性植株的具有基因型 RfRf 的雄性能育欧洲油菜植物， 其中所述雄性能 育欧洲油菜植物是 i. 对于功能性恢复系等位基因 (Rf 等位基因 ) 是纯合的， 该等位基因可获得自任何被 商业化作为种子用于栽培的欧洲油菜能育近交系， 和 ii. 优势雄性能育， 和 c) 使步骤 b) 的雄性植株传粉给步骤 a) 的条件性雄性不育雌性植株， 让种子发育， 并收 获所述能育杂种种子。
7： 根据权利要求 6 的生产欧洲油菜的雄性能育杂种种子的方法， 其中所述 ( 雄性能 育 ) 雄性植株系和所述 ( 雄性不育 ) 雌性植株系基于遗传多样性背景和 / 或其中所述 ( 雄 性不育 ) 雌性系对于 Ms 等位基因是杂合的。
8： 根据权利要求 2-7 任一项的方法， 其中 ( 雄性不育 ) 雌性植株和 ( 雄性能育 ) 雄性 植株以交替带状生长和 / 或其中通过修剪或用生长延迟化学药品处理或通过与 ( 雄性不 育 ) 雌性植株相比播种 ( 雄性能育 ) 雄性植株延迟至多 3 周来延迟雄性植株开花。
9： 根据权利要求 2-8 任一项的方法， 其中所述方法在低于 28℃的温度下实施。
10： 一种生产欧洲油菜杂种种子的方法， 所述欧洲油菜杂种种子生长成产生籽粒的欧 洲油菜植物， 所述籽粒任选地具有不超过 25μmol/ 克 9％水分含量的风干种子的总芥子油 苷含量， 其中所述方法包括如在以下所请求保护的一种或多种方法 a) 权利要求 1， 和 b) 权利要求 2-5 任一项， 和 c) 权利要求 6-9 任一项。
11： 权利要求 1-10 任一项的方法， 其中 Ms 等位基因具有赋予条件性核雄性不育表型的 特征， 其 a) 通过暴露于高于 35℃的温度， 暂时恢复能育性， 3 b) 在至少一部分的 F1 植物中恢复能育性， 所述 F1 植物获得自具有基因型 MsMsrfrf 或 Msmsrfrf 的雄性不育植物与任何包含至少一个显性 Rf 等位基因的欧洲油菜植物的杂交， 和 c) 在 F1 植物中得以保持， 所述 F1 植物获得自具有所述 Ms 等位基因涉及的条件性雄性 不育表型的植物与来源于在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子的雄性能育植物的杂交。
12： 权利要求 1-11 任一项的方法， 其中 Ms 等位基因是存在于在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子中 Ms 等位基因或其遗传变体， 其赋予条件性雄性不育表型。
13： 权利要求 1-12 任一项的方法， 其中条件性雄性不育表型和 / 或 Ms 等位基因与选自 如下的一种或多种特性连锁和 / 或与之相关 I. 在具有 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型的植物中的芽败育表型， II. 在具有 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型的植物中的白色条纹或白色斑点花瓣表 型， 和 III. 在包含至少一个拷贝的 Ms 等位基因的雄性能育和雄性不育植物中存在 Ms 等位基 因特异性标记。
14： 权利要求 1-13 任一项的方法， 其中条件性雄性不育表型和 / 或 Ms 等位基因与选自 如下的一种或多种标记连锁和 / 或与之相关 I. 选自由如下组成的 NR1116 标记区中多态性组的标记 a) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 85 位的位置处的 A 的单核苷酸多态性标记， b) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 87 位的位置处的 G 的单核苷酸多态性标记， c) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 139 位的位置处的 A 的单核苷酸多态性标记， d) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 214 位的位置处的 C 的单核苷酸多态性标记， e) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 218 位的位置处的 G 的单核苷酸多态性标记， f) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 277 位的位置处的 G 的单核苷酸多态性标记， g) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 286 位的位置处的 A 的单核苷酸多态性标记， h) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 312 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标记， i) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 319 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标记， j) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 359 位的位置处的 C 的单核苷酸多态性标记， k) 在相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 221 位的位置处的 5′ -TTGGTGAACAATC-3′缺失突变， 和 l) 在相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 328-330 位的位置处的 5′ -GAA-3′插入突变 II. 选自由如下组成的 NR2525 标记区中多态性组的标记 a) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 60 位的位置处的 A 的单核苷酸多态性标记， b) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 92 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标记， c) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 105 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标记， d) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 158 位的位置处的 C 的单核苷酸多态性标记， e) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 431 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标记， f) 在相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 82 位的位置处的单核苷酸缺失突变， 和 g) 在相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 17-25 位的位置处的 5′ -TGAGCAAAA-3′缺失突变， III. 选自由下列组成的 SNP 标记组的标记 4 a) 在使用包含 SEQ ID NO ： 12 所示的核苷酸序列的 SNP- 探针的 SNP 检测中， 产生阳性 信号， 和使用包含 SEQ ID NO ： 11 所示的核苷酸序列的 SNP- 探针， 产生阴性信号， 和 b) 在使用包含 SEQ ID NO ： 17 所示的核苷酸序列的 SNP- 探针的 SNP 检测中， 产生阳性 信号， 和使用包含 SEQ ID NO ： 18 所示的核苷酸序列的 SNP- 探针， 产生阴性信号， IV. 选自由下列组成的 SSR 标记组的标记 ： a) 具有 96.7(+/-1.0)bp 的表观分子量的 PCR 片段， 该片段产生自使用具有 SEQ ID NOs ： 1 和 2 所示序列的引物的 PCR 反应， 和 b) 具有 192.8(+/-0.3)bp 的表观分子量的 PCR 片段， 该片段产生自使用具有 SEQ ID NOs ： 4 和 5 所示序列的引物的 PCR 反应， 和 V. 选自与 SEQ ID NOs ： 3、 6、 11 和 18 所示的至少一条序列连锁的标记组的标记， 其中一种或多种标记 (Ms 等位基因标记 ) 还包括选自如下序列的分离的核苷酸序列， 所述序列 IV. 与在上述 I.-V. 节中定义的标记序列具有至少 80％的序列同一性， 或 V. 在严格条件下与在上述 I.-V. 节中定义的标记序列杂交， 或 VI. 包含在上述 I.-V. 节中定义的标记序列的至少 25 个连续的核苷酸。
15： 权利要求 1-10 任一项的方法， 其中 ms 等位基因特征在于具有如下的表型特性 a) 不能恢复 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型的能育性， 和 b) 在不存在 Ms 等位基因的情况下， 不能赋予雄性不育表型。
16： 权利要求 1-10 和 15 任一项的方法， 其中 ms 等位基因与选自如下的一种或多种标 记连锁和 / 或与之相关 I. 选自由如下组成的 NR1116 标记区中多态性组的标记 a) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 85 位的位置处的 G 的单核苷酸多态性标记， b) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 87 位的位置处的 A 的单核苷酸多态性标记， c) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 139 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标记， d) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 214 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标记， e) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 218 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标记， f) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 277 位的位置处的 A 的单核苷酸多态性标记， g) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 286 位的位置处的 G 的单核苷酸多态性标记， h) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 312 位的位置处的 A 的单核苷酸多态性标记， i) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 319 位的位置处的 C 的单核苷酸多态性标记， j) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 359 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标记， k) 在相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 221 位的位置处的 5′ -TTGGTGAACAATC-3′插入突变， 和 l) 在相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 328-330 位的位置处的 5′ -GAA-3′缺失突变 II. 选自由如下组成的 NR2525 标记区中多态性组的标记 a) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 60 位的位置处的 C 的单核苷酸多态性标记， b) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 92 位的位置处的 C 的单核苷酸多态性标记， c) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 105 位的位置处的 C 的单核苷酸多态性标记， d) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 158 位的位置处的 A 的单核苷酸多态性标记， 5 e) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 431 位的位置处的 C 的单核苷酸多态性标记， f) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 82 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标记， 和 g) 在相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 17-25 位的位置处的 5′ -TGAGCAAAA-3′插入突变， III. 选自由下列组成的 SNP 标记组的标记 a) 在使用包含 SEQ ID NO ： 11 所示的核苷酸序列的 SNP- 探针的 SNP 检测中， 产生阳性 信号， 和使用包含 SEQ ID NO ： 12 所示的核苷酸序列的 SNP- 探针， 产生阴性信号， 和 b) 在使用包含 SEQ ID NO ： 18 所示的核苷酸序列的 SNP- 探针的 SNP 检测中， 产生阳性 信号， 和使用包含 SEQ ID NO ： 17 所示的核苷酸序列的 SNP- 探针， 产生阴性信号， IV. 选自由下列组成的 SSR 标记组的标记 ： a) 具有选自由 94(+/-0.9)bp、 110.4(+/-0.5)bp、 112.3(+/-0.4)bp 和 116.3(+/-0.4) bp 组成的表观分子量组的表观分子量的 PCR 片段， 该片段产生自使用具有 SEQ ID NOs ： 1和 2 所示序列的引物的 PCR 反应， 和 b) 具有 183.8(+/-0.4)bp 的表观分子量的 PCR 片段或无能育等位基因相关的 PCR 片 段， 该片段产生自使用具有 SEQ ID NOs ： 4 和 5 所示序列的引物的 PCR 反应， 其中一种或多种标记还包括选自如下序列的分离的核苷酸序列， 所述序列 a) 与在上述 I.-IV. 节中定义的标记序列具有至少 80％的序列同一性， 或 b) 在严格条件下与在上述 I.-IV. 节中定义的标记序列杂交， 或 c) 包含在上述 I.-IV. 节中定义的标记序列的至少 25 个连续的核苷酸。
17： 权利要求 1-10 任一项的方法， 其中 rf 等位基因具有如下表型特性的特征 a) 不能恢复 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型的能育性， 和 b) 能保持 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型。
18： 权利要求 1-10 和 17 任一项的方法， 其中 rf 等位基因选自 a) 可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的 rf 等位基因， 和 b) 以能保持 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型的纯合形式存在的其变体。
19： 权利要求 1-10、 17 和 18 任一项的方法， 其中 rf 等位基因与 SSR 标记连锁和 / 或与 之相关， 该 SSR 标记由具有 240.8(+/-0.4)bp 的表观分子量的 PCR 片段组成， 该 PCR 片段来 自使用具有如 SEQ ID NOs ： 19 和 20 所示序列的引物的 PCR 反应。
20： 权利要求 1-10 任一项的方法， 其中能育性恢复表型和 / 或 Rf 等位基因与选自如下 的一种或多种特性连锁和 / 或与之相关 a) 在获得自与在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子生长成的欧洲油菜植物杂交的 F1 植物中， 恢复能育性， 和 b) 在获得自与种子生长成的欧洲油菜植物杂交的 F1 植物中， 恢复能育性， 所述种子 获得自作为雄性不育雌性植株 (female male sterile plant) 的获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子的欧洲油菜植物与作为雄性能育植物的获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子的欧洲油菜植物的杂交。
21： 权利要求 1-10 和 20 任一项的方法， 其中 Rf 等位基因可获得自任何被商业化作为 种子用于栽培的欧洲油菜能育近交系。
22： 权利要求 1-21 任一项的方法， 其中 Rf 等位基因和 / 或 ms 等位基因可获得自市售 6 欧洲油菜能育近交系， 所述市售欧洲油菜能育近交系选自包括在 2006 年 12 月确认合格的 OECD 品种列表中的被商业化作为种子用于栽培目的的非杂种欧洲油菜品种。
23： 权利要求 1-10 和 20-22 任一项的方法， 其中能育性恢复表型和 / 或 Rf 等位基因与 SSR 标记连锁和 / 或与之相关， 所述 SSR 标记由缺少具有 240.8(+/-0.4)bp 的表观分子量的 PCR 片段的 SSR 标记组成， 所述 PCR 片段来自使用具有 SEQ ID NOs ： 19 和 20 所示序列的引 物的 PCR 反应。
24： 一种具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物， 该基因型可获得自在 保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子， 其中所述条件性雄性不育欧洲油菜雌性植 株是 i. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育等位基 因 (Ms 等位基因 ) 是纯合的， 和 ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保持系 等位基因 (rf 等位基因 ) 是纯合的， 和 iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度时， 优势雄性不育， 和 iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度时， 恢复优势雄性能育表型。
25： 权利要求 24 的植物， 其中所述条件性雄性不育植物可获得自通过权利要求 1 的方 法生产的种子。
26： 一种具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物， 其中所述条件性雄性 不育欧洲油菜雌性植株是 iii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育等位 基因 (Ms 等位基因 ) 是杂合的， iv. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保持系 等位基因 (rf 等位基因 ) 是纯合的， v. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度时， 优势雄性不育， 和 vi. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度时， 恢复优势雄性能育表型。
27： 权利要求 26 的植物， 其中所述条件性雄性不育植物可获得自通过权利要求 2 的方 法生产的种子。
28： 一种具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物， 该基因型可获得自在保藏编 号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子， 其中所述雄性能育欧洲油菜植物为 v. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子的能育等位基因 (ms 等位基因 ) 是纯合的， 和 vi. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保持系等位基因 (rf 等位基因 ) 是纯合的， 和 vii. 优势雄性能育。
29： 一种具有基因型 MsmsRfrf 或 msmsRfrf 的雄性能育欧洲油菜杂种植物， 其中所述雄 性能育欧洲油菜杂种植物为 i. 对功能性恢复系等位基因 (Rf 等位基因 ) 或保持系等位基因 ( 功能失常的恢复系等 位基因 ； rf 等位基因 ) 是杂合的， ii. 优势雄性能育， 和 7 iii. 任选地产生具有不超过 25μmol/ 克的由所述植物产生的 9％水分含量的风干种 子的总芥子油苷含量的籽粒。
30： 权利要求 24-29 任一项的植物， 其中 a)Ms 等位基因如权利要求 11-14 中任一项所定义的， 和 b)ms 等位基因如权利要求 15-16 任一项中所定义的， 和 c)rf 等位基因如权利要求 17-19 任一项中所定义的， 和 d)Rf 等位基因如权利要求 20-23 任一项中所定义的。
31： 权利要求 24-30 任一项的植物， 其中所述植物包含选自黄色种皮颜色、 除草剂抗 性、 生物胁迫抗性和非生物胁迫抗性的性状。
32： 权利要求 24-31 任一项的植物， 其中所述植物产生籽粒， 该籽粒产生具有选自如下 组成的油类 a) 小于 2％的芥子酸含量， b) 大于 45％的芥子酸水平， c) 大于 70％的油酸含量， d) 小于 8％的 α- 亚油酸含量， e) 小于 8％的亚麻酸含量， f) 小于 10％的饱和脂肪酸含量， g) 大于 20％的硬脂酸含量， h) 大于 10％的短链和中链脂肪酸含量， i) 大于 20％的棕榈酸含量， 和 j) 大于 10％的多不饱和脂肪酸含量。
33： 权利要求 24-32 任一项的芸苔属植物的部分， 选自种子、 小孢子、 原生质体、 细胞、 胚珠、 花粉、 营养体部分、 子叶和合子。
34： 一种产生如权利要求 24-32 任一项所请求保护的植物的欧洲油菜种子。
35： 一种生产欧洲油菜种子或籽粒的方法， 包括步骤 a) 播种通过权利要求 6-10 任一项的方法提供的杂种种子， b) 由所述种子生长成杂种欧洲油菜植物， 和 c) 收获所述植物的成熟种子或籽粒。
36： 一种生产欧洲油菜油和粕的方法， 包括步骤 a) 播种通过权利要求 6-10 任一项的方法提供的杂种种子， b) 由所述种子生长成杂种欧洲油菜植物， c) 收获所述植物的成熟种子或籽粒， d) 破碎所述种子或籽粒并由粕中分离或提取油。
37： 权利要求 36 的方法， 其中所述油具有选自由如下组成的组成 a) 小于 2％的芥子酸含量， b) 大于 45％的芥子酸水平， c) 大于 70％的油酸含量， d) 小于 8％的 α- 亚油酸含量， e) 小于 8％的亚麻酸含量， 8 f) 小于 10％的饱和脂肪酸含量， g) 大于 20％的硬脂酸含量， h) 大于 10％的短链和中链脂肪酸含量， i) 大于 20％的棕榈酸含量， 和 j) 大于 10％的多不饱和脂肪酸含量。
38： 使用欧洲油菜植物的方法， 包括步骤 ： 收获来自由通过权利要求 6-10 任一项的方 法提供的种子培育的芸苔属植物的种子， 以及种植所述种子以产生后代。
39： 权利要求 38 的方法， 进一步包括步骤 ： 重复种植收获的后代植物的种子的步骤。 40. 一种经营种子生意的方法， 包括步骤 a) 提供如权利要求 24-28 任一项所请求保护的种子生产植物给感兴趣生产杂种油菜 籽的育种人员， b) 让所述育种人员在许可下通过将步骤 (a) 中提供的所述植物与所述育种人员可获 得的雄性能育欧洲油菜品系杂交创建欧洲油菜杂种种子。 41. 根据权利要求 40 的方法， 其中步骤 (a) 中提供的种子生产植物是权利要求 26 或 27 的条件性雄性不育欧洲油菜植物。 42. 一种寡核苷酸引物， 选自 SEQ ID NOs ： 1、 2、 4、 5、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 和 20 所示序列。 43. 一种适合于检测单核苷酸多态性的探针， 包含作为核酸部分的选自 SEQ ID NOs ： 11、 12、 17 和 19 所示序列的序列。 44. 一种分离的核苷酸序列， 选自 a) 序列， 其 i) 与选自 SEQ ID NOs ： 3 和 6 所示序列的共有序列具有至少 80％的序列同一性， 或 ii) 在严格条件下与选自 SEQ ID NOs ： 3 和 6 所示序列的共有序列杂交， 或 iii) 包含选自 SEQ ID NOs ： 3 和 6 所示序列的共有序列的至少 25 个连续的核苷酸的 序列， 和 b) 序列， 其 i) 与选自 SEQ ID NOs ： 21、 22 和 23 所示序列的序列具有至少 80％的序列同一性， 或 ii) 在严格条件下与选自 SEQ ID NOs ： 21、 22 和 23 所示序列的序列杂交， 或 iii) 包含选自 SEQ ID NOs ： 21、 22 和 23 所示序列的序列的至少 25 个连续的核苷酸。 45. 一种在基于标记的选择中使用根据权利要求 42 或 44 的核酸序列用于将选自 Ms 等 位基因、 ms 等位基因、 Rf 等位基因和 / 或 rf 等位基因的等位基因基因渗入缺少所述等位基 因集合的芸苔种质中的方法。 46. 一种鉴定或表征根据权利要求 24-32 任一项的欧洲油菜植物的方法， 该方法包括 如下步骤 ： iii) 从要被测试的根据权利要求 24-32 任一项的植物或植物种群获得植物材料并从 所述材料中提取 DNA ； iv) 通过使用根据权利要求 42-44 任一项的核酸序列， 分析步骤 i) 中获得的 DNA 样品 以确定 Ms 等位基因、 ms 等位基因、 rf 等位基因和 / 或 Rf 等位基因的存在 / 不存在。 47. 一种使用根据权利要求 24-32 任一项的欧洲油菜植物生产杂种种子的方法。 9 48. 权利要求 47 的方法， 其中欧洲油菜植物选自由在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子培育的或来源于该种子的品种。 49. 一种在生产欧洲油菜能育杂种种子的方法中使用具有基因型 RfRf 的雄性能育欧 洲油菜植物的方法。 50. 权利要求 49 的方法， 其中所述生产能育杂种种子的方法是根据权利要求 6-8 任一 项的方法。 51. 具有基因型 RfRf 的雄性能育欧洲油菜植物在生产欧洲油菜能育的杂种种子的方 法中的用途。 52. 根据权利要求 51 的用途， 其中所述生产能育的杂种种子的方法是根据权利要求 6-9 任一项生产能育的杂种种子的方法。 53. 欧洲油菜植物在方法中的用途， 所述方法包括步骤 ： 由通过权利要求 6-10 任一项 的方法提供的种子生长成的芸苔属植物收获种子， 和种植所述种子以生产后代。 54. 根据权利要求 53 的用途， 进一步包括重复种植收获的后代植物种子步骤的步骤。 55. 根据权利要求 42 或 44 任一项的核酸序列在用于将选自 Ms 等位基因、 ms 等位基 因、 Rf 等位基因和 / 或 rf 等位基因的等位基因基因渗入缺少所述等位基因集合的芸苔种 质中的基于标记的选择中用途。 56. 在生产杂种种子的方法中使用一种或多种选自具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄 性不育欧洲油菜植物、 具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物或具有基因 型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物的欧洲油菜植物的方法。 57. 一种或多种选自具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物、 具有基因 型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物或具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜 植物的欧洲油菜植物在生产杂种种子的方法中的用途。 58. 根据权利要求 57 的用途， 其中具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植 物和具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物用于生产杂种种子的方法中。 59. 根据权利要求 56-58 任一项的用途， 其中所述方法是如权利要求 6-23 任一项中所 请求保护的方法。 60. 在生产具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物或其种子的方法中 使用一种或多种选自具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物和具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物的欧洲油菜植物的方法。 61. 一种或多种选自具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物和具有基 因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物的欧洲油菜植物在生产具有基因型 Msmsrfrf 的条 件性雄性不育欧洲油菜植物或其种子的方法中的用途。 62. 根据权利要求 61 的用途， 其中具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物用于 生产具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物或其种子的方法中。 63. 根据权利要求 60-62 任一项的用途， 其中所述方法是如权利要求 2-5、 8、 9 和 11-23 任一项中所请求保护的方法。
40： 8(+/-0.4)bp 的表观分子量的 PCR 片段组成， 该 PCR 片段来 自使用具有如 SEQ ID NOs ： 19 和 20 所示序列的引物的 PCR 反应。 20. 权利要求 1-10 任一项的方法， 其中能育性恢复表型和 / 或 Rf 等位基因与选自如下 的一种或多种特性连锁和 / 或与之相关 a) 在获得自与在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子生长成的欧洲油菜植物杂交的 F1 植物中， 恢复能育性， 和 b) 在获得自与种子生长成的欧洲油菜植物杂交的 F1 植物中， 恢复能育性， 所述种子 获得自作为雄性不育雌性植株 (female male sterile plant) 的获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子的欧洲油菜植物与作为雄性能育植物的获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子的欧洲油菜植物的杂交。 21. 权利要求 1-10 和 20 任一项的方法， 其中 Rf 等位基因可获得自任何被商业化作为 种子用于栽培的欧洲油菜能育近交系。 22. 权利要求 1-21 任一项的方法， 其中 Rf 等位基因和 / 或 ms 等位基因可获得自市售 6 欧洲油菜能育近交系， 所述市售欧洲油菜能育近交系选自包括在 2006 年 12 月确认合格的 OECD 品种列表中的被商业化作为种子用于栽培目的的非杂种欧洲油菜品种。 23. 权利要求 1-10 和 20-22 任一项的方法， 其中能育性恢复表型和 / 或 Rf 等位基因与 SSR 标记连锁和 / 或与之相关， 所述 SSR 标记由缺少具有 240.8(+/-0.4)bp 的表观分子量的 PCR 片段的 SSR 标记组成， 所述 PCR 片段来自使用具有 SEQ ID NOs ： 19 和 20 所示序列的引 物的 PCR 反应。 24. 一种具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物， 该基因型可获得自在 保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子， 其中所述条件性雄性不育欧洲油菜雌性植 株是 i. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育等位基 因 (Ms 等位基因 ) 是纯合的， 和 ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保持系 等位基因 (rf 等位基因 ) 是纯合的， 和 iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度时， 优势雄性不育， 和 iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度时， 恢复优势雄性能育表型。 25. 权利要求 24 的植物， 其中所述条件性雄性不育植物可获得自通过权利要求 1 的方 法生产的种子。 26. 一种具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物， 其中所述条件性雄性 不育欧洲油菜雌性植株是 iii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育等位 基因 (Ms 等位基因 ) 是杂合的， iv. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保持系 等位基因 (rf 等位基因 ) 是纯合的， v. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度时， 优势雄性不育， 和 vi. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度时， 恢复优势雄性能育表型。 27. 权利要求 26 的植物， 其中所述条件性雄性不育植物可获得自通过权利要求 2 的方 法生产的种子。 28. 一种具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物， 该基因型可获得自在保藏编 号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子， 其中所述雄性能育欧洲油菜植物为 v. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子的能育等位基因 (ms 等位基因 ) 是纯合的， 和 vi. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保持系等位基因 (rf 等位基因 ) 是纯合的， 和 vii. 优势雄性能育。 29. 一种具有基因型 MsmsRfrf 或 msmsRfrf 的雄性能育欧洲油菜杂种植物， 其中所述雄 性能育欧洲油菜杂种植物为 i. 对功能性恢复系等位基因 (Rf 等位基因 ) 或保持系等位基因 ( 功能失常的恢复系等 位基因 ； rf 等位基因 ) 是杂合的， ii. 优势雄性能育， 和 7 iii. 任选地产生具有不超过 25μmol/ 克的由所述植物产生的 9％水分含量的风干种 子的总芥子油苷含量的籽粒。 30. 权利要求 24-29 任一项的植物， 其中 a)Ms 等位基因如权利要求 11-14 中任一项所定义的， 和 b)ms 等位基因如权利要求 15-16 任一项中所定义的， 和 c)rf 等位基因如权利要求 17-19 任一项中所定义的， 和 d)Rf 等位基因如权利要求 20-23 任一项中所定义的。 31. 权利要求 24-30 任一项的植物， 其中所述植物包含选自黄色种皮颜色、 除草剂抗 性、 生物胁迫抗性和非生物胁迫抗性的性状。 32. 权利要求 24-31 任一项的植物， 其中所述植物产生籽粒， 该籽粒产生具有选自如下 组成的油类 a) 小于 2％的芥子酸含量， b) 大于 45％的芥子酸水平， c) 大于 70％的油酸含量， d) 小于 8％的 α- 亚油酸含量， e) 小于 8％的亚麻酸含量， f) 小于 10％的饱和脂肪酸含量， g) 大于 20％的硬脂酸含量， h) 大于 10％的短链和中链脂肪酸含量， i) 大于 20％的棕榈酸含量， 和 j) 大于 10％的多不饱和脂肪酸含量。 33. 权利要求 24-32 任一项的芸苔属植物的部分， 选自种子、 小孢子、 原生质体、 细胞、 胚珠、 花粉、 营养体部分、 子叶和合子。 34. 一种产生如权利要求 24-32 任一项所请求保护的植物的欧洲油菜种子。 35. 一种生产欧洲油菜种子或籽粒的方法， 包括步骤 a) 播种通过权利要求 6-10 任一项的方法提供的杂种种子， b) 由所述种子生长成杂种欧洲油菜植物， 和 c) 收获所述植物的成熟种子或籽粒。 36. 一种生产欧洲油菜油和粕的方法， 包括步骤 a) 播种通过权利要求 6-10 任一项的方法提供的杂种种子， b) 由所述种子生长成杂种欧洲油菜植物， c) 收获所述植物的成熟种子或籽粒， d) 破碎所述种子或籽粒并由粕中分离或提取油。 37. 权利要求 36 的方法， 其中所述油具有选自由如下组成的组成 a) 小于 2％的芥子酸含量， b) 大于 45％的芥子酸水平， c) 大于 70％的油酸含量， d) 小于 8％的 α- 亚油酸含量， e) 小于 8％的亚麻酸含量， 8 f) 小于 10％的饱和脂肪酸含量， g) 大于 20％的硬脂酸含量， h) 大于 10％的短链和中链脂肪酸含量， i) 大于 20％的棕榈酸含量， 和 j) 大于 10％的多不饱和脂肪酸含量。 38. 使用欧洲油菜植物的方法， 包括步骤 ： 收获来自由通过权利要求 6-10 任一项的方 法提供的种子培育的芸苔属植物的种子， 以及种植所述种子以产生后代。 39. 权利要求 38 的方法， 进一步包括步骤 ： 重复种植收获的后代植物的种子的步骤。 40. 一种经营种子生意的方法， 包括步骤 a) 提供如权利要求 24-28 任一项所请求保护的种子生产植物给感兴趣生产杂种油菜 籽的育种人员， b) 让所述育种人员在许可下通过将步骤 (a) 中提供的所述植物与所述育种人员可获 得的雄性能育欧洲油菜品系杂交创建欧洲油菜杂种种子。
41： 根据权利要求 40 的方法， 其中步骤 (a) 中提供的种子生产植物是权利要求 26 或 27 的条件性雄性不育欧洲油菜植物。
42： 一种寡核苷酸引物， 选自 SEQ ID NOs ： 1、 2、 4、 5、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 和 20 所示序列。
43： 一种适合于检测单核苷酸多态性的探针， 包含作为核酸部分的选自 SEQ ID NOs ： 11、 12、 17 和 19 所示序列的序列。
44： 一种分离的核苷酸序列， 选自 a) 序列， 其 i) 与选自 SEQ ID NOs ： 3 和 6 所示序列的共有序列具有至少 80％的序列同一性， 或 ii) 在严格条件下与选自 SEQ ID NOs ： 3 和 6 所示序列的共有序列杂交， 或 iii) 包含选自 SEQ ID NOs ： 3 和 6 所示序列的共有序列的至少 25 个连续的核苷酸的 序列， 和 b) 序列， 其 i) 与选自 SEQ ID NOs ： 21、 22 和 23 所示序列的序列具有至少 80％的序列同一性， 或 ii) 在严格条件下与选自 SEQ ID NOs ： 21、 22 和 23 所示序列的序列杂交， 或 iii) 包含选自 SEQ ID NOs ： 21、 22 和 23 所示序列的序列的至少 25 个连续的核苷酸。
45： 一种在基于标记的选择中使用根据权利要求 42 或 44 的核酸序列用于将选自 Ms 等 位基因、 ms 等位基因、 Rf 等位基因和 / 或 rf 等位基因的等位基因基因渗入缺少所述等位基 因集合的芸苔种质中的方法。
46： 一种鉴定或表征根据权利要求 24-32 任一项的欧洲油菜植物的方法， 该方法包括 如下步骤 ： iii) 从要被测试的根据权利要求 24-32 任一项的植物或植物种群获得植物材料并从 所述材料中提取 DNA ； iv) 通过使用根据权利要求 42-44 任一项的核酸序列， 分析步骤 i) 中获得的 DNA 样品 以确定 Ms 等位基因、 ms 等位基因、 rf 等位基因和 / 或 Rf 等位基因的存在 / 不存在。
47： 一种使用根据权利要求 24-32 任一项的欧洲油菜植物生产杂种种子的方法。 9
48： 权利要求 47 的方法， 其中欧洲油菜植物选自由在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子培育的或来源于该种子的品种。
49： 一种在生产欧洲油菜能育杂种种子的方法中使用具有基因型 RfRf 的雄性能育欧 洲油菜植物的方法。
50： 权利要求 49 的方法， 其中所述生产能育杂种种子的方法是根据权利要求 6-8 任一 项的方法。
51： 具有基因型 RfRf 的雄性能育欧洲油菜植物在生产欧洲油菜能育的杂种种子的方 法中的用途。
52： 根据权利要求 51 的用途， 其中所述生产能育的杂种种子的方法是根据权利要求 6-9 任一项生产能育的杂种种子的方法。
53： 欧洲油菜植物在方法中的用途， 所述方法包括步骤 ： 由通过权利要求 6-10 任一项 的方法提供的种子生长成的芸苔属植物收获种子， 和种植所述种子以生产后代。
54： 根据权利要求 53 的用途， 进一步包括重复种植收获的后代植物种子步骤的步骤。
55： 根据权利要求 42 或 44 任一项的核酸序列在用于将选自 Ms 等位基因、 ms 等位基 因、 Rf 等位基因和 / 或 rf 等位基因的等位基因基因渗入缺少所述等位基因集合的芸苔种 质中的基于标记的选择中用途。
56： 在生产杂种种子的方法中使用一种或多种选自具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄 性不育欧洲油菜植物、 具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物或具有基因 型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物的欧洲油菜植物的方法。
57： 一种或多种选自具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物、 具有基因 型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物或具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜 植物的欧洲油菜植物在生产杂种种子的方法中的用途。
58： 根据权利要求 57 的用途， 其中具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植 物和具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物用于生产杂种种子的方法中。
59： 根据权利要求 56-58 任一项的用途， 其中所述方法是如权利要求 6-23 任一项中所 请求保护的方法。
60： 在生产具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物或其种子的方法中 使用一种或多种选自具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物和具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物的欧洲油菜植物的方法。
61： 一种或多种选自具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物和具有基 因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物的欧洲油菜植物在生产具有基因型 Msmsrfrf 的条 件性雄性不育欧洲油菜植物或其种子的方法中的用途。
62： 根据权利要求 61 的用途， 其中具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物用于 生产具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物或其种子的方法中。
63： 根据权利要求 60-62 任一项的用途， 其中所述方法是如权利要求 2-5、 8、 9 和 11-23 任一项中所请求保护的方法。

说明书


用于欧洲油菜的新杂交系统

    发明领域 本发明涉及一种欧洲油菜 (Brassica napus) 核条件性雄性不育系统。本发明的 实施方案提供了预基础 (prebasic)( 雄性不育 ) 雌性系 (MsMsrfrf)、 ( 雄性能育 ) 保持系 (msmsrfrf)、 基础 ( 雄性不育 ) 雌性系 (Msmsrfrf) 和杂交系。进一步提供了用于生产那些 品系的方法。本发明的进一步的实施方案涉及与不育性、 能育性和保持系等位基因分别相 关的标记， 以及那些标记在提供杂交系统中的应用。
     发明背景
     来自芸苔属植物的含油种子是一种愈加重要的农作物。作为植物油的来源， 在商 业重要性上其目前仅排在大豆和棕榈之后， 与向日葵相当。其油被用作为色拉油和烹饪用 油， 并且在生物燃料 ( 生物柴油 ) 中起着日益重要的作用。
     芸苔油 (Brassica oil) 即菜籽油 (rapeseed oil) 最初由于其相对高水平的芥子 酸， 因此对人有害。芥子酸通常以基于总脂肪酸含量的 30-50％ ( 重量 ) 的浓度存在于自 然栽培品种中。当植物科学家鉴定到低芥子酸种质时 (Stefansson， 1983)， 就克服了该问 题。尽管在它们的总脂肪酸组成中具有小于 2％的芥子酸 ( 一致的零点精度 (single zero quality)) 的这些品种出产食用油， 但在高蛋白质粕 (meal) 中称为芥子油苷 (GSLs) 的含 硫化合物的持续存在仍然是进一步市场扩张的主要约束。由于种子中存在 GSLs， 因此阻碍 了油菜籽粕被广泛接受用于动物营养。此外， 由于在提炼油过程中在酶裂解下以及在破碎 过程中通过内源性酶——黑芥子酶作用消化下， 芥子油苷可导致抗营养分解产物 ( 例如硫 氰酸盐、 异硫氰酸盐和亚硝酸盐 ) 的产生， 因此它们也是不希望有的。结果， 开发了所谓的 “双低” 品种 ( 在油中低芥子酸以及在提炼油后在固体粕中低芥子油苷 )， 其具有基于总脂
     肪酸含量的小于 2％ ( 重量 ) 的芥子酸含量， 以及小于 30μmol/g 无油粕的芥子油苷含量。 在加拿大首先开发了这些油菜优质品种， 被称为双低油菜 (canola)。 目前， 欧洲法律所允许 的最大阈值为通过 HPLC 所测量的， 25μmol 总芥子油苷 (GSL)/ 克 (g) 种子 (8.5％水分含 量 )(EU 法令 2294/92)。当通过 TMS 测量时， 在加拿大栽培的双低春油菜 (spring canola) 品种必须具有小于 30μmol GSLs/g 风干的无油粕 (0％水分含量 ) 的 GSL 水平。在欧洲和 加拿大所通常栽培的双零油菜品种的 GSL 水平明显低于阈值水平， 为官方阈值水平的 60％ 或甚至更低。然而， 为了登记双低油菜品种， 许多国家需要甚至更低的芥子油苷水平。
     此外， 植物科学家已尝试改良菜籽油的脂肪酸组成 (1984 ； Ratledge等， 1984 ； 1975 ； Rakow&McGregor， 1973)。
     尤 其 是， 在 温 带 农 业 区 中 冬 油 菜 ( 欧 洲 油 菜 (Brassica napus L.ssp. oleifera(Metzg.))， 十字花科 ) 是一种重要的含油种子生产作物。在德国， 在 2006 年大约 1.5 百万公顷 (12％的总农业区 ) 播种油菜。
     油 菜 (oilseed rape) 是 一 种 具 有 约 1/3 远 交 的 优 势 自 花 传 粉 作 物 (Becker 等， 1992)。油菜籽植物的育种业已集中于通过利用所述植物的高自交亲和性所得到 的开放传粉种子。在杂种栽培品种开发中， 对该用于油菜种子生产的显著的杂种优势 产生了兴趣 (Riaz 等， 2001)。杂种优势意味着通过两个遗传学上不同的、 纯合基因型杂交得到的杂种与它们的亲本相比， 具有生长和产量优势 (Shull， 1922)。油菜籽杂种 在产量上总显示显著的杂种优势。在油菜籽杂交育种初期， 多位作者报道了对于欧洲 油菜 (Brassica napus L.)F1 杂种的种子产量值得考虑的杂种优势 (Schuster， 1969 ； 1985 ； Grant&Beversdorf， 1985 ； Lefort-Buson 等， 1987 ； Brandle&McVetty， 1989 ； Paulmann&Frauen， 1991 ； Stefansson， 1983 ； Brandle&McVetty， 1990 ； Shen， 2005)。 大 体上， 在春油菜籽中杂种优势水平可高达 20％ -30％， 以及在冬油菜籽中为约 30％ -40％。
     杂种种子的有效生产既需要鉴定杂种优势群 (heterotic groups)( 遗传上差异基 因库 ； Melchinger&Gumber， 1998， Becker&Link， 2000) 又需要一种用于那些杂种优势群定 向杂交的方法。
     在冬油菜中， 在欧洲登记的一代杂种品种是使用 INRA ogura 体系的杂交系组合以 及使用 MSL 体系的全恢复的杂种 ( 详见下文 )。然而， 与优良近交系相比， 杂种优势效应仍 是适中的。 然而， 相对低的产量增加并不是由杂交系统的低效所引起的， 而是由于数十年的 育种以及政府法规 ( 例如芥子油苷或芥子酸含量 ) 的缘故， 因此在油菜籽中缺少遗传多样 的基因库， 其还造成有限的种质变异性。
     更多样的基因库会产生较强的杂种优势效应， 但在最近才开始对它们的开发。尽 管如此， 对于在未来实现油菜籽显著增产， 商业上有用的杂交系统是主要的先决条件。 那些 增产不仅是食物目的的需求增加所需， 还是生物燃料 ( 生物柴油 ) 需求的快速增加所需。 除化学试剂诱导的雄性不育 (CHA) 之外， 在芸苔属品种中已研究了三种基于遗 传学的杂交系统原则 ： 育种人员使用了自交不亲和 (SI)、 细胞质雄性不育 (CMS) 和核雄 性不育 (NMS ； 以前也称为雄性核不育或遗传雄性不育， GMS) 的芸苔属植物作为母本 ( 关 于蔬菜中杂交系统的评述参见 Kumar 等， 2004)。SI 植物由于它们的遗传组成 (genetic constitution)， 因此无法自花传粉， 并且 CMS 和 NMS 雌株也不能产生花粉。因此， 所有这些 植物必须通过雄性能育亲本异花传粉。在使用这些植物中， 育种人员尝试改善种子生产的 效率和 F1 杂种的品质， 以及减少育种成本。当不使用 Si、 CMS 或 NMS 植物进行杂交时， 由于 亲本能同时经历异花传粉和自花传粉， 因此更难以在后代 (F1 代 ) 中获得并分离期望的性 状。
     对于在商业化杂种种子生产中利用杂种优势， 简单且有效的传粉控制系统是关键 步骤。如果亲本之一是 SI、 CMS 或 NMS 植物， 则无法自花传粉或不能产生花粉， 仅会发生异 花传粉。通过在杂交中除去一方亲本品种的花粉， 植物育种人员确信获得了质量一致的杂 种种子， 前提是亲本是质量一致的并且育种人员实施单交。
     自交不亲和性系统 ： 迄今为止尚未开发用于油菜籽的商业上可用的 SI 系统。 加拿 大专利 CA 2,143,781 描述了一种用于十字花科作物的杂交育种方法， 其中通过将自交不 亲和的雄性不育系的母本与父本杂交生产 F1 种子。然而， 对于 SI 主要问题在于大规模繁 殖 SI 亲本系， 其使得该系统难以商业应用。
     细胞质雄性不育 (CMS) ： CMS 是一种母系遗传的现象， 其遗传因子位于胞质器线粒 体的基因组中。这种植物产生功能性花粉粒的能力严重受损。对于 CMS 系统， 恢复系基因 是显性核基因， 其抑制细胞质的雄性不育效应。在 cms 植物中雄性不育的表现是隐性核基 因 ( 称为保持系等位基因 ； rf) 和雄性不育特异性胞质基因组之间不亲和性的结果。
     用于油菜籽植物 F1 杂种商业性生产的 CMS 系统是 Polima(pol ； Fu， 1981)、 Kosena
     和 Ogura 系 统 (Ogura， 1968 ； Makaroff， 1989 ； Pellan-Delourme 等， 1987 ； US 5,254,802 ； US20040237141， US20020032916， EP 0599042 ； US6,229,072)。
     在中国， Polima 细胞质雄性不育 (Pol CMS) 系统已主要用于杂种油菜籽生产。然 而， 由于其固有局限， 例如不育性的不稳定性、 有限数量的恢复系以及细胞质的潜在不利影 响， 因此大面积使用具有单一 CMS 细胞质的杂种并不理想。pol CMS 的主要不利之处在于 在高温下雄性不育的不稳定性。在相对低或高的温度条件下雄性不育系能变得部分能育 (Yang&Fu， 1987)。
     Ogura(ogu ； Ogura， 1968 ； Pelletier 等， 1983 ； Heyn， 1976) 和 Kosena 系统均依赖 于萝卜来源的 CMS 基因。已将一种用于 Ogura 细胞质雄性不育植物的育性恢复系从萝卜 (Raphanus sativus)( 萝卜 (radish)) 中转移到芸苔中 (Pelletier 等， 1987)， 因为油菜籽 缺少相应于所述 CMS 基因的 Rf 等位基因。Ogura 系统描述于 EP0599042、 EP 0671121 和 WO2005/074671 中。描述了来源于萝卜的恢复系等位基因的表型 (WO 92/05251 ； Delourme 等， 1991)。最初， Ogura 恢复系材料显示与其育性恢复基因紧密连锁的降低的雌性能育性 和高含量的芥子油苷， 其通过漫长回交得以克服 (Delourme 等， 1991， Renard 等， 1997)。EP 1493328 描述了一种生产用于 Ogura 细胞质雄性不育的欧洲油菜双低恢复系的方法。尽 管在艰辛地回交后， 在那些品系中芥子油苷含量降低了， 但似乎存在某些与 Rf 等位基因 相关的固有问题例如在较高温度下产量下降、 降低的结实率和每个长角果减少的胚珠数 (Pellan-Delourme&Renard， 1988 ； Delourme 等， 1994)、 较低的种子产量、 弱抗病性和倒伏 易感性。这些特性的某些与恢复系等位基因紧密连锁 (Delourme 等， 1994， 1995) 并有数据 暗示那些特性的某些可能对恢复系等位基因是内源的， 并且通过育种或甚至使用分离的恢 复系等位基因的转基因方法可能无法得到克服。
     CMS 系统的一个固有缺点在于纯合 CMS 雌性系的繁殖。由于雄性不育， 因此 CMS A 雌性系无法自花传粉， 其必须通过将所述 A 系与雄性能育的并且在遗传学上相同于 A 系的 保持系 B 系杂交而得以保持。该杂交的结果是雄性不育 CMS A 系。
     核雄性不育 (NMS) ： 核雄性不育 ( 早期称为雄性核不育 gms) 受来自细胞核区 域的基因控制。大多数天然存在或诱导的雄性不育突变体在自然界中是隐性的， 但在 甘蓝类蔬菜 ( 例如卷心菜和花椰菜 ) 和遗传转化的雄性不育系中存在极少例外 (Kaul， 1988， Williams 等， 1997)。尽管产生了具有功能的花粉， 但是因为花粉没有裂开或植物 的特殊花形态， 如在番茄中位置性不育 (Atanassova， 1999) 和在茄子中功能性雄性不育 (Phatak&Jaworski， 1989)， 因此某些突变体的花粉无法自受精 (self fertilize)。出现优 势隐性雄性不育表明在任何基因控制的小孢子发生 ( 花粉发育过程 )、 雄蕊发育或小配子 发生 ( 雄配子发育过程 ) 中， gms 是突变的结果。
     NMS 系统具有几乎不带有不利细胞质效应的完全且稳定的不育性优点。在欧洲油 菜中已发现了几种 NMS 突变体， 并且也已报道了这些突变体的不育性受一种基因 (Takagi， 1970 ； Mathias， 1985 ； Hu， 2000)、 两 种 基 因 (Li 等， 1985， 1988， 1993， 1995 ； Hou 等， 1990 ； Tu 等， 1997a)、 三种基因 (Chen 等， 1998 ； Wang 等， 2001) 和具有复等位基因的一种基因 (Song， 2005) 控制。 然而， 该系统在实践上难以操作并且常常显示对环境效应如热的高敏感性。 因 此， 与 CMS 系统相比， 在油菜籽生产中应用该显性 NMS 法则相差很远， 主要因为复杂的能育 性遗传以及在分离种群中区分不同基因型的困难。 用于纯合两型系的育种过程是非常复杂的， 并且使用传统的育种方法鉴定回交或自身世代中具有预期性状的不同基因型 (Ms Rf) 是费力费时的。
     在中国， 有三种 NMS 系统已被用于杂交育种中， 以及有几种杂种已登记。尽管隐性 NMS 具有优点 ( 其仅需要两系 )， 但其还具有难以驱动整个雄性不育群的致命缺陷。 由于 gms 在整个回交中都被保持， 因此在杂种种子生产中， 在田地中 50％的雄性能育分离子 (Msms) 需要鉴定并在它们脱落花粉之前除去。 可例如通过标记辅助选择实现从雌性系中除去 50％ 的雄性能育植物 (Tu 等， 1999)。然而， 这些方法昂贵、 费力且在商业上没有竞争力。由于非 常冗长的保持过程以及未利用蔬菜作物中合适的标记基因， 因此 gms 的利用只局限于非常 少的蔬菜中。迄今为止没有开发油菜籽中的系统。对于特定的核雄性不育基因鉴定能育细 胞质 (Horner&Palmer， 1995) 是一项感兴趣的研究领域， 其一旦成功， 就可提供最有效地利 用品系如 cms 系的机会。
     一种特殊类型的核 ms 系统是转基因雄性不育系统， 其在 1990 年初期得到早期 开发 (Mariani， 1992)。由于花药或花粉特异性基因和启动子序列的分离、 克隆和鉴定 (Williams 等， 1997)， 因此这些系统变得可以接受。然而， 转基因系统必须经历漫长且耗费 巨大的政府批准过程， 使得与其他系统相比， 那些系统处于明显的竞争不利中。
     环境敏感的雄性不育 (enms) 系统 ： 植物中某些 nms 系是条件突变体， 因此意味 着在特定的环境中， 雄性不育突变体植物变成雄性能育。在针对不育性和能育性表现确定 关键的环境 ( 通常是温度或光周期 ) 之后， 上述 GMS 突变体被分成环境敏感的核雄性不育 (enms) 系。在蔬菜作物中， 已报道了主要的温度敏感的 enms 系 ( 表 1)。从实际应用的观 点来看， 在温度和光周期敏感的雄性核不育系统中， 对于能育性 / 不育性表现需要分别鉴 定关键的温度或光周期。
     表1： 蔬菜中环境敏感的雄性不育突变体
     TGMS- 热敏感的基因雄性不育
     PGMS- 光周期敏感的基因雄性不育 *
     TCMS- 热敏感的细胞质雄性不育
     表格来自 Kumar 等， 2004
     使用 enms 系的杂种种子生产更具吸引力， 原因在于容易进行雄性不育系的种子 繁殖。可在其表现雄性能育性状的环境中繁殖 enms 系的种子， 与此同时可在其表现雄性不 育的另一环境中生产杂种种子。
     NPZ(“Norddeutsche Pflanzenzucht Lembke” )MSL 系统 ： MSL( 雄性不育 Lembke) 系统是一种 NPZ/Lembke 提供的系统， 目前在欧洲市场有售 (Pinochet 等， 2000)。在 2006 年， 在欧洲使用该系统生产的杂种覆盖了大约 1.15 百万公顷的面积 ( 其中在德国为 850,000 公顷 (Frauen 等， 2007))。 据称 MSL 系统是在 1984 年于 NPZ 育种场中基于自发突变 和选择得到的 (Frauen， 1999 ； Paulmann&Frauen， 1999)。 在德国， 1996 年批准了第一种恢复 的 MSL 杂种品种 (Frauen&Baer， 1996)， 与优良的常规非杂种品种相比显示增加了大约 12％ 的产量。该系统被描述为一种可供选择的 CMS 系统 (Frauen， 1999 ； “Hybridrapsfiebel” ， Rapool promotion material)， 其使用了用于繁殖不育母系的能育保持系以衍生全恢复的 杂种。对于该雄性不育系统， 所有已知的常规油菜籽栽培品种以及品系都是恢复系。这种 情况以及所宣称的该系统来源于自发突变暗示了其不同于其他已知的不育系统。 公众既不 知道 MSL 系统的亲本系， 也不知道制备该杂种种子的方法， 其作为商业秘密得到保持。这限 制了使用 MSL 系统及其在油菜籽品种中的更广泛地应用。
     MS Takagi ： 通过 γ- 照射诱变， Takagi(1970) 在日本品种 Murasaki natane 中 诱导了雄性不育。该系统被 Takagi 描述为单基因隐性。Theis(1990) 在他的博士论文 (p.14-18) 中描述了 MS Takagi 受两种基因控制， 一种是纯合隐性的雄性不育基因以及另 一种是显性的 “修饰基因” 。Theis 描述了 MS Takagi 在正常田地条件下是不育的， 但可在 7-10 后于一周的温度处理 (38℃日白天温度 /18℃夜间温度 ) 下恢复能育性 (p.49)。 Theis 进一步提议通过用不育的、 温度处理的植物的花粉给不育植物授粉生产 100％能育亲本系 (p.55)。 然而， 公众不知道该系统的商业应用并且也没有开发在商业上可行的其杂交系统。 对于不育基因或 “修饰基因” ， Takagi 和 Theis 都没有描述纯合系。当讨论核雄性不育系统 时， Denis 等 (1993) 描述了 Takagi 系统， 涉及该系统问题的一个原因是缺少标记基因， 其 使得在后代中不能分选雄性不育或雄性能育植物， 因此需要提供纯合系 ( 详细讨论参见如 下 )。
     如上所述， 目前在商业上仅使用两种杂交系统 ： (1)NPZ MSL 系统， 但其起源未知， 和 (2)Ogura 系统， 因为某些与恢复系等位基因连锁的农艺学缺点， 因此也不是最佳的。另 TM 外能获得的 InVigor 杂种双低油菜系统 (BayerCropScience) 是一种转基因系统， 因此涉 及高管理费用和公众关注。然而， 这几个系统在数量上有限。因此， 不仅从经济角度还从农 业原因来看， 额外的系统应当有益 ： 在作物如油菜籽中大量使用单一杂交系统会致使种群 在抗病时容易受伤， 这种易伤性在同一遗传种群中可能更容易地传播。平行利用几种杂交 系统会提供较大的遗传变异并会减少这种易伤性。
     因此本发明待解决的问题是提供一种代替的在商业上可行的新的油菜籽核雄性 不育杂交系统， 其产生了商业上可行的油菜籽粕和油， 并且是一种便利且具成本效益的生 产杂种种子 ( 优选具有不超过 25μmol/ 克 9％水分含量的风干种子的芥子油苷含量 ) 的方 法， 此外其不具有目前所用系统的缺点。
     通过本发明解决了该问题。
     附图描述
     图1： 恢复的杂交系统 (RHS) 遗传和品种发展。用于 Ms 系和保持系固定的育种计 划以及随后用于杂交系统的杂交计划。该计划的上半部分描述了 MsMsrfrf 基因型 ( 预基 础雌性系 ) 和 msmsrfrf 基因型 ( 保持系 ) 的固定。下半部分描述了用于提供杂种种子的杂交计划， 首先通过将预基础雌性系 (MsMsrfrf) 和保持系 (msmsrfrf) 杂交提供基础雌性 系 (Msmsrfrf)， 然后通过将基础雌性系 (Msmsrfrf) 与恢复系 (msmsRfRf) 杂交提供杂种种 子。
     图2： 与雄性能育植物的花相比， 显示条件性雄性不育植物 ( 在温度诱导的再受精 后 ) 的白色条纹 / 白色斑点表型的图。
     A： 在高温诱导的再受精后， 条件性雄性不育欧洲油菜植物的白色条纹 / 白色斑点 表型。
     B： 白色条纹 / 白色斑点花 ( 雄性不育欧洲油菜植物 ； 左边的花 ) 与雄性能育欧洲 油菜植物的正常的花 ( 右边的花 ) 的比较。
     C： 与 A 相同， 具有通过重叠的阴影线区域标记的白色区域
     D： 与 B 相同， 具有通过重叠的阴影线区域标记的白色区域
     E： 雄性能育欧洲油菜植物的花。
     图3： 显示条件性雄性不育欧洲油菜植物的芽败育表型的图像。
     A： 具有芽败育的雄性不育植物的不育枝
     B-D ： 在于同一枝条上具有不育和能育的花的热处理后雄性不育植物的枝条 E： 在热处理受精和自交后具有荚的雄性不育植物枝条
     图4 ： A： 显示与不育性连锁以及之后与 Ms 等位基因 (alt ： 1) 分离连锁的多态性的 BSA 候选标记的分布图。在雄性能育集团 (bulks) 中显示的片段的大小与对于雄性能育亲 本所观察到结果的相同。 然而， 雄性不育集团显示了两条片段 ： 对于雄性不育亲本观察到一 条， 以及对于雄性能育亲本也观察到一条。该观察结果与期望值一致， 因为对于 Ms 等位基 因， 雄性不育植物可以既是纯合的又是杂合的。
     B： 通过引物 HiNK6702 和 6707( 分别为 SEQ ID NOs ： 13 和 14) 组合在雄性能育 (F) 和雄性不育 (S) 系中获得的扩增产物的琼脂糖分布图。
     图5： 根据荧光发射类型及其强度， 使用在三块不同的云簇 (clouds) 中分离的纯 合不育 (MsMs)、 杂合不育 (Msms) 或纯合能育 (msms) 植物， 针对标记 SR0002A 获得的典型的 SNP 图。
     图6： 标记序列 NR1116。加下划线的是用于 SSR 扩增的正向和反向引物。SSR 自身 以黑体字母标出。在该序列的 5’ - 末端， 某些核苷酸无法得到清楚鉴定， 因此用可代表 A、 T、 C或G的 “N” 标记。
     图7： 标记序列 NR2525。加下划线的是用于 SSR 扩增的正向和反向引物。SSR 自 身以黑体 (bold) 字母标出。
     图8： 标记序列 NR2219。加下划线的是用于 SSR 扩增的正向和反向引物。SSR 自 身以黑体字母标出。
     图9： A： SNP 共有序列 1(SEQ ID NO ： 3)
     B： SNP 共有序列 2(SEQ ID NO ： 6)
     显示的是能育和不育等位基因的共有序列。突变区示于 ( 括号 ) 中， 并且对于能 育和不育单倍体型均列出核苷酸 ( 详情参见实施例 )。在共有序列 1 的 5’ - 末端的黑体字 母标记的是 SSR 重复的 3’ - 末端。
     图 10 ： TaqMan 检测基本原理 ( 来自 ： Pre-Developed16AssayReagents101861390 A CN 101861391说明书7/93 页Allelic Discrimination Protocol ； 件号 4312214Rev.C 5/2005 ； Applied Biosystems)
     图 11 ： 横贯 5 条拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 染色体的 23 种芸苔候选基因的 拟南芥同系物的图位。以碱基对表示的物理距离列于条左侧， 拟南芥基因的参考 ID 列于条 右侧。
     图 12 ： 显示了纯合不育 (rfrf)、 纯合能育 (RfRf) 和杂合能育 (Rfrf) 植物个体实 例的来源于 PUT-161a-Brassica_napus-59218 的 SSCP 标记的 GeneMapper 输出结果。
     定义
     应当理解本发明不限于如在此描述的具体方法学、 实验方案、 细胞系、 植物种或 属、 构建体和试剂。还应当理解在本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案的目的， 并 不意在限制本发明的范围， 其仅受限于附加的权利要求。 应当指出， 除非上下文另有清楚指 示， 当在本文中以及在附加的权利要求中使用时， 单数形式 “a” 、 “an” 和 “the” 包括复数。 因此， 例如提及 “一种植物” 时， 则是提及一种或多种植物并包括本领域技术人员所知的其 等价物， 等等。当在本文中使用时， 词语 “或” 指具体列表的任何一个成员， 并且还包括该列 表成员的任意组合 ( 即还包括 “和” )。
     术语 “约” 在本文中用于指大约地、 约略地、 左右或在 ...... 附近。当术语 “约” 与数值范围连用时， 其通过延伸所列数值的上边界和下边界从而改变了该范围。 一般而言， 术语 “约” 在本文中用于改变数值使之高过并低于设定值， 具有 20％， 优选 10％上下的变化 ( 更高或更低 )。高于温度， 术语 “约指 ±1.0℃， 优选 ±0.5℃。在术语约用于本发明上下 文的情况下 ( 例如与温度或分子量值连用 )， 优选精确值 ( 即没有 “约” )。
     术语 “等位基因” 指基因的一种或多种可供选择的形式中的任何一种， 所有的等 位基因均涉及至少一种性状或特性。在二倍体细胞中， 给定基因的两个等位基因占据了一 对同源染色体上的相应基因座。在某些情况下 ( 例如对于 QTLs)， 其更准确地指 “单倍体 型” ( 即染色体区段的等位基因 ) 而非 “等位基因” ， 然而， 在那些情况下， 术语 “等位基因” 应当理解为包含术语 “单倍体型” 。 如果两个个体在一个特定的基因座上具有相同的等位基 因， 以及如果等位基因由一个共同的祖先遗传而来 ( 即该等位基因是同一亲本等位基因的 拷贝 )， 则该等位基因被称为 “后裔一致 (identical by descent)” 。另一种情况是等位基 因是 “状态一致 (identical by state)” ( 即等位基因看上去是相同的， 但来源于等位基因 的两个不同拷贝 )。对于连锁研究后裔一致性信息是有用的 ； 尽管后裔一致性信息可能是 特别有用的， 但是后裔一致性和状态一致性信息都可用于例如在本文中描述的那些相关研 究中。
     在本发明的范围中， 术语 “回交” 被理解为指一种其中将杂种后代与亲本之一重复 杂交的方法。
     术语 “芸苔 (Brassica)” 指芸苔属， 非常具体地指其中的种 ： napus( 欧洲油菜 )、 campestris( 甜菜 )、 oleracea cv Tastie( 甘蓝 )、 oleracea cv Snowball Y( 花椰菜 ) 和 oleracea cv Emperor( 花茎甘蓝 )。
     术语 “欧洲油菜 (Brassica napus)” 或 “油菜 (oilseed rape)” 指欧洲油菜的植 物、 种子、 植物部分和细胞， 并包括一年生春油菜、 半年生 (biannual) 冬油菜以及半年生中 间型油菜。在上下文中， 一年生或半年生表示品种是否能越过冬季生长期生长。一般而言， 冬油菜在西北欧种植， 而春油菜则主要在加拿大、 中国、 印度、 澳大利亚和南美种植。油菜(oilseed rape) 来源于甘蓝 (B.oleracea) 与甜菜 (B.campestris) 的种间杂交。因此， 该 术语也包括任何由这两个品种实施的再整合。一种优选的春油菜是双低油菜型油菜。包 括了用于表达低芥子油苷含量的遗传手段并在欧洲市售的代表性的冬油菜品种包括例如 CAPITOL、 cv.CAMPALA、 cv.CALIFORNIUM( 可获得自 Dekalb， 孟山都的商标 )、 cv.LORENZ、 cv.OASE( 可获得自 RAPOOL)。包括了用于表达低芥子油苷含量的遗传手段并加拿大市售 的代表性的春油菜品种包括例如 cv.BULLET、 cv.GARRISON 和 cv.KRISTANA( 各自可获得自 SvalofWeibull)。 其他包括了用于表达低芥子油苷含量的遗传手段并在欧洲市售的冬油菜 品种包括 cv.APEX、 cv.NK FAIR、 cv.VIKING、 cv.BILLY、 cv.LADOGA 和 cv.CASTILLE。在含油 种子芸苔中这样低的芥子油苷含量足以提供给粕以增加的商业价值。
     术语 “欧洲油菜 - 特异性 DNA 序列” 指与显示与其最大相似性的物种欧洲油菜 ( 或 产生 ( 整合 ) 自即芜菁 (Brassica rapa) 和甘蓝 (Brassica oleracea) 的两种欧洲油菜中 的任何一种 ) 的基因组序列具有大于 80％， 优选大于 85％， 更优选大于 90％， 还更优选大于 95％， 仍更优选大于 97％， 最优选大于 99％的核苷酸序列同源性的多核苷酸序列。
     术语 “双低油菜 (Canola)” 指一种产生包含小于 2％芥子酸的油类的欧洲油菜， 并 且种子的固体成分必须包含小于 30μM/g 风干无油固体的 3- 丁烯基芥子油苷、 4- 戊烯基 芥子油苷、 2- 羟基 -3 丁烯基芥子油苷、 2- 羟基 -4- 戊烯基芥子油苷的任何一种或任何混合 物。
     如同本领域所公认的一样， 术语 “染色体” 在本文中用于指包含细胞核 DNA 并在其 核苷酸序列中携带线性基因阵列的细胞核中的自我复制的遗传结构。
     术语 “条件性雄性不育” 指一种可为某些条件所诱导和 / 或抑制的雄性不育表型 ( 即不能产生能育花粉 )。因此， 通过应用所述某些条件， 植物可从雄性不育 “转换” 为雄性 能育表型。雄性不育可由多种因素引起， 并可例如表现为完全缺少雄性器官 ( 花药 )、 花粉 退化、 花粉不育等。基于条件的强度， 从雄性不育 “转换” 为雄性能育可以是完全或不完全 的。最优选地， 在本发明的上下文中， 术语 “条件性雄性不育” 指温度依赖的雄性不育， 从而 指一种核雄性不育表型， 其中不育性是温度依赖的并且能在高于 35℃ ( 优选 35℃ -43℃， 更 优选 37℃ -40℃， 最优选在约 39℃ ； 优选暴露如本文中所规定的优选的热处理时间以及随 后在如本文所规定的环境温度下生长 ) 的温度下恢复能育性。
     “基因” 在本文中定义为一种由 DNA 序列组成的遗传单位， 该 DNA 序列占据了染色 体上特定位置并包含针对生物体中特定特性或性状的遗传指令。
     “遗传工程” 、 “转化” 和 “遗传修饰” 在本文中都用作为将分离的和克隆的基因转移 入另一生物体的 DNA， 通常是染色体 DNA 或基因组中的同义词。
     术语 “基因型” 指细胞或生物体的遗传组成。个体的 “对于遗传标记组的基因型” 包括对于存在于个体中的一个或多个遗传标记基因座， 特定的等位基因。 如本领域所知的， 基因型可涉及单基因座或多基因座， 与基因座相关或不相关和 / 或连锁或不连锁无关。在 某些实施方案中， 个体的基因型涉及一种或多种基因， 所述一种或多种基因涉及与目标表 型 ( 例如本文中所定义的数量性状 ) 表达相关的一种或多种基因。因此， 在某些实施方案 中， 基因型包含位于数量性状的一个或多个遗传基因座上的， 存在于个体中的一个或多个 等位基因的总和。在某些实施方案中， 用单倍体型 ( 在本文中如下定义的 ) 来表示基因型。
     术语 “种质” 指种群或另一个组个体 ( 例如物种 ) 的基因型的总和。术语 “种质” 还可指植物材料 ； 例如一组充当各种等位基因库的植物。短语 “适应种质” 指被证明具有遗传 优势的植物材料 ； 例如对于给定的环境或地理区域， 而短语 “非适应种质” 、 “粗种质” 和 “外 来种质” 指未知或未被证明具有遗传价值的植物材料 ； 例如对于给定的环境或地理区域 ； 同 样， 在某些实施方案中， 短语 “非适应种质” 指不是已建立的繁殖种群一部分并且与该已建 立的繁殖种群的成员不具有已知关系的植物材料。
     术语 “芥子油苷” 指在种子已被磨碎并提取油之后， 仍留在在种子的固体成分 - 固 体粕中的硫基化合物。它们的结构包括与脂肪族烃结合的葡萄糖 (3- 丁烯基芥子油苷、 4- 戊烯基芥子油苷、 2- 羟基 -3- 丁烯基芥子油苷和 2- 羟基 -4- 戊烯基芥子油苷 ) 或与芳 香族烃结合的葡萄糖 (3- 吲哚基甲基芥子油苷、 1- 甲氧基 -3- 吲哚基甲基芥子油苷 )。脂 肪族芥子油苷也称为烯基芥子油苷。芳香族芥子油苷也称为吲哚。术语 “总芥子油苷含量” 指在所示材料例如在粕或干燥种子中包含的所有芥子油苷的总和。总芥子油苷含量可以 μmol( 芥子油苷 )/ 克种子 ( 例如 9％水分含量的风干种子 ) 或粕来显示。
     术语 “单倍体型” 指从一个亲本遗传来的个体等位基因的组合。因此， 二倍体个体 具有两个单倍体型。术语 “单倍体型” 可更加狭义地用于指与表型性状相关的物理连锁和 / 或未连锁的遗传标记 ( 例如序列多态性 )。短语 “单倍域” (haplotype block)( 有时在文 献中也简称为单倍体型 ) 指一组两种或更多种在单条染色体 ( 或其一部分 ) 上物理连锁的 遗传标记。 通常， 每个域都具有几个共同的单倍体型， 并且可挑选唯一鉴定这些单倍体型中 每一个的遗传标记亚组 ( 即 “单倍体型标签” )。
     术语核苷酸或氨基酸序列的 “同源性” 、 “序列相似性” 或 “序列同一性” 指两条 或更多条序列的同一性或相似性的程度， 并可按惯例通过使用已知的软件或计算机程序 如 BestFit 或 Gap 成 对 比 较 程 序 (GCG Wisconsin 程 序 包， Genetics Computer Group， 575Science Drive， Madison， Wis.53711) 进 行 测 定。BestFit 使 用 Smith 和 Waterman， Advances in Applied Mathematics 2 ： 482-489(1981) 的局部同源性算法来发现两条序列 间同一性或相似性最佳的片段。 通常通过在整个比较窗口上比较两条序列的一部分以鉴定 并比较局部区域的序列相似性， 从而进行两条或更多条多核苷酸或聚氨基酸序列之间的序 列比较。比较窗口通常为约 20-200 个连续的核苷酸。使用 Needleman 和 Wunsch， J.Mol. Biol.48 ： 443-453(1970) 的方法， Gap 执行一条序列的全部与另一条相似序列的全部的全 局比对。当使用序列比对程序例如 BestFit 来测定 DNA 序列同源性、 相似性或同一性程度 时， 可使用默认设置， 或可选择合适的打分矩阵来优化同一性、 相似性或同源性得分。类似 地， 当使用程序如 BestFit 来测定两条不同的氨基酸序列之间的序列同一性、 相似性或同 源性时， 亦可使用默认设置， 或可选择合适的打分矩阵如 blosum45 或 blosum80 来优化同一 性、 相似性或同源性得分。
     “同源重组” 指在相同的核苷酸序列区域中， 两个 DNA 分子或配对染色体的染色单 体之间的 DNA 片段的交换 (“互换” )。 “重组事件” 在本文中被理解为指减数分裂交换。
     术语 “杂合的” 指在同源染色体的相应基因座上存在不同的等位基因时所存在的 遗传状况。
     术语 “纯合的” 指在同源染色体的相应基因座上存在相同的等位基因时所存在的 遗传状况。
     在植物育种上下文中， 术语 “杂种” 、 “杂种植物” 和 “杂种后代” 指一种植物， 其是由不同品系或品种或种的植物杂交产生的子代或遗传上不同的亲本， 所述杂交包括但不限于 在两种近交系 ( 例如遗传上杂合的或主要杂合的个体 ) 之间的杂交。短语 “单交 F1 杂种” 指由两种近交系之间杂交产生的 F1 杂种。
     在核酸上下文中， 术语 “杂合体 (hybrid)” 指在互补核苷酸碱基之间通过氢键形成 的双链核酸分子或双链体。术语 “杂交 (hybridise)” 或 “退火” 指在互补碱基之间核酸序 列单链通过氢键形成双螺旋区段的过程。
     短语 “近交系” 指遗传上纯合的或接近纯合的种群。例如， 可通过几个循环的兄弟 / 姐妹育种或自交得到近交系。 在某些实施方案中， 对一种或多种目标表型性状进行近交系 纯育。 “近交” 、 “近交个体” 或 “近交后代” 是采样自近交系的个体。术语 “近交” 指基本上 纯合的个体或品系。
     术语 “基 因 渗 入 ( 基 因 渗 入 )” 、 “基 因 渗 入 (introgressed)”和 “基 因 渗 入 (introgressing)” 指一种既是天然又是人工的过程， 籍此通过杂交， 一种物种、 品种或栽培 品种的基因组区域移入另一物种、 品种或栽培品种的基因组中。该过程可任选地通过与轮 回亲本回交而得以完成。
     术语 “连锁” 及其语法上的变型指在同一染色体上不同基因座处的等位基因分离 联合超过预期碰巧组合的倾向， 如果它们的传递是独立的话， 在某些实施方案中， 是它们的 物理邻近的结果。
     短语 “连锁不平衡” ( 也称为 “等位基因关联” ) 指一种现象， 其中当从亲本分离给 子代时， 在处于两个或更多个基因座上的特定等位基因倾向于以连锁群联合， 具有较在给 定种群中所预期的它们的个体频率更高的频率。例如， 当遗传标记等位基因和 QTL 等位基 因同时出现时， 它们可显示连锁不平衡， 具有较预期来自个体等位基因的那些频率更高的 频率。连锁不平衡可能产生的几个原因包括但不限于在染色体上密切邻近的等位基因。
     术语 “连锁群” 指位于同一条染色体上的全部基因或遗传性状。在连锁群中， 那些 近得足以在一起的基因座会在遗传杂交中显示连锁。 由于交换概率随染色体上基因间物理 距离的减小而增加， 因此在直接的遗传检测中在连锁群中其位置彼此远离的基因就不显示 任何可检测的连锁。术语 “连锁群” 主要用于指在尚未进行染色体定位的情况下， 在遗传系 统中显示连锁行为的遗传基因座。因此， 在本发明的上下文中， 术语 “连锁群” 与 ( 物理实 体的 ) 染色体同义。
     术语 “基因座” 指在给定物种的染色体上的位置 ( 例如基因、 遗传标记等的 )。
     术语 “分子标记” 或 “遗传标记” 指一种用于肉眼观察核酸序列特性差异的方法中 的指示物。其涉及一种与一种或多种目标基因座相关的个体基因组 ( 例如存在于个体基 因组中的核苷酸或多核苷酸序列 ) 的特征。在某些实施方案中， 取决于上下文， 在目的种 群中或在多态性占据的基因座中遗传标记是多态的。遗传标记包括例如单核苷酸多态性 (SNPs)、 indels( 即插入 / 缺失 )、 简单序列重复 ( 也称为微卫星标记 ； SSRs)、 限制性片段长 度多态性 (RFLPs)、 随机扩增多态 DNAs(RAPDs)、 分裂扩增多态序列 (CAPS) 标记、 多样性阵 列技术 (DArT) 标记和扩增片段长度多态性 (AFLPs) 等。额外的标记包括插入突变、 序列特 异性扩增区 (SCARs) 或同工酶标记或限定了特定的遗传和染色体位置的在本文中所述的 标记的组合。 遗传标记可例如用于定位染色体上包含在表型性状表达中有助于变异性的等 位基因的遗传基因座。短语 “遗传标记” 还可指一种与基因组序列互补的多核苷酸序列， 例如用作探针的核酸的序列。遗传标记可在物理上位于染色体上的位置中， 该位置位于与该 遗传标记相关的遗传基因座之内或之外 ( 即分别为基因内或基因外 )。 换种说法， 虽然遗传 标记通常在相应于目标基因座的基因的染色体上位置未被鉴定并且在遗传标记和目标基 因座之间的重组率不为零时使用， 但本文中所公开的主题还可使用在物理上位于遗传基因 座 ( 例如在相应于一种基因的基因组序列内部， 例如但不限于在基因的内含子或外显子中 的多态性 ) 边界之内的遗传标记。在本发明的某些实施方案中， 一种或多种遗传标记包含 1-10 种标记， 以及在某些实施方案中， 一种或多种遗传标记包含多于 10 种的遗传标记。
     在本发明的范围中， 术语 “基于标记的选择” 被理解为指在核酸与期望性状相关的 情况下， 使用遗传标记来检测来自植物的一种或多种核酸以鉴定携带有负责期望 ( 或不期 望的 ) 性状的基因的植物， 使得那些植物可用于 ( 或免于 ) 选择育种计划。
     在本发明的范围中， 术语 “微卫星或 SSRs( 简单序列重复 ) 标记” 被理解为指一种 由多个 DNA 碱基短序列重复组成的遗传标记， 其见于遍及植物的 DNA 的基因座上， 并且有可 能是高度多态的。
     短语 “核酸” 指可相应于核苷酸链的任何单体单元的物理链， 包括核苷酸聚合物 ( 例如典型的 DNA 或 RNA 聚合物 )、 修饰的寡核苷酸 ( 例如包含对于生物学 RNA 或 DNA 非典 型的碱基的寡核苷酸， 例如 2′ -O- 甲基化寡核苷酸 ) 等。在某些实施方案中， 核酸可以是 单链、 双链、 多链或它们的组合。 除任何明示的序列之外， 除非另有指示， 本发明的具体核酸 序列任选地包含或编码的互补序列。
     短语 “表型性状” 指个体外观或其他可检测的特性， 由其基因组与环境的相互作用 而产生。
     术语 “多数” 指多于一个的实体。因此， “多数个体” 指至少两个个体。在某些实施 方案中， 术语多数指多于全体的一半。例如， 在某些实施方案中， “多数种群” 指多于种群成 员的一半。
     术语 “后代” 指特定杂交的后裔。 通常， 后裔由两个个体繁殖而产生， 尽管某些物种 ( 特别是某些植物和雌雄同体的动物 ) 能自交 ( 即同一植物充当雄配子和雌配子的供体 )。 后裔可以是例如 F1、 F2 或任何后代。
     短语 “质量性状” 指一种受一种或几种显示主要表型效应的基因控制的表型性状。 因此， 质量性状通常是简单遗传的。在植物中的实例包括但不限于花色、 穗轴颜色和抗病 性， 例如玉米大斑病 (Northern corn leafblight) 抗性。
     在本发明的范围中， “PCR( 聚合酶链反应 )” 被理解为指一种产生相对大量的 DNA 特定区域， 从而使多种基于那些区域的分析变成可能的方法。
     在本发明的范围中， “表型” 被理解为指一种遗传受控性状的可区分的特性。
     “植物” 是处于任意发育阶段的任意植物， 特别是种子植物。
     “植物细胞” 是一种包含原生质体和细胞壁的植物结构和生理学单位。植物细胞可 以分离的单细胞或培养细胞的形式存在， 或作为更高级组织单位例如植物组织、 植物器官 或全植物的一部分。
     “植物细胞培养物” 指植物单位例如原生质体、 细胞培养物细胞、 植物组织中的细 胞、 花粉、 花粉管、 胚珠、 胚囊、 合子和处于不同发育阶段的胚的培养物。
     “植物材料” 指叶、 茎、 根、 花或花部分、 果实、 花粉、 卵细胞、 合子、 种子、 插条、 细胞或组织培养物或植物的任何其他部分或产物。
     “植物器官” 是一种具有截然不同且可见结构的并且分化的植物部分， 例如根、 茎、 叶、 花芽或胚。
     当在本文中使用时， “植物组织” 指一群组织成结构和功能单位的植物细胞。包括 处于植物或培养物中的任何植物组织。该术语包括但不限于全植物、 植物器官、 植物种子、 组织培养物和任何组织成结构和 / 或功能单位的植物细胞群。在该术语与如上所列的或包 含于该定义中的任何特定类型的植物组织连用或不存在该术语时， 并不意在排除任何其他 类型的植物组织。
     术语 “植物部分” 指植物的一部分， 包括单细胞和细胞组织， 例如在植物中完整的 植物细胞、 可再生植物的细胞团和组织培养物。 植物部分的实例包括但不限于来自花粉、 胚 珠、 叶、 胚、 根、 根尖、 花药、 花、 果、 茎、 枝条和种子的单细胞和组织 ； 以及花粉、 胚珠、 叶、 胚、 根、 根尖、 花药、 花、 果、 茎、 枝条、 接穗、 砧木、 种子、 原生质体、 愈伤组织等。
     在本发明的范围中， “多态性” 被理解为指在一个种群中两种或更多种不同类型的 基因、 遗传标记或遗传性状的存在。
     术语 “种群” 指享有共同的遗传起源的在遗传上异质的植物集合。 术语 “优势雄性不育” 指在至少 100 株植物的种群中， 不超过 10 ％， 优选不超过 5％， 更优选不超过 1％的在所有那些植物上的花具有产生能育花粉的功能性雄性器官。应 当理解单株植物可同时具有能育和不育的花。 在优选的实施方案中， 不超过 10％， 优选不超 过 5％， 更优选不超过 1％的在单株植物上的花具有产生能育花粉的功能性雄性器官。
     术语 “探针” 指一种会与靶核酸序列分析物或其 cDNA 衍生物中的互补序列形成氢 键双链体的单链寡核苷酸序列。
     当在本文中使用时， 术语 “引物” 指一种能退火至扩增靶标上， 让 DNA- 聚合酶附 着， 从而在置于其中引物延伸产物的合成被诱发的条件 ( 即在核苷酸和用于聚合的物质如 DNA 聚合酶存在下以及处于合适的温度和 pH 下 ) 下时作为 DNA 合成引发点的寡核苷酸。在 扩增中为了达到最高效率， ( 扩增 ) 引物优选是单链。优选地， 引物是一种寡脱氧核糖核苷 酸。引物必须足够长以致于在用于聚合的物质存在下能引发延伸产物的合成。引物的精确 长度取决于许多因素， 包括温度和引物组成 (A/T 和 G/C 含量 )。如在 DNA 扩增领域例如在 PCR 扩增中所通常使用的， 双向引物对由一条正向和一条反向引物组成。当在本文中使用 时， 应当理解 “引物” 可指多于一条引物， 特别是在关于要被扩增的靶区末端序列的信息有 些含糊的情况下。因此， “引物” 包括包含代表序列中可能变化的序列的引物寡核苷酸的集 合， 或包括能使典型的碱基配对得以进行的核苷酸。可通过任何合适的方法制备寡核苷酸 引物。用于制备特定序列的寡核苷酸的方法是本领域已知的， 包括例如合适序列的克隆和 二乙氨基磷 限制性酶切以及直接化学合成。化学合成方法可包括例如磷酸二酯或三酯法、 酸酯 (diethylphosphoramidate) 法和披露于例如 US 4,458,066 中的固相载体法。 视情况， 通过可检测的掺入手段例如通过光谱、 荧光、 光化学、 生物化学、 免疫化学或化学手段可检 测的， 引物可被标记。在包含合适的盐类、 金属阳离子和 pH 缓冲系统的反应介质中， 在足够 量的四种脱氧核糖核苷酸三磷酸酯 (dATP、 dGTP、 dCTP 和 dTTP， 即 dNTPs) 或类似物存在下， 聚合剂催化了寡核苷酸引物的模板依赖的延伸。 合适的聚合剂是已知催化引物和模板依赖 的 DNA 合成的酶类。已知的 DNA 聚合酶包括例如大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 或其 Klenow 片段、
     T4DNA 聚合酶和 Taq DNA 聚合酶。使用这些 DNA 聚合酶用于催化 DNA 合成的反应条件是本 领域已知的。该合成的产物是由模板链和引物延伸链组成的双链分子， 其包括靶序列。这 些产物又用作模板用于另一轮的复制。在第二轮复制中， 第一次循环的引物延伸链用其互 补引物进行退火 ； 合成产生了通过引物序列或它们的互补序列结合 5′ - 末端和 3′ - 末端 的 “短” 产物。变性、 引物退火和延伸的重复循环导致为引物所限定的靶区的指数式累积。 运行足够的循环以获得所需数量的饱含核酸靶区的多核苷酸。该所需数量可改变， 并取决 于产物多核苷酸所服务的作用。 PCR 法为手册所详细描述， 并且是技术人员所知的。 在通过 PCR 扩增后， 可通过在高至中等严格杂交和洗涤条件下与探针多核苷酸杂交检测靶多核苷 酸， 其形成了带有靶序列的稳定的杂合体。如果预期探针与靶序列会基本上完全互补 ( 即 约 99％或更多 )， 则使用严格条件。如果预期有某些错配， 例如如果预期变体品系具有探针 不会完全互补的结果， 则杂交严格性可降低。然而， 要选择消除非特异性 / 不定结合的条 件。影响杂交并且选择性抗非特异性结合的条件是本领域已知的， 并描述于例如 Sambrook 和 Russell， 2001 中。一般而言， 更低的盐浓度和更高的温度增加杂交条件的严格性。在本 发明的范围中， “PCR 引物” 优选被理解为指在 DNA 特定区域的 PCR 扩增中使用的单链 DNA 的相对短的片段。
     术语 “子代” 植物指由一种或多种亲本植物或其后代的营养体或有性生殖获得的 作为后代的任何植物。例如， 子代植物可通过克隆或自交亲本植物或通过杂交两种亲本植 物获得， 并可包括与 F1 或 F2 或更远的世代自交获得。F1 是由亲本产生第一代子代， 亲本至 少之一首次用作性状供体， 而第二代子代 (F2) 或后代 (F3、 F4 等 ) 则是由 F1、 F2 等自交产生 的范本。因此， F1 可以是 ( 以及通常是 ) 由两种不分离亲本 ( 对于一种性状， 不分离系是 纯合的 ) 杂交产生的杂种， 而 F2 则可以是 ( 以及通常是 ) 由所述 F1 杂种自花传粉产生的子 代。
     “重组” 是减数分裂过程中两条同源染色体之间的信息交换。双重组的频率是单重 组体频率的产物。例如， 可发现在 10cM 区域中的重组体具有 10％的频率， 则发现双重组体 具有 10％ x10％＝ 1％的频率 (1 厘摩规定为在测交中的 1％重组体后代 )。
     术语 “RHS” 或 “恢复的杂交系统” 指本发明的基于核雄性不育的杂交系统。
     在本发明的上下文中， 短语 “有性杂交” 和 “有性生殖” 指配子融合产生后代 ( 例如 通过受精， 例如在植物中通过传粉产生种子 )。在某些实施方案中， “有性杂交” 或 “异花受 精” 是某一个体受精自另一个体 ( 例如在植物中异花传粉 )。在某些实施方案中， 术语 “自 交” 指通过自花受精或自花传粉产生种子 ； 即花粉和胚珠来自同一植株。
     在本发明的范围中， “选择育种” 被理解为指一种利用具有或显示所需性状的植物 作为亲本的育种计划。
     术语 “严格条件” 或 “严格杂交条件” 包括提及与其他序列相比， 在多肽会与其靶序 列杂交的情况下， 在更大程度上可检测到的条件 ( 例如至少超过背景 2- 倍 )。严格条件是 序列依赖的且在不同的情况下会有不同。通过控制杂交和 / 或洗涤条件的严格性， 可鉴定 与探针 100％互补的靶序列 ( 同源探查 )。可选地， 可调节严格条件以容许某些序列中的错 配， 使得能检测到较低程度的相似性 ( 异源探查 )。一般而言， 严格条件是那些其中盐浓度 低于大约 1.5M Na 离子， 通常为约 0.01-1.0M Na 离子 ( 或其他盐类 ) ； pH 7.0-8.3 ； 以及对 于短探针 ( 例如 10-50 个核苷酸 )， 温度为至少约 30℃， 和对于长探针 ( 例如大于 50 个核苷酸 )， 温度为至少约 60℃的条件。 还可通过添加去稳定剂如甲酰胺获得严格条件。 例证性的 低严格条件包括在 37℃下使用 30-35％甲酰胺， 1M NaCl， 1％ SDS (w/v ； 十二烷基硫酸钠 ) 的缓冲溶液进行杂交， 以及在 50-55℃下于 1×-2×SSC(20×SSC ＝ 3.0M NaCl/0.3M 柠檬酸 三钠 ) 中洗涤。例证性的中等严格条件包括在 37℃下于 40-45％甲酰胺， 1M NaCl， 1％ SDS 中杂交， 以及在 55-60℃下于 0.5×-1×SSC 中洗涤。例证性的高严格条件包括在 37℃下于 50％甲酰胺， 1M NaCl， 1％ SDS 中杂交， 以及在 60-65℃下于 0.1×SSC 中洗涤。特异性通常 是杂交后洗涤的函数， 关键因素是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于 DNA-DNA 杂合体， Tm 可从 Meinkoth 和 Wahl(Anal.Biochem.， 138 ： 267-284， 1984) 的方程式中近似得到 ： Tm ＝ 81.5℃ +16.6(log M)+0.41(％ GC)-0.61(％ form)-500/L ； 其中 M 是单价阳离子的摩尔浓 度， ％ GC 是 DNA 中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数， ％ form 是杂交溶液中甲酰胺的百分数， 以及 L 是碱基对中杂合体的长度。 Tm 是在 50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交 ( 在规 定的离子强度和 pH 下 ) 时的温度。Tm 每降低约 1℃， 就意味着 1％的错配 ； 因此， 可调节 Tm、 杂交和 / 或洗涤条件以与所需同一性的序列杂交。例如， 如果寻找具有大约 90％同一性的 序列， 则 Tm 可降低 10℃。一般而言， 对于特定序列及其互补序列， 严格条件选择为在规定的 离子强度和 pH 下低于热熔点 (Tm) 约 5℃。 然而， 高严格条件可利用在比热熔点 (Tm) 低 1、 2、 3 或 4℃下进行杂交和 / 或洗涤 ； 中等严格条件可利用在比热熔点 (Tm) 低 6、 7、 8、 9 或 10℃ 下进行杂交和 / 或洗涤 ； 低严格条件可利用在比热熔点 (Tm) 低 11、 12、 13、 14、 15 或 20℃下 进行杂交和 / 或洗涤。使用上述方程式、 杂交和洗涤组合物以及所需的 Tm， 本领域技术人 员应当理解固有地描述了杂交和 / 或洗涤溶液的严格性变化。如果所需的错配程度导致低 于 45℃ ( 水溶液 ) 或 32℃ ( 甲酰胺溶液 ) 的 Tm， 则优选增加 SSC 浓度， 使得可使用更高的 温度。关于核酸杂交的大量指导见于 ： Tijssen， Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes， Part I， 第 2 章″ Overview of principlesof hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″， Elsevier， N.Y.(1993) ； 和 Current Protocols in Molecular Biology， 第 2 章， Ausubel， 等， 编， Greene Publishing and Wiley-Interscience， New York(1995)。 严格杂交的方法是本领域已知的， 其条件可通过本领域已知手段进行计算。这披露于 Sambrook 等， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 第 2 版 .， Cold SpringHarbor Laboratory Press， 1989， Cold Spring Harbor， N.Y. 和 Current Protocolsin Molecular Biology， Ausebel 等， 编， John Wiley and Sons， Inc.， 2000 中。测定序列同一性百分数的 方法是本领域已知的， 其实例为 GCG 计算机序列分析软件 (GCG， Inc， Madison Wis.)。
     在本发明的范围中， “测交植物” (tester plant) 被理解为指一种用于在遗传学上 鉴定要被测试的植物中性状的植物。通常， 将要被测试的植物与 “测交系” 植物杂交， 并记 录杂交后代中性状的分离比率。
     术语 “测交系” 指具有标准基因型、 已知特性和确认性能的品系或个体。 “测交亲 本” 是来自在有性杂交中用作亲本的测交系的个体。 通常， 测交亲本与其所要杂交的个体无 关， 并且在遗传学上也与之不同。 当与个体或近交系杂交用于表型评估时， 测交系通常用于 产生 F1 后代。
     短语 “顶交组合” 指将单测交系与多个品系杂交的过程。产生该杂交的目的是要 确定杂种后代的表型特性 ； 也就是说， 评估多种品系中的每一种在通过测交系杂交来源于其的杂种后代中产生所需表型的能力。
     术语 “品种” 或 “栽培品种” 指一群在结构或遗传特征和 / 或特性上能与相同种中 的其他品种区分的相似的植物。
     发明详述
     本发明提供了一种用于生产欧洲油菜杂种种子的商业上可行的系统。 该系统使用 了显性核雄性不育基因。可通过显性恢复系等位基因恢复能育性。本发明的贡献包括但不 限于 ：
     1. 提供条件性核雄性不育系， 其包含以纯合子存在的雄性不育基因 ( 基因型 MsMsrfrf)。 有可能通过提供用于作为本发明一部分的雄性不育基因的遗传标记， 从而提供 该品系。
     2. 提供一种通过经特定的热处理导入能育性， 繁殖以未改变类型存在的条件性雄 性不育系的方法。
     3. 提供欧洲油菜保持系， 其既不包含核雄性不育基因， 也不包含恢复系等位基因 ( 基因型 msmsrfrf) 的功能性拷贝。
     由于在所有杂交系统中雌性系的繁殖是主要的数量限制且昂贵的步骤， 因此现有 系统提供了在 2- 步操作中繁殖雌性系 ： 首先， 发现本发明的系统是一种环境敏感的核雄性 不育 (enms) 系统。由于在田间生长条件下不育性可能意外丢失， 因此大多数这些系统在商 业上并不可行， 而现有系统可通过高温处理转换开关， 因此上述不育性的意外丢失不太可 能在油菜籽正常生长的条件下发生。通过利用 enms 特性的本发明的自交方法， 使用该系统 提供了足够数量的预基础雌性系。
     在第二步中， 将预基础雌性系与保持系 (msmsrfrf) 杂交产生包含以杂合形式存 在的雄性不育基因 ( 基因型 Msmsrfrf) 的雄性不育基础雌性系。
     当在本文中使用时， 术语 “预基础雌性系 (prebasic female)” 指例如具有基因型 MsMsrfrf 的条件性 ( 例如高温调节的 ) 雄性不育欧洲油菜品系， 该基因型可例如获得自在 保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子 ( 参见以下第 1 节 “提供预基础雌株和种子 的方法” )， 其中所述欧洲油菜雌株是
     i. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育等 位基因 (Ms 等位基因 ) 是纯合的，
     ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保 持系等位基因 (rf 等位基因 ) 是纯合的，
     iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度时， 优势雄性不育， 和
     iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度时， 恢复优势雄性能育 表型。
     此外， 当在本文中使用时， 术语 “基础雌性系 (basic female)” 指例如具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物 ( 参见以下第 2 节 “基础种子生产” )， 其中所述 欧洲油菜雌株是
     i. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育等 位基因 (Ms 等位基因 ) 是杂合的，
     ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保持系等位基因 (rf 等位基因 ) 是纯合的，
     iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度时， 优势雄性不育， 和
     iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度时， 恢复优势雄性能育 表型。
     在杂种种子生产中预基础和基础雄性不育雌性系都适合作为雌性系。
     最后， 当在本文中使用时， 术语 “保持系” 指具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲 油菜植物， 其基因型存在于在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子中 ( 参见以下 第 2.1 节， “保持系” )， 其中所述欧洲油菜植物是
     i. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子的能育等位基 因 (ms 等位基因 ) 是纯合的，
     ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保持系等位 基因 (rf 等位基因 ) 是纯合的， 和
     iii. 优势雄性能育。
     本发明的杂交系统的特殊优点在于实际上每个可能获得的油菜籽品系都包含功 能性恢复系等位基因， 并且能用作为雄性能育系以与 ( 雄性不育 ) 雌性系组合来产生杂种 种子。
     在提供商业上可行的核雄性不育杂交系统中， 一个最阻碍的困难是繁殖和增殖 ( 雄性不育 ) 雌株。在大多数系统中， 仅起始于对于 Ms 等位基因是杂合的植物的繁殖是可 行的。这就导致需要选取所有那些作为完全缺少 Ms 等位基因的自交结果的植物。因此， 其 对于提供条件性不育系统是有利的， 其中能育性 / 不育性可基于在正常生长条件下不存在 的以及其中能育性 / 不育性的分布几乎完整的因素而被转换开 / 关。迄今为止没有描述这 样的在商业上可行的系统。
     现在， 令人惊奇地发现某些包含于 MSL 杂种种子中的组分可被利用来获得商业化 gms 系统。 在工作期间， 观察到惊人的且意外的与 Takagi 系统的相似性。 尽管本发明的杂交 系统的遗传学分离自杂交系 ( 事实上， 雄性不育植物最初选自市售 NPZ 杂交系 “Panther” ； 参见实施例 3)， 该杂交系不能与 Takagi 种质明确连锁 ( 以及在事实上被描述属于 cms 系 统 )， 但是仍有某些表型指示 ( 例如热敏感性 ) 来假定该遗传学至少的相似性。 基于业已开 发的 MSL 材料标记 ( 参见实施例 ) 以及通过利用这些标记， 分离了本发明系统的组分。然 而， 现在无法获得 Takagi 原系的种子， 因此不可能进行详细的比较。即使 Takagi 种质中的 遗传学会等同于在此描述的某一种质， 但是 Takagi 的原文以及 Theis(1990) 的相关的后继 工作都没有提供对于本发明下文所述内容的启示。如果不了解杂交系统的确切遗传， 那么 将其简化成商业上可行的方法就行不通。
     Theis 描述了如下的 Takagi 系统 ： 如果对于隐性雄性不育 (ms) 基因是纯合的植 物在非纯合的隐性形式中还包括了所谓的修饰基因 (md)， 则仅存在雄性不育植物。结果， Theis 推定一种隐性雄性不育基因和一种显性修饰基因。然而， 本发明人的发现完全不同 ： 通过提供标记， 使得在 Takagi 系统下的两种基因的分离变得有可能， 证实了显性雄性不 育 (Ms) 基因和隐性恢复系等位基因 (rf 等位基因 )。能育性恢复通过存在于所有基于非 Takagi 的品系 ( 事实上所有公众可得到的欧洲油菜品系 ) 中的显性恢复系等位基因 (rf 等 位基因 ) 是有可能实现的。显然， Theis 没有分离这两种基因， 也没有提供对于这些基因是纯合的品系 ( 如通过在其的杂交试验中的分离方式所证实的 )。如在本发明的上下文中所 证实的， Theis 错误命名为 “ms 等位基因” 的该基因无法同样地提供雄性不育表型。与此相 反， 其仅仅是恢复系等位基因 (rf) 的无活性形式。这种 Theis 命名为 “修饰基因” 的基因 事实上是雄性不育基因。 基于没有标记， 这样的分离分析可能是非常麻烦的事实， 这并不令 人惊奇。其他与 Ms 等位基因连锁的表型特性并不适合用于区分杂合个体和纯合个体。因 此， Theis 提供了令人误解的信息， 其会阻碍本领域技术人员开发商业上可行的杂交系统。 此外， 隐性雄性不育基因与商用杂交系统中的许多困难相关。同样从这一角度来看， Theis 的教导偏离了 Takagi 系统的商业应用。
     此外， 提供纯合的雄性不育系仍无法产生商业上可行的系统。两个重要的问题需 要解决 ： 首先， 纯合雄性不育 (Ms) 系 ( 在本发明的上下文中， 称为预基础雌株 ) 的繁殖问 题， 其使得所有其他迄今已知的核雄性不育系统在商业上都不可行。 其次， 提升至商业规模 的问题。该纯合 Ms 系的繁殖问题已为本发明通过提供条件性、 热诱导的再受精方法所解 决。该方法使雄性不育预基础系得以容易繁殖。
     尽管预基础雌株能大体上直接用作雌性系用于杂种种子的生产， 但是热处理步骤 并不适合于提供足够数量的所述品系。 因此， 本发明的方法使用了重新设计的步骤， 其中将 条件性雄性不育 ( 预基础雌性 ) 系与保持系杂交以再次提供雄性不育种子。该种子对于雄 性不育基因是杂合的， 但仍具有条件性雄性不育表型。只有通过提供既不具有功能性 ms 等 位基因又不具有功能性恢复系等位基因的保持系该繁殖才得以可能。 该重新设计的步骤是 商业上可行的系统所需要的。 有趣地以及作为本发明的具体创造性和有利特征， 能育恢复系等位基因存在于所 有非 -Takagi 系中， 即实际上存在于所有可获得的欧洲油菜品系中。这是有益的， 因为这意 味着实际上在杂种种子生产过程中所有品系都可用作雄性系， 无需基因渗入恢复系等位基 因。与例如 Ogura 系统相比， 这是一个明显的优点， 并且惊人地相似于其遗传学公众未知的 NPZ MSL 系统， 尽管 NPZ MSL 系统据说是一种细胞质雄性不育 (cms) 系统 (Frauen， 1999)。
     1. 提供预基础雌株和种子的方法
     本发明的第一个实施方案涉及一种生产或繁殖具有基因型 MsMsrfrf 的条件性 ( 高温调节的 ) 雄性不育欧洲油菜品系的种子 ( 适合作为预基础雌性系用于生产欧洲油菜 杂种种子 ) 的方法， 所述方法包括步骤
     a) 提供具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物， 该基因型存在于 在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子中， 其中所述条件性雄性不育欧洲油菜植 物是
     i. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育基 因 (Ms 等位基因 ) 是纯合的， 和
     ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 4148 下保藏的欧洲油菜种子的保持 系等位基因 ( 功能失常的恢复系等位基因 ； rf 等位基因 ) 是纯合的。和
     iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度时， 优势雄性不育， 和
     iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度时， 恢复优势雄性能育 表型， 和
     b) 将所述条件性雄性不育欧洲油菜植物暴露于高于 35℃的温度至少 4 小时， 和
     c) 将步骤 (b) 中获得的热处理的条件性雄性不育欧洲油菜植物暴露于低于 33℃ 的温度， 直至雄性能育花发育， 和
     d) 使具有在步骤 (c) 中获得的所述雄性能育花的欧洲油菜植物自花传粉， 让种子 发育， 并收获种子， 其中所收获的种子特征在于它们是具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性 不育欧洲油菜品系的种子。
     术语 “基因型 MsMsrfrf” 指一种对于显性 Ms 等位基因是纯合的以及对于隐性保持 系等位基因 ( 也称为功能失常的恢复系等位基因或 rf 等位基因 ) 也是纯合的植物。该基 因型可存在于芸苔属植物， 优选欧洲油菜植物的任何遗传背景中， 前提是不存在功能性恢 复系等位基因 (Rf 等位基因 ) 拷贝。
     在本发明的一个优选的实施方案中， 在上述生产或繁殖具有基因型 MsMsrfrf 的 条件性雄性不育欧洲油菜品系的种子的方法的步骤 (a) 中提供的条件性雄性不育欧洲油 菜植物进一步特征在于
     iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于优选低于 25℃的温度， 更优选暴露于低 于 20℃的温度， 但至少在容许正常生长的温度例如至少 12℃， 优选至少 14℃， 更优选至少 16℃下之时， 优势雄性不育， 和
     iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于优选 35℃ -43℃的温度， 更优选暴露于 37℃ -40℃的温度， 最优选暴露于约 39℃的温度时， 恢复优势雄性能育表型 ； 最优选暴露如 下 ( 例如在步骤 b 中 ) 规定的优选的热处理时间以及随后在如下 ( 例如在步骤 c 中 ) 规定 的环境温度下生长。
     在本发明的一个优选的实施方案中， 在上述生产或繁殖具有基因型 MsMsrfrf 的 条件性雄性不育欧洲油菜品系的种子的方法的步骤 (b) 中， 条件性雄性不育欧洲油菜植物 在开花之前和 / 或开花期间暴露于约 35℃ - 约 43℃， 优选约 36- 约 42℃， 更优选约 37℃ - 约 41℃， 还更优选约 38- 约 40℃和最优选约 39℃的温度至少 4 小时， 优选至少 8 或 12 小时， 更优选至少 24 或 36 小时， 还更优选至少 48 或 96 小时和最优选至少 112 小时。
     在 本 发 明 的 一 个 进 一 步 优 选 的 实 施 方 案 中， 在上述生产或繁殖具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜品系的种子的方法的步骤 (c) 中， 将条件性雄性不育 欧洲油菜植物暴露于低于 30℃， 优选低于 28℃， 更优选 16-25℃， 还更优选 18-20℃的温度， 直至雄性能育花发育。
     对于 Ms 等位基因是纯合的欧洲油菜植物代表了本发明的贡献。因此， 本发明的另 一个实施方案涉及一种具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物， 其基因型 可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子， 其中所述条件性雄性不育欧洲 油菜雌株 ( 植株 )(femaleconditionally male sterile Brassica napus plant) 是
     i. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育基 因 (Ms 等位基因 ) 是纯合的，
     ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保 持系等位基因 ( 功能失常的恢复系等位基因 ； rf 等位基因 ) 是纯合的，
     iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度时， 优势雄性不育，
     iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度时， 恢复优势雄性能育 表型。在本发明的上下文中， 如上所述具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油 菜植物也称为 “预基础雌性系” 或 “预基础雌株” 。
     优选地， 所述具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物可获得自通 过本发明的生产预基础雌性种子的方法所生产的种子。本发明的另一个实施方案涉及种 子， 其生长成所述具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物、 所述植物的部 分， 以及所述植物在杂种种子生产过程中的应用。优选地， 所述植物的遗传背景不是杂种， 更优选其是一种欧洲油菜近交系。优选地， 所述植物部分选自种子、 小孢子、 原生质体、 细 胞、 胚珠、 花粉、 营养体部分、 子叶、 合子。
     在本发明的一个优选的实施方案中， 具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧 洲油菜植物， 其基因型可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子， 进一步 特征如下 ：
     iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于优选低于 25℃的温度， 更优选暴露于低 于 20℃的温度， 但至少在容许正常生长的温度例如至少 12℃， 优选至少 14℃， 更优选至少 16℃下之时， 优势雄性不育， 和
     iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于优选 35℃ -43℃的温度， 更优选暴露于 37℃ -40℃的温度， 最优选暴露于约 39℃的温度时， 恢复优势雄性能育表型 ； 优选暴露如本 文中所规定的优选的热处理时间以及随后在如本文所规定的环境温度下生长。
     在本发明的一个优选的实施方案中， 在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子用于 获得具有基因型 MsMsrfrf 的雄性不育欧洲油菜植物 ( 即在此所披露的预基础雌性系 )。 在 本发明的一个进一步优选的实施方案中， 任何 Norddeutsche Pflanzenzucht Hans-Georg Lembke KG(NPZ) 在德国基于他们的 MSL 系统生产的种子可用于获得具有基因型 MsMsrfrf 的雄性不育欧洲油菜植物。这样的种子的实例包括但不限于品系 Joker、 Pronto、 Panther、 Artus、 B aldur、 Elan、 Marcant、 Mendel、 Talent、 Taurus、 Tenno、 Titan、 Trabant、 Zeppelin、 Visby、 Horus 和 Siesta 的种子。其他可获得具有基因型 MsMsrfrf 的雄性不育欧洲油菜植 物的种子的实例包括但不限于如 Alkido、 Mika、 Fangio、 Elektra 和 Libretto 的种子。在 本发明的一个进一步优选的实施方案中， 在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子被用于生 产或繁殖具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物的种子的方法中， 如用于 以上所描述的方法中。
     本发明的预基础雄性不育系优选具有不大于 50μmol/ 克 9％水分含量的风干种 子 ( 小于 40μmol/ 克， 更优选 5-35μmol/ 克， 最优选 10-25μmol/ 克 ) 的总芥子油苷含 量。应当指出在预基础雌性系繁殖中利用的热处理 ( 如在加热室环境下 ) 在某些情况下， 增加芥子油苷含量至超过 30μmol/ 克的水平。同样， 由于在种子生产中的低结实率， 因此 从不育的基础雌性系收获的 F1 杂种可能超过 30μmol GSL。然而， 这并不是品系遗传的结 果， 而是因为环境胁迫之故， 与此同时由本发明的杂种植物 (F2 种子 ) 所产生的籽粒中芥子 油苷水平处于商用水平 ( 具有不超过 25μmol/ 克 9％水分含量的风干种子的总芥子油苷含 量 ( 优选 1-22μmol/ 克， 更优选 5-20μmol/ 克， 最优选 8-17μmol/ 克 ))。
     1.1Ms 等位基因， 其相关的表型和标记
     关于在布达佩斯条约下进行的保藏物以及关于 Ms、 Rf、 ms、 rf 等位基因或任何包 含它们的组合的基因型， 术语 “可获得” 指这些基因或基因型可获得自所述保藏材料， 但也可获得自其他材料。获得自其他材料的基因的序列可不同于所保藏的材料中基因的序列 (“变体” )。因此， 术语 “Ms 等位基因” 包含可获得自保藏材料的基因及其变体。因此， 在 本发明的一个优选的实施方案中， Ms 等位基因是存在于在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏 的种子中 Ms 等位基因或其遗传变体， 与存在于在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子中 的 Ms 等位基因相比， 该遗传变体赋予基本上相同的表型。在本发明的一个优选的实施方 案中， 在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子用于获得雄性不育等位基因 (Ms 等位基因 )。 在本发明的一个进一步优选的实施方案中， 雄性不育等位基因 (Ms 等位基因 ) 还可获得自 NorddeutschePflanzenzucht Hans-Georg Lembke KG(NPZ) 在德国基于他们的 MSL 系统生 产的种子。这样的种子的实例包括但不限于品系 Joker、 Pronto、 Panther、 Artus、 Baldur、 Elan、 Marcant、 Mendel、 Talent、 Taurus、 Tenno、 Titan、 Trabant、 Zeppelin、 Visby、 Horus 和 Siesta 的种子。其他可获得雄性不育等位基因 (Ms 等位基因 ) 的种子的实例包括但不 限于如 Alkido、 Mika、 Fangio、 Elektra 和 Libretto 的种子。此外， 雄性不育等位基因 (Ms 等位基因 ) 还可获得自 Syngenta( 或其附属公司之一 ) 生产的种子， 例如但不限于品系 NK Petrol、 NKKaribik、 NK Speed、 NK Octans、 NK Kick、 NK Technik、 NK Picolo、 NK Caravel 的种子。
     当在本文中使用时， “基本上相同的表型” 指赋予条件性 ( 优选高温调节的 ) 核雄 性不育表型的能力。
     优选地， 如果获得自其他来源， 则所述其他来源的起源是 Takagi(1970) 提供的突 变的品系。应当理解尽管 Ms 等位基因可获得自在保藏编号 NCIMB41480 下保藏的欧洲油菜 种子， 但所述 Ms 等位基因可获得自的其他来源仍可存在 ( 以相同或不同的形式存在 )。在 本发明的上下文中提供的基因和基因型 ( 无论获得自保藏物还是其他来源 ) 的相同和 / 或 相似性都可通过与所述基因或基因型连锁的下述一种或多种特性而得以证实。
     在本发明的上下文中利用的 Ms 等位基因的最主要特性和独特性质在于能育性能 通过实际上任何公众可获得的欧洲油菜品系 ( 除由 Takagi 种质产生的品系之外 ) 而得以 恢复， 但不为其种子在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的保持系所恢复的这一事实。本发明 所提供的保持系包含以纯合子 (rfrf) 存在的保持系等位基因 ( 功能失常的恢复系等位基 因 )， 而 “常规的” 欧洲油菜植物则包含以功能型 (RfRf) 存在的恢复系。除来源于 Takagi 种质的种质之外， 尚不知道不包含至少一个 Rf 等位基因功能拷贝的品系。结果， 发现在本 发明之日实际上所有可获得的油菜籽品系都是恢复系。推测在 Takagi 种质中出现双突变 的两种基因 Ms 和 rf 的存在对于本发明所披露的功能性杂交系统是必不可少的。这还意味 着通过使用保藏材料， Ms 或 rf 等位基因的存在可容易地确定。基于 Ms 等位基因的雄性不 育系可通过与其种子在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的保持系杂交得以 “保持” 其雄性不 育表型， 但还可通过与任何恢复系杂交而得以恢复能育性 ( 参见以下实施例 )。
     因此， Ms 等位基因与雄性不育表型连锁， 所述雄性不育表型可为任何包含至少一 个显性 Rf 等位基因的植物当在本文中提及时， 所谓的 “恢复系植物” ) 恢复 ( 至少在后代的 一部分中 ) 能育性， 但不为来源于在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子 ( 保持系 ) 的植 物恢复能育性。因此， Ms 等位基因优选具有赋予条件性核雄性不育表型的特性， 其
     a) 通过暴露于高于 35℃的温度， 暂时恢复能育性，
     b) 在 至 少 一 部 分 的 F1 植 物 中 恢 复 能 育 性， 所 述 F1 植 物 获 得 自 具 有 基 因 型MsMsrfrf 或 Msmsrfrf 的雄性不育植物与任何包含至少一个显性 Rf 等位基因的欧洲油菜植 物的杂交， 和
     c) 在 F1 植物中得以保持， 所述 F1 植物获得自具有所述 Ms 等位基因赋予的条件性 雄性不育表型的植物与来源于在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子的雄性能育植物的 杂交。
     在本发明的一个优选的实施方案中， Ms 等位基因优选具有赋予条件性核雄性不育 表型的特征， 其
     a) 通过暴露于高于 35 ℃的温度， 优选暴露于 35 ℃ -43 ℃的温度， 更优选暴露于 37℃ -40℃的温度， 最优选暴露于约 39℃， 暂时恢复能育性 ； 优选暴露如本文中所规定的优 选的热处理时间以及随后在如本文所规定的环境温度下生长，
     b) 在 至 少 一 部 分 的 F1 植 物 中 恢 复 能 育 性， 所 述 F1 植 物 获 得 自 具 有 基 因 型 MsMsrfrf 或 Msmsrfrf 的雄性不育植物与任何包含至少一个显性 Rf 等位基因的欧洲油菜 植物的杂交， 或在所有 F1 植物中恢复能育性， 所述 F1 植物获得自具有基因型 MsMsrfrf 或 Msmsrfrf 的雄性不育植物与对于 Rf 等位基因是纯合的欧洲油菜植物， 即具有基因型 RfRf 的欧洲油菜植物的杂交。和
     c) 在 F1 植物中得以保持， 所述 F1 植物获得自具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性 不育植物 ( 例如一种具有所述 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型的植物 ) 与来源于在保藏 编号 NCIMB 41481 下保藏的种子的植物的杂交。
     “能育性的时序恢复” 指仅有在高温处理过程中诱导的花发育成雄性能育花， 而在 此之前或之后诱导的花则只发育成雄性不育花， 即使在同一植物上发育。 因此， 高温处理是 暂时的， 同样能育性恢复也是暂时的并且与高温处理的持续时间相关。
     因此， 通过将雄性不育植物与如下植物杂交
     a) 任何包含至少一个 Rf 等位基因， 优选对于 Rf 等位基因 ( 恢复系植物 ) 是纯合 的雄性能育、 自交的欧洲油菜植物， 和
     b) 来源于在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子的植物，
     可清楚地鉴定 Ms 等位基因的存在与否。
     “恢复系植物”或 “恢复系”指任何包含至少一个 Rf 等位基因的能育的、 自交 的欧洲油菜植物， 优选对 Rf 等位基因是纯合的。恢复系植物包括所有被商业化作为种 子用于栽培的 ( 开放传粉的， 非杂种 ) 欧洲油菜能育近交系， 优选在本发明的优先权日 之前。本发明人没有发现例外。合适的恢复系还包括在 2006 年 12 月 OECD 品种列表 上的那些恢复系 ( 确认合格的 OECD 品种列表 -2006/2007 ； 2006 年 12 月 ； http://www. oecd.org/dataoecd/1/44/33999447.PDF ； http://www.oecd.org/document/14/0， 2340， en_2649_33909_2485070_1_1_1_1， 00.html)， 优选被商业化作为种子用于栽培 ( 用于油料 生产 ) 的非杂交系， 更优选在所述 OECD 列表上那些没有标记为 “d” ( 只要它们代表杂交亲 本系， 就是近交系 ) 或 “b” ( 杂种 ) 的品种。
     虽然该特性是只有在下文中提供的本发明的杂交系统才有的， 但仍有其他与 Ms 等位基因连锁或与之相关的特性。在本发明的一个优选的实施方案中， 条件性雄性不育表 型和 / 或 Ms 等位基因与选自如下的一种或多种特性连锁和 / 或与之相关
     I. 在具有 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型的植物中的芽败育表型，II. 在具有 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型的植物中的白色条纹或白色斑点花 瓣表型， 和
     III. 在包含至少一个拷贝的 Ms 等位基因的雄性能育和雄性不育植物中， 存在 Ms 等位基因特异性标记。
     在本发明的另一个优选的实施方案中， 条件性雄性不育表型和 / 或 Ms 等位基因与 选自由如下组成的组 (“MS 基因标记组” ) 的一种或多种标记 (Ms 等位基因标记 ) 连锁和 / 或与之相关
     I. 选自由如下组成的 NR1116 标记区中多态性 ( 突变 ) 组的标记
     a) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 85 位的位置处的 A 的单核苷酸多态性标记，
     b) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 87 位的位置处的 G 的单核苷酸多态性标记，
     c) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 139 位的位置处的 A 的单核苷酸多态性标 记，
     d) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 214 位的位置处的 C 的单核苷酸多态性标 记，
     e) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 218 位的位置处的 G 的单核苷酸多态性标 记，
     f) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 277 位的位置处的 G 的单核苷酸多态性标 g) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 286 位的位置处的 A 的单核苷酸多态性标 h) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 312 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标 i) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 319 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标 j) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 359 位的位置处的 C 的单核苷酸多态性标记，
     记，
     记，
     记，
     记， k) 在位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 221 位的位置处的 5′ -TTGGTGAACAATC-3′ 缺失突变，
     1) 在位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 328-330 位的位置处的 5′ -GAA-3′插入突 变，
     II. 选自由如下组成的 NR2525 标记区中多态性组 ( 突变 ) 的标记
     a) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 60 位的位置处的 A 的单核苷酸多态性标记，
     b) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 92 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标记，
     c) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 105 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标 记，
     d) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 158 位的位置处的 C 的单核苷酸多态性标 记，
     e) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 431 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标 记，
     f) 在位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 82 位的位置处的单核苷酸缺失突变， g) 在位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 17-25 位的位置处的 5′ -TGAGCAAAA-3′缺 III. 选自由如下组成的 SNP 标记组的标记 a) 在使用包含 SEQ ID NO ： 12 所示的核苷酸序列 ( 不育等位基因特异性探针 的 SNP 检 测 )失突变，
     HiNK6701) 的 SNP- 探 针 (SNP- 探 针 1) 的 SNP 检 测 ( 优 选 基 于中， 阳性信号， 和使用包含 SEQ ID NO ： 11 所示的核苷酸序列 ( 能育等位基因特异性探针 HiNK6700) 的 SNP- 探针 (SNP- 探针 2)， 阴性信号，
     b) 在使用包含 SEQ ID NO ： 17 所示的核苷酸序列 ( 不育等位基因特异性探针 HiNK6775) 的 SNP- 探 针 (SNP- 探 针 3) 的 SNP 检 测 ( 优 选 基 于 的 SNP 检 测 ) 中， 阳性信号， 和使用包含 SEQ ID NO ： 18 所示的核苷酸序列 ( 能育等位基因特异性探针 HiNK6776) 的 SNP- 探针 (SNP- 探针 4)， 阴性信号，
     IV. 选自由如下组成的 SSR 标记组的标记 ：
     a) 由使用 SEQ ID NOs ： 1 和 2 所示的引物的 PCR 反应产生的具有 96.7(+/-1.0)bp 的表观分子量的 PCR 片段， b) 由使用 SEQ ID NOs ： 4 和 5 所示的引物的 PCR 反应产生的具有 192.8(+/-0.3) bp 的表观分子量的 PCR 片段， 和
     V. 选自与 SEQ ID NOs ： 3、 6、 11 和 18 所示的序列至少之一连锁的标记组的标记，
     其中一种或多种标记 (Ms 等位基因标记 ) 还包括选自如下序列的分离的核苷酸序 列， 所述序列
     I. 与在上述 I.-V. 中定义的标记序列具有至少 80％的序列同一性， 或
     II. 在严格条件下与在上述 I.-V. 中定义的标记序列杂交， 或
     III. 包含在上述 I.-V. 中定义的标记序列的至少 25 个连续的核苷酸。
     在一个优选的实施方案中， 条件性雄性不育表型和 / 或 Ms 等位基因与选自 NR1116 标记区中多态性 ( 突变 ) 组的标记连锁和 / 或与之相关， 所述 NR1116 标记区由至少 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11 或 12 个组 I 的突变组成， 更优选由至少在相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 214 位 (T/C) 和第 218 位 (T/G) 的位置处的突变组成。优选地， 该 NR1116 标记区存在至少 1、 2、 3、 4、 5、 6 或 7 个组 II 的突变， 更优选存在至少在相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 158 位的位 置处的突变。
     此外， 与条件性雄性不育表型和 / 或 Ms 等位基因连锁和 / 或与之相关的上述组 V 的一种或多种标记可与 SEQ ID NOs ： 3、 6、 11 和 18 所示的 1、 2、 3 条或所有的序列连锁。
     如上所述的标记可用于本发明的多个其他方面中。然而， 本发明的方面不限于使 用在本申请中披露的标记。 进一步强调的是这些方面还可使用没有在本文中明确披露的标 记或仍待鉴定的标记。
     术语 “SNP” 或 “单核苷酸多态性” 指当在物种成员之间或个体中配对染色体或等 位基因之间， 优选在基因组 ( 或其他共有序列 ) 中单核苷酸 ( 优选 A、 T、 C 或 G) 不同时， 发 生的核苷酸 ( 优选 DNA) 序列变异。例如， 来自不同个体的两条测序的 DNA 片段， AAGCCTA 对 AAGCTTA， 包含了单个核苷酸的差异。在该情况下， 可以说存在两个等位基因 ： C 和 T。单核 苷酸多态性可落入基因的编码序列、 基因的非编码区或基因间的基因间区中。由于遗传密
     码的简并性， 编码序列中的 SNPs 可未必改变所产生的蛋白的氨基酸序列。其中两种类型都 产生相同的多肽虚序列的 SNP 称为 “同义的” ( 有时称为沉默突变 )， 如果产生了不同的多 肽序列， 则它们是非同义的。没有位于蛋白编码区中的 SNPs 仍可具有基因剪接、 转录因子 结合或非编码 RNA 序列的结果。然而， 像这样的 SNP 可能根本不具有功能相关性， 并且可能 仅仅与某一表型和 / 或基因型 “连锁” 或相关 ( 即与所述基因型和 / 或表型具有一定可能 性的分离 )。术语 “SNP- 探针” 指适合于检测 SNP 的探针， 更优选适合于自动化检测的标记 的探针 ( 如下所述 )。
     短语 “相应于 SEQ ID NO ： Y 中第 X 位的位置” 指 SEQ ID NO ： Y 所示的序列是共有 序列。在具体植物 ( 其中 SNP 存在与否有待检测 ) 中相应的序列 ( 在大多数情况下 ) 将不 同于所述共有序列。 然而， 在一个优选的实施方案中， 可确定在所述共有序列与所述具体植 物中的所述序列的比对中的序列同一性。序列比对是一种排列核苷酸 ( 例如 DNA) 的一级 序列以鉴定可能是序列之间功能上、 结构上或进化关系上结果的相似性区域的方法。比对 的核苷酸残基序列 Aligned 通常在矩阵中排成行。空位可插入残基之间， 使得具有同一或 相似特性的残基能在连续的栏中进行比对。可通过例如 ClustalW 或 BLAST 程序产生序列 比对。如果在一次比对中两条序列享有共同的祖先， 则错配可解释为点突变以及空位可解 释为 indels( 即插入或缺失突变 )， 即由于它们彼此趋异， 从而在漫长的时间中导入到一个 或两个谱系中的突变。 因此， 作为缺失和突变的结果， 所述具体植物中的序列与共有序列的 长度可以不同。结果， 特异性 SNP 的绝对位置 ( 如由序列起点所测定的 ) 也可以不同。然 而， 当以适当的方式进行比对时， 那些位置仍然彼此匹配。短语 “相应于 SEQ ID NO ： Y 中第 X 位的位置” 指这样的事实， 并因此意味着尽管在获得自具体植物的序列中绝对位置可以不 同， 但是在与共有序列 (“Y” ) 的比对中， 其仍会匹配所示位置 (“X” )。
     术语 “SNP 检测” 指任何一种本领域已知适合于检测或显现单核苷酸多态性的方 法。这些方法可例如基于杂交。通过将互补的 DNA 探针与 SNP 位点杂交， 业已开发了几种 调查 SNPs 的应用 (Rapley&Harbron， 2004)。这样的方法包括动力等位特异性杂交 (DASH)。 其他用于 SNP 检测的方法包括使用利用了包含荧光团和荧光猝灭剂的特异性工程化的单 链寡核苷酸探针的分子信标 (Abravaya 等， 2003)。SNPs 还可通过包含排列在小芯片上的 成百上千条探针的高密度寡核苷酸 SNP 阵列进行检测， 使得大量的 SNPs 能同时得到调查 (Rapley&Harbron， 2004)。 此外， 各种酶包括 DNA 连接酶、 DNA 聚合酶和核酸酶已用于产生高 保真 SNP 基因分型方法。另一种方法是基于限制性片段长度多态性 (RFLP)。业已基于 PCR 开发了多种 SNP 检测方法。这样的方法包括四引物 ARMS-PCR， 其在一次 PCR 反应中使用两 对引物来扩增两种等位基因。 Flap 核酸内切酶 (FEN) 是一种催化结构特异性切割的核酸内 切酶。该切割对错配高度敏感并能用于调查 SNPs， 具有高度特异性 (Olivier， 2005)。在基 础侵入者测定 (basic Invader assay) 中， 被叫做裂解酶的 FEN 与两条特异性寡核苷酸探 针结合， 其与靶 DNA 一起可形成为裂解酶所识别的三层型结构 (Olivier， 2005)。
     引物延伸是一种两步过程， 第一步包括探针与紧接 SNP 核苷酸上游碱基的杂交， 然后是 ‘微 测 序 (mini-sequencing)’反 应， 其 中 DNA 聚 合 酶 通 过 添 加 与 该 SNP 核 苷 酸 互补的碱基延伸杂交的引物。检测该掺入的碱基并确定 SNP 等位基因 (Syvanen， 2001 ； Rapley&Harbron， 2004)。Illumina 公司的 Infinium 检测是一种基于引物延伸法的全基因 组基因分型流水线的实例。 在 Infinium 检测中， 超过 100,000 条 SNPs 可被基因分型。 该检测在引物延伸反应中使用了半抗原标记的核苷酸 (Gunderson 等， 2006)。寡核苷酸连接酶 检测利用了 DNA 连接酶， 其催化 DNA 片段的 3′末端与直接相邻的 DNA 片段的 5′末端的连 接。 通过杂交两条直接跨越 SNP 多态位点的探针， 该机制可用于调查 SNP(Rapley&Harbron， 2004)。
     在 本 发 明 的 上 下 文 中， 最优选的是使用检 测 来 检 测 SNPs。 术 语“检测” 通常指一种使用双重标记的荧光团探针 (TaqMan 探针 ； Heid 等， 1996) 的定量实时 PCR 法。在 PCR 指数期过程中， 而非在常规 PCR 终点， TaqMan 实时 PCR 通过荧光 即检测到荧光明显指 团测量产物积累。该产物的指数式增加则被用于确定阈值循环， CT， 数式增加时 PCR 循环的数目， 并且其与存在于反应中的 DNA 模板的拷贝数直接相关。不同 于常规 PCR， 在 TaqMan 实时 PCR 中， 将探针 ( 即与处于 DNA 模板中并位于两条引物之间的 20-60 个核苷酸的区段互补的单链寡核苷酸 ) 添加到反应中。荧光报道分子或荧光团 ( 例 如 6- 羧基荧光素， 简称 ： FAM， 或四氯荧光素， 简称 ： TET) 以及猝灭剂 ( 例如四甲基若丹明， 简称 ： TAMRA， 或二氢环吡咯并吲哚三肽 “小沟结合物” ， 简称 ： MGB) 被分别共价连接于探针 的 5′和 3′末端 (Kutyavin， 2000)。连接在探针上的荧光团和猝灭剂之间密切接近， 从而 抑制了来自荧光团的荧光。在 PCR 过程中， 当 DNA 合成开始时， Taq 聚合酶的 5′至 3′核 酸外切酶活性降解了一定比例的已退火到模板上的探针。 探针降解释放了来自其的荧光团 并破坏了与猝灭剂的密切相邻， 从而减轻了猝灭效应， 并产生了荧光团的荧光。因此， 在实 时 PCR 热循环仪检测到的荧光与在 PCR 中释放的荧光团和存在的 DNA 模板的量成正比。
     更具体地说， 对于 SNP 检测， 在 Taqman 检测中使用 Taq DNA 聚合酶的 5’ - 核酸酶 活性来进行 SNP 基因分型。Taqman 检测与 PCR 反应同时进行， 当 PCR 反应进行时可实时读 出结果 (McGuigan&Ralston， 2002)。该检测需要会扩增包括 SNP 多态位点的区域的正向和 反向 PCR 引物。使用结合有一种或两种与该 SNP 多态位点杂交的等位基因特异性探针 ( 优 选的 SNP- 探针， 例如本发明的 SNP- 探针 1、 2、 3 或 4) 的 FRET， 实现了等位基因区分。所述 探针 ( 例如本发明的 SNP- 探针 1、 2、 3 或 4) 优选具有与它们的核酸核心序列的 5’ 末端相 连的荧光团以及与它们的 3’ 末端相连的猝灭剂分子。当探针是完整的时候， 猝灭剂会留下 来接近荧光团， 除去荧光团的信号。在 PCR 扩增步骤过程中， 如果等位基因特异性探针与 SNP 等位基因完全互补， 则其会结合靶 DNA 链， 然后当其由 PCR 引物延伸 DNA 时为 Taq 聚合 酶的 5’ - 核酸酶活性所降解。探针降解导致荧光团与猝灭剂分子分离， 从而产生可检测的 信号。如果等位基因特异性探针没有完全互补， 则其会具有较低的解链温度并且不会有效 结合。这就阻止了核酸酶作用于探针 (McGuigan&Ralston， 2002)。该 Taqman 检测是基于 PCR 的， 并且对设备要求相对简单。该 Taqman 检测可通过在一次反应中组合多达 7 个 SNPs 的检测从而实现多重检测 (Syvanen， 2001)。还参见 Affymetrix(2007)Genome-Wide Human SNP Array 5.0.[ 在线 ] 网址 ： http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/ genome_wide/genome_wide_snp_5.affx( 检索日期 2007 年 2 月 27 日 )。用于基于 TaqMan 的 SNP 检测的试剂和详细实验方案是可获得且得以描述的 (US 5,876,930 ； Livak 等， 1995 ； Pre-Developed Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol ； 件号 4312214Rev.C 5/2005 ； Applied Biosystems)。
     另外的 SNP 检测法对于本领域技术人员是公知的， 并且是基于 DNA 的物理特性、 单 链构象多态性的， 使用了温度梯度凝胶电泳或变性高效液相色谱、 整个扩增子的高分辨率解链或测序。
     术语 “PCR 片段” 指通过利用一条或多条引物、 DNA 聚合酶 ( 优选耐热 DNA 聚合酶 ) 和一次或多次扩增循环， 获得自靶 DNA( 例如基因组 DNA) 扩增的核酸片段 ( 优选 DNA 片段 )。 聚合酶链反应 (PCR) 是一种经酶促复制用于指数式扩增 DNA 的生化和分子生物学技术。由 于 PCR 是一种体外技术， 因此其能得以进行而无针对 DNA 形式的限制， 并且可对其进行广泛 修改以执行大阵列的基因操作。
     术语 “表观分子量” 指如与分子量标准物比较所测量得到的分子 ( 例如 DNA 片段 ) 的分子量。例如， 该分子量可通过凝胶 ( 例如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶 ) 电泳 ( 以平板凝 胶、 毛细管或本领域已知的其他手段 ) 得到测量。优选地， 通过使用 DNA 测序仪和荧光标记 的探针作为标准物进行分子量测定。更具体地说， 当在本发明的上下文中使用时， 表观分 TM TM 子量指通过使用 3700DNA 分析仪或等效设备， 在与 GeneScan 500ROX 大小标准物 (ROXTM 染料标记的大小标准物， 用于片段分析数据的可重现大小分级 ) 相比下测定的分子量。该 TM TM GeneScan 500ROX 大小标准物被设计用来分级 35-500 个核苷酸范围内的 DNA 片段， 并提 供 35、 50、 75、 100、 139、 150、 160、 200、 250、 300、 340、 350、 400、 450、 490 和 500 个核苷酸的 16 TM 条单链标记片段。 由这些短片段产生的大小曲线使得 GeneScan 500ROXTM 大小标准物能理 想地用于多种片段分析应用中， 例如微卫星、 片段长度多态性和相对荧光定量。每条 DNA 片 TM 段都用 ROX 荧光团标记， 当在变性条件下运转时其产生单峰。
     在另一个优选的实施方案中， Ms 等位基因、 ms 等位基因和 / 或雄性不育表型进一 步特征在于定位于欧洲油菜染色体 N7 上， 优选处于标记序列 NR1116( 例如 SEQ ID NO ： 21) 和 NR2525( 例如 SEQ ID NO ： 22) 之间， 更优选与 NR1116 具有 2.8cM 的距离以及与 NR2525 具有 6.0cM 的距离， 还更优选处于 SNP 标记 SR0002A 和 SR0003B 之间， 最优选与 SR0002A 具 有大约 2.8cM 的距离以及与 SR0003B 具有大约 3.3cM 的距离。
     术语 “标记序列 NR1116” 指如 SEQ ID NO ： 21 所示序列及其变体， 该变体
     i) 与 SEQ ID NO ： 21 所示序列具有至少 80％的序列同一性， 或
     ii) 在严格条件下与 SEQ ID NO ： 21 所示序列杂交， 或
     iii) 包含 SEQ ID NO ： 21 所示序列的至少 25 个连续的核苷酸。
     术语 “标记序列 NR2525” 指如 SEQ ID NO ： 22 所示序列及其变体， 该变体
     i) 与 SEQ ID NO ： 22 所示序列具有至少 80％的序列同一性， 或
     ii) 在严格条件下与 SEQ ID NO ： 22 所示序列杂交， 或
     iii) 包含 SEQ ID NO ： 22 所示序列的至少 25 个连续的核苷酸。
     术语 “SNP 标记 SR0002A” 指包含通过 SEQ ID NOs ： 8 和 10 所示的引物对扩增的 SNP 突变的片段， 其优选在使用包含 SEQ ID NO ： 12 所示的核苷酸序列 ( 不育等位基因特异 性探针 HiNK6701) 的 SNP- 探针 1 的 SNP 检测 ( 优选基于 的 SNP 检测 ) 中， 对于 能育等位基因， 产生阴性信号， 以及优选在使用包含 SEQ ID NO ： 11 所示的核苷酸序列 ( 能 育等位基因特异性探针 HiNK6700) 的 SNP- 探针 2 中， 产生阳性信号 ( 以及对于不育等位基 因则结果是相反的 )。
     术语 “SNP 标记 SR0003B” 指包含通过 SEQ ID NOs ： 15 和 16 所示的引物对扩增的 SNP 突变的片段， 其对于能育等位基因， 优选在使用包含 SEQ IDNO ： 17 所示的核苷酸序列 ( 不育等位基因特异性探针 HiNK6775) 的 SNP- 探针 3 的 SNP 检测 ( 优选基于36的101861390 A CN 101861391说明书27/93 页SNP 检测 ) 中产生阴性信号， 以及优选使用包含 SEQ ID NO ： 18 所示的核苷酸序列 ( 能育等 位基因特异性探针 HiNK6776) 的 SNP- 探针 3， 产生阴性信号 ( 以及对于不育等位基因则是 相反的 )。
     因此， 以纯合子存在的雄性不育基因 (Ms 等位基因 ) 与雄性不育表型连锁， 其
     - 可通过与任何包含至少一个显性功能性 Rf 等位基因 ( 恢复系等位基因 ) 的植物 杂交恢复能育性， 和
     - 能通过与来源于在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子的植物 ( 保持系 ) 杂交 得以保持，
     其中所述 Ms 等位基因选自
     a) 可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的 Ms 等位基因， 和
     b) 具有相同的表型特性的其变体 ( 即与雄性不育有关 )。
     更优选， 所述 Ms 等位基因是处于在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子中的 Ms 等位基因， 其与一种或多种选自如下的特性连锁和 / 或与之相关 ：
     I. 在具有 Ms 等位基因赋予的条件性雄性不育表型的植物中的芽败育表型，
     II. 在包含至少一个拷贝的 Ms 等位基因的雄性能育和雄性不育植物中， 一种或多 种选自 MS 基因标记组 ( 如上定义的 ) 的标记，
     III. 在具有 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型的植物中的白色条纹或白色斑点花 瓣表型，
     或所述 Ms 等位基因的变体， 其显示具有相同恢复特性的条件性雄性不育表型。
     因此， 在一个优选的实施方案中， 对于与雄性不育表型连锁的雄性不育基因 (Ms 等位基因 ) 具有基因型 MsMsrfrf 的雄性不育欧洲油菜植物是纯合的， 其
     - 通过与任何包含至少一种显性功能性 Rf 等位基因的植物 ( 恢复系 ) 杂交可恢复 能育性， 和
     - 其可通过与来源于在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子的植物 ( 保持系 ) 杂 交得以保持，
     其中所述的 Ms 等位基因选自
     a) 可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的 Ms 等位基因， 和
     b) 具有相同的表型特性的其变体 ( 即雄性不育 )。
     当在包含 Ms 基因 ( 即与 Rf 等位基因存在与否无关 ) 的雄性能育和雄性不育植物 中都存在与 Ms 等位基因标记 ( 如上定义的特性 II.) 的连锁时， 仅在雄性不育表型 ( 即在 Rf 等位基因不存在的情况下 ) 中可观察到芽败育和白色条纹或白色斑点花瓣的表型特性 ( 分别是特性 I. 和 III.)。因此， 该观察结果能容易地区分雄性不育和雄性能育植物。
     应当理解， 尽管在保藏的种子中 Ms 等位基因与 Ms 等位基因标记 ( 如上定义的特 性 II.) 和 / 或芽败育和 / 或白色条纹或白色斑点花瓣的表型特性 ( 分别是如上定义的特 性 I. 和 III.) 连锁， 但是在育种计划过程中， 可能存在这样一种情况， 在该情况下所述连锁 可能丢失或被有意或无意破坏。破坏所述连锁的可能性取决于标记与 Ms 等位基因的距离。 本领域技术人员熟知如何破坏标记和所连锁的基因之间的连锁。然而， 还是有可能通过额 外的标记分析、 表型分析或杂交实验来证实在这样的具有保藏的种子中的 Ms 等位基因的 改性品系中 Ms 等位基因的一致性。对于白色条纹或白色斑点花瓣的表型 ( 特性 III.)， 迄今为止尚不清楚其是否直接由 Ms 等位基因或与之紧密连锁的基因所致。存在某些该表型 无法观察到或不能清楚表达的品系。 然而， 还知道这样的表型可为其他表型所遮蔽， 例如在 花瓣中具有高水平类胡萝卜素表达的表型。迄今为止， 没有发现雄性不育表型和芽败育表 型 ( 特性 I.) 的分离。结果， 很可能该表型或是与 Ms 等位基因紧密连锁或就由之所引起。
     当涉及 Ms 或 ms 等位基因， 使用术语 “变体” 时， 指优选不影响 Ms 等位基因的功能 性但可影响其序列的遗传变异。在原系 ( 例如 Takagi 原系 ) 繁殖过程中， 可能会偶然发现 存在于 Ms 等位基因的基因序列中但不影响其功能的某些序列多态性或体细胞突变。这样 的突变可位于基因的功能非相关区域例如内含子中。 优选地， 与可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子的 Ms 等位基因或可获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子的 ms 等位基因相比， Ms 等位基因和 / 或 ms 等位基因变体的基因同一性大于 90％， 优选大于 95％， 更优选大于 98％。或者， 变体优选在严格条件 ( 优选中等严格条件， 更优选高严格条 件 ) 下仍与可获得自在保藏编号 NCIMB41480 下保藏的种子的 Ms 等位基因杂交。由于 Ms 等位基因是一种 ms 等位基因的功能失常的拷贝 ( 其可能是一种在欧洲油菜发育中与花粉 或花药有关的功能基因 ) 无法被排除 ( 事实上有可能 )， 因此关于 Ms 等位基因， 术语变体还 包括 ms 等位基因 ( 或如上定义的其变体 ) 的其他功能失常型， 只要那些变体能通过在保藏 编号 NCIMB 41481 下保藏的保持系保持不育性即可。这样的变体通过例如不同的突变、 缺 失、 截短等可不同于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子的 Ms 等位基因。 当涉及 Ms 或 ms 等位基因， 使用术语 “变体” 时， 还指在与上述 Ms 或 ms 等位基因 相同的区中定位的 Ms 或 ms 等位基因的变体， 即该变体也被定位在欧洲油菜染色体 N7 上， 优选处于标记序列 NR1116( 例如 SEQ ID NO ： 21) 和 NR2525( 例如 SEQ ID NO ： 22) 之间， 更优选分别与 NR1116 具有 2.8cM 的距离以及与 NR2525 具有 6.0cM 的距离， 还更优选处于 SNP 标记 SR0002A 和 SR20003B 之间， 最优选分别与 SR0002A 具有大约 2.8cM 的距离以及与 SR0003B 具有 3.3cM 的距离。该类型的变体还优选在严格条件 ( 优选中等严格条件， 更优 选高严格条件 ) 下与可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子的 Ms 等位基因杂交。 优选地， Ms 或 ms 等位基因的变体显示与对以上 Ms 等位基因所描述的具有相同的恢复特性 的条件性雄性不育表型。
     1.2rf 等位基因及其表型
     术语 “保持系等位基因” 、 “功能失常的恢复系等位基因” 或 “rf 等位基因” 指不 存在功能性恢复系等位基因 (rf 等位基因 )， 以及更具体地说， 可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 和 / 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的 rf 等位基因及其变体。该 rf 等位基因优选 与如下表型特性连锁并以如下表型特性为特征
     a) 不能恢复 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型的能育性， 和
     b) 能保持 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型。
     应当理解尽管保持系等位基因 ( 功能失常的恢复系等位基因 ； rf 等位基因或 rf) 可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 和 / 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子， 但可存在其他可 获得所述 rf 等位基因的来源。
     在本发明的一个优选的实施方案中， 在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子或在 保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子用于获得保持系等位基因 (rf 等位基因 )。
     在本发明的一个进一步优选的实施方案中， 保持系等位基因 (rf 等位基因 ) 还可
     获得自 Norddeutsche Pflanzenzucht Hans-Georg Lembke KG(NPZ) 在德国基于他们的 MSL 系统生产的种子。这样的种子的实例包括但不限于品系 Joker、 Pronto、 Panther、 Artus、 Baldur、 Elan、 Marcant、 Mendel、 Talent、 Taurus、 Tenno、 Titan、 Trabant、 Zeppelin、 Visby、 Horus 和 Siesta 的种子。其他可获得保持系等位基因 (rf 等位基因 ) 的种子的实例包括但 不限于如 Alkido、 Mika、 Fangio、 Elektra 和 Libretto 的种子。此外， 保持系等位基因 (rf 等位基因 ) 还可获得自 Syngenta( 或其附属公司之一 ) 生产的种子， 例如， 获得自品系 NK Petrol、 NK Karibik、 NK Speed、 NK Octans、 NK Kick、 NKTechnik、 NK Picolo、 NK Caravel 的种子。
     保持系等位基因 (rf 等位基因 ) 与雄性不育保持表型连锁， 其以纯合子存在使得 由 Ms 所致的雄性不育表型得以表达。所述雄性不育保持表型可通过至少一种功能性显性 Rf 等位基而你装。 所述 Rf 等位基因可获得自任何基于非 Takagi 的种质。 除来源于 Takagi 种质的种质之外， 尚不知道不包含至少一个功能性 Rf 等位基因拷贝的品系。结果， 实际上 发现在本发明之日可获得的所有油菜籽品系都是恢复系。
     在本发明的另一个优选的实施方案中， rf 等位基因、 Rf 等位基因和 / 或雄性不 育保持表型进一步的特征在于定位于欧洲油菜染色体 N19 上， 优选在标记序列 NR2219( 例 如 SEQ ID NO ： 23) 和 NR3454( 例如 SEQ ID NO ： 26) 之间， 更优选与 NR2219 具有 10.2cM 以及与 NR3454 具有 26.5cM 的距离， 最优选在标记序列 NR3454( 例如 SEQ ID NO ： 26) 和 PUT-161a-Brassica_napus-59218( 例如 SEQ ID NO ： 31) 之间， 更优选与 NR3454 具有 26.5cM 以及与 PUT-161a-Brassica napus-59218 具有 4.1cM 的距离。
     当在本文中使用时， 术语 “标记序列 NR2219” 指如 SEQ ID NO ： 23 所示序列及其变 体， 该变体
     i) 与 SEQ ID NO ： 23 所示序列具有至少 80％的序列同一性， 或
     ii) 在严格条件下与 SEQ ID NO ： 23 所示序列杂交， 或
     iii) 包含 SEQ ID NO ： 23 所示序列的至少 25 个连续的核苷酸。
     当在本文中使用时， 术语 “标记序列 NR3454” 指如 SEQ ID NO ： 26 所示序列及其变 体， 该变体
     i) 与 SEQ ID NO ： 26 所示序列具有至少 80％的序列同一性， 或
     ii) 在严格条件下与 SEQ ID NO ： 26 所示序列杂交， 或
     iii) 包含 SEQ ID NO ： 26 所示序列的至少 25 个连续的核苷酸。
     当在本文中使用时， 术语 “标记序列 PUT-161a-Brassica napus-59218” 指如 SEQ ID NO ： 31 所示序列及其变体， 该变体
     i) 与 SEQ ID NO ： 31 所示序列具有至少 80％的序列同一性， 或
     ii) 在严格条件下与 SEQ ID NO ： 31 所示序列杂交， 或
     iii) 包含 SEQ ID NO ： 31 所示序列的至少 25 个连续的核苷酸。
     因此， 保持系等位基因 (rf 等位基因 ) 以纯合子与雄性不育保持表型连锁， 该保持 系等位基因
     a) 不能恢复包含至少一个 Ms 等位基因的植物的能育性，
     b) 能保持包含至少一个 Ms 等位基因的植物的不育性，
     其中所述 rf 等位基因选自a) 可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的 rf 等位 b) 与恢复和保持 Ms 等位基因赋予的雄性不育有关的具有相同的表型特性的其变基因， 和
     体。 在本发明的另一个优选的实施方案中， 条件性雄性不育保持表型和 / 或 rf 等位基 因与一种或多种标记连锁和 / 或与之相关， 所述标记选自由 SSR 标记组成的组 (“rf 等位 基因标记组” )， 该 SSR 标记由具有 240.8(+/-0.4)bp 的表观分子量的 PCR 片段组成， 该 PCR 片段来自使用具有如 SEQ ID NOs ： 19 和 20 所示序列的引物的 PCR 反应。
     因此， 在一个优选的实施方案中， 对以纯合子与雄性不育保持表型连锁的保持系 等位基因 (rf 等位基因 )， 具有基因型 MsMsrfrf 或 msmsrfrf 的欧洲油菜植物是纯合的， 该 保持系等位基因
     - 不能恢复包含至少一个 Ms 等位基因的植物的能育性，
     - 能保持包含至少一个 Ms 等位基因的植物的不育性，
     - 与一种或多种选自 rf 等位基因标记组 ( 如上定义的 ) 的标记连锁，
     其中所述 rf 等位基因选自
     a) 可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的 rf 等位 基因， 和
     b) 具有相同的表型特性的其变体。
     在本发明的上下文中， 具有基因型 msmsrfrf 的欧洲油菜植物称为 “保持系” 或 “保 持系植物” 。
     当涉及 rf 或 Rf 等位基因使用时， 术语 “变体” 指优选不影响 rf 等位基因功能性 但可影响其序列的遗传变异。在原系 ( 例如 Takagi 原系 ) 繁殖过程中， 可能会偶然发现存 在于 rf 等位基因的基因序列中但不影响其功能的某些序列多态性或体细胞突变。这样的 突变可位于基因的功能非相关区域例如内含子中。优选地， 与可获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子的 rf 等位基因或可获得自任何恢复系的 Rf 等位基因相比， rf 等位基 因和 / 或 Rf 等位基因变体的基因同一性大于 90％， 优选大于 95％， 更优选大于 98％。或 者， 变体优选在严格条件 ( 优选中等严格条件， 更优选高严格条件 ) 下仍与可获得自在保藏 编号 NCIMB 41480 下保藏的种子的 rf 等位基因杂交。由于 rf 等位基因是一种 Rf 等位基 因 ( 其可代表一种涉及欧洲油菜中花粉或花药发育的功能基因 ) 的功能失常型无法被排除 ( 事实上其可能 )， 因此关于 rf 等位基因， 术语变体还包括 Rf 等位基因 ( 或如上定义的其 变体 ) 的其他功能失常型， 只要那些变体能保持在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的雄性不 育 Ms 系的不育性即可。这样的变异可不同于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的种子的 rf 等位基因， 例如通过不同的突变、 缺失、 截短等。
     已如上所述， 当涉及 rf 或 Rf 等位基因使用时， 术语 “变体” 还指在与上述 rf 或 Rf 等位基因相同的区中定位的 rf 或 Rf 等位基因的变体， 即该变体还定位于欧洲油菜染色体 N19 上， 优选处于标记序列 NR2219( 例如 SEQ IDNO ： 23) 和 NR3454( 例如 SEQ ID NO ： 26) 之 间， 更优选与 NR2219 具有 10.2cM 的距离以及与 NR3454 具有 26.5cM 的距离， 最优选处于标 记序列 NR3454( 例如 SEQ ID NO ： 26) 和 PUT-161a-Brassica_napus-59218( 例如 SEQID NO ： 31) 之间， 更优选与 NR3454 具有 26.5cM 的距离以及与 PUT-161a-Brassica_napus-59218 具
     有 4.1cM 的距离。该类型的变体还优选在严格条件 ( 优选中等严格条件， 更优选高严格条 件 ) 下与可获得自保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的种子的 rf 等位基因杂交。优 选地， 该 rf 或 Rf 等位基因的变体显示与对以上 rf 或 Rf 等位基因所描述的相同的表型特 性。
     1.3 优选的组合
     更进一步地， 在一个特别优选的实施方案中， 本发明涉及一种生产或繁殖具有基 因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜品系 ( 适合作为雄性不育预基础雌性系用于生 产欧洲油菜杂种种子 ) 的种子的方法， 所述方法包括步骤
     a) 提供具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物， 其基因型可获得 自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子， 其中所述条件性雄性不育欧洲油菜植 物是
     i. 对于与雄性不育表型连锁的雄性不育基因 (Ms 等位基因 ) 是纯合的， 所述雄性 不育表型可通过与任何包含至少一种显性功能性 Rf 等位基因 ( 恢复系基因 ) 的植物杂交 而得以恢复能育性， 以及其可通过与来源于在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子的植物 ( 保持系 ) 杂交而得以保持， 和其中所述 Ms 等位基因选自
     I) 可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的 Ms 等位基因， 和
     II) 具有基本上相同的表型特性 ( 即赋予核条件性雄性不育表型 ) 的其变体，
     和其中所述 Ms 等位基因优选是在在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子中与一 种或多种选自如下的特性连锁和 / 或与之相关的 Ms 等位基因 ：
     I. 在具有 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型的植物中的芽败育表型，
     II. 在包含至少一个拷贝的 Ms 等位基因的雄性能育和雄性不育植物中， 存在一种 或多种选自 MS 基因标记组 ( 如上定义的 ) 的标记，
     III. 在具有 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型的植物中的白色条纹或白色斑点花 瓣表型，
     或其变体， 其赋予核条件性雄性不育表型 ( 通过保持系 ( 如上定义的 ) 可保持的， 但通过任何包含 Rf 等位基因的植物可恢复能育性的 ； 并因此具有基本相同的表型特性 )，
     ii. 对于保持系等位基因 ( 功能失常的恢复系等位基因 ； rf 等位基因 ) 是纯合的， 其中以纯合子存在的所述保持系等位基因 (rf 等位基因 ) 与雄性不育保持表型连锁， 该雄 性哺育保持表型无法恢复包含至少一种 Ms 等位基因的植物的能育性， 以及能保持包含至 少一种 Ms 等位基因的植物的不育性， 和其中所述 rf 等位基因选自
     I) 可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的 rf 等位 基因， 和
     II) 具有相同的表型特性的其变体，
     以及其中所述 rf 等位基因优选为处于在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子中 的 rf 等位基因， 该等位基因与一种或多种选自 rf 等位基因标记组 ( 如上定义的 ) 的标记 连锁和 / 或与之相关，
     或所述 rf 等位基因的变体， 其具有基本上相同的表型特性 ( 即保持 Ms 基因赋予 的核条件性雄性不育表型 )，
     iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28 ℃的温度 ( 优选暴露于低于 25 ℃的温度， 更优选暴露于低于 20 ℃的温度， 但至少在容许正常生长的温度例如至少 12℃， 优选至少 14℃， 更优选至少 16℃下 ) 之时， 优势雄性不育， 和
     iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度 ( 优选 35℃ -43℃， 更 优选 37℃ -40℃， 最优选在约 39℃ ； 优选暴露如本文中所规定的优选的热处理时间以及随 后在如本文所规定的环境温度下生长 ) 时， 恢复优势雄性能育表型，
     b) 在开花之前和 / 或开花期间将所述条件性雄性不育欧洲油菜植物暴露于约 35-43 ℃的温度 ( 优选约 36 ℃ - 约 42 ℃， 更优选约 37 ℃ - 约 41 ℃， 还更优选约 38 ℃ - 约 40℃， 最优选约 39℃ ) 至少 4 小时 ( 优选至少 8 或 12 小时， 更优选至少 24 或 36 小时， 还更 优选至少 48 或 96 小时， 最优选至少 112 小时 )， 和
     c) 将步骤 b) 中获得的热处理的条件性雄性不育欧洲油菜植物暴露于低于 33℃的 温度 ( 优选低于 30℃， 更优选低于 28℃， 还更优选 14℃ -25℃， 最优选 18℃ -20℃ )， 直至雄 性能育花发育， 和
     d) 使具有在步骤 (c) 中获得的所述雄性能育花的欧洲油菜植物自花传粉， 让种子 发育， 并收获所述具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜品系的种子。
     对于 Ms 等位基因是纯合的欧洲油菜植物代表了本发明的贡献。因此， 本发明的另 一个实施方案涉及具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物， 该基因型可获 得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子， 其中所述条件性雄性不育欧洲油菜 雌株是
     i. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育基 因 (Ms 等位基因 ) 或其具有相同的表型特性 ( 即它们赋予核条件性雄性不育表型 ( 其是通 过保持系 ( 如上定义的 ) 可保持的， 但通过任何包含 Rf 等位基因的植物可恢复能育性 )) 的变体是纯合的， 其中所述雄性不育基因 (Ms 等位基因 ) 或其变体与雄性不育表型连锁， 通 过与任何包含至少一种功能性 Rf 等位基因 ( 恢复系等位基因 ) 的植物杂交， 其能恢复能育 性， 和通过与来源于在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子 ( 保持系 ) 的植物杂交其能被 保持， 以及其中所述 Ms 等位基因优选与选自如下的一种或多种特性连锁和 / 或与之相关 ：
     I. 在具有 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型的植物中的芽败育表型，
     II. 在包含至少一个拷贝的 Ms 等位基因的雄性能育和雄性不育植物中， 一种或多 种选自 MS 基因标记组 ( 如上定义的 ) 的标记， 和
     III. 在具有 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型的植物中的白色条纹或白色斑点花 瓣表型，
     ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保 持系等位基因 ( 功能失常的恢复系等位基因 ； rf 等位基因 ) 或其具有相同表型特性 ( 即它 们保持 Ms 基因赋予的核条件性雄性不育表型 ) 的变体是纯合的， 其中以纯合子存在的所述 保持系等位基因 (rf 等位基因 ) 或其变体与不能恢复包含至少一个 Ms 等位基因的植物能 育性以及其能保持包含至少一个 Ms 等位基因的植物的不育性的雄性不育保持表型连锁，
     iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度时， 优势雄性不育， 和
     iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度时， 恢复优势雄性能育 表型。
     在本发明的一个优选的实施方案中， 具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物， 该基因型可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子， 进一步 具有如下特征
     I. 当在开花之前和 / 或开花期间 ( 参见上述 iii.) 暴露于优选低于 25℃的温度， 更优选暴露于低于 20 ℃的温度， 但至少在容许正常生长的温度例如至少 12 ℃， 优选至少 14℃， 更优选至少 16℃下之时， 优势雄性不育， 和
     II. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于优选 35℃ -43℃的温度， 更优选暴露于 37℃ -40℃的温度， 最优选暴露于约 39℃的温度时， 恢复优势雄性能育表型 ； 优选暴露如本 文中所规定的优选的热处理时间以及随后在如本文所规定的环境温度下生长。
     在本发明的上下文中， 如上所述具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油 菜植物被称为 “预基础雌性系 ( 预基础雌株 )” 。
     1.4 热处理步骤
     使用热诱发的能育性诱导进行预基础雄性不育雌性系 ( 基因型 MsMsrfrf) 的繁 殖。
     在一个优选的实施方案中， 优势雄性不育和优势雄性能育表型之间的 “转换” 优选 指不是所有的植物和 / 或不是单株植物中所有的花都具有相同的表型 ( 不育性 / 能育性 )。 因此， 能育和不育的花可在一定程度上并行出现在同一植物上。然而， 本发明的条件性雄 性不育植物 ( 预基础或基础雌株 ) 优选在低于 30℃的温度下于单一植物上具有大于 80％ ( 优选大于 90％， 更优选大于 95％， 还更优选大于 98％ ) 的雄性不育花 ( 最优选基本上在 所有的植物上都不出现任何孕性花 (fertile flowers))， 但在高于 35℃的温度下产生大于 20％ ( 优选大于 40％， 更优选大于 60％， 最优选大于 80％ ) 的雄性能育花。雄性能育花与 雄性不育花的比率优选在热暴露结束后 1-2 周进行测定。如果应用约 1 周的热处理， 则该 比率优选在热暴露开始后约 2-3 周进行测定。 包含 Ms 等位基因 ( 以及没有 Rf 等位基因 ) 植物的雄性不育表型可通过暴露于高 温恢复为雄性能育表型， 所述高温优选约 35-43℃ ( 更优选 37℃ -40℃， 最优选约 39℃ )。 在开花之前和开花期间处于低于 28℃， 优选低于 25℃， 更优选 20℃的温度下仅存在雄性不 育表型。然而， 在开花之前和 / 或开花期间处于高于 35℃的温度下孕性花生长。发现在大 约 39℃的温度下存在花发育和热暴露之间的最佳比率， 即由升高温度所诱发的热胁迫导致 的损害易为植物所应付， 而反之雄性能育花的发育则足以被诱导来获得上述在同一植物上 雄性能育花与雄性不育花的比率。热暴露可在带有温度 ( 允许误差 ±1℃ ) 和湿度控制的 人工气候室 (Redeker Kaeltetechnik ； D-32791Lage， Germany) 中进行。 在一个进一步优选 的实施方案中， 在温室隔室中进行热暴露， 在其中可应用类似的温度动态变化。 还优选在生 长期期间在塑料大棚田地中进行热处理， 通过天然加热或使用任何类型的加热器进行额外 加热施加高温。甚至有可能将雄性不育植物保持在田地中， 如果在开花期期间生长的田地 提供了足够的温度水平的话。
     关于高温处理， 术语 “暴露” 指用高温进行处理， 优选另外处于最佳生长条件下如 处于高湿度 ( ＞ 80％ )、 施肥和作物保护处理等之下。
     暴露优选进行至少 4 小时， 优选至少 8 或 12 小时， 更优选至少 24 或 36 小时， 还更 优选至少 48 或 96 小时， 最优选至少 112 小时 ( “热处理时间” )。在正常 ( 环境 ) 温度 ( 优 选在约 19℃ -22℃ ) 下， 热处理时间可以是连续或断续的一段时间。优选地， 应用的热处理
     时间为 1-14 天， 更优选 3-10 天， 还更优选 4-9 天或 5-8 天， 最优选约 7 天。如上所述， 热处 理并不一定指在整个时间段内处于高温下的处理。在本发明的一个优选的实施方案中， 针 对预基础雌性系受精的热处理的实施具有白天温度 / 夜间温度改变， 以避免过度的温度胁 迫。这减少了对植物的热胁迫。优选在白天增加供热 ( 如上定义的 )， 而在夜晚温度减少供 热至低于 33℃， 优选低于 30℃， 更优选低于 28℃， 还更优选降低至 16-25℃， 最优选 19-22℃ 的温度。优选地， 通过将热处理时间调节至日∶夜时间段， 使之均匀分布于上述周期中。日 / 夜比为约 0.5 ∶ 1- 约 3 ∶ 1， 优选约 1 ∶ 1- 约 2.5 ∶ 1， 更优选约 1.2 ∶ 1- 约 2.0 ∶ 1， 最优选约 1.8 ∶ 1( 优选具有 39℃ ( 白天温度 )-21.5℃ ( 夜间温度 ) 的日夜间温度 )。在 本发明的一个优选的实施方案中， 再热处理 / 生长室中通过人造光调节日∶夜时间段。优 选使用至少 10000lux 的人造日光。
     取决于暴露的温度和时间， 植物可包含能育和不育的花。 然而， 如果在开花过程结 束之前停止热暴露， 则除雄性能育花之外可发育出额外的雄性不育花。 然而， 优选调节暴露 的温度和时间以产生具有多于 30％ ( 优选多于 50％ ) 雄性能育花的预基础植物。
     在热暴露和孕性花发育已被诱导后， 可将植物转移到 “常规” 条件 ( 通常低于 28℃ 的温度 )- 例如在温室中 ) 下并继续这些花的发育 ( 尽管不会诱导更多的孕性花， 但已诱导 的芽会开放为孕性花 )。优选地， 将热处理的欧洲油菜植物转移到具有低于 33℃， 优选低于 30℃， 更优选低于 28℃， 还更优选 16-25℃， 最优选 18℃ -20℃的温度的环境中 )， 直至雄性 能育花发育。通常， 植物在这些条件下保持约 5-14 天 ( 优选 5-7 天 )， 直至雄性能育花发 育。
     如此获得的雄性能育 Ms 预基础植物是 “自花受精的” ， 即它们能自花传粉。这样的 自花传粉能在具有或不具有人工干预的情况下发生。然而， 重要的是不发生与其他芸苔属 植物的异花传粉。因此， 植物或孕性花要与不同的传粉者保持隔离。可通过例如刷子介导 的花粉转移或其他本领域已知方法增加自交。在成功的传粉 ( 自交 ) 后， 热处理的 “已受 精” 植物可用作雄性系 ( 传粉者 ) 与作为雄性不育雌性系的相同基因型的无热处理的品系 相组合。可选地， 热处理的品系可用作单系， 即代表雌性系和雄性系。两种操作在此在此都 被理解为基于相同的遗传背景的自花传粉。在传粉后， 让已被传粉的植物发育为成熟的种 子， 如本领域技术人员所知的进行收获并贮存用于进一步的应用 ( 例如用于生产基础雌性 种子 )。
     应当指出 - 以及也是本发明的一个优选的实施方案 - 无需将所有预基础雄性不育 雌性系 ( 基因型 MsMsrfrf) 植物暴露于热处理用于获得预基础雄性不育雌性系的花粉。为 了获得足够量的花粉， 只要预基础雄性不育雌性系植物的一部分或只要这些植物的某些或 一些用升高的温度进行处理。 使用在经处理的植物中获得的花粉给其他预基础雄性不育雌 性系植物传粉。为了获得足够数量的花粉， 必须暴露于热处理中的植物的数目是本领域技 术人员已知的。
     2. 基础种子生产
     大体上， 预基础雌性系应适合作为 ( 雄性不育 ) 雌性系直接用于杂种种子的生产。 然而， 尽管可在相当大规模的程度 ( 在开花期之前或开花期过程中提供了足够的热量用于 雄性能育性诱导的气候室中或天然条件下进行生长 ) 上进行通过热处理步骤的繁殖， 但是 其在商业上吸引力较小， 原因在于加热室的专用设备所产生的额外费用， 或在天然条件下低的和 / 或不可控的种子产量。
     因此， 本发明的一项创造性贡献在于提供无需热处理繁殖雄性不育表型、 品系和 种子的步骤。其可通过将预基础 ( 雄性不育 ) 雌性系与不包含 Ms 等位基但仅包含保持系 等位基因 ( 功能失常的恢复系等位基因 ； 保持系 ； 基因型 msmsrfrf) 的保持系杂交而实现。 这样的杂交产生了仍然是雄性不育但仅包含一个拷贝的 Ms 等位基因的品系。该雄性不育 预基础雌性系和作为雄性系的保持系的杂交可用于在商业规模上提供雄性不育基础种子 ( 即雄性不育基础雌性系的种子 )。
     因此， 本发明的另一个优选的实施方案涉及一种生产具有基因型 Msmsrfrf 的条 件性雄性不育欧洲油菜品系种子的方法， 该品系适合作为 ( 雄性不育 ) 基础雌性系用于生 产欧洲油菜杂种种子， 所述方法包括步骤
     a) 提供作为雌株的具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育 ( 预基础 ) 欧洲油菜 植物， 该基因型可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子， 其中所述具有 基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜雌株是
     i. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育基 因 (Ms 等位基因 ) 是纯合的， 和
     ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保 持系等位基因 ( 功能失常的恢复系等位基因 ； rf 等位基因 ) 是纯合的， 和
     iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度时， 优势雄性不育， 和
     iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度时， 恢复优势雄性能育 表型， 和
     b) 提供作为雄株的具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育保持系欧洲油菜植物， 该 基因型可获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子， 其中所述具有基因型 msmsrfrf 的欧洲油菜植物是
     i. 对于可获得自在 NCIMB 保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子的能育等 位基因 ( 功能失常的雄性不育基因 ； ms 等位基因 ) 是纯合的， 和
     ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保持系等位 基因 ( 功能失常的恢复系等位基因 ； rf 等位基因 ) 是纯合的， 和
     iii. 优势雄性能育， 和
     c) 使步骤 b) 的雄株传粉给步骤 a) 的雌株， 让种子发育 ( 优选直至成熟 )， 并收获 种子， 其中收获的种子特征在于它们是具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜 品系 ( 即基础雌株 ) 的种子。
     对于预基础雌性系， Ms 等位基因和 rf 等位基因定义如上， 具有相同的参数选择。 能育等位基因 ( 功能失常的雄性不育基因 ； ms 等位基因 ) 定义如下。
     在本发明的一个优选的实施方案中， 在生产上述具有基因型 Msmsrfrf 的条件性 雄性不育欧洲油菜品系种子的方法的步骤 (a) 中提供的条件性雄性不育欧洲油菜植物进 一步特征如下
     a. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于优选低于 25℃的温度， 更优选暴露于低 于 20℃的温度， 但至少在容许正常生长的温度例如至少 12℃， 优选至少 14℃， 更优选至少 16℃下之时 ( 上述步骤 a 的子步骤 iii.))， 优势雄性不育， 和b. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于优选 35 ℃ -43 ℃的温度， 更优选暴露于 37℃ -40℃的温度， 最优选暴露于约 39℃的温度时， 恢复优势雄性能育表型 ； 最优选暴露如 本文中所规定的优选的热处理时间以及随后在如本文所规定的环境温度下生长。
     在本发明的一个优选的实施方案中， 在生产或繁殖上述具有基因型 Msmsrfrf 的 条件性雄性不育欧洲油菜品系的种子的方法的步骤 (b) 中提供的条件性雄性不育欧洲油 菜植物任选地具有不超过 25μmol/ 克 ( 优选 1-22μmol/ 克， 更优选 5-20μmol/ 克， 最优 选 8-17μmol/ 克 )9％水分含量的风干种子的总芥子油苷含量。
     在生产适合作为 ( 雄性不育 ) 基础雌性系用于生产欧洲油菜杂种种子的具有基因 型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜品系的种子的方法的一个优选的实施方案中， 用 作雌株并在步骤 a) 中提供的具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育 ( 预基础 ) 欧洲油菜 植物生长自已使用上述生产或繁殖具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜品系 的种子的方法生产的种子， 即通过
     a) 提供具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物， 该基因型存在于 在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子中， 其中所述条件性雄性不育欧洲油菜植 物是
     i. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育基 因 (Ms 等位基因 ) 是纯合的， 和
     ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 4148 下保藏的欧洲油菜种子的保持 系等位基因 ( 功能失常的恢复系等位基因 ； rf 等位基因 ) 是纯合的， 和
     iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度时， 优势雄性不育， 和
     iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度时， 恢复优势雄性能育 表型， 和
     b) 将所述条件性雄性不育欧洲油菜植物暴露于高于 35℃的温度至少 4 小时， 和
     c) 将步骤 (b) 中获得的热处理的条件性雄性不育欧洲油菜植物暴露于低于 33℃ 的温度， 直至雄性能育花发育， 和
     d) 使具有在步骤 (c) 中获得的所述雄性能育花的欧洲油菜植物自花传粉， 让种子 发育， 并收获种子， 其中所收获的种子特征在于它们是具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性 不育欧洲油菜品系的种子。
     优选地， 在基础雌性种子生产中使用的雄性系和 ( 雄性不育 ) 雌性系都基于相同 的遗传背景。 更优选地， 通过杂交系统相应基因的基因渗入欧洲油菜近交系中， 然后通过针 对所述品系进行至少 1 次 ( 优选 2、 3 或 4 次 ) 回交， 从而提供所述雄性系和所述 ( 雄性不 育 ) 雌性系。 例如， 基因渗入包括选自如下的一种或多种方法 ： 分离和转化、 常规育种、 谱系 选择、 杂交、 自花传粉、 单倍性、 双单倍体技术、 胚拯救、 单粒传法、 标记辅助育种、 诱发突变 以及回交。
     在本发明的一个优选的实施方案中， 可通过以交替带状培育相应的 ( 雄性不育 ) 雌株和雄株实现基础雌性种子的生产， 其中传粉者 ( 雄性能育系 ) 在传粉后抛弃。对于足 够的雌性系产量优选良好的传粉条件。母本和传粉者的比率应优选 2 ∶ 1、 3 ∶ 1 或 4 ∶ 1， 优选 3 ∶ 1。可通过使用具有 2/3 设置的播种机来设定该比率。如果在田地中进行生产， 则 每公顷 3-5 个蜂箱是有益的。如果旨在产生具有一致的 Msmsrfrf 基因型的预基础种子， 优选地， 如果在田地中 进行， 则在温度不增加超过 33℃， 优选 30℃的条件和 / 或场所中进行基础雌性种子的生产。 对于在早春种植的冬油菜， 大多数场所通常不是关键的。对于春油菜 ( 例如双低油菜 )， 具 有高于环境温度条件的场所 ( 瑞典， 加拿大 ) 是优选的。然而， 在该阶段于更高的温度下生 产并不是不利的。当温度超过 35℃时， 其仅仅会导致预基础雌性系能自花传粉并且所生产 的基础种子包含一定水平的预基础种子。然而， 预基础种子和基础种子都同样适合于生长 成用于生产杂种种子的雌株。因此， 对于预基础雌性系生产， 温度控制仅仅是任选的， 并且 较阻止预基础雌性系受精与高种子产量 ( 其在更高的温度下减产 ) 更相关。
     为避免用来自除保持系之外的其他植物的花粉异花传粉， 用于生产基础种子的 田地要与其他欧洲油菜植物， 优选其他芸苔属植物保持隔离。隔离距离为至少 500m， 优选 1km， 更优选 2km， 最优选 5km。
     业已发现与在这些生产步骤中使用的雄性能育植物相比， ( 雄性不育 ) 雌株延迟 开花。为了能最佳传粉， 因此优选通过选自如下的一种或多种方法同步化雄株和 ( 雄性不 育 ) 雌株的开花 ：
     i. 修剪雄性能育植物 ( 即开花部分 ) 以延迟开花直至 ( 雄性不育 ) 雌株开花 ( 优 选所述植在开花后立刻使用电动或机械切割器修剪大约 30cm)，
     ii. 使用生长和 / 或成熟延迟化学药品 ( 例如 FolicurTM， 一种具有生长调节特性 的杀真菌剂 ) 处理开花植物， 和
     iii. 延迟雄性能育亲本播种至多 3 周 ( 即与 ( 雄性不育 ) 雌株相比， ( 雄性能育 ) 雄株播种延迟至多 3 周 )。
     优选在低于 33℃， 优选低于 28℃， 更优选低于 25℃的温度下进行基础雌性种子和 / 或杂种种子的生产。
     从预基础到基础种子的繁殖效果通常为大约 1 ∶ 500-1 ∶ 1000。
     由该方法产生的基础 ( 雄性不育 ) 雌株代表了本发明的另一个发明目的。因此， 本发明的另一个实施方案涉及具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物， 其 中所述 ( 条件性雄性不育 ) 欧洲油菜雌株是
     i. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育等 位基因 (Ms 等位基因 ) 是杂合的， 和
     ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保 持系等位基因 ( 功能失常的恢复系等位基因 ； rf 等位基因 ) 是纯合的， 和
     iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度时， 优势雄性不育， 和
     iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度时， 恢复优势雄性能育 表型。
     在本发明的一个优选的实施方案中， 如上所述的具有基因型 Msmsrfrf 的条件性 雄性不育欧洲油菜植物进一步具有如下特征
     I. 当在开花之前和 / 或开花期间 ( 参见上述 iii.) 暴露于优选低于 25℃的温度， 更优选暴露于低于 20 ℃的温度， 但至少在容许正常生长的温度例如至少 12 ℃， 优选至少 14℃， 更优选至少 16℃下之时， 优势雄性不育， 和
     II. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于优选 35℃ -43℃的温度， 更优选暴露于37℃ -40℃的温度， 最优选暴露于约 39℃的温度时， 恢复优势雄性能育表型 ； 优选暴露如本 文中所规定的优选的热处理时间以及随后在如本文所定义的环境温度下生长 ( 参见上述 iv.)。
     在本发明的一个优选的实施方案中， 如上所述的具有基因型 Msmsrfrf 的条件性 雄性不育欧洲油菜植物的进一步的特征在于具有不超过 25μmol/ 克 9％水分含量的风干 种子， 优选 1-22μmol/ 克 9％水分含量的风干种子， 更优选 5-20μmol/ 克 9％水分含量的 风干种子， 最优选 8-17μmol/ 克 9％水分含量的风干种子的总芥子油苷含量。
     对于预基础雌性系， Ms 等位基因和 rf 等位基因如上定义具有相同的优先选择。 能 育等位基因 ( 功能失常的雄性不育基因 ； ms 等位基因 ) 定义如下。
     优选地， 具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物 ( 即基础雌株 ) 是
     i. 对于与雄性不育表型连锁的雄性不育等位基因 (Ms 等位基因 ) 是杂合的， 其可 通过与任何包含至少一个显性功能性 Rf 等位基因 ( 恢复系 ) 的植物杂交恢复能育性， 并且 可通过与来源于在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子 ( 保持系 ) 的植物杂交得以保持， 其中所述 Ms 等位基因选自
     I) 可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的 Ms 等位基因， 和
     II) 具有基本上相同的表型特性的其变体 ( 即赋予核条件性雄性不育表型 ( 通过 如上定义的保持系可保持的， 但通过任何包含 Rf 等位基因的植物可恢复能育性的 ))，
     以及其中所述 Ms 等位基因优选与选自如下的一种或多种特性连锁和 / 或与之相 关：
     I. 在具有 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型的植物中的芽败育表型， 和
     II. 在包含至少一个拷贝的 Ms 等位基因的雄性能育和雄性不育植物中， 一种或多 种选自 MS 基因标记组 ( 如上定义的 ) 的标记， 和
     III. 具有 Ms 等位基因赋予的雄性不育表型的植物中的白色条纹或白色斑点花瓣 表型，
     或赋予了核条件性雄性不育表型的其变体 ( 通过保持系 ( 如上定义的 ) 可保持 的， 但通过包含 Rf 等位基因的任何植物可恢复能育性 ； 因此具有基本上相同的表型特性 )，
     ii. 对于保持系等位基因 ( 功能失常的恢复系等位基因 ； rf 等位基因 ) 是纯合的， 其中所述保持系等位基因 (rf 等位基因 ) 以纯合子与雄性不育保持表型连锁， 其不能恢复 包含至少一个 Ms 等位基因的植物的能育性， 以及能保持包含至少一个 Ms 等位基因的植物 的不育性， 其中所述 rf 等位基因选自
     I) 可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的 rf 等位 基因， 和
     II) 具有相同的表型特性的其变体 ( 即保持 Ms 等位基因赋予的核条件性雄性不育 表型 )，
     以及其中所述 rf 等位基因优选是在在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子中与 一种或多种选自 rf 等位基因标记组 ( 如上定义的 ) 的标记连锁和 / 或与之相关的 rf 等位 基因，
     或所述 rf 等位基因的变体， 其具有基本上相同的表型特性 ( 即保持 Ms 基因赋予 的核条件性雄性不育表型 )，iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度 ( 优选低于 25℃的温 度， 更优选低于 20℃， 但至少在容许正常生长的温度例如至少 12℃， 优选至少 14℃， 更优选 至少 16℃下 ) 之时， 优势雄性不育， 和
     iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度 ( 优选 35℃ -43℃， 更 优选 37℃ -40℃， 最优选在约 39℃ ； 优选暴露如本文中所规定的优选的热处理时间以及随 后在如本文所规定的环境温度下生长 ) 时， 恢复优势雄性能育表型， 和
     v. 任选地具有不超过 25μmol/ 克 9％水分含量的风干种子 ( 优选 1-22μmol/ 克， 更优选 5-20μmol/ 克， 最优选 8-17μmol/ 克 ) 的总芥子油苷含量。
     另一方面， 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性 不育等位基因 (Ms 等位基因 ) 是杂合的植物对于能育等位基因 ( 功能失常的雄性不育等位 基因 ； ms 等位基因 ) 是杂合的。详细定义提供于下。
     在本发明的一个优选的实施方案中， 在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子被用 于生产具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物， 即根据本发明的基础雌性 系的方法中。在本发明的一个进一步优选的实施方案中， Norddeutsche Pflanzenzucht Hans-Georg Lembke KG(NPZ) 在德国基于他们的 MSL 系统生产的种子也可被用于生产具有 基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物的方法中。这样的种子的实例包括但不 限于品系 Joker、 Pronto、 Panther、 Artus、 Baldur、 Elan、 Marcant、 Mendel、 Talent、 Taurus、 Tenno、 Titan、 Trabant、 Zeppelin、 Visby、 Horus 和 Siesta 的种子。其他还可用于生产具 有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物的方法中的种子的实例包括但不限于 如 Alkido、 Mika、 Fangio、 Elektra 和 Libretto 的种子。此外， Syngenta( 或其附属公司之 一 ) 所生产的种子， 例如来自品系 NK Petrol、 NK Karibik、 NK Speed、 NK Octans、 NK Kick、 NKTechnik、 NK Picolo、 NK Caravel 的种子也可用于生产具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄 性不育欧洲油菜植物的方法中。
     优选地， 在用于杂种种子的生产系统中， 具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育 欧洲油菜植物适合作为基础雌性种子。
     在一个优选的实施方案中， 所述基础雌株可获得自通过本发明用于生产基础雌性 种子的方法所生产的种子。另一个实施方案涉及生长成所述具有基因型 Msmsrfrf 的条件 性雄性不育欧洲油菜植物的种子， 所述植物的部分， 以及所述植物在杂种种子生产过程中 的应用。优选地， 所述基础雌株的遗传背景不是杂种， 更优选其是近交的。所述植物部分优 选自包含种子、 小孢子、 原生质体、 细胞、 胚珠、 花粉、 营养体部分、 子叶、 合子的组。本发明 的其他优选的实施方案涉及在本发明的杂种种子生产系统中使用的植物成分 ： 预基础雌性 系、 保持系、 基础雌性系、 所得到的杂种植物和生长成所述植物的种子。
     基础种子 ( 即生长成基础雌株的种子 ) 的生产优选在通过使用条件性雄性不 育预基础雌性系和雄性能育保持系的田地中进行。优选将这两个品系以带状种植 ( 如 Sauermann&Lamp， 1997 所描述的 )。仅收获雄性不育预基础雌性系获得的种子。保持系仅 用于传粉者并在开花后移除并处置。
     2.1 保持系
     本发明的另一个实施方案涉及一种具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植 物 ( 在本发明的上下文中， 也称为 “保持系” )， 该基因型可获得自在保藏编号 NCIMB 41481下保藏的欧洲油菜种子， 其中所述雄性能育欧洲油菜植物是
     i. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子的能育等位基 因 ( 功能失常的雄性不育等位基因 ； ms 等位基因 ) 是纯合的， 和
     ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子的保持系等位 基因 ( 功能失常的恢复系等位基因 ； rf 等位基因 ) 是纯合的， 和
     iii. 优势雄性能育， 和
     iv. 任选地具有不超过 25μmol/ 克 ( 优选 1-22μmol/ 克， 更优选 5-20μmol/ 克， 最优选 8-17μmol/ 克 ) 的由所述植物产生的 9％水分含量的风干种子的总芥子油苷含量。
     rf 等位基因定义如上， 具有相应的参数选择。
     在本发明的进一步优选的实施方案中， 在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子用 作获得具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物 ( 即如上所述的保持系 ) 或用作提 供能育等位基因 ( 如上所述在 2.2 下的 ms 等位基因 ) 和 / 或保持系等位基因 ( 如上所述 在 1.2 下的 rf 等位基因 )， 以供本发明任一方法使用。
     本发明的一个进一步优选的方面涉及在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子 用于保持种子的条件性雄性不育的应用， 所述种子是在根据本发明的生产具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物 ( 即本发明的预基础雌性系 ) 的种子的方法 ( 即 在第 1 节中描述的方法 ) 中生严的。
     2.2ms 等位基因、 其相关的表型和标记
     术语 “ms 等位基因” 、 “能育等位基因” 或 “功能失常的雄性不育等位基因” 指不存 在功能性雄性不育等位基因 (Ms 等位基因或 Ms 基因 )， 以及更具体地说， 可获得自在保藏编 号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子的 ms 等位基因及所述等位基因的变体赋予了基本 上相同的表型 ( 即雄性能育表型 )。该 ms 等位基因优选与如下表型特性连锁和 / 或以如下 表型特性为特征
     a) 不能恢复由 Ms 等位基因所引起的雄性不育表型的能育性， 和
     b) 在不存在 Ms 等位基因的情况下不能赋予雄性不育表型。
     当这些特性只有是 ms 等位基因才有时， 存在其他与 ms 等位基因连锁或与之相关 的特性。在本发明的一个优选的实施方案中， ms 等位基因与一种或多种选自由如下组成的 组 (“ms 等位基因标记组” ) 的标记 (“ms 等位基因标记” ) 连锁
     I. 选自由如下组成的 NR1116 标记区中多态性 ( 突变 ) 组的标记
     a) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 85 位的位置处的 G 的单核苷酸多态性标记，
     b) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 87 位的位置处的 A 的单核苷酸多态性标记，
     c) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 139 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标 记，
     d) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 214 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标 记，
     e) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 218 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标 记，
     f) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 277 位的位置处的 A 的单核苷酸多态性标 记，g) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 286 位的位置处的 G 的单核苷酸多态性标 h) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 312 位的位置处的 A 的单核苷酸多态性标 i) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 319 位的位置处的 C 的单核苷酸多态性标 j) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 359 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标 k) 在相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 221 位的位置处的 5′ -TTGGTGAACAATC-3′插入 1) 在相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 328-330 位的位置处的 5′ -GAA-3′缺失突变， II. 选自由如下组成的 NR2525 标记区中多态性 ( 突变 ) 组的标记 a) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 60 位的位置处的 C 的单核苷酸多态性标记， b) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 92 位的位置处的 C 的单核苷酸多态性标记， c) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 105 位的位置处的 C 的单核苷酸多态性标 d) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 158 位的位置处的 A 的单核苷酸多态性标 e) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 431 位的位置处的 C 的单核苷酸多态性标记，
     记，
     记，
     记，
     突变，
     记，
     记，
     记， f) 具有位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 82 位的位置处的 T 的单核苷酸多态性标记，
     g) 在 位 于 相 应 于 SEQ ID NO ： 6 中 的 第 17-25 位 的 位 置 处 的 插 入 突 变 5′ -TGAGCAAAA-3′，
     III. 选自由如下组成的 SNP 标记组的标记
     a) 在使用包含 SEQ ID NO ： 11 所示的核苷酸序列 ( 能育等位基因特异性探针 HiNK6700) 的 SNP- 探针 (SNP- 探针 2) 的 SNP 检测中， 产生阳性信号， 和优选在使用包含 SEQ ID NO ： 12 所示的核苷酸序列 ( 不育等位基因特异性探针 HiNK6701) 的 SNP- 探针 (SNP- 探
     针 1) 的 SNP 检测 ( 优选基于
     的 SNP 检测 ) 中， 产生阴性信号， 和b) 在使用包含 SEQ ID NO ： 18 所示的核苷酸序列 ( 能育等位基因特异性探针 HiNK6776) 的 SNP 探针 (SNP- 探针 4) 的 SNP 检测中， 产生阳性信号， 和优选在使用包含 SEQ ID NO ： 17 所示的核苷酸序列 ( 不育等位基因特异性探针 HiNK6775) 的 SNP 探针 (SNP- 探 针 3) 的 SNP 检测 ( 优选基于
     的 SNP 检测 ) 中， 产生阴性信号，IV. 选自由如下组成的 SSR 标记组的标记
     a) 具 有 选 自 由 94(+/-0.9)bp、 110.4(+/-0.5)bp、 112.3(+/-0.4)bp 和 116.3(+/-0.4)bp 组成的表观分子量组的表观分子量的 PCR 片段， 该片段产生自使用具有 SEQ ID NOs ： 1 和 2 所示序列的引物的 PCR 反应，
     b) 具有 183.8(+/-0.4)bp 的表观分子量的 PCR 片段或无能育等位基因相关的 PCR 片段， 该片段产生自使用具有 SEQ ID NOs ： 4 和 5 所示序列的引物的 PCR 反应，
     其中一种或多种标记 (Ms 等位基因标记 ) 还包括选自如下序列的分离的核苷酸序列， 所述序列
     I. 与在上述 I.-IV. 中定义的标记序列具有至少 80％的序列同一性， 或
     II. 在严格条件下与在上述 I.-IV. 中定义的标记序列杂交， 或
     III. 包含在上述 I.-IV. 中定义的标记序列的至少 25 个连续的核苷酸。
     优选地， 存在至少 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11 或 12 个组 I. 的突变， 更优选地存在 至少位于相应于 SEQ ID NO ： 3 中第 214 位 (T/C) 和 218 位 (T/G) 的位置处的突变。优选 地， 存在至少 1、 2、 3、 4、 5、 6 或 7 个组 II. 中的突变， 更优选地， 存在至少位于相应于 SEQ ID NO ： 6 中第 158 位的位置处的突变。应当指出与 Ms 等位基因不同， 与 ms 等位基因相关的标 记变化更多。结果， 如上所示可能存在一条或多条具有不同表观分子量的条带。原因非常 简单 ： Ms 等位基因由一种未经历频繁的后发遗传修饰的单一种质来源产生的， 而 ms 等位基 因则是一种存在于不同的遗传背景中的欧洲油菜 “天然等位基因” ， 并且其的遗传环境受诸 多繁殖活动的影响。因此， 相关标记的明显更高的变异性是有可能的。
     业已如上所述， 标记可用于本发明的多个其他方面中。 然而， 本发明的这些方面并 不限于使用本申请中所披露的标记。 需要强调的是这些发明还可使用没有在本文中明确披 露的标记或仍待鉴定的标记。
     此外， 应当理解尽管能育等位基因 ( 功能失常的雄性不育等位基因 ； ms 等位基因 或 ms) 可获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子， 但可存在可获得所述 ms 等位基因的其他来源。事实上， ms 等位基因的存在是有规则的而非出现例外， 并且应当实 际上存在于所有的欧洲油菜种质中 ( 除来源于 Takagi 种质的种质以外 )。
     在本发明的一个优选的实施方案中， 在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子用于 获得能育等位基因 ( 如上定义的 ms 等位基因 )。
     以纯合子存在的能育等位基因 ( 功能失常的雄性不育等位基因 ； ms 等位基因 ) 与 雄性能育表型连锁。在杂合型 ( 即与 Ms 等位基因结合 ) 中， 其容许由 Ms 所引起的雄性不 育表型在纯合的 rf 等位基因 (rfrf ； 或换言之， 在不存在 Rf 等位基因的情况下 ) 存在下表 现。所述 ms 等位基因存在于任何基于非 -Takagi 的种质中。除来源于 Takagi 种质的种质 之外， 尚不知道不包含至少一个功能性 ms 等位基因拷贝的品系。因此， 以纯合子存在的能 育等位基因 ( 功能失常的雄性不育等位基因 ； ms 等位基因 ) 与雄性能育表型连锁， 其中所 述 ms 等位基因优选自
     a) 存在于在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的欧洲油菜种子中的 ms 等位基因， 和
     b) 具有相同的表型特性的其变体。
     在本发明的一个优选的实施方案中， 所述具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲 油菜植物在本发明的基础雌性种子生产方法中适合作为保持系。 另一个实施方案涉及生长 成所述具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物的种子， 所述植物的部分， 以及所述 植物在杂种种子生产方法中的应用。优选地， 所述植物的遗传背景不是杂种， 更优选地， 其 是自交的。
     另一个实施方案涉及生长成所述具有基因型 MsmsRfrf 或 msmsRfrf 的雄性能育欧 洲油菜杂种植物的种子， 所述植物的部分， 以及所述植物用于栽培用于油料生产的欧洲油 菜籽粒的应用。
     3. 杂种种子生产本发明的另一个实施方案涉及一种生产欧洲油菜的雄性能育杂种种子的方法， 所 述方法包括步骤
     a) 提供作为雌株的具有基因型 Msmsrfrf( 基础雌性系 ) 或 MsMsrfrf( 预基础雌性 系 ) 的条件性雄性不育欧洲油菜植物， 其中所述条件性雄性不育欧洲油菜雌株是
     i. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育等 位基因 (Ms 等位基因 ) 是杂合的 ( 基础雌性系 ) 或纯合的 ( 预基础雌性系 )， 和
     ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子的功 能失常的恢复系等位基因 (rf 等位基因 ) 是纯合的， 和
     iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度时， 优势雄性不育， 和
     iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度时， 恢复优势雄性能育 表型， 和
     b) 提供作为雄株的具有基因型 RfRf 的雄性能育欧洲油菜植物 ( 如下定义的 “恢 复系” )， 其中所述雄性能育欧洲油菜植物是
     i. 对于功能性恢复系等位基因 (Rf 等位基因 ) 是纯合的， 该等位基因可获得自任 何被商业化作为种子用于栽培的欧洲油菜能育近交系， 和
     ii. 优势雄性能育， 和
     c) 使步骤 b) 的雄株传粉给步骤 a) 的条件性雄性不育雌株， 让种子发育， 并收获所 述雄性能育杂种种子。
     在一个优选的实施方案中， 在上述生产欧洲油菜的雄性能育杂种种子的方法的步 骤 a) 中提供作为雌株的条件性雄性不育欧洲油菜植物具有基因型 Msmsrfrf( 即为上文中 所描述的基础雌性系 )。结果， 步骤 a) 中提供的雌株优选对于雄性不育等位基因 (Ms 等位 基因 ) 是杂合的。
     在一个进一步优选的实施方案中， 在上述生产欧洲油菜的雄性能育杂种种子的方 法的步骤 a) 中作为雌株提供的条件性雄性不育欧洲油菜植物进一步具有如下特征
     I. 当在开花之前和 / 或开花期间 ( 参见上述 iii. 在步骤 a) 下 ) 暴露于优选低 于 25 ℃的温度， 更优选暴露于低于 20 ℃的温度， 但至少在容许正常生长的温度例如至少 12℃， 优选至少 14℃， 更优选至少 16℃下之时， 优势雄性不育， 和
     II. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于优选 35℃ -43℃的温度， 更优选暴露于 37℃ -40℃的温度， 最优选暴露于约 39℃的温度时， 恢复优势雄性能育表型 ； 优选暴露如本 文中所规定的优选的热处理时间以及随后在如本文所规定的环境温度下生长 ( 参见上述 iv. 在步骤 a) 下 )。
     在一个进一步的实施方案中， 在上述生产欧洲油菜的雄性能育杂种种子的方法的 步骤 a) 中作为雌株提供的条件性雄性不育欧洲油菜植物进一步具有如下特征 ： 具有不超 过 25μmol/ 克， 优选 1-22μmol/ 克， 更优选 5-20μmol/ 克， 最优选 8-17μmol/ 克 9％水分 含量的风干种子的总芥子油苷含量。
     在生产欧洲油菜的雄性能育杂种种子的方法的一个优选的实施方案中， 在步骤 a) 中作为雌株提供的具有基因型 Msmsrfrf( 基础雌性系 ) 或 MsMsrfrf( 预基础雌性系 ) 的条 件性雄性不育欧洲油菜植物由已使用上述方法之一生产的种子生长成， 所述方法例如对于 预基础雌性系， 生产或繁殖具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜品系种子的方法， 所述方法包括步骤 ：
     a) 提供具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物， 其基因型存在于 在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子中， 其中所述条件性雄性不育欧洲油菜植 物是
     i. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育基 因 (Ms 等位基因 ) 是纯合的， 和
     ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 4148 下保藏的欧洲油菜种子的保持 系等位基因 ( 功能失常的恢复系等位基因 ； rf 等位基因 ) 是纯合的， 和
     iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度时， 优势雄性不育， 和
     iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度时， 恢复优势雄性能育 表型， 和
     b) 将所述条件性雄性不育欧洲油菜植物暴露于高于 35℃的温度至少 4 小时， 和
     c) 将步骤 (b) 中获得的热处理的条件性雄性不育欧洲油菜植物暴露于低于 33℃ 的温度， 直至雄性能育花发育， 和
     d) 使具有在步骤 (c) 中获得的所述雄性能育花的欧洲油菜植物自花传粉， 让种子 发育， 并收获种子， 其中所收获的种子特征在于它们是具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性 不育欧洲油菜品系的种子，
     或对于基础雌性系， 使用该上述生产具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧 洲油菜品系的种子的方法的优选的实施方案， 其中用作雌株并在该方法的步骤 a) 中提供 的具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育 ( 预基础 ) 欧洲油菜植物由已用上述生产或繁 殖具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜品系的种子的方法生产的种子生长 成， 即通过
     a) 提供具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物， 该基因型存在于 在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子中， 其中所述条件性雄性不育欧洲油菜植 物是
     i. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的欧洲油菜种子的雄性不育基 因 (Ms 等位基因 ) 是纯合的， 和
     ii. 对于可获得自在保藏编号 NCIMB 41480 或 4148 下保藏的欧洲油菜种子的保持 系等位基因 ( 功能失常的恢复系等位基因 ； rf 等位基因 ) 是纯合的， 和
     iii. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于低于 28℃的温度时， 优势雄性不育， 和
     iv. 当在开花之前和 / 或开花期间暴露于高于 35℃的温度时， 恢复优势雄性能育 表型， 和
     b) 将所述条件性雄性不育欧洲油菜植物暴露于高于 35℃的温度至少 4 小时， 和
     c) 将步骤 (b) 中获得的热处理的条件性雄性不育欧洲油菜植物暴露于低于 33℃ 的温度， 直至雄性能育花发育， 和
     d) 使具有在步骤 (c) 中获得的所述雄性能育花的欧洲油菜植物自花传粉， 让种子 发育， 并收获种子， 其中所收获的种子特征在于它们是具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性 不育欧洲油菜品系的种子。
     术语 “恢复系” 指任何对于 Rf 基因是纯合的芸苔属植物 ( 优选任何欧洲油菜植物 )( 即具有基因型 RfRf)。关于 Ms 基因， 这样的植物可具有任何 ms 和 Ms 等位基因的组合， 尽 管优选具有 msms 基因型， 原因在于其是 “天然” 能育等位基因表型。结果， 恢复系可具有选 自 msmsRfRf、 MsmsRfRf 和 MsMsRfRf 的基因型。优选地， 恢复系对于能育等位基因 ( 功能失 常的雄性不育等位基因 ； ms 等位基因 ) 是纯合的， 所述等位基因优选可获得自任何被商业 化作为种子用于栽培的欧洲油菜能育近交系， 或可获得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏 的种子。
     在另一个实施方案中， 上述生产欧洲油菜的雄性能育杂种种子的方法的步骤 b) 中提供的具有基因型 RfRf 的雄性能育欧洲油菜植物进一步特征在于具有不超过 25μmol/ 克， 优选 1-22μmol/ 克， 更优选 5-20μmol/ 克， 最优选 8-17μmol/ 克 9％水分含量的风干 种子的总芥子油苷含量。
     在最优选的实施方案中， 在收获前让步骤 c) 中发育的种子发育直至成熟。
     在本发明的一个较少优选的实施方案中， 恢复系是具有基因型 Rfrf 的雄性能育 欧洲油菜雄株， 其中雄性能育欧洲油菜植物是
     i. 对于功能性恢复系等位基因 (rf 等位基因 ) 是杂合的， 所述等位基因优选可获 得自任何被商业化作为种子用于栽培的欧洲油菜能育近交系， 和
     ii. 优势雄性能育， 和
     iii. 任选地具有不超过 25μmol/ 克 ( 优选 1-22μmol/ 克， 更优选 5-20μmol/ 克， 最优选 8-17μmol/ 克 )9％水分含量的风干种子的总芥子油苷含量。
     在本发明的一个优选的实施方案中， 将在保藏编号 NCIMB 41480 和 / 或 NCIMB 41481 下分别保藏的种子用于生产如本文中所描述的欧洲油菜的能育杂种种子的方法中。
     优选地， 在该杂种种子生产中使用的雄性能育系 ( 保持系 ) 和雌性雄性不育系 ( 基础雌性系或预基础雌性系， 优选基础雌性系 ) 是基于遗传多样性背景的。 可通过使用例 如 Knaak(1996) 中所描述的分子标记测定遗传距离。
     本发明的另一个优选的实施方案涉及具有基因型 MsmsRfrf 或 msmsRfrf 的雄性能 育欧洲油菜杂种植物， 其中所述雄性能育欧洲油菜杂种植物是
     i. 对于功能性恢复系等位基因 (rf 等位基因 ) 或保持系等位基因 ( 功能失常的恢 复系等位基因 ； rf 等位基因 ) 是杂合的， 和
     ii. 优势雄性能育， 和
     iii. 任 选 地 产 生 具 有 不 超 过 25μmol/ 克 ( 优 选 1-22μmol/ 克， 更优选 5-20μmol/ 克， 最优选 8-17μmol/ 克 ) 的由所述植物产生的 9 ％水分含量的风干种子的 总芥子油苷含量的籽粒 (F2 种子 ； 优选当通过不同的芸苔品种异花传粉时， 是基本上不存在 的 )。
     在一个优选的实施方案中， 上述具有基因型 MsmsRfrf 或 msmsRfrf 的雄性能育欧 洲油菜杂种植物优选产生具有不超过 25μmol/ 克， 优选 1-22μmol/ 克， 更优选 5-20μmol/ 克， 最优选 8-17μmol/ 克的由所述植物产生的 9％水分含量的风干种子的总芥子油苷含量 的籽粒 (F2 种子 ； 优选当通过不同的芸苔品种异花传粉时， 是基本上不存在的 )。
     本发明的另一个优选的实施方案涉及本发明的所述杂种芸苔属植物的部分， 优选 所述部分选自包含种子、 小孢子、 原生质体、 细胞、 胚珠、 花粉、 营养体部分、 子叶、 合子的组。
     在一个优选的实施方案中， 根据本发明的杂种种子的生产可通过以交替带状栽培相应的雌性 ( 雄性不育 ) 和雄性能育植物而得以实现， 其中传粉者 ( 雄性能育系 ) 在传粉 后抛弃。对于足够的雌性系产量优选良好的传粉条件。母本 ( 雄性不育雌性系 ) 和传粉者 的比率应优选 3 ∶ 1， 以及如果在田地中进行生产， 则每公顷 3-5 个蜂箱是有益的。以交替 带状进行的种子生产优选得到高的杂交性水平。尽管如此， 还是有可能 ( 尽管在某些国家 中不被接受 ) 通过将 ( 母本 ) 雌性系与传粉者 ( 雄性系 ) 混合来生产杂种种子。混合生产 的优点在于降低生产成本。
     已发现在本发明的过程中， 与在这些生产步骤中使用的雄性不育雌株相比， 雄性 能育植物更早开花。 为了能最佳传粉， 为此优选修剪雄性能育植物以延迟开花， 直至雄性不 育雌株开花。优选地， 基础雌性种子和 / 或杂种种子的生产在低于 33℃， 优选低于 28℃， 更 优选低于 25℃的温度下进行。
     在本发明的一个进一步优选的实施方案中， 无需利用热介导的雄性不育植物自交 来实施欧洲油菜的雄性能育杂种种子的生产。在该实施方案中， 如本领域所知的自交具 有基因型 MsmsRfrf 的雄性能育植物。可通过将 RHS 雌株与正常的油菜进行杂交并随后 通过使用标记 ( 例如本发明的标记 ) 鉴定所需基因的存在， 进行自交， 从而获得具有基因 型 MSmsRFrf 的植物。还可通过在每一世代中回交和标记分析， 以保持只有那些对于 Ms 和 Rf 基因都是杂合的植物， 从而获得这些植物。甚至有可能从热介导的雄性不育植物自交 中选择具有基因型 MsMsrfrf 的植物 ( 如上所述用于常规的 RHS 开发 )， 并将它们与正常 的 msmsRfRf 油菜籽品系品种杂交。这两种品系应当是近等基因以获得纯系用于进一步的 开发。在分离后代中， 预计有雄性不育植物 ( 具有基因型 Msmsrfrf 和 MsMsrfrf) 和雄性 能育植物 ( 具有基因型 MsMsRfRf、 MsmsRfRf、 msmsRfRf、 MsMsRfrf、 MsmsRfrf、 msmsRfrf 或 msmsrfrf)。通过利用使用如在上文中所述的紧密连锁的分子标记的选择获得具有基因型 MsMSRfrf 和 msmsrfrf 的雄性能育植物。如本领域所知的， 自交这些植物。
     将 雄 性 不 育 MsMsRfrf 植 物 的 后 代 播 种 在 田 地 中 作 为 雌 性 系， 与雄性能育 msmsrfrf 植物 ( 在此称为保持系 ) 的后代呈交替带状。在雌性条带中植物会在具有基因 型 MsMsRfRf 或 MsMsRfrf 的雄性能育表型和具有基因型 MsMsrfrf 的雄性不育表型中分离， 分离比率为 3 能育的∶ 1 不育的。业已如上所述， 雄性不育植物具有花序的第一个芽败育 和白色条纹或斑点花瓣为特征的表型。此外， 雄性不育植物开始开花明显迟于近等基因雄 性能育植物。这些表型差异使得能在雄性不育植物开始开花前除去雄性能育 ( 早期开花 ) 植物。 在雄性不育植物开始开花前完全除去雄性能育植物毫无疑问能避免均来源于雄性能 育 MsmsRfrf 植物自交的杂种生产中雄性能育植物 ( 如保持系 ) 和雄性不育植物之间的异 花传粉。 修剪雄性能育植物是不足够的， 因为仅仅延迟了雄性能育植物开花， 且仍有可能存 在之前提及的不合需要的异花传粉。一旦在开花前除去雄性能育植物， 则保留在田地里的 雄性不育植物通过雄性能育恢复系植物 ( 优选地如上所述以交替带状存在 ) 传粉用于 F1 杂 种种子生产。种子仅获得自在雌性条带中生长的雄性不育 MSMSrfrf 植物， 并且会具有基因 型 Msmsrfrf ； 从这些种子生长成的植物会是雄性不育的。该完全雄性不育种群是大量生产 杂种种子的先决条件。 然而， 这种类型的基础种子生产需要小规模田地， 以便能尽可能地粗 选雄性能育植物。
     取决于用于传粉的传粉者， 在上述方法中具有基因型 MsmsRfrf 的植物通常有可 能产生 (1) 基础雌性系的种子 ( 使用具有基因型 msmsrfrf 的保持系作为传粉者 ) 或 (2)F1杂种种子 ( 使用具有基因型 msmsRfRf 的恢复系作为传粉者 )。然而， 此后用于生产 F1 杂种 种子的方法却并不有效， 原因在于需要大量的 F1 杂种种子。临近没有雄性不育雌性纯系， 具有基因型 MsmsRfrf 的植物就不得不通过抛弃 75％的全部子代 ( 雄性能育植物 ) 来进行 选择， 从而导致种子生产植物的大量损失。 因此， 优选产生用于杂种种子生产的雄性不育雌 性纯系。
     在生产杂种植物中， 优选与恢复系杂交的基础雌性系以及自身具有足够低的芥子 油苷水平的恢复系以确保 F1 杂种植物的籽粒 ( 或生长成的种子 ) 具有处于控制水平内的芥 子油苷水平。 收获自 F1 杂种的种子的芥子油苷水平约略为母本和父本的芥子油苷水平的平 均水平 ( 或略低于平均水平 ( 例如 10-20％ ))。杂种籽粒 (F2) 的芥子油苷水平反映了 F1 杂种的基因型。例如， 如果目标是获得具有低于 25μmol/ 克 ( 优选低于 20μmol/ 克 ) 的 芥子油苷水平的杂种籽粒 (F2)， 则雄性能育亲本 ( 恢复系 ) 具有 15μmol/ 克的芥子油苷水 平， 母本优选具有低于 25μmol/ 克的芥子油苷水平。
     3.1 恢复系和 Rf 等位基因
     术语 “( 功能性 ) 恢复系等位基因” 或 “Rf 等位基因” 或 “功能失常的保持系等位 基因” 指具有显性的等位基因， 其能 ( 即 Rf 等位基因与选自如下的一种或多种特性连锁和 / 或与之相关 )
     a) 在 F1 植物中恢复能育性， 所述 F1 植物获得自与由在保藏编号 NCIMB41480 下保 藏的种子生长成的欧洲油菜植物杂交， 和
     b) 在 F1 植物中恢复能育性， 所述 F1 植物获得自与由获得自作为雄性不育雌株的 获得自在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子的欧洲油菜植物与作为雄性能育植物的获 得自在保藏编号 NCIMB 41481 下保藏的种子的欧洲油菜植物的杂交的种子生长成的欧洲 油菜植物的杂交。
     Rf 等位基因可获得自任何基于非 -Takagi 的种质。除来源于 Takagi 种质的种质 之外， 尚不知道不包含至少一个功能性 Rf 等位基因拷贝的欧洲油菜能育近交系。结果， 发 现实际上所有在本发明之日可获得的欧洲油菜能育近交系都是恢复系 ( 即包含 Rf 等位基 因 )。
     因此， 恢复系等位基因 (Rf 等位基因 ) 选自可获得自任何被商业化作为种子用于 栽培的欧洲油菜能育近交系 (“恢复系” )( 不包括其的任何杂种系或亲本系 ) 的 Rf 等位 基因， 优选可获得自在本发明优先权之日市售的品系， 更优选自 Bounty、 Cyclone、 Delta、 Ebony、 Garrison、 Impact、 Legacy、 Legend、 Profit、 Quantum、 Campala、 Pollen、 Grizzly、 Expert、 Aviso、 NK Jetix、 Oase、 Smart、 NK Fair、 NK Nemax、 Ladoga、 Cooper、 Billy、 Lorenz、 Aurum、 Lilian、 Californium、 Lisek、 Orkan、 Winner、 Licorne、 Castille、 Fortis 的品系和在它们的谱系中具有前述品种的欧洲油菜能育近交系。合适的恢复系还包括在 2006 年 12 月 OECD 品种列表上的那些恢复系 ( 确认合格的 OECD 品种列表 -2006/2007 ； 2006 年 12 月 ； http://www.oecd.org/dataoecd/1/44/33999447.pdf ； http://www.oecd. org/document/14/0， 2340， en_2649_33909_2485070_1_1_1_1， 00.html)， 优选被商业化作 为种子用于栽培的非杂交系 ( 用于油料生产 )， 更优选在所述 OECD 列表上那些没有标记为 “d” ( 只要它们代表杂交亲本系， 就是近交系 ) 或 “b” ( 杂种 ) 的品种。
     本发明的一个优选的实施方案涉及任何一种被商业化作为种子用于栽培的欧洲油菜能育近交植物用于获得供生产在此披露的欧洲油菜的能育杂种种子使用的功能性恢 复系等位基因 (rf 等位基因 ) 的应用。
     育性恢复表型和 / 或 Rf 等位基因与一种或多种 SSR 标记 (“Rf 等位基因标记” ) 连锁和 / 或与之相关， 所述 SSR 标记不存在于具有 240.8(+/-0.4)bp 的表观分子量的 PCR 片段中， 所述 PCR 片段来自使用 SEQ ID NOs ： 19 和 20 所示引物的 PCR 反应。
     在上下文中， 应当指出与 rf 等位基因不同， 与 Rf 等位基因相关的标记有可能变化 更多。 结果， 可能存在更多具有不同表观分子量的条带。 原因非常简单 ： rf 等位基因由一种 未经历频繁的后发遗传修饰的单一种质来源产生的， 而 Rf 等位基因则是一种存在于不同 的遗传背景中的欧洲油菜 “天然等位基因” ， 并且其的遗传环境受诸多繁殖活动的影响。因 此， 相关标记的更高的变异性是有可能的。
     在本发明的一个优选的实施方案中， 在一个整合的生产过程中实施繁殖预基础种 子、 生产基础雌性种子和生产杂种种子的方法。因此， 优选地， 本发明的另一个实施方案涉 及一种生产生长成产种子 ( 或籽粒 ( 即非栽培目的的种子 ) ； 任选地， 但优选地， 具有不超 过 25μmol/ 克 ( 优选 1-22μmol/ 克， 更优选 5-20μmol/ 克， 最优选 8-17μmol/ 克 ) 的 9％ 水分含量的风干种子的总芥子油苷含量 ) 欧洲油菜植物的欧洲油菜杂种种子的方法 ； 其中 所述方法包括繁殖预基础雌性种子 ( 如上定义的 ) 的方法、 生产基础雌性种子 ( 如上定义 的 ) 的方法， 以及生产杂种种子 ( 如上定义的 ) 的方法。
     本发明的一个进一步优选的实施方案涉及任何一种被商业化作为种子用于栽培 携带至少一种 “( 功能性 ) 恢复系等位基因” 、 “Rf 等位基因” 或 “功能失常的保持系等位基 因” (“恢复系” )( 即如上所述的 “恢复系植物” 或 “恢复系” ) 的欧洲油菜能育近交系在由 本发明的条件性雄性不育欧洲油菜植物 ( 参见如上 ) 杂交获得的 F1 植物中恢复雄性能育 性的作用。
     4. 用于 Ms、 ms、 rf、 Rf 等位基因的标记以及标记技术的应用
     分子标记可用于显现核酸序列的差异。例如由于在用限制性内切酶消化后的 DNA-DNA 杂交技术 (RFLP) 和 / 或由于使用聚合酶链反应的技术 ( 如 STS、 微卫星、 AFLP)， 因 此使得该显现得以可能。如下所述在此鉴定的标记可用于本发明的各个方面中。本发明的 方面不限于使用在此鉴定的标记。 强调指出这样的方面也可使用没有在此明确披露的标记 或甚至待鉴定的标记。
     分子标记即 SNP 和 SSR 被用于杂种育种计划中， 以及被用于开发在该育种计划中 使用的近交系， 以指引等位基因 ( 例如 Ms、 ms、 Rf、 rf 等位基因 ) 的遗传或评估所选择的育 种品系的遗传距离。通过将所选择的品系标记辅助回交入本发明的杂交系统中 ( 或反之亦 然 )， 该回交步骤可从 5 代回交减少到 3 代回交。
     有几种分子标记可用于基于标记的选择， 包括限制性片段长度多态性 (RFLP)、 多 态 DNA 随机扩增 (RAPD)、 扩增片段长度多态性 (AFLP)、 单序列重复 (SSR) 和单核苷酸多态 性 SNPs。RFLP 涉及使用限制性内切酶在特定的短限制酶切位点处切割染色体 DNA， 多态性 产生自位点或在该限制酶切位点处突变之间的重复或缺失。 RAPD 利用了低严格性聚合酶链 反应 (PCR) 扩增， 使用单条随机序列引物来产生未知 DNA 片段的链特异性阵列。该方法仅 需要很好的 DNA 样品， 却能分析大量的多态性基因座。AFLP 需要在使用 PCR 和引物中选择 性的核苷酸来扩增特异性片段前， 用限制性内切酶消化细胞 DNA。一种特别优选的方法利用了基于广泛分布于真核生物基因组中的 DNA 微卫星 ( 短重复 ) 序列的 SSR 标记分析， 该 DNA 微卫星 ( 短重复 ) 序列被选择性扩增以检测简单序列重复中的变异。对于 SSR 分析仅 需要很少的 DNA 样品。还优选的是 SNP 标记， 其使用了能有效地挑选点突变的 PCR 延伸检 测。该方法对每个样品只需要很少的 DNA。一种或两种上述方法可用于典型的基于标记的 选择育种计划中。
     对于标记辅助选择， 用于实现植物基因组跨多态性区域的核苷酸片段扩增的最优 选的方法利用了聚合酶链反应 (“PCR” )(Mullis 等， 1986)， 使用能与在其双链形式中限定 了多态性的近侧序列杂交的包括反向引物和正向引物的引物对。备选的方法可被用于扩 增这样的片段， 例如 “连接酶链反应” (“LCR” )(Barany， 1991)， 其使用两对寡核苷酸探针 来指数式扩增特异性靶标。挑选每对寡核苷酸的序列以容许该寡核苷酸对与靶标的同一 条链的邻接序列杂交。这种杂交产生了用于模板依赖的连接酶的底物。因此， 如同 PCR 一 样， 所得到的产物在随后的循环中用作模板并获得了所需序列的指数式扩增。可用具有多 态位点的同一条链的近侧和远侧序列的寡核苷酸来执行 LCR。 在一个实施方案中， 任何一条 寡核苷酸都被设计以包括多态性的实际多态位点。在这样一种实施方案中， 如果靶分子包 含或缺少与寡核苷酸上存在的多态位点互补的特异性核苷酸， 则可选择反应条件使得该寡 核苷酸只能连接在一起。可选地， 可选择该寡核苷酸使得它们不包括该多态位点 ( 参见 WO 90/01069)。
     另一种被利用的可替代的方法是 “寡核苷酸连接检测” (“OLA” )(Landegren 等， 1988))。该 OLA 实验方案使用了两条被设计成能杂交靶单链的邻接序列的寡核苷酸。OLA， 像 LCR 一样， 特别适用于检测点突变。然而， 不像 LCR， OLA 产生了 “线性” 而非指数式的靶 序列扩增。Nickerson 等描述了一种结合了 PCR 和 OLA 特性的核酸检测方法 (Nickerson 等， 1990)。在该方法中， PCR 用于实现靶 DNA 的指数式扩增， 然后使用 OLA 进行检测。除需 要多个和分离的处理步骤之外， 与上述组合相关的一个问题是它们继承了与 PCR 和 OLA 相 关的所有问题。基于在具有合成的 “二寡核苷酸” 的序列的核酸存在下连接两条 ( 或更多 条 ) 寡核苷酸， 从而扩增该二寡核苷酸的方案也是已知的 (Wu 等， 1989)， 并可容易地适应于 本发明的用途。
     在一个实施方案中， 分子标记是通过 PCR 扩增的 DNA 片段， 如 SSR 标记。在一个 实施方案中， 扩增的 DNA 片段的存在与否是性状自身或该性状特定等位基因存在与否的指 示。在一个实施方案中， 扩增的 DNA 片段的长度差异是性状特定等位基因存在的指示， 并因 此能区分不同的性状等位基因。在本发明的一个具体实施方案中， 简单序列重复 (SSR) 标 记用于在亲本植物和 / 或其祖先中， 以及在由所述亲本植物杂交产生的后代植物中， 鉴定 发明相关的等位基因。简单序列重复是短重复的 DNA 序列， 存在于所有真核生物的基因组 中， 并由几个到超过几百个 1-4 个核苷酸基序的重复组成。由于在植物中存在于基因组中 特定位置处的 SSRs 数目通常不同， 因此可分析 SSRs 以确定特定等位基因的存在与否。
     在一个方面， 本发明涉及选自 SEQ ID NOs ： 1、 2、 4、 5、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 和 20 所示的序列组的寡核苷酸引物。 这些引物优选用作由正向引物和反向引 物组成的 PCR 寡核苷酸引物对或用作 SNP 突变检测探针。优选地， 用于扩增 SSR 标记的引 物对由 SEQ IDNOs ： 1 和 2( 引物对 1)、 SEQ ID NOs ： 4 和 5( 引物对 2) 或 SEQ ID NOs ： 19 和 20( 引物对 3) 所示的引物组成。 优选地， 用于扩增 SNP 标记片段 ( 即包含 SNP 突变的片段 )的引物对由 SEQ ID NOs ： 8 和 10( 引物对 4) 或由 SEQ ID NOs ： 15 和 16( 引物对 5) 所示的 引物组成。在此提供的其他引物对也可能适合作为标记序列 ( 例如对于 RFLP 标记 )， 例如 SEQ ID NOs ： 13 和 14 所示的引物 ( 引物对 6)， 或 SEQ ID NOs ： 7 和 8 所示的引物 ( 引物对 7)。 适合于检测单核苷酸多态性 (SNP) 的探针可包含作为核酸部分的选自 SEQ ID NOs ： 11、 12、 17 和 19 所示序列的序列。
     业已测序了包含 SSRs 和 SNPs 的区域。在那些与相应的等位基因 ( 例如 MS 等位 基因、 ms 等位基因、 Rf 等位基因、 rf 等位基因 ) 和相关表型连锁的序列之间存在着相当大 的突变差异。 其结果是， 那些区域存在着本发明的创造性特征， 因为它们能鉴定更多的标记 和 / 或开发用于邻近基因组测序的引物， 所述邻近基因组可包含相应的 MS 等位基因、 ms 等 位基因、 Rf 等位基因、 rf 等位基因。为了序列比较， 对不育和能育的植物比对变化的区域以 创建共有序列 ( 分别为 SEQ ID NO ： 3 和 6)。该序列可优选用于检测迄今未被分析欧洲油 菜种质的相应序列。 作为结果， 本发明的另一个实施方案涉及一种分离的核苷酸序列， 选自
     a) 序列， 其
     i) 与选自 SEQ ID NOs ： 3 和 6 所示序列的共有序列具有至少 80％的序列同一性， 或
     ii) 在严格条件下与选自 SEQ ID NOs ： 3 和 6 所示序列的共有序列杂交， 或
     iii) 包含选自 SEQ ID NOs ： 3 和 6 所示序列的共有序列的至少 25 个连续的核苷 酸， 和
     b) 序列， 其
     i) 与选自 SEQ ID NOs ： 21、 22 和 23 所示序列的序列具有至少 80％的序列同一性， 或
     ii) 在严格条件下与选自 SEQ ID NOs ： 21、 22 和 23 所示序列的序列杂交， 或
     iii) 包含选自 SEQ ID NOs ： 21、 22 和 23 所示序列的序列的至少 25 个连续的核苷 酸。
     在本发明中披露的序列在标记辅助育种和选择中是特别有用的。然而， 这些序列 可用于不限于使用如在本申请中所描述的标记的本发明的多个其他方面中。 需要强调的是 本发明还可利用没有在此明确披露的序列或仍待鉴定的序列。
     关于标记辅助选择， 本发明的另一个实施方案涉及一种使用本发明的核酸序列 ( 或与所述核苷酸序列享有 90％ -99％， 优选 95％ -98％序列同一性的其片段 ) 用于将选自 Ms 等位基因、 ms 等位基因、 Rf 等位基因和 / 或 rf 等位基因等位基因基因渗入缺少所述等 位基因集合的芸苔种质中的方法。 本发明的一个进一步优选的实施方案涉及根据本发明的 核酸序列在基于标记的选择中的应用， 所述基于标记的选择用于将选自 Ms 等位基因、 ms 等 位基因、 Rf 等位基因和 / 或 Rf 等位基因的等位基因基因渗入至如上所述缺少所述等位基 因集合的芸苔种质中。
     赋予雄性不育或保持雄性不育的本发明的植物可例如具有基因型 MsMsrfrf、 Msmsrfrf 或 msmsrfrf， 而本发明的杂种植物具有 MsmsRfrf 或 msmsRfrf 的基因型， 其中 Ms、 ms、 rf、 Rf 具有上述含义。因此， 本发明还提供了通过在所述植物中检测如在此定义的 Ms 和 / 或 rf 等位基因的存在， 用于选择显示赋予或保持雄性不育表型的物种欧洲油菜植物的 方法。在本发明的一种优选的用于选择这样的植物的方法中， 所述方法包括 ：i) 从要被检测的植物或植物种群获得植物材料并从所述材料提取 DNA ；
     ii) 通过使用一种或多种本发明的核酸序列， 分析步骤 i) 中获得的 DNA 样品以确 定 Ms 等位基因、 ms 等位基因、 rf 等位基因和 / 或 Rf 等位基因的存在 / 不存在。
     更优选地， 上述方法的步骤 ii) 包括在所述基因组 DNA 的样品中检测至少一种与 Ms 等位基因、 ms 等位基因、 rf 等位基因或 Rf 等位基因连锁的分子标记， 更优选地， 检测至 少来自所述组的两种分子标记， 其中一种标记检测 Ms 等位基因或 ms 等位基因， 另一种标记 检测 rf 等位基因或 Rf 等位基因。
     该分析可以多种方法来进行， 并可包括例如下列步骤 ：
     a) 使用 PCR 寡核苷酸引物对鉴定至少一个标记基因座， 所述引物对由具有如 SEQ ID NOs ： 1、 2、 4、 5、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 或 20 任一所示的核苷酸序列的 正向引物和反向引物组成， 和
     b) 通过测定步骤 a) 中获得的 PCR 扩增产物的分子量鉴定标记等位基因， 和
     c) 使用标记分析数据鉴定具有所需组成的植物。
     DNA 样品可获得自合适的植物材料， 例如通过使用已知技术提取 DNA 的叶组织。
     在一个优选的实施方案中， 检测分子标记的步骤 ( 步骤 b) 可包括使用一组双向引 物， 该双向引物用于 SSR 法中来产生随后被证实是适合用于 Ms、 ms、 Rf 或 rf 等位基因的标 记的扩增产物。这样的一组引物在此称为规定 SSR 标记的引物或标记特异性引物。 “双向” 意味着在核酸的扩增反应中引物的一个方向起正向引物作用以及另一个方向起反向引物 作用。该检测分子标记的步骤 ( 步骤 b) 还可包括针对所述基因组 DNA 执行核酸扩增反应 来检测一种或多种 Ms、 ms、 Rf 或 rf 等位基因。这可通过使用一组标记特异性引物进行 PCR 反应而得以合适地进行。在一个优选的实施方案中， 所述步骤 b) 包括使用至少一组规定用 于所述等位基因的 SSR 标记的引物， 或一种在严格条件下与用于所述等位基因的 SSR 标记 的核酸序列特异性杂交的引物。
     然后， 使用本领域技术人员公知的聚合酶链反应 (PCR) 法， 将侧接包含与在此披 露的本发明的等位基因连锁的 SSRs 或 SNPs 区域的引物用于扩增 DNA 样品。基本上， 该 PCR 扩增法涉及使用包含两条侧接要被扩增的 DNA 区段的短寡核苷酸引物序列的引物对。重复 的 DNA 加热和变性循环之后是在低温下引物退火至它们的互补序列上， 以及使用 DNA 聚合 酶的退火引物的延伸。引物与 DNA 靶序列的相反链杂交。杂交指互补 DNA 链的退火， 其中 互补指核苷酸序列如此以致一条链中的核苷酸能键合相反链上的核苷酸以形成双链结构。 引物如此定向使得通过聚合酶的 DNA 合成跨引物之间的核苷酸序列双向进行。该方法有效 地在一次循环中倍增了 DNA 区段的数量。由于 PCR 产物与引物互补并能与之结合， 因此每 轮成功的循环倍增了在之前循环中合成的 DNA 的量。该方法的结果是特异性靶片段的指数 式累积， 其系数为大约 2n， 其中 n 为循环数。通过 PCR 扩增， 制备了成百万拷贝的侧接引物 的 DNA 片段。
     对于 SSRs， 不同等位基因中侧接引物之间的重复序列数量的差异反映在扩增的 DNA 片段的长度变化上。这些变化可通过在凝胶上电泳分离扩增的 DNA 片段而检测到。通 过分析凝胶， 能确定植物是否以纯合或杂合形式包含所需的等位基因， 或者所需的等位基 因是否不存在于植物基因组中。
     使用提取自非常年轻的植物的叶组织的 DNA 样品， 标记分析可在植物发育初期进行。该标记分析容许鉴定在繁殖周期早期具有所需遗传组成的植物， 并可在传粉前抛弃不 含有所需的、 本发明相关的等位基因的植物， 从而减少繁殖种群的大小。此外， 通过使用分 子标记， 可在携带两拷贝的所需的、 本发明相关的等位基因的纯合植物和仅携带一个拷贝 的杂合植物之间进行区分。
     可通过标准的凝胶电泳技术或通过使用自动化 DNA 测序仪执行检测具有预计长 度或预计核酸序列的扩增的 DNA 片段的步骤。该方法无需在此描述， 因为它们是本领域技 术人员所熟知的。
     本发明的标记还可用于将本发明的等位基因定位至欧洲油菜基因组中的某一位 置处。一般而言， 可通过邻接的显示与表型性状统计相关标记串 (string) 指示某一性状基 因 ( 例如 Ms 或 rf 等位基因 ) 的位置。一旦发现标记位于该串之外 ( 即具有低于某一阈值 的 LOD- 计分， 表明该标记距离之远以致标记和基因 ( 或等位基因 ) 之间的区域中的重组 如此频繁地发生， 使得标记的存在不以统计显著方式与表型的存在相关 )， 就设定了该基因 ( 或等位基因 ) 的边界。 因此， 还有可能通过其他位于该指定区域中的标记来指示基因 ( 或 等位基因 ) 的位置。
     应当指出 ( 如上所述 )， 当本发明所述的等位基因 ( 例如 Ms 等位基因或 rf 等位 基因 ) 被基因渗入另一遗传背景种 ( 即基因渗入另一植物物种或另一欧洲油菜品种的基因 组中 ) 时， 某些标记可不再发现于子代中， 尽管在其中存在性状， 表明在最初的亲本系中这 样的标记位于代表了特定性状的基因组区之外， 以及该新的遗传背景具有不同的基因组结 构。在其不存在时指示在子代中成功地导入了遗传元件的这样的标记称为 “反式标记” ， 并 可同样适用于本发明中的 MAS 法。
     本发明的 Ms 或 rf 等位基因的核苷酸序列可例如通过如下得以解析 ： 测定与所述 等位基因 ( 例如在下文中披露的核酸序列 ) 相关的一种或多种标记的核苷酸序列并针对所 述标记序列设计内部引物， 然后引物用于进一步测定在所述标记序列之外的基因序列。
     在这样的用于检测受怀疑的涉及或保持雄性不育的植物 ( 或杂种植物 ) 中 Ms 等 位基因、 ms 等位基因、 Rf 等位基因或 rf 等位基因存在的方法的实施方案中， 该方法还可包 括步骤 ： 提供能在严格杂交条件下与标记的核酸序列杂交的寡核苷酸或多核苷酸， 所述标 记与所述 Ms 等位基因、 ms 等位基因、 Rf 等位基因或 rf 等位基因连锁， 将所述寡核苷酸或多 核苷酸与所述受怀疑的植物的消化的基因组核酸接触， 以及确定所述寡核苷酸或多核苷酸 与所述消化的基因组核酸的特异性杂交的存在。 优选地， 尽管还可以使用原位杂交法， 但是 对获得自所述受怀疑的植物的核酸样品执行所述方法。可选地， 以及在一个更优选的实施 方案中， 一旦 Ms 等位基因、 ms 等位基因、 Rf 等位基因或 rf 等位基因的核苷酸序列被测序， 技术人员就可设计能在严格杂交条件下与所述 Ms 等位基因、 ms 等位基因、 Rf 等位基因或 rf 等位基因的核苷酸序列杂交的特异性杂交探针或寡核苷酸， 并可将这样的杂交探针用于 本发明的在怀疑的欧洲油菜植物中检测 Ms 等位基因、 ms 等位基因、 Rf 等位基因或 rf 等位 基因存在的方法中。
     在一个进一步的实施方案中， 本发明涉及一种检测包含 Ms 等位基因 ( 用于核雄性 不育 ) 的芸苔属植物的方法， 包括步骤 ：
     a) 从芸苔属植物获得样品 ； 和
     b) 在所述样品中检测能通过使用至少一种如上定义的本发明的 Ms 等位基因标记得以鉴定的 DNA 片段。
     在一个进一步优选的实施方案中， 本发明涉及一种检测包含恢复系等位基因 (rf) 的芸苔属植物的方法， 包括步骤 ：
     a) 从芸苔属植物获得样品 ； 和
     b) 在所述样品中检测能通过使用至少一种如上定义的本发明的 Rf 等位基因标记 得以鉴定的 DNA 片段。
     在一个进一步优选的实施方案中， 本发明涉及一种检测包含 ms 等位基因 ( 与核雄 性能育性相关 ) 的芸苔属植物的方法， 包括步骤 ：
     a) 从芸苔属植物获得样品 ； 和
     b) 在所述样品中检测能通过使用至少一种如上定义的本发明的 ms 等位基因标记 得以鉴定的 DNA 片段。
     在一个进一步优选的实施方案中， 本发明涉及一种检测包含保持系等位基因 (rf) 的芸苔属植物的方法， 包括步骤 ：
     a) 从芸苔属植物获得样品 ； 和
     b) 在所述样品中检测能通过使用至少一种如上定义的本发明的 rf 等位基因标记 得以鉴定的 DNA 片段。
     在另一个优选的实施方案中， 根据本发明检测芸苔属植物 ( 具有 Ms、 Rf、 ms 或 rf 等位基因 ) 的方法进一步包括选择包含所述 DNA 片段的所述芸苔属植物或其部分的步骤 c)。还在另一个实施方案中， 根据本发明检测芸苔属植物的方法进一步包括自交包含所述 DNA 片段的所述芸苔属植物的步骤 d)。还在另一个实施方案中， 根据本发明检测芸苔属植 物的方法进一步包括将所述芸苔属植物与另一种芸苔属植物杂交的步骤 e)。
     5. 本发明植物的农业和工业用途
     本发明的植物 - 特别是杂种植物 - 和 / 或从其中获得的产物可用作农业和 / 或工 业用途 ( 例如在食品和饲料工业中 )。
     因此， 本发明的另一个实施方案涉及基于使用本发明的杂种种子的农业方法。一 个实施方案涉及一种用于栽培和 / 或生产欧洲油菜籽粒或种子的方法， 包括步骤 ：
     a) 播种本发明的杂种种子或通过本发明的方法提供的杂种种子，
     b) 由所述种子培育杂种欧洲油菜植物， 和
     c) 由所述植物收获成熟种子或籽粒。
     本发明的又一个优选的实施方案涉及本发明的杂种种子在这样的过程中的应用。
     在一定的环境下， 能经济可行地再植由杂种芸苔属植物收获的种 ( 例如如果那些 种子产生高价值特种油料的话 )。 因此， 本发明的另一个实施方案涉及一种使用欧洲油菜植 物的方法， 包括步骤 ： 由本发明的 ( 或由通过生产本发明的杂种种子的方法提供的种子生 长成的 ) 芸苔属杂种植物收获种子， 和种植所述种子以产生后代。优选地， 所述收获的种子 具有不超过 25μmol/ 克 ( 优选 1-22μmol/ 克， 更优选 5-20μmol/ 克， 最优选 8-17μmol/ 克 )9％水分含量的风干种子的芥子油苷含量。更优选， 所述再植种子对于功能失常的恢复 系等位基因 (rf 等位基因 ) 是至少杂合的或对于雄性不育等位基因 (Ms 等位基因 ) 是至少 杂合的， 即具有选自如下的表型 ： MsmsRfRf、 MsMsRfrf、 MsmsRfrf、 msmsRfrf 和 Msmsrfrf。 该 再植方法可重复进行， 并因此可包括重复种植收获的后代植物的种子的步骤。本发明的又一个优选的实施方案涉及欧洲油菜植物在方法中的应用， 包括步骤 ： 由通过如在此所提供的本发明的方法提供的种子生长成的芸苔属植物收获种子， 和种植所 述种子以产生后代。 优选地， 该应用进一步包括步骤 ： 重复种植所收获的后代植物的种子的 步骤。
     本发明的另一个实施方案涉及使用本发明的杂种种子， 特别是由该种子生长成和 / 或由其可获得油的植物生产油的方法。 因此， 一个实施方案涉及一种生产油菜籽 ( 欧洲油 菜 ) 油和粕 ( 优选粕基本上是无油的， 即具有小于 10％， 优选小于 5％， 更优选小于 2％的含 油量 ) 的方法， 包括步骤 ：
     a) 播种本发明提供的或通过本发明的方法提供的杂种种子，
     b) 由所述种子生长成杂种欧洲油菜植物，
     c) 由所述植物收获成熟的种子或籽粒， 和
     d) 破碎所述种子或籽粒并由粕中分离或提取油 ( 以及优选进一步包括将油和粕 分离的步骤 )。
     生产油和粕的方法产生了两种产物 ( 油和粕 )， 它们可作为方法的分离产物获得 并具有不同的效用。油用于食品和饲料工业中用于不同的用途。粕用于饲料用途或生产生 物气体。粕的代表性用途包括用于牲畜的饲料。所述油类代表性的用途包括凉拌、 油炸、 烹 饪、 喷涂和粘性食品应用。 由于本发明的内源性蔬菜粕和油满足了大量最终应用的要求， 因 此处理和库存考虑得到大大简化。在固有优良的健康和营养特性的内源性产物中， 这些益 处中的每一个都可以直接的方式得以实现。
     “种子” 指适合于和 / 或被选定用于进一步种植的由欧洲油菜植物收获的种子材 料。 “籽粒 (Grain)” 指不适合于 ( 在商业上或在实践上 ) 和 / 或未被选定用于进一步种植 的由欧洲油菜植物收获的种子材料。
     本发明的又一个实施方案涉及本发明的杂种种子在这样的方法中的应用。
     另一个实施方案涉及一种生产欧洲油菜 ( 油菜籽 ) 油和粕的方法， 包括步骤 ：
     a) 提供对于功能失常的恢复系等位基因 (rf 等位基因 ) 是至少杂合或对于雄性不 育等位基因 (Ms 等位基因 ) 是至少杂合的油菜籽籽粒， 和
     b) 破碎所述种子并分离或提取油。
     在一个优选的实施方案中， 所述油具有选自如下所述的优选组成的组的脂肪酸组 成。
     本发明的另一个实施方案涉及欧洲油菜粕， 其基本上无油并且是使用任何一种本 发明的植物的含油种子生产的。 本发明的另一个实施方案涉及一种通过破碎任何一种本发 明的植物的含油种子提供欧洲油菜粕的方法。优选地， 所述含油种子对于功能失常的恢复 系等位基因 (rf 等位基因 ) 是至少杂合的或对于雄性不育等位基因 (Ms 等位基因 ) 是至少 杂合的， 即具有选自 MsmsRfRf、 MsMsRfrf、 MsmsRfrf、 msmsRfrf 和 Msmsrfrf 的表型。
     本发明的又一个实施方案涉及一种通过如下经营种子生意的方法 ：
     a) 提供选自具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物 ( 即预基础雌 性系 )、 具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物 ( 即基础雌性系 ) 或具有基 因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物 ( 即保持系 ) 的本发明的种子生产植物给感兴趣 生产杂种油菜籽的育种人员， 和b) 让所述育种人员在许可下通过将所述步骤 (a) 的种子生产植物与所述育种人 员可获得的雄性能育欧洲油菜近交系 ( 即所述育种人员可获得的恢复系， 其优选不是基于 Takagi 种质的 ) 杂交创建欧洲油菜杂种种子。
     在本发明的更优选的实施方案中， 在上述经营种子生意的方法的步骤 a) 中提供 给育种人员的种子生产植物是本发明的基础雌性系 ( 例如具有基因型 Msmsrfrf 的欧洲油 菜自交植物 )。
     在一个进一步优选的实施方案中， 本发明涉及一种在生产杂种种子的方法中使用 一种或多种选自具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物 ( 即预基础雌性 系 )、 具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物 ( 即基础雌性系 ) 或具有基因 型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物 ( 即保持系 ) 的本发明的欧洲油菜植物的方法。该 杂种种子的生产优选如上所述来进行 ( 例如在第 3 节中所描述的 )。
     本发明的又一个优选的实施方案涉及一种或多种选自具有基因型 MsMsrfrf 的条 件性雄性不育欧洲油菜植物 ( 即预基础雌性系 )、 具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育 欧洲油菜植物 ( 即基础雌性系 ) 或具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物 ( 即保 持系 ) 的本发明的欧洲油菜植物在生产杂种种子的方法中的应用。该生产杂种种子的方法 优选是上述本发明的方法之一。
     在一个更优选的实施方案中， 本发明涉及具有基因型 MsMsrfrf 的本发明的条件 性雄性不育欧洲油菜植物 ( 即预基础雌性系 ) 和具有基因型 msmsrfrf 的本发明的雄性能 育欧洲油菜植物 ( 即保持系 ) 在生产杂种种子的方法中的应用。此外， 该生产杂种种子的 方法优选是上述本发明的方法之一。
     在一个还进一步优选的实施方案中， 本发明涉及一种在生产具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物 ( 即基础雌性系 ) 或其种子的方法中使用一种或多种选自 具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物 ( 即预基础雌性系 ) 和具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲油菜植物 ( 即保持系 ) 的本发明的欧洲油菜植物的方法。 该具有 基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物的生产优选如上所述来进行 ( 例如在第 3 节中所描述的 )。
     在 一 个 进 一 步 优 选 的 实 施 方 案 中， 本发明涉及一种或多种选自具有基因型 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物 ( 即预基础雌性系 ) 和具有基因型 msmsrfrf 的 雄性能育欧洲油菜植物 ( 即保持系 ) 的本发明的欧洲油菜植物在生产具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物 ( 即基础雌性系 ) 或其种子的方法中的应用。该杂种种子 的生产优选如上所述来进行 ( 例如在第 3 节中所描述的 )。
     在一个更优选的实施方案中， 本发明涉及具有基因型 msmsrfrf 的雄性能育欧洲 油菜植物 ( 即保持系 ) 在生产具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物 ( 即 基础雌性系 ) 或其种子的方法中的应用。此外， 该生产具有基因型 Msmsrfrf 的条件性雄性 不育欧洲油菜植物的方法优选是上述本发明的方法之一。
     在一个优选的实施方案中， 用于使用本发明的欧洲油菜植物生产杂种种子的方法 中的欧洲油菜植物选自由在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的欧洲油菜种子生长成 或来源于所述种子的品种。
     在又一个优选的实施方案中， 本发明涉及一种在提供如上所述的欧洲油菜的能育杂种种子的方法中使用具有基因型 RfRf 的雄性能育欧洲油菜植物的方法。优选地， 所 述在提供如上所述的欧洲油菜的能育杂种种子的方法 ( 即生产本发明的欧洲油菜的能育 杂种种子方法 ) 中使用具有基因型 RfRf 的雄性能育欧洲油菜植物的方法， 其中具有基因 型 Msmsrfrf 或 MsMsrfrf 的条件性雄性不育欧洲油菜植物被提供作为雌株， 而具有基因型 RfRf 的雄性能育欧洲油菜植物则被提供作为雄株， 以及让所述雄株传粉给条件性雄性不育 雌株， 让种子发育并作为能育杂种种子收获。关于该方法以及在该方法中使用的本发明的 植物的详情参见如上。
     本发明另一个优选的实施方案涉及具有的基因型 RfRf 能育欧洲油菜植物在提供 如上所述的欧洲油菜的能育杂种种子的方法中的应用。优选地， 具有基因型 RfRf 的能育欧 洲油菜植物用于提供能育杂种种子的方法中， 所述方法是上述生产本发明的能育杂种种子 的方法之一。
     在一个进一步优选的实施方案中， 本发明涉及通过上述应用或在上述使用方法中 获得的欧洲油菜植物、 其种子或杂种种子。
     6. 具有遗传背景和其他性状的杂交系统的组合
     大体上， 本发明的预基础雌性系、 基础雌性系、 保持系和 / 或杂种植物可与具有任 意遗传背景的欧洲油菜组合。然而， 这些植物 ( 尤其是杂种植物 ) 优选具有选自如下的一 种或多种特性 ： 黄色种皮颜色、 除草剂抗性、 生物胁迫抗性 ( 例如抗例如昆虫、 真菌、 细菌、 线虫、 病毒等的病原体抗性 ) 和非生物胁迫抗性 ( 例如干旱、 盐、 热、 霜冻等 )。在商业上期 望的额外的性状是那些会降低芸苔属作物生产成本的性状 ( 输入性状 ) 或会增加芸苔属作 物或来自其的油类或粕的品质的性状 ( 输出性状 )。输入性状可选自除草剂抗性、 抗虫性、 抗病性和胁迫抗性 ( 例如旱、 冷、 热和盐抗性 )。输出性状可优选自具体所需的油类或脂肪 酸组成。
     病原体抗性性状包括但不限于
     a) 单基因 Rlm7Phoma 抗性 ( 油菜茎基溃疡病菌 (Leptosphaeriamaculans)) ； 这样 的性状易得自欧洲油菜品种 cv.Roxet， 和 cv.Caiman ；
     b) 根肿病抗性 ( 甘蓝根肿菌 (Plasmodiophora brassicae)) ； 这样的性状易得自 欧洲油菜品种 cv.Tosca， 和 cv.Mendel ； 和
     c)TUYV 病 毒 抗 性 ( 芜 菁 黄 化 病 毒 ) ； 这样的性状易得自欧洲油菜品种 cv.Caletta。
     本领域技术人员可利用本发明的芸苔属植物来开发生产含油种子的， 对于核雄性 不育的能育性预基础或基础雌性系、 保持系或恢复系的芸苔属植物， 其优选具有低芥子油 苷含量以及任何其他期望的性状。
     由本发明的植物和种子产生的粕和油取决于预期用途还可具有多种特性。 这样的 用途可以是工业用途或作为饲料或食品的用途。 作为食品目的的用途可包括用作为油炸用 油， 广义来讲， 作为烹饪用油或作为色拉油。所有这些预期用途均与优选的脂肪酸组成相 关。优选地， 本发明的芸苔属植物和 / 或所述植物的种子和 / 或由所述植物获得的种子均 具有双低油菜品质。
     6.1. 油组成性状
     在一个优选的实施方案中， 本发明的预基础系、 基础系、 保持系和杂种植物产生具有大于 40％， 优选大于 42％和最优选大于 44％的含油量的籽粒。
     芸苔油种子的食用内源性植物油包含受遗传手段控制的脂肪酸和其他性状 (W091/15578 ； US 5,387,758)。优选地， 基于总脂肪酸含量， 为人或动物消费所设计的芸苔 油种子包括不超过 2wt％的低浓度的芥子酸， 其受控于与其他所列指定组分相结合的遗传 手段。用于表达这样的芥子酸性状的遗传手段可来源于多种具有良好农艺学特性的市售 双低油菜品种， 例如 Bounty、 Cyclone、 Delta、 Ebony、 Garrison、 Impact、 Legacy、 Legend、 Profit、 Quantum、 Campala、 Pollen、 Grizzly、 Expert、 Aviso、 NK Jetix、 Oase、 Smart、 NK Fair、 NK Nemax、 Ladoga、 Cooper、 Billy、 Lorenz、 Aurum、 Lilian、 Californium、 Lisek、 Orkan、 Winner、 Licorne、 Castille、 Fortis。
     在一个优选的实施方案中， 本发明的杂种欧洲油菜植物 ( 或用于其育种的本发明 的基础、 预基础或保持系 ) 产生特有的油组成。对于芸苔中优选的特有的油组成的评述参 见 Scarth&Tang(2006) 及其中引用的参考文献 ； 均在此以其整体并入作为参考。
     传统的芸苔油种子栽培品种产生的菜籽油通常具有 5％棕榈酸 (C 16:0)、 1％硬 脂酸 (C18:0)、 15％油酸 (C18:1)、 14％亚油酸 (C18:2)、 9％亚麻酸 (C18:3) 和 45％芥子酸 (C22:1) 的脂肪酸组成 (Ackman， 1990)。C22:1 是一种在营养上不合需要的脂肪酸， 并且在 芸苔油中为了可食用业已降至非常低的水平。低 C22:1 芸苔油具有在营养上合乎需要的脂 肪酸组成， 具有低饱和脂肪酸和高水平的 C18:3- 一种 ω-3 脂肪酸 (Eskin 等， 1996)。 C22:1 在工业应用上具有重要价值， 并且对于这些应用， 期望在传统的菜籽油中尽可能高地增加 45％水平， 以提高高芥子酸菜籽 (HEAR) 油及其衍生物的经济竞争力。除在芸苔油中常见的 脂肪酸之外， 植物界成员产生超过 200 种不常见的脂肪酸， 特别是在非农学植物中 (van de Loo 等， 1993 ； Thelen&Ohlrogge， 2002 ； Jaworski&Cahoon， 2003)。 许多这些脂肪酸具有营养 益处或工业用途。然而， 大多数这些植物具有有限的驯化潜力。由于含油种子生产相对低 的成本和可再生的特性， 因此包括芸苔含油种子在内的含油种子作物可被改性来产生新的 脂肪酸， 作为石油衍生的工业原料的替代来源 (Cahoon， 2003 ； Thelen&Ohlrogge， 2002)。
     常规育种有助于开发瞄准不同市场的四种主要类型的具有改变的脂肪酸组成的 芸苔油 (Burton 等， 2004 ； Przybylski， 2005)。 这些开发是在芸苔属物种中使用天然和人工 诱发突变的植物育种的结果。
     低芥子酸 ： 在使用高 C22:1 的菜籽油的动物饮食研究中鉴定了潜在的人体健康影 响之后， 于 1950 年代开始了低 C22:1 的芸苔油的选择和开发。动物研究显示高 C22:1 菜籽 油饮食与心肌损伤相关， 表现出心脏和肾脏周围脂肪沉积以及心脏中肌肉损伤。 1959 年， 从 德国春季型欧洲油菜饲料栽培品种 Liho 中首次鉴定到了具有在种子油中低水平的 C22:1 的突变体 (Stefansson 等， 1961)。将低 C22:1 植物与适合的栽培品种回交。在北美洲和欧 洲， 已有从传统油菜籽和低芥子酸品种完整转换为双低油菜品质品种的商业性生产存在。
     高芥子酸和超高芥子酸 ： 尽管在营养上不合需要， 但是高 C22:1 油类和 C22:1 衍生物具有超过 200 种潜在的工业应用， 例如作为润滑剂和溶剂中的添加剂， 作为织物 软化剂以及酰胺衍生物用于制造聚合物、 高温流动性润滑剂、 表面活性剂、 增塑剂、 表面 涂 层 和 药 物 (Scarth&McVetty， 2006)， 以 及 公 布 了 超 过 1000 项 关 于 C22:1 应 用 的 专 利 (Mietkiewska 等， 2004)。为与基于石油的产品竞争， 期望尽可能高地增加 C22:1 水平以 减少纯化费用。最初的具有低芥子油苷含量的高芥子酸油菜籽 (HEAR) 栽培品种， 例如cv.Hero(Scarth 等， 1991， 1992)、 cv.Mercury(54％ C22:1 ； Scarth 等， 1995a)、 cv.Castor 和 MilleniUM01(C22:155％ ； McVetty 等 1998， 1999) 是可以利用的。此外， 具有高芥子酸含量 的合适的品种是 cv.Hearty、 Maruca、 Maplus。已通过经杂交挑选的两种祖二倍体品系—— 芜菁 (B.rapa) 和甘蓝 (B.oleracea) 再合成欧洲油菜 (Taylor 等， 1995)， 从而逼近了增加 C22:1 水平的目标。再合成的植物可积累 C22:1 水平至高达 60％ (Lühs&Friedt， 1995)。已 知涉及 C22:1 合成的基因和等位基因 (Scarth&McVetty， 2006)， 因此利用定向 ( 标记辅助育 种 ) 和 / 或转基因方法来增加 C22:1 含量都是有可能。具有大于 80％ C22:1 水平的超高 芥子酸菜籽 (SHEAR) 油期望能降低生产作为一种可再生的、 环境友好的工业原料的该脂肪 酸及其衍生物的成本。通过表达旱金莲 (Tropaeolum majus L.)FAE 基因 C22:1 水平增加 90％ (Mietkiewska 等， 2004)， 证实了使用 FAE 基因由高 -C22:1 累积物种来增加芸苔种子 油中 C22:1 积累的潜在应用。
     低亚麻酸 C18:3 和 C18:2， 与它们的更长链和更不饱和的衍生物一起构成了人体 发育和健康所必需的两个系列的必需多不饱和脂肪酸 (PUFA)， 分别属于 n-3 和 n-6 脂肪酸。 然而， 在 PUFA 的化学结构中增加数目的双键使得它们对氧化敏感。与 C18:1 相比， C18:2 和 C18:3 的氧化速率分别高大约 10 和 25 倍。因此， 高 C18:2 和 C18:3 的油类在暴露在空 气中时就会变质得越快， 特别是处于高温时， 导致缩短的油类货架期， 使得该油类对于人消 费是较不健康的。通常地， 较不稳定的油类会被氢化以增加稳定性， 但氢化步骤会导致反 式脂肪酸形成， 由于它们的生理功能， 其又引起关注。此外， 氢化增加了加工商品油类的成 本。最初的低 C18:3 双低油菜品种， 例如 cv.Stellar(3％ C18:3)， 品系 ‘M11’ ( &Nitsch， 1975) 和 cv.Apollo(Scarth 等， 1995b) 是可利用的。已知涉及 C22:1 合成的基因 和等位基因 (Scarth&McVetty， 2006)， 因此利用定向 ( 标记辅助育种 ) 和 / 或转基因方法来 增加 C22:1 含量都是有可能的。
     高和非常高油酸具有高 C18:1 和低 C18:3 水平的油类具有更高的氧化稳定性， 无 需部分氢化， 并且在油炸期间产生较少的不合需要的产物。高油酸油具有与饱和脂肪相 当的热稳定性， 并且适合在需要长期稳定性的商业饮食服务应用中取代它们。描述了具 有 80-90％ C18:1 的高油酸含量的品系 (Vilkki& 1995 ； Rücker& 1995 ； Schierholt&Becker， 1999 ； Wong 等， 1991)。市售的是具有 70-75 ％ C18:1 和降低的 C18:3 水平的 cv.Clear Valley 75 和 MONOLA(Scarth&McVetty， 1999)。高 C18:1 突变与欧 洲油菜中 fad2 基因相关 (Laga 等， 2004)。在芥菜型油菜 (B.juncea) 中， 在 C18:1 水平中， 两个 QTLs 共同可占 32.2％变化 (Sharma 等， 2002)。在通过 Δ12- 去饱和酶和 FatB 硫酯酶 工程化开发非常高 C18:1 含油种子中已取得了相当大的进展。使用有义或反义 Δ12- 去饱 和酶构建体的转基因欧洲油菜在种子油中能积累高达 89％ C18:1， 并且 PUFA 级分减少 ( 评 述于 Scarth&McVetty， 2006 中 )。 特别优选地是高油酸和低亚油酸组合的油组成， 其产生了 具有非常好的油炸品质的油类。这样的性状存在于例如品种 cv.Splendor 中。 低和非常低饱和脂肪酸 C16:0 是包括芸苔油的植物油的总饱和脂肪酸水平的主 要组成部分。C16:0 以及更短链的脂肪酸 C8:0-C14:0 被广泛报道增加动物和人中血浆总 胆固醇 (TC) 和低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 水平。双低油菜油是唯一符合美国和加拿大 的标签条例中所规定的低饱和油类 ( ＜ 7％ ) 标准的商用植物油。期望进一步降低饱和脂 肪酸水平以达到零饱和脂肪水平。描述了具有小于 6％的进一步减少的水平的品系 (Raney
     等， 1999)。一种替代 “传统” 育种用于减少饱和水平的方法在于调节包括 KAS、 去饱和酶和 硫酯酶的多种基因的表达 (Dehesh， 2004 ； Scarth&McVetty， 2006)。描述了与在非转化的 欧洲油菜植物中约 6.0％的水平相比， 具有低于 3.4％的总饱和脂肪酸水平的转基因芸苔 (Dehesh， 2004)。
     高水平的短链和中链脂肪酸 ( 高月桂酸、 高辛酸和癸酸 ) 富含短链和中链脂肪酸 (SMCFA) 的植物油在多个食品和非食品工业中是有用的。目前， SMCFA 的商业来源是椰子 油和棕榈仁油。芸苔种子油具有几乎无法被检测到的水平的 C8:0、 C10:0 和 C12:0 的痕量 SMCFA。通过使用各种基因的转基因方法， 可获得显著水平的 SMCFA。这样地转基因植物产 生具有高达 56mol％ C12:0 的种子油 (Voelker 等， 1996)。Bay-FatB 转化的欧洲油菜植物 的种子油在 SMCFA 水平中类似于椰子油和棕榈仁油的组成 (Voelker 等， 1996)， 所述椰子油 和棕榈仁油用于食品例如巧克力、 糖果包衣、 糖膏、 非乳制奶油、 低脂人造黄油、 肥皂、 洗涤 剂和化妆品中。在用 Cuphea FatB2 硫酯酶基因转化后的芸苔中获得了高达 40％ C8:0 和 C10:0(Dehesh 等， 1996)。
     高棕榈酸在表达 FatB 硫酯酶和来自 MCFA- 累积植物物种的 KAS 的转基因植物中 观察到种子油 C16:0 水平的明显增加。表达 Cuphea Ch FatB1 基因的转基因植物具有高 达 34mol％的 C16:0 水平 (Jones 等， 1995)。在表达来自榆树 ( 美国榆 (Ulmus americana L.)) 和肉豆蔻 (Myristica fragrans Houtt.) 的 FatB 基因的转基因欧洲油菜植物的种子 油中发现了类似的 C16:0 水平 (Voelker 等， 1997)。
     高硬脂酸具有高饱和脂肪酸水平的植物油用于制造固体脂肪食品， 例如人造黄油 和起酥油， 节约了氢化成本并避免了产生不需要的反式脂肪酸。 C18:0 优于其他类型饱和脂 肪酸， 原因在于其降低了血清脂蛋白胆固醇或对之没有影响。双低油菜栽培品种在种子油 中仅具有 1.1-2.5％ C18:0。业已报道了非天然或诱导的高 C18:0 芸苔种质。但是， 描述了 控制 C18:0 水平的基因 ( 评述于 Scarth&Mc Vetty， 2006 中 )。描述了欧洲油菜 Westar 品 种 (B.napus cv.Westar) 产生的种子油具有高达 10.1％ C18:0(Hitz 等， 1995)。欧洲油菜 Quantum 品种 (B.napus cv.Quantum) 中来自倒捻子 (mangosteen) 的 FatA 基因的表达增加 了超过 22％的 C18:0 水平 (Hawkins&Kridl， 1998)。 与野生型 FatA 版本相比， 来自位点特异 性诱变的突变的倒捻子 FatA 的表达导致 C18:0 水平 55-68％的增加 (Facciotti 等， 1999)。 第二种策略是过表达 Δ9- 去饱和酶， 该酶指导碳流至 C18:1-ACP 生产。 降低的 Δ9- 去饱和 酶活性会导致更高的 C18:0 累积 (Knutzon 等， 1992)。尽管使用大豆 Δ9- 去饱和酶的有义 抑制在欧洲油菜中无效 (Hitz 等， 1995)， 但是使用芜菁 Δ9- 去饱和酶基因的反义抑制在转 基因芜菁中增加 C 18:0 水平至大于 32％以及在欧洲油菜中增加至大于 40％ (Knutzon 等， 1992)。第三种策略是同时操纵两种酶的活性。过表达 FatA 硫酯酶并下调节 Δ9- 去饱和 酶， 增加 C18:0 水平至 45％， 较单独表达 FatA 硫酯酶转基因 (11％ C18:0) 和 Δ9- 去饱和 酶转基因 (13％ C18:0) 更高 ( 等， 1995)。启动了具有包含靶基因反向重复序列的 双沉默构建体的欧洲油菜和芥菜型油菜中 FatA 和 FatB 的下调节 (Pandian 等， 2004)。一 种用于开发高 C18:0 芸苔油的额外方法可下调节 Δ9 和 Δ12 去饱和酶的活性， 如在对于两 种去饱和酶用发夹 RNA 沉默构建体工程化的棉籽中所示的， 将棉籽 C18:0 水平从 2-3％增加 到 40％ (Liu 等， 2002)。
     多不饱和脂肪酸 (PUFA)γ- 亚麻酸 (GLA) 是一种必需脂肪酸 n-6 家族中的 PUFA。GLA 是一种人和动物饮食中在营养上重要的多不饱和脂肪酸。描述了用于表达这些脂肪酸 的基因 ( 论述于 Scarth&McVetty， 2006)。极长链多不饱和脂肪酸 (VLCPUFA) 具有 20 或 22 个碳原子， 带有 4-6 个中断的双键， 包括在人中具有重要治疗和营养益处的脂肪酸， 例如花 生四烯酸 (ARA)、 二十碳五烯酸 (EPA) 和二十二碳六烯酸 (DHA)。芸苔物种像其他高等植物 一样不产生极长链 PUFAs 例如 ARA、 EPA 和 DHA。GLA 和 ALA 并不常见于高等植物中。为开 发富含 ARA 和 EPA 的含油种子， 必须导入至少三个基因 (Abbadi 等， 2004)。 在烟草中证实了 工程化 ARA 途径的可行性 (Huang 等， 2004)。 共轭脂肪酸是具有不为甲叉单元所分离的双键 的多不饱和脂肪酸。在涂层应用中， 富含共轭脂肪酸 ( 例如十八碳三烯酸 ) 的油类具有作 为干性油的优异特性。 来自编码将共轭双键导入多不饱和脂肪酸的酶的金盏花 (Calendula officinalis L.) 基因的表达导致在大豆油中累积了 20-25 ％总脂肪酸的十八碳三烯酸 (Cahoon 等， 2001)。环氧脂肪酸例如斑鸠菊酸是通过单加氧酶和二铁去饱和酶的趋异型所 产生的 (Hatanaka 等， 2004)， 并且是用于生产树脂、 胶、 塑料、 聚合物等的有价值的原材料。
     其他新的脂肪酸 “新的” 或 “不常见的” 脂肪酸宽广地定义为具有不同于在主要含 油种子作物中常见的那些脂肪酸的化学结构的脂肪酸 (Jaworski-&Cahoon， 2003)。通过特 定的去饱和酶产生了不常见的单不饱和脂肪酸， 该去饱和酶将双键插入酰基链中不常见的 位置处， 而非如在常见的脂肪酸 C18:1 中所看到的碳 8-9 之间。在生产生物可降解的润滑 剂、 表面活性剂和塑料前体中， 富含岩芹酸或棕榈油酸的植物油可用作石油的代用品。
     此外， 在本发明的一个优选的实施方案中， 由杂种种子生长成的本发明的芸苔属 植物产生了种子， 在收获和破碎后， 其产生了具有选自如下组成的油
     a) 小于 2％的芥子酸 (erucic acid) 含量，
     b) 大于 45％的芥子酸水平，
     c) 大于 70％的油酸含量，
     d) 小于 8％的 α- 亚油酸含量，
     e) 小于 8％的亚麻酸含量，
     f) 小于 10％的饱和脂肪酸含量，
     g) 大于 20％ ( 优选 20-35％ ) 的硬脂酸含量，
     h) 大于 10％， 优选大于 20％的短链和中链脂肪酸 ( 优选自月桂酸、 辛酸和癸酸 ) 含量，
     i) 大于 20％， 优选大于 30％的棕榈酸含量， 和
     j) 大于 10％， 优选大于 20％的多不饱和脂肪酸 ( 优选地， 长链多不饱和脂肪酸选 自花生四烯酸 (ARA)、 二十碳五烯酸 (EPA) 和二十二碳六烯酸 (DHA)， 或共轭多不饱和脂肪 酸例如共轭亚油酸 (CLA)) 含量。
     6.2 除草剂抗性性状
     在本发明的另一个优选的实施方案中， 本发明的欧洲油菜植物进一步包含除草剂 抗性性状。除草剂抗性可包括例如针对孟山都以 ROUNDUPTM 商标名出售的除草剂草甘膦的 抗性。草甘膦是一种广泛使用的除草剂， 因为迄今在植物的生长部分种类及并且具有很少 的土壤残留物或没有土壤残留物。
     视情况， 如在公知的 US 5,387,758( 在此并入作为参考 ) 中所描述的， 用于容忍当 按能破坏本发明缺少所述遗传手段的油菜植物的比例应用的除草剂的遗传手段任选地还可掺入本发明的油菜植物中。在双低油菜中有两种基因涉及草甘膦抗性。一种编码解毒的 酶除草剂 ； 其称为 GOX， 草甘膦氧化还原酶。另一种是编码 EPSP 合酶突变体的突变的靶基 因。基本上， 将上述基因导入植物细胞中， 例如携带有 Ms 系统的遗传成分的本发明的植物 细胞中， 然后将该植物细胞生长成芸苔属植物。
     另一种优选的除草剂抗性， 其既可作为转基因又可作为天然突变的基因型获得， 是针对咪唑啉和 / 或碘酰脲类除草剂 ( 例如 PURSUITTM) 家族的抗性。针对咪唑啉的抗性是 基因 AHAS 或 ALS 所赋予的。本领域技术人员会将存在于任意的 CLEARFIELDTM 油菜籽中的 AHAS 的突变型导入还携带有本发明的 Ms 系统的遗传成分的芸苔属植物中。 可选地， 通过本 领域公知的几种方法的任何一种， 可以将带有合适的启动子的 AHAS 基因的修饰型导入油 菜籽植物细胞中。基本上， 将上述基因导入植物细胞中， 例如携带有任何一种本发明的 Ms 系统的遗传成分的本发明的植物细胞中， 然后将该植物细胞生长成芸苔属植物。
     7. 一般技术
     7.1 性状和基因渗入
     本发明的 Ms 等位基因、 ms 等位基因、 Rf 等位基因、 rf 等位基因 ( 或它们的任何组 合 ) 可渗入欧洲油菜和其他芸苔属品种的任何遗传背景中。
     转基因技术
     根据本发明的另一个方面， 对于 Ms 和 / 或 rf 等位基因， 包含基因组序列的核酸 ( 优选 DNA) 序列可用于生产转基因杂交系统。所述核酸序列可来源于在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的种子。 本发明还涉及一种生产具有基因型 MsMsrfrf 的雄性不育欧 洲油菜植物或具有基因型 msmsrfrf 的欧洲油菜保持系植物的方法， 包括步骤 ： 执行一种检 测与雄性不育相关的 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因存在的方法， 和 / 或执行一种如上所 述在根据本发明的欧洲油菜植物中保持雄性不育的方法， 和将包含至少一种如此检测到的 Ms 等位基因或 rf 等位基因的核酸序列， 或赋予或保持雄性不育的其部分， 从所述供体植物 转移到受体植物 ( 优选芸苔属植物， 更优选欧洲油菜植物 )。 可通过任何本领域已知的方法 包括农杆菌介导的基因转移或微粒介导的基因转移， 进行所述核酸序列的转移。
     非转基因技术
     这样的方法的一个优选的实施方案包括通过杂交所述植物， 由基础雌性或保持系 欧洲油菜植物 ( 例如来源于在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的种子的植物 ) 基因 渗入所述核酸序列的转移。因此， 该转移可适合与传统的育种技术一起使用。
     在每一世代中， 确定 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因的存在与否。由于雄性 不育表型， 恢复系等位基因的存在与否可容易在每一世代中检测， 例如通过能育性计分 (fertility scoring)。在最后一次回交发生后， 优选进行自交步骤。在下一世代中， 如在 本发明中所描述的， 分子标记用于选择对于 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因是纯合的植物。 这些植物代表了可用于生产杂种种子的预基础雌性系 (MsMsrfrf) 或保持系 (msmsrfrf)。
     优选通过使用上述的标记辅助选择 (MAS) 或标记辅助育种 (MAB)， 将 Ms 等位基因 和 / 或 rf 等位基因基因渗入商用欧洲油菜品种中。MAS 和 MAB 涉及使用一种或多种分子 标记用于鉴定和选择那些包含一种或多种编码所需性状的基因的子代植物。 在本发明的实 例中， 这样的鉴定和选择是基于 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因或与之相关的标记的选择。 根据该实施方案开发的欧洲油菜植物可有利地从受体植物中获得它们的大部分性状， 以及从供体植物 ( 即基础雌性系或保持系 ) 中获得赋予或保持特性的雄性不育。
     在一种称为谱系选择的方法中， 将显示赋予或保持特性的雄性不育的供体欧洲油 菜植物 ( 如本发明的预基础雌株或保持系植物 ) 与缺少所述特性但优选显示商业上所需特 性的受体欧洲油菜植物杂交， 所述商业上所需特性例如但不限于抗病性、 抗虫性、 有价值油 类和 / 或粕特性等。然后， 将所得到的植物种群 ( 表示为 F1 杂种 ) 进行自花传粉， 并使之 产生种子 (F2 种子 )。接着， 对由 F2 种子生长成的 F2 植物筛选赋予或保持特性的雄性不育。 可以多种不同方式筛选该种群。首先， 可通过分别评估品系的不育性或能育性或它们的特 性筛选种群以保持不育性。其次， 可使用上述一种或多种分子标记进行标记辅助选择以鉴 定那些包含 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因的后代。涉及上文中通过相关的表型用于检测 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因存在的方法的其他方法也可使用。 同样， 标记辅助选择可用 于证实由定量生物测定所获得的结果， 因此， 几种方法还可组合使用。
     本发明进一步包括一种基因渗入 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因的方法， 包括步 骤： 获得包含 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因的芸苔属植物， 例如在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下分别保藏的芸苔近交系， 将该植物与另一种芸苔属植物杂交并选择包含 Ms 等位 基因和 / 或 rf 等位基因的种子。 将得到的 F1 植物与轮回亲本杂交以取代更多的芸苔近交系 的基因组， 特别是 80-99.5％的基因组， 更特别是 90％ -99％的基因组， 但尤其是 95％ -98％ 的基因组。将包含 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因的植物对具有目标遗传背景的品种至少 回交两次。在第 2 次回交中， 进行能育雌性系 ( 包含来自具有目标背景的能育品种的 Rf 等 位基因 ) 的平行自交以获得 BC0S1 植物。在随后的育种步骤中只利用包含 Ms 和 rf 等位基 因 ( 自交后产生不育植物 ) 的植物。在每一个 BC 世代中进行个自交和平行杂交过程。可 选地， 可使用标记技术追踪 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因的存在与否。
     可使用轮回选择和回交、 自交和 / 或双单倍体技术或任何其他用于制备亲本系统 的技术开发雄性不育基础雌性近交系或保持系。在轮回选择和回交方法中， 通过将轮回亲 本与第一供体植物杂交， 可将涉及或保持雄性不育的基因型基因渗入靶受体植物 ( “轮回亲 本” ) 中， 所述第一供体植物不同于轮回亲本并在此被称为 “非轮回亲本” 。轮回亲本是一种 缺少赋予或保持雄性不育特性并且优选具有商业上所需特性的植物， 所述商业上所需特性 例如但不限于 ( 额外的 ) 抗病性、 抗虫性、 有价值油类或粕特性等。非轮回亲本显示雄性不 育赋予或保持特性并包含编码 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因的核酸序列。非轮回亲本可 以是任何与轮回亲本杂交可育的植物品种或近交系。 将轮回亲本和非轮回亲本之间杂交所 得到的后代与轮回亲本回交。然后针对所需特性筛选所得到的植物种群， 该筛选可以多种 不同方式来进行。例如， 可使用本领域已知的表型病理学筛查法或定量生物测定法进行种 群筛选。可选地， 代替使用生物测定法， 可使用一种或多种上文中描述的分子标记、 杂交探 针或多核苷酸来鉴定那些包含编码 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因的核酸序列的后代， 以 进行标记辅助选择 (MAS)。同样， MAS 可用于证实定量生物测定获得的结果。因此， 在此定 义的标记最终适合于通过基因型筛选来选择合适的子代植物。
     筛选后， 选择显示雄性不育赋予或保持表型的或更优选显示雄性不育赋予或保持 基因型并因此包含编码 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因的必需核酸序列的欧洲油菜植物， 并与轮回亲本回交持续多个世代， 以致使得欧洲油菜植物变得格外近交。 该方法可进行 2-5 个或更多个世代。原则上， 由轮回亲本与涉及或保持雄性不育的非轮回亲本杂交过程产生的后代对于 Ms 等位基因或 rf 等位基因是杂合的。纯合植物可通过该植物自交并通过标记 分析评估后代的基因型或进一步自交并检测表型分离模式而获得。
     一般而言， 一种将所需的赋予或保持雄性不育性状导入欧洲油菜品种中的方法包 括步骤 ：
     (a) 将欧洲油菜近交亲本与另一包含 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因的欧洲油菜 植物杂交以产生 F1 后代植物 ；
     (b) 选择具有所需 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因的所述 F1 后代植物以产生经选 择的 F1 后代植物， 优选使用在此定义的分子标记 ；
     (c) 将经选择的后代植物与所述的欧洲油菜近交亲本植物回交以产生回交后代植 物；
     (d) 对回交后代植物选择具有所需 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因以及所述欧洲 油菜近交植物的形态学和生理学特性的植物， 其中所述选择包括分离基因组 DNA 并针对 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因测试所述 DNA 中至少一种分子标记的存在， 优选如在此所描述 的；
     (e) 重复步骤 (c) 和 (d) 两次或更多次继而产生经选择的第三代或更高代回交后 代植物 ； 和
     (f) 任选地自交选择的回交后代以便鉴定纯合植物。
     如所指示的， 可自交最后一个回交世代以便提供用于赋予或保持雄性不育的纯合 的纯育 ( 近交 ) 后代植物。 因此， 轮回选择、 回交和自交的结果是产生了在遗传学上对于 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因以及对于与商业上感兴趣的性状相关的其他基因是纯合的品 系。
     在一个用于生产本发明的雄性不育系或保持系芸苔属植物的可选的实施方案中， 原生质体融合可用于将本发明的 Ms 等位基因或 rf 等位基因转移到受体植物。 通过该方法， 本发明的杂交系统可在用于其他物种， 优选用于其他芸苔物种例如甘蓝。原生质体融合是 一种诱发或自发的联合， 例如在两个或更多个原生质体 ( 其细胞通过酶处理除掉细胞壁 ) 之间进行体细胞杂交产生单一双核或多核细胞。 融合细胞可甚至获得自在自然界中没有进 行品种间杂交的植物物种， 经组织培养成具有所需性状组合的杂种植物。 更具体地说， 第一 原生质体可获得自本发明的欧洲油菜植物 ( 例如来源于在保藏编号 NCIMB 41480 或 41481 下保藏的种子的植物 )。第二原生质体可获得自另一种欧洲油菜例如其他芸苔物种或其他 植物品种， 优选包含商业上有价值的特性例如但不限于抗病性、 抗虫性、 有价值的果实特性 等的芸苔品系。然后， 使用本领域已知的传统的原生质体融合方法融合原生质体。
     可选地， 胚拯救可用于将在此描述的包含 Ms 和 / 或 rf 等位基因的核酸从供体植 物转移到受体植物。胚拯救可用作一种从其中植物无法产生有活力的种子的杂交中分离 胚的方法。在该方法中， 对植物已受精的子房或不成熟的种子进行组织培养以产生新植物 (Pierik， 1999)。
     其他技术可额外地或替代地用于基因和性状的基因渗入。 这样的技术可包括使用 双单倍体技术 (Fletcher 等， 1998)， 对于预基础系和保持系， 其能显著增加近交世代的速 度。对于预基础系， 需要利用热处理操作， 因为要不然小孢子会败育。
     7.2 创建差异基因库利用杂种优势最大效应以及长期成功的杂种优势育种需要具有高遗传差异性的 亲本。油菜的窄遗传基础是在长期育种中增加杂种性能的限制因素。通过导入再合成的基 因型 (Girke， 2002) 并使用相互反复选择方法， 该遗传基础肯定会逐步延伸。尤其在冬双低 油菜中， 可观察到现有商用品种的窄遗传相关 (r ＝ 0， 87)(Girke， 2002)。
     具有较固定最小值更低的遗传距离的亲本系并不值得在田间进行检测。可通 过同工酶分析 (Mündges 等， 1990) 或更便利地通过标记 (RFLP ： Beckmann&Soller， 1983 ； Botstein 等， 1980 ； RAPD( 随机扩增多态 DNA) ： Williams 等， 1990 ； &Knaak， 1995) 检 测距离。这减少了产量试验的工作量。
     7.3 在育种中的应用
     本发明的植物可用于多种繁殖活动， 包括但不限于
     a) 杂种的自交递降 (Selfing Down) ： 培养包含本发明的新的 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因的低芥子油苷杂种。 能育植物进行自花传粉， 一些使用袋子， 其他通过人工刷花 粉。由这些 F1 植物收获 F2 种子并种植作为种群。选择来自该种群的能育植物并生长作为 F3 畦 (row)， 从而提供用于育种方法例如谱系选择、 轮回选择等的起始材料。
     b) 在传统育种中作为亲本 ： 将包含本发明的 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因的品 系与作为育种计划一部分的其他种质品系杂交。生长来自这些杂交的 F1。能育植物自花传 粉并收获所得到的 F2 种子。挑选、 收获来自 F2 种群的能育植物并生长作为 F3 畦， 从而提供 用于育种方法例如谱系选择、 轮回选择等的起始材料。
     c) 在双单倍体中作为亲本 ： 将本发明的 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因的来源与 改良的种质杂交。所得到的杂种经历小孢子培养产生双单倍体恢复系。所利用的小孢子培 养类似于 Chen 等 (1994) 和 Mollers 等 (1994) 所描述的那些小孢子培养。因此， 本发明的 另一个实施方案涉及一种生产本发明的欧洲油菜植物 ( 例如基础、 预基础或保持系 ) 的方 法， 包括步骤 ：
     i. 选择具有包含选自 Ms 等位基因、 ms 等位基因、 rf 等位基因和 Rf 等位基因的等 位基因的小孢子的雄性能育亲本 ；
     ii. 由所选择的步骤 (i) 的雄性能育植物培养经选择的小孢子， 形成单倍体并包 括双单倍体 ；
     iii. 对双单倍体后代检测与所述等位基因相关的表型或通过标记检测等位基因 的存在 ； 和
     iv. 选择对于所述等位基因的存在是阳性的后代。
     d) 在回交计划中作为起源 ： 将包含 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因的材料与挑选 的近交系杂交。雄性能育植物去雄并再与近交系 ( 轮回亲本 ) 杂交。将所得到的雄性能育 植物再与近交系回交。在任一世代， 材料的自交递减可开始产生新的恢复系。这些计划例 证了一种将 Ms 等位基因和 / 或 rf 等位基因带入优良种质中的回交计划。可使用标记分析 ( 如上所述的 )。
     根据阅读下列实施例和附加的权利要求， 本发明的这些和其他目的和优点对于本 领域技术人员是显而易见的。
     保藏物
     欧 洲 油 菜 近 交 系 07055001( 雄 性 不 育 预 基 础 种 子 系 ； 基 因 型 MsMsrfrf) 的种 子 样 品 于 2007 年 5 月 16 日 保 藏 在 NCIMB， Ltd.(NCIMB Ltd ； FergusonBuilding， Craibstone Estate， Bucksburn， Aberdeen， AB219YA， UK ； Tel ： +44(0)1224711100Fax ： +44(0)1224711299)， 保藏编号 NCIMB 41480。
     欧洲油菜近交系 04058001( “保持系” ； 基因型 msmsrfrf) 的种子样品于 2007 年 5 月 16 日保藏在 NCIMB， Ltd.(NCIMB Ltd ； Ferguson Building， Craibstone Estate， Bucksburn， Aberdeen， AB219YA， UK ； Tel ： +44(0)1224711100Fax ： +44(0)1224711299)， 保藏编号 NCIMB 41481。
     关于生物材料来源的声明
     Ms 和 rf 等位基因获得自 1998 年欧盟 ( 德国和其他国家 ) 市售的欧洲油菜材料。 具体实施方式
     下列实施例旨在提供本发明应用的例证， 并不意在完全规定或限制本发明的范 围。
     实施例 1 ： GSL 分析
     在育种计划全过程中监测芸苔种子的芥子油苷 (GSL) 含量。芥子油苷含量以 μlmol/ 克 9 ％水分含量的种子给出。可使用现有技术例如 HPLC 或近红外反射光谱法 (NIRS) 进行芥子油苷分析。 利用 NIRS 法， 可对未受破坏的芸苔种子样品分析它们的品质构 成油类、 蛋白和芥子油苷。
     在此讨论的芥子油苷水平根据两种标准方法进行测定， 即 (1) 如用于总全芥子油 苷定量的 ISO 9167-1 ： 1992(E) 中所描述的高效液相色谱法 (HPLC)(“油菜籽 - 芥子油苷 含量的测定 -- 第 1 部 ： 使用高效液相色谱的方法， 国际标准化组织” ， 日内瓦 )， 和 (2) 如通 过 Sosulski 和 Dabrowski(1984) 所描述的， 用于提取并纯化的脱硫芥子油苷的三甲基甲硅 烷 (TMS) 衍生物定量的气相色谱法。在此讨论的用于测定芥子油苷水平的 HPLC 和 TMS 法 均涉及破碎和提炼油后种子固体成分 ( 即脱脂或无油粕 ) 的分析。更优选地， 使用近红外 反射光谱法进行芥子油苷分析。该分析在 FOSS NIR Systems Model5000-c 上进行。芥子 油苷分析描述于 Williams&Sobering(1992) 中。
     实施例 2 ： 测定脂肪酸组成的方法
     根据标准方法测定在此讨论的脂肪酸浓度， 其中通过破碎从芸苔含油种子中除去 油， 随后与甲醇和甲醇钠 (sodium methoxide) 反应作为脂肪酸甲酯提取。接着， 通过使用 毛细管柱的气液色谱法对所得到的酯分析脂肪酸含量， 该气液色谱法容许在不饱和度和链 长的基础上进行分离。该分析方法描述于 Daun 等 (1983) 的工作中， 其在此并入作为参考。
     实施例 3 ： 纯合的预基础雄性不育系的开发
     使用欧洲油菜品种 Zenith 的花粉对雄性不育 Takagi 种质欧洲油菜植物传粉。该 杂交的 F1 后代是雄性能育的。在温室中将那些植物与人工除雄后的品种 Smart 的雄性能 育植物杂交。F1 植物由温室中每一植物的杂交种生长起来。所有植物都显示雄性能育表 型。通过用塑料袋 (Cryovac CrispacBeutel Super Micro Lochung 360x 830mm， 供应商 ： Baumann SaatzuchtbedarfD-74638Waldenburg) 分离单株植物， 自交在该种群之外的单株 植物。在温室中对雄性不育 / 能育性测试 F2 自交后代。10 个种群中的 8 个是能育的， 其他 2 个种群显示不育性 / 能育性分离。如在以下实施例 10 中所描述的， 在高温度条件下自交来自这些种群的不育植物。那些雄性不育植物的 F3 种群再在温室中生长并自交。仅 3 个 种群显示雄性不育植物， 而 10 个种群分离成雄性不育和雄性能育植物。在热处理下自交来 自非分离种群的雄性不育植物。根据图 1 给出的遗传方案并通过标记分析证实， 这些植物 显示基因型 MSMSrfrf。在温室中生长出 264 株 F4 植物。它们都显示雄性不育表型。在热 处理后， 可从所有植物中收获总计 232g 的种子。
     实施例 4 ： 保持系的开发
     当它们显示 rfrfmsms 时， 自交在来自实施例 3 的分离 F3 种群之外的雄性能育植物 ( 图 1)。进行与完全雄性不育 F3 种群植物的测交。使用 16 株植物各自评估 5 种不同的杂 交。 所有植物均显示雄性不育表型， 前提是杂交是如所推测的 rfrfMSMS x rfrfmsms。 在保 持系中不存在 Rf 等位基因是关键的。为确保这一点， 对该等位基因必须具有标记。来自恢 复系的异花传粉无法被检测到， 因为在保持系和恢复系之间不存在表型差异。
     实施例 5 ： 鉴定与 RHS 不育等位基因 (Ms 等位基因 ) 连锁的分子标记
     对对于 RHS 不育性基因座分离的 162 株个体的 F2 种群运行分离种群分组分析法 (BSA)(Michelmore 等， 1991) 实验。该种群来源于 RHS- 不育系 (ID ： 03550015-34 ； 如通过 在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子样品所代表的 ) 和相应的 RHS- 能育保持系 (ID ： 03560006-08 ； 如通过在保藏编号 NCIMB41481 下保藏的种子样品所代表的 ) 之间的杂交。 将在 F2 种群中观察到的对于雄性不育的分离拟合对于单显性基因预期的 3 ∶ 1 比率。 一组 762 条微卫星标记 (SSR) 用于检测在亲本系之间以及在雄性不育和雄性能育 F2 植物集团之 间的多态性。两个不同的雄性能育和雄性不育集团得到分析。所述集团由来自 10 株能育 或 10 株不育 F2 植物的叶样品混合物组成。BSA 披露了在两个亲本系之间以及在雄性不育 和雄性能育集团之间的 5 个显示多态性的 SSR 标记 ( 图 4-A)。
     随 后 在 整 个 F2 种 群 中 对 这 些 5 个 SSR 标 记 进 行 基 因 分 型 并 使 用 Mapmaker/ Exp(3.0b 版 ) 作图。作图结果证实标记 NR1116( 通过寡核苷酸引物 SEQ ID NO ： 1 和 2 扩增 的 SSR ； SSR 区如 SEQ ID NO ： 21 所示 ； 对于引物和 SSR 基序的定位还参见图 6) 和 NR2525( 通 过寡核苷酸引物 SEQ ID NO ： 4 和 5 扩增的 SSR ； SSR 区如 SEQ ID NO ： 22 所示 ； 对于引物和 SSR 基序的定位还参见图 7) 与染色体 N7 上的雄性不育等位基因 (Ms) 紧密连锁 ( 表 2)。
     NR1116 正向引物序列 ：
     5’ -TCTTCAAGGGATTCATTCGG-3’ (SEQ ID NO ： 1)
     NR1116 反向引物序列 ：
     5’ -GAAACTTCGTCGAATCCTCG-3’ (SEQ ID NO ： 2)
     NR2525 正向引物序列 ：
     5’ -ATTACCATTTCCAACGAATCT-3’ (SEQ ID NO ： 4)
     NR2525 反向引物序列 ：
     5’ -GTCTCTTTCTCAACTCTTGTATC-3’ (SEQ ID NO ： 5)
     SSR 标记 NR1116 由大约 20 个单元的 GA/CA 重复组成。 在 RHS-Ms 作图群 ( 使用 ABI 3700 测序仪 ) 中观察到的等位基因大小对于 RHS- 不育系 (0355015-34) 为 ： 96.7(+/-1) bp( 雄性不育等位基因 )， 以及对于 RHS- 保持系 (03560006-08) 为 ： 112.3(+/-0.4)bp( 雄 性能育等位基因 )。
     SSR 标记 NR2525 由大约 20 个单元的 AG 重复组成。在 RHS-Ms 作图群 ( 使用 ABI3700 测序仪 ) 中观察到的等位基因大小对于 RHS- 不育系 (0355015-34) 为 ： 192.8(+/-0.3) bp( 雄性不育等位基因 ) 以及对于 RHS- 保持系 (03560006-08)( 雄性能育等位基因 ) 没有 条带。原因在， 对于 Ms NR2525 被计为显性标记。观察到另一条 194.6(+/-0.5)bp 的片段， 但没有考虑到该条带， 因为其不变地出现在所有植物个体中， 而与它们的表型无关。
     根据表型预测 Ms 等位基因的基因型 ： 雄性不育植物可以是 ‘Msms’ 或 ‘MsMs’ ， 但雄 性能育植物则总是 ‘msms’ 。因此， Ms 等位基因被定位为显性标记。因此， NR1116 和 NR2525 定位在 Ms 性状的任意一侧， 分别具有 2.8cM 和 6.0cM 的遗传距离 ( 参见表 2)。对于 Ms 和 ms 等位基因， 计算的距离基本上相同。
     表2： 使用 Mapmaker(3.0b 版 ) 计算的位于染色体 N7 上的 Ms 和侧翼标记之间的 图距。标记间的遗传距离以厘摩 (cM) 来估计， 并与种群中发现的重组体数目成正比。
     基因座 NR1116 Ms 等位基因 NR2525 遗传距离总和
     基因座之间的遗传距离 2.8cM 6.0cM ---8.8cM用于 BSA 或用于 SSR 标记的定位的试验条件由分子标记领域技术人员公知的常规 的实验方案组成。用于 BSA 筛选的 PCR 扩增在来自 AppliedBiosystems Inc. 的 GeneAMP PCR System 9700 设备上的 384 孔板的 10μl 的总反应体积中运行， 使用 Sigma Jump start Taq 聚合酶。PCR 混合物由来自 Sigma 的 1X 反应缓冲液， 1.65mM MgCl2， 0.25mM dNTPs 和 400nM 每种引物组成。PCR 条件通常由如下组成 ： 94℃， 2min， 然后 40 个循环 (94℃， 15 秒， 59℃， 45 秒 )， 以及最终在 72℃温育 2min。随后， 根据供应商的使用说明书， 将扩增产物加 载并迁移到 3％ Resophor 琼脂糖 1000( 来自 Invitrogen Corp.) 凝胶上。为了定位目的， 用于 PCR 扩增的引物包含至少一条标记有 HEX(5’ - 六氯 - 荧光素 )、 NED( 苯并氟三氯羧 基 - 荧光素 ) 或 FAM( 羧基荧光素 ) 的引物， 以便能在 ABI 3700 测序仪上进行荧光检测以解 析并计分长度多态性。除使用荧光标记的引物之外， 用于 SSRs 定位的 PCR 条件与用于 BSA 筛选的相同。
     实施例 6 ： SSR 标记转换为 SNP 标记 .
     为了将 SSR 标记转换为被证实对于标记辅助育种更通用的 SNP 标记， 在包含纯 合的雄性不育系 (MsMs) 和纯合的雄性能育系或保持系 (msms) 的品系组中对 SSR 标记的 扩增产物进行测序， 每次 8 条。每个雄性不育系和保持系的组合代表了不同的遗传背景。 BLAST 分析使用 NR1116 的核苷酸序列 (SEQ ID NO ： 21) 作为针对 NCBI 上的基因组测绘序 列数据库 (genomicsurvey sequence database)(GSS) 的询问， 显示在 NR1116 和具有登录 号 BH708933 的来自甘蓝的 GSS 片段之间的高序列同源性。该同源性在紧接下微卫星基序 的游延续了大约 0.4Kb 的长度， 并能用于设计推定的基因组 ( 芜菁 )- 特异性引物 HiNK6440 和 6442( 分别为 SEQ ID NOs ： 7 和 8)。寡核苷酸引物 HiNK6440 ：
     5’ -GTTCACTTCTCATCTTCTTCCAG-3’ (SEQ ID NO ： 7)
     寡核苷酸引物 HiNK6442 ：
     5’ -TCCTGGCAATCAGACAATACTT-3’ (SEQ ID NO ： 8)
     对在 MsMs 和 msms 品系中获得的扩增产物的序列分析揭示了两个显示与雄性不育 性状相关的单倍体型。表 3 概述了区分两种单倍体型的多态位置的位置 ； 共有序列如 SEQ ID NO ： 3 所示。
     表 3 观察到的雄性不育和雄性能育单倍体型的特性。根据参考序列 SEQID NO ： 3 观察到的多态性的类型和位置。(indel ＝缺失 )
     使用 Applied Biosystems Inc. 发布的引物 Express 2.0 软件并遵循相应的使用 检测。称为 SR0002A说明， 选择位于第 214(T/C) 和 218(T/G) 位的 SNPs 来来发的相应于该检测的引物和探针序列列于表 4 中。
     表4： 用于 Taqman 检测 SR0002A 的引物和探针的核苷酸序列。荧光染料 ： FAM( 羧 基荧光素 ) ； VIC(Applied Biosystems 专有缩语 )。MGB ： 小沟结合物。NFQ ： 非荧光猝灭剂。
     微卫星标记 NR2525 的序列在登录号 BZ061557(SEQ ID NO ： 22) 下公开。为了测量 该序列片段与雄性不育性状相关的等位变异性， 针对该序列设计侧接微卫星基序的 PCR 引 物。
     寡核苷酸引物 HiNK6702 ：
     5’ -AGTAACATCAGCGGGGAAC-3’ (SEQ ID NO ： 13)
     寡核苷酸引物 HiNK6707 ：
     5’ -TTTAAGAGCATTGGAACTCTCC-3’ (SEQ ID NO ： 14)
     引物 HiNK6702 和 6707 的组合 ( 分别为 SEQ ID NO ： 13 和 14) 显示了两种大概相 应于 A 和 C 基因组的扩增产物 ； 在多种不同的遗传背景中， 0.6Kb 的较大的片段结果弄清楚 是单态的， 但较小的片段则显示与雄性不育性状相关的长度多态性， 对于雄性能育等位基 因为 0.5Kb， 与之相比对于雄性不育等位基因为 0.4Kb( 图 4B)。跨 MsMs 和 msms 系的该多 态片段的序列分析揭示了三种单倍体型 ( 表 5)， 如所期望的雄性不育 Ms 等位基因的一种单 一的单倍体型 ( 单倍体型 B)， 和雄性能育 ms 等位基因的两种单倍体型 ( 单倍体型 A 和 C)。
     表5： 观察到的雄性不育和雄性能育单倍体型的特征。根据参考序列 SEQ ID NO ： 6 观察到的多态性的类型和位置 (“.” 指单核苷酸缺失 )
     位置 单倍体型 B 不育 单倍体型 A 能育 单倍体型 C 能育
     365424431GCTTTCGCC三种单倍体型的共有序列如 SEQ ID NO ： 6 所示。如通过单倍体型的比对所显示 检测设计所靶向的第 158 位的 SNP 上， 雄的， 在多个位置上包括在为如上所述的性不育等位基因可与雄性能育等位基因相区分。被称为 SR0003B 的在该检测中使用的引物 和探针的序列列于表 6 中。
     表6： 用于 Taqman 检测 SR0003B 的引物和探针的核苷酸序列。荧光染料 ： FAM( 羧 基荧光素 ) ； VIC(Applied Biosystems 专有缩语 )。MGB ： 小沟结合物。NFQ ： 非荧光猝灭剂。
     使用来自 Invitrogen Corp 的 Platinum Taq 聚合酶和相应的酶混合物， 衍生于 检测通常在来自 Applied Biosystems Inc. 的 GeneAMP PCRNR1116 和 NR2525 的System 9700 设备上的 384 孔板的 10μl 的反应体积中运行。PCR 条件通常由如下组成 ： 最 初的变性步骤 ： 94℃， 2 分钟， 然后是的 40 个扩增循环 (94℃， 15 秒和 62℃， 60 秒 )。随后使 用 SDS 2.1 软件包， 在来自 Applied Biosystems Inc 的 7900HT 测序系统上定量荧光 FAM 和 VIC 信号。图 5 显示了一张使用在三块不同的云簇中分离的纯合雄性不育 (MsMs)、 杂合 雄性不育 (Msms) 和纯合雄性能育 (msms) 植物， 针对标记 SR0002A 获得的典型的图。使用 上述实验方案， 两个标记都被定位在如实施例 1 中所描述的对于雄性不育性状分离的 F2 种 群中。如所期望的， 基于原始 SSR 标记的作图位置， SNP 测定了 SR0003B 和 SR0002A 定位在 Ms 性状的任意一侧， 相对于 Ms 性状分别具有的 2.8cM 和 3.3cM 的距离 ( 表 7)。
     表7： 使用 Mapmaker(3.0b 版 ) 计算的位于染色体 N7 上的 Ms 和侧翼标记之间的 图距。标记间的遗传距离以厘摩 (cM) 来估计， 并与种群中发现的重组体数目成正比。
     基因座 NR1116 SR0002A Ms 等位基因 SR0003B NR2525 遗传距离总和
     基因座之间的遗传距离 0.0cM 2.8cM 3.3cM 2.2cM -----8.3cMMs 和 ms 等位基因显示基本上相同的距离。
     如上所述， 对于本领域技术人员显而易见的是组合使用两种标记能在油菜中进行 可靠的 Ms 性状基因分型。
     实施例 7 ： 鉴定与 RHS 恢复系等位基因 (rf 等位基因 ) 连锁的分子标记
     为了开发用于 Rf 基因座的标记， 对对于 RHS 能育性分离的 190 株个体的 F2 种群进 行 BSA(Michelmore 等， 1991)。该种群来源于 RHS- 不育系 (MsMsrfrf)(ID ： 05056504， 如在 保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子样品所代表的 ) 和恢复系 (msmsRfRf)(ID ： NK FAIR) 之间的杂交。由于对于雄性不育 Ms 基因座在该杂交中同样分离， 因此如实施例 5 中所描述 的在基于对 SSRs 标记 NR1116 和 NR2525 获得的基因型的 BSA 筛选之前从种群中除去能育的 msms 植物个体。在仅包含 MsMs 和 Msms 植物的 190 株个体的亚种群中， 将对于能育性的分 离拟合对于单显性基因预期的 3 ∶ 1 比率。一组 1225 条微卫星标记 (SSR) 用于检测在亲本系之间以及在雄性不育和雄性能育 F2 植物集团之间的多态性。三个不同的雄性能育和 雄性不育集团得到分析。所述集团由来自 10 株能育或 10 株不育 F2 植物的叶样品混合物 组成。BSA 披露了在亲本系之间以及在雄性不育和雄性能育 F2 植物集团之间的 37 个 SSRs 多态性。随后在整个 F2 种群中对这些 37 个 SSRs 进行基因分型并使用 Mapmaker/Exp(3.0b 版 ) 作图。根据所观察到的表型预测 Rf 等位基因的基因型 ： 雄性能育植物可以是 ‘Rfrf’ 或 ‘RfRf’ ， 但雄性不育植物则总是 ‘rfrf’ 。因此。Rf 等位基因被定位为显性标记。该作 图结果揭示了两种与染色体 N19 上雄性能育性基因 (Rf) 紧密连锁的 SSRs， NR2219(SEQ ID NO ： 23) 和 NR3454(SEQ ID NO ： 26)( 表 8)。事实上， NR2219 和 NR3454 分别定位在 Rf 任何 一侧的 10.2cM 和 26.5cM 的遗传距离上。对于 rf 和 Rf 等位基因， 所计算的距离基本上相 同。
     业已如实施例 5 中所描述的， 用于 BSA 或用于 SSR 标记的定位的试验条件由分子 标记领域技术人员公知的常规的实验方案组成。
     用于 SSR NR2219 扩增的引物如下 ：
     NR2219 正向引物序列 ：
     5’ -ATTATCCTCTCGCCATTTC-3’ (SEQ ID NO ： 19)
     NR2219 反向引物序列 ：
     5’ -AAACTCCTGAACACCTCCTAC-3’ (SEQ ID NO ： 20)
     用于 SSR NR3454 扩增的引物如下 ：
     NR3454 正向引物序列 ：
     5’ -GATGGTGATGGTGATAGGTC-3’ (SEQ ID NO ： 24)
     NR3454 反向引物序列 ：
     5’ -GAAGAGAAGGAGTCAGAGATG-3’ (SEQ ID NO ： 25)
     SSR NR2219 由大约 27 个单元的 TA 重复组成。对于雌性亲本系 (ID ： 05056504， 如在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子样品所代表的 ) 的 rf 等位基因， 在 ABI 3700 测 序仪上观察到的等位基因大小为 240.8(+/-0.4)bp， 而对于恢复系 (NK FAIR ： Rf 等位基 因； 恢复系等位基因 )， 则没有获得条带。因此， NR2219 在分离种群中起显性标记作用 ： 等 位基因 240.8(+/-0.4) 的存在相应于 rf 等位基因的纯合和杂合状况， 而不存在等位基因 240.8(+/-0.4) 则相应于 Rf 等位基因的纯合状态。
     SSR NR3454 由大约 4 个单元的 TCA 重复组成。对于雌性亲本系 (ID ： 05056504， 如 在保藏编号 NCIMB 41480 下保藏的种子样品所代表的 ) 的 rf 等位基因， 在 ABI3700 测序仪 上观察到的等位基因大小为 282(+/-0.38)bp， 以及对于恢复系 (NK FAIR ： Rf 等位基因 ； 恢 复系等位基因 ) 则为 290(+/-0.38)bp。
     表8： 使用 Mapmaker(3.0b 版 ) 计算的位于染色体 N19 上的 Rf 和侧翼标记之间的 图距。标记间的遗传距离以厘摩 (cM) 来估计， 并与种群中发现的量组体数目成正比
     基因座 NR3454基因座之间的遗传距离 26.5cM82101861390 A CN 101861391说基因座 Rf 等位基因 NR2219明书73/93 页基因座之间的遗传距离 10.2cM -----遗产距离的总和 36.7cM实施例 8 ： 在基因芯片上通过单特征多态性 (SFP) 检测进行 RHS 恢复系基因 (rf 基 因 ) 的精细作图
     通过在 Syngenta 专有的芸苔基因芯片上对 Rf 基因进行近等基因系 (NILs) 杂交， 获得 RHS 恢复系基因 (rf 基因 ) 的精细作图。该芸苔基因芯片的设计是 一种通过 实现的用户定制设计。该基因芯片包含来源于代表了欧洲油菜、 芜菁或甘蓝的 152， 362 条芸苔 unigenes 的 2.56 百万条探针。该 unigenes 由来源于位 于 PlantGDB(www.plantgbd.org， 161A 版， 用于欧洲油菜和芜菁， 157a 版， 用于甘蓝 ) 的芸 苔 EST 集群的结合的共有序列组成。通过使用具有 98 ％序列同一性阈值的 cd-hit 程序 (http://bioinformatics.ljcrf.edu/cd-hi/) 组合 3 个集群获得了结合的共有序列。共 有序列各自被分成 150 个碱基长的探针选择区 (PSR)。平均起来， 每个 PSR4 条探针， 并沿 着整个转录物避开内含子 / 外显子边界对每条转录物设计 16 条探针 ( 仅仅完全匹配的探 针 )。将该约束条件应用于探针设计， 从而确保了探针序列的唯一性、 可比较的杂交效率并 除去了 Affymetrix 推荐的杂交探针。 为了能够评估本底信号， 17.000 条抗基因组探针包括 在芯片上。
     8 对近等基因系用于该实验中。这 8 对由 8 种不同的油菜品系 ( 恢复系 ； Rf 等位 基因 ； 恢复系等位基因 ) 和它们相应的通过 1 次回交基因渗入保持系等位基因 (rf 等位基 因 ) 然后通过 5 次连续自交固定的近等基因系 ( 表 9) 组成。通过 55 种沿 19 条欧洲油菜 染色体适当分布的多态 SSR 标记的基因分型评估品系的基因纯化水平。
     表9： 用于 Rf 精细作图 ( 参见实施例 8) 的 16 种 NILs 的列表和特性
     除 NIL 对 NO ： 1 的品系进行两倍 6 次杂交以便获得足够的统计显著性之外， 在基因 芯片上对每一个体品系杂交两次。总数合计达 36 块芯片用于该实验。如在公开的国际专 利申请 WO2007/005305 中所描述的进行 DNA 制备和标记、 杂交以及和芯片扫描， 以及数据归 一化， 该文献特此以其整体在此并入作为参考。
     为了数据分析， 通过将所有恢复系 (RfRf 系 ) 的杂交结果与所有保持系 (rfrf 系 ) 的杂交结果进行比较执行单向方差分析 (ANOVA)， 使得 36 次个体杂交被分析为 18 次 RfRf 基因型重复和 18 次 rfrf 基因型重复。该策略导致统计能力增加。
     选择用 Bonferonni 检验计算的 α- 值阈值来声明 SFP 为显著的， 意思是在 RfRf 和 rfrf 系之间的杂交信号是统计学差异的。Bonferroni 校正是一种当几次相关或独立的统 计检验同时进行时所使用的多重比较校正 ( 虽然对于每次个体比较给出的 α 值可能是合 适的， 但对于所有比较的集合却并不合适 )。 为了避免伪阳性， 需要将 α 值降低来解决正在 进行的比较的数目。因此， 将 0.05 的理论 α- 值除以基因芯片上 ： 0.05/152362 ＝ 3.310-7。
     该阈值产生代表 30 种芸苔 unigenes 的 55 条显著的 SFP， 称为芸苔候选基因。
     通过在芸苔属和拟南芥属基因组之间使用同线性进一步确认 30 条芸苔候选基 因。对 TAIR 拟南芥蛋白数据库进行的芸苔 unigenes 核苷酸序列的 TBLASTX 分析得以对 23 条芸苔候选基因鉴定了拟南芥同系物。随后， 基于拟南芥同系物的物理位置， 将该 23 条 芸苔候选基因投射到拟南芥基因组上 ( 图 11)， 从而鉴定了染色体 5 上 14 条拟南芥基因的 簇。由于芸苔 unigenes 被预测定位在 Rf 基因座周围， 因此可假定 Rf 基因位于拟南芥中该 1.77 百万碱基对的同线区中。14 条拟南芥基因和 14 条芸苔候选基因之间的对应关系在表 10 中给出。
     表 10 ： 在 14 种定位在染色体 5 上簇中的拟南芥基因和它们的芸苔候选基因同系物之间的对应关系。
     拟南芥基因 ID AT5G17440物理位置 (bp)芸苔 unigene ID ( 植物 GBD 来源 )拟南芥基因注释5751705PUT-161a-Brassica_ napus-59218含 LUC7N_ 末端结构域蛋白AT5G183506076548PUT-161a-Brassica_ napus-113367 PUT-161a-Brassica_ napus-61265抗病性蛋白 (TIR-NBS-LRR 类 )， 推定的 糖转运蛋白， 推定的AT5G188406214517AT5G189006305255PUT-161a-Brassica_ napus-98270 PUT-161a-Brassica_ napus-64108 PUT-161a-Brassica_ napus-116958 PUT-161a-Brassica_ napus-212137960氧化还原酶， 2OG-Fe(II) 加 氧酶家族蛋白 氧化还原酶， 2OG-Fe(II) 加 氧酶家族蛋白 未知蛋白AT5G189006305255AT5G189206310457AT5G190706376455未知蛋白AT5G194606557383PUT-161a-Brassica_ napus-93955 PUT-161a-Brassica_ napus-20713 PUT-161a-Brassica_ napus-98091 PUT-161a-Brassica_ napus-112386 PUT-161a-Brassica_ rapa-6777ATNUDT20( 拟南芥 Nudix 水解酶同系物 20) ATNUDT20( 拟南芥 Nudix 水解酶同系物 20) CPK7( 钙调蛋白结构域蛋白 激酶 7) 未知蛋白AT5G194606557383AT5G194506557383AT5G194806572515AT5G224607444530酯酶 / 脂肪酶 / 硫酯酶家族蛋 白85101861390 A CN 101861391说物理位置 (bp)明书拟南芥基因注释76/93 页拟南芥基因 ID AT5G22500芸苔 unigene ID ( 植物 GBD 来源 )7472285PUT-161a-Brassica_ napus-59425脂肪酰辅酶 A 还原酶， 推定 的 / 雄性不育性蛋白， 推定 的AT5G226507537143PUT-161a-Brassica_ napus-116246HD2B ( 组蛋白脱乙酰基酶 2B)
     随后， 列于表 10 中的 14 条芸苔候选基因被调查作为靶用于标记开发。由于在 芯片检测到的多态性的确切特性未知， 因此单链构型多态性 (SSCP) 技术被用于基因分型 以及随后的作图。用于该目的的对 Rf 分离的种群与实施例 7 中所描述的相同。对于每种 芸苔候选基因。设计包围用于 SFP 鉴定的探针区的引物。使用添加到 5’ 末端的 M13F 尾 (5’ CACGACGTTGTAAAACGAC 3’ ； SEQ ID NO ： 27) 合成正向引物， 反向引物携带位于 5’ 末端 的 M13R 尾 (5’ CAGGAAACAGCTATGACC 3’ ； SEQ ID NO ： 28)。在包含 5μl 5ng/μl 浓度的基 因组 DNA、 1.5μl10X 反应缓冲液、 1.2μl10mM dNTPs、 0.5μl 50mM MgCl2、 0.3μl10μM 浓
     度的每种引物、 0.12μlInvitrogen Taq platinium(5U/μl) 的 15μl 终体积中进行最初的 PCR 反应。所有 PCR 反应均在 ABI GeneAmp PCR 系统 9700 上进行。最初的 PCR 的热循环 条件由如下组成 ： 在 94℃下初始温育 2 分钟以活化 Taq 聚合酶， 然后 35 个扩增循环 (94℃， 变性 30 秒， 55℃， 退火 30 秒， 和 72℃， 延伸 30 秒 )。最终在 72℃下延伸 5 分钟完成 PCR 反 应。
     将 PCR 产物稀释 100 倍， 然后使用各自处于 10μM 浓度下的 5μl 稀释的产物作为 模板和 0.4μl M13F 标记的尾作为正向引物 ： PET-5’ -CACGACGTTGTAAAACGAC-3’ (SEQ ID NO ： 27) 以及 0.4μl M13R 标记的尾 ： FAM-5’ -CAGGAAACAGCTATGACC-3’ (SEQ ID NO ： 28) 作 为反向引物进行第二次 PCR。除引物浓度和退火温度被设定在 50℃以外， 第二次 PCR 反应 的试验条件与第一次反应相同。
     在 ABI 3130xl 基因分析仪上进行 SSCP 分析。在加载和运行样品前， 将来自 Applied Biosystems 的 0.2μl Genescan 500LIZ 大小标准物和 9μlHi-Di 甲酰胺添加到 2ul 40- 倍稀释的最终 PCR 产物中。 在 95℃下对该混合物变性 5 分钟， 并在冰上冷却 3 分钟 以避免重退火。 根据供应商推荐制备 7.2％浓度的由来自 ABI 的 POP 构象分析聚合物 (CAP) 加载样品并迁移到 36cm 毛细管阵列上， 与此同时应用下列参数 ： 箱温 ： 组成的电泳聚合物。 25℃， Poly_Fill_Vol ： 6500 阶， 电流稳定度 ： 5μA， 预运行电压 15kV， 预运行时间 180 秒， 注 入电压 ： 1.2kV， 注入时间 ： 24 秒， 电压步数 40nk， 电压阶跃间隔 15 秒， 数据延迟时间 1 秒， 运 行电压 15kV 和运行时间 ： 3000 秒。使用来自 ABI 的 GeneMapper 软件 v4.0 分析电泳期间 收集的数据。
     在 所 测 试 的 14 种 芸 苔 候 选 基 因 中， unigene ID ： PUT-161a-Brassica_ napus-59218(SEQ ID NO ： 31) 被定位为最接近于 Rf 基因， 处于 Rf 下方 4.1cM 的距离。图 12 显示了在分离种群中对于该基因座观察到多态性的类型。因此， 对于 Rf 相应的 SSCP 标记容许缩小定位间隔并代表了现有可获得的最接近的标记 ( 表 11)。
     PUT-161a-Brassica_napus-59218 正向引物序列 ：
     5’ -ACAGAGACAGAGGAGGTAGC-3’ (SEQ ID NO ： 29)
     PUT-161a-Brassica napus-59218 反向引物序列 ：
     5’ -ATCATAATCCCTCGTTCTTT-3’ (SEQ ID NO ： 30)
     表 11 ： 使用 Mapmaker(3.0b 版 ) 计算的位于染色体 N19 上的 Rf 和侧翼标记之间 的图距。标记间的遗传距离以厘摩 (cM) 来估计， 并与种群中发现的重组体数目成正比。对 于 rf 和 Rf 等位基因， 该距离基本上相同。
     基因座基 NR3454 Rf 等位基因因座之间的遗传距离 26.5cM 4.1cMPUT-161a-Brassica_napus-59218 ----遗传距离总和
     30.6cM实施例 9 ： 在 RHS 系统分离种群中对雄性不育和雄性能育植物进行标记选择
     如果植物例如由 RHS- 不育系和恢复系杂交产生的 F2 植物是雄性不育或雄性能育 的， 则一种可能的用于上述雄性不育或雄性能育的测定是使用与 Ms( 如实施例 1 和 2 中所 描述的 ) 和 Rf 等位基因 ( 如实施例 3 中所描述的 ) 连锁的标记检测该植物。
     实施例 9.1 ： 预测 Ms 基因型
     NR1116、 NR2525、 SR0002A 和 SR0003B 标记的基因型提供对 Ms- 基因型的预测 ( 表 12 ； 图 5)。
     表 12 ： 对 NR1116 和 NR2525 下划线的等位基因的特性， 以及 Ms 和 ms 等位基因的指 定。 ‘Ms’ 是不育基因的雄性不育等位基因以及 ‘ms’ 是不育基因的雄性能育等位基因。给 出的等位基因大小已在 ABI 3700 测序仪上计分过。针对分子量标准物 ROX 500(Applied Biosystem) 进行表观片段分子量的校正。
     如果仅存在雄性不育等位基因， 则可预测该植物对于雄性不育 (MsMs) 是纯合的。 如果既存在雄性不育等位基因又存在雄性能育等位基因， 则可预测该植物对于雄性不育 (Msms) 是杂合的。 以及如果仅存在能育等位基因， 则可预测该植物对于雄性能育 (msms) 是 纯合的。
     实施例 9.2 ： 预测 Rf 基因型
     NR3454、 NR2219 和 PUT-161a-Brassica napus-59218 标记容许预测 Rf- 基因型 ( 表 12)。对于 SSCP 标记 PUT-161a-Brassica napus-59218， 由于所使用的技术， 其不可能 给出等位基因大小来计分。总是必须参看对参照恢复系 ‘RfRf’ 和保持系 ‘rfrf’ 品系所观 察到的多态性 ( 图 13)。
     表 13 ： 对 NR2219 下划线的等位基因的特性以及 Rf 和 rf 等位基因的指定。 ‘Rf’ 是恢复系等位基因的能育等位基因以及 ‘rf’ 是恢复系等位基因的不育等位基因。给出 的等位基因大小已在 ABI 3700 测序仪上计分过。针对分子量标准物 ROX 500(Applied Biosystem) 进行表观片段分子量的校正。
     如果仅存在保持系 ‘rf’ 等位基因， 则可预测该植物对于雄性不育 (rfrf) 是纯合 的。如果既存在保持系等位基因又存在恢复系等位基因， 则可预测该植物对于雄性不育 (Rfrf) 是杂合的。以及如果仅存在恢复系 ‘Rf’ 等位基因， 则可预测该植物对于雄性能育 (RfRf) 是纯合的。
     实施例 9.3 ； 预测雄性不育和雄性能育表型
     根据预测的 Ms- 基因型和 Rf- 基因型， 我们能预测植物的雄性不育性或雄性能育
     性 ( 表 14)。由于在雄性不育基因 (Ms) 上恢复系等位基因 (rf) 是显性的， 因此在 Rf 处每 次都具有雄性能育等位基因的植物是雄性能育的。如果在 Rf 处的能育等位基因不存在并 且在 Ms 处的雄性不育等位基因存在， 则仅可获得雄性不育。
     表 14 ： 根据雄性不育基因 (Ms) 和恢复系等位基因 (rf) 的基因型确定雄性不育和 雄性能育表型。
     表型 能育 能育 能育 能育 能育 能育 能育 不育 不育
     Rf- 基因型 RfRf RfRf RfRf Rfrf Rfrf Rfrf rfrf rfrf rfrfMs- 基因型 MsMs Msms msms MsMs Msms msms msms Msms MsMs实施例 10 ： RHS 雄性不育植物自交
     为了产生花粉， 在开第一朵花之后， 优选用大约 38℃的白天温度 (16 小时 ) 和大约 20℃的夜间温度 (8 小时 ) 处理 RHS 雄性不育植物 7 天。 该处理在空调房 ( 空调设备制造商 ： www.redeker-kaeltetechnik.de) 中进行， 该空调房装备有 8 盏 400W 飞利浦 SON-TP 400W Agro 温室用灯。在热处理后一周， 将植物送回温室并在至少 18℃白天温度和 14℃夜间温 度的自然条件下培育。在所述热处理后 7-14 天， 植物显示具有扩大的花药的花。那些花药 能释放花粉。花粉用于传粉给同一植物的雄性不育和雄性能育花。使用塑料袋 (Cryovac Crispac Beutel Super Micro Lochung 360x 830mm， 供应商 ： Baumann Saatzuchtbedarf D-74638 Waldenburg) 分离相邻的植物以防止不受控制的传粉。已被传粉的植物显示正常 的荚发育， 并且在干燥作为正常的能育油菜籽植物的植物后可收获种子。
     实施例 11 ： 生产杂合的基础种子雌性系
     将来自实施例 10 的 F4 雄性能育植物和 F4 雄性不育植物的种子播种在隔离的大棚 中。大棚长 20m， 宽 8m。覆盖材料是具有 16x 10 网眼大小的防虫网。该设计是一行雄株， 接着 6 行雌株， 4 行雄株， 6 行雌株以及再一行的雄株。每行播种大约 1.5g 单一植物自交种 子。在开花开始前覆盖大棚。在开花前对雄性能育植物选择雌株。不管在自交过程中多么细心， 通过来自温室中的恢复系花粉的异花传粉还是无法完全排除。雄性能育植物可根据 它们不显示雄性不育个体的芽败育表型来进行选择。由于芽败育， 因此雄性不育植物开始 开花较能育植物为迟。为了使开花同步， 通过在开始开花时人工修剪主芽延迟雄性能育植 物开花。在开花后， 除去在大棚边界的两行传粉者。人工分离两块 6 行雄性不育雌株和 4 行雄株以避免种子混杂。在成熟后， 单独收获雄性不育雌性系和雄性能育保持系植物。在 2005 年， 一个大棚中的基础雌性种子的种子产量为 11.9kg 未清洁的种子。 在同一个大棚中 的保持系植物的种子产量为 8.9kg。
     也可以田地生产方式进行预基础种子生产。因此， 两块油菜籽地的最小距离必须 是 5km。 还要确保在周围 5km 内不存在能与油菜籽异花传粉的能育油菜籽或十字花科植物。 重要的是要检查油菜籽植物经常生长的路边。
     实施例 12 ： 杂种开发
     以露地生产方式生产杂种。雌性系是实施例 4 中所描述的基础种子雌性系。恢复 系是任何一种常规的油菜籽品系。技术是带状生长， 在恢复系植物田地周围具有至少 3m 的 边界。在田地中雄∶雌比率为 1 ∶ 3-1 ∶ 4， 取决于农场主的条播机， 1 个条带在 2.5-4m 之 间。在开花前， 50％的恢复系植物必须截去约 50cm 高度。这可通过任何一种常规的割草机 来进行。如实施例 4 中所描述的， 在开花前雄性不育植物需要进行针对雄性能育植物的选 择。毫无疑问是要确保在不育条带中能育植物的数量不超过总数的 0.2％以确保超过 90％ 的杂种性。隔离距离必须为 200m。必不可少的是要控制开花期间的环境温度。如果温度超 过 20℃， 则必须在开花 3 周内对雄性不育雌株检查雄性能育花。 在开花后， 传粉者必须除去 以保证所收获的 F1 杂种种子的纯度。
     实施例 13 ： 杂种性能
     在不同国家的产量试验中测试杂种。试验进行至少 3 个复本， 具有至少 15m2 土地 面积。收获土地并以 dt/ha 再计算土地产率。使用 NIRS 技术在 FOSS NIR Systems Model 5000-c 上分析种子。那些分析的原则描述于 Williams&Sobering(1992) 中。那些在德国和 波兰试验的结果在表 15 中给出 (RNX ： 本发明的各种杂种种子 ； msl ： 基于 NPZ msl 的杂种种 子； Ogura ： Inra Ogura 杂种种子 )。 与现有可获得的杂交系统相比， 相对种子产量的性能如 果不是更好的话， 至少也是一样好。
     表 15 ： 在 2006 年 ( 德国和波兰 ) 和 2007 年 ( 德国、 波兰和法国 )， RHS 杂种的性 能
     品种位置 编号系统在 dt/ha 中， 绝对 种子产 量相对种 子产量9％水分 含量的种 子中含油 量％9％水分含 量的种子中 蛋白质含量 ％GSL 含量 μmol/ 克 9％ 水分含量的 种子德国 200690101861390 A CN 101861391说系统 在 dt/ha 中， 绝对 种子产 量明书9％水分 含量的种 子中含油 量％ 9％水分含 量的种子中 蛋白质含量 ％ 19.381/93 页品种位置 编号相对种 子产量GSL 含量 μmol/ 克 9％ 水分含量的 种子 11.1TAURU S Elektra RNX 3401 RNX 3402 RNX 3501 RNX 3504 RNX 3505 RNX 3506 波兰 2006 ES SAPHIR Elektra RNX 3401 RNX 3402 RNX 34037msl49.30101.343.07 7msl RHS48.00 51.3098.7 105.442.0 41.819.6 20.211.0 10.97RHS50.80104.441.419.911.47RHS48.6099.940.420.413.07RHS52.60108.140.919.711.97RHS51.10105.040.620.311.37RHS50.50103.840.820.011.14INRA Ogura46.0999.043.118.833.44 4msl RHS46.98 47.89101.0 102.944.4 44.217.9 17.712.7 11.34RHS48.62104.544.617.513.74RHS48.83104.944.317.814.391101861390 A CN 101861391说系统 在 dt/ha 中， 绝对 种子产 量明书9％水分 含量的种 子中含油 量％ 9％水分含 量的种子中 蛋白质含量 ％ 17.982/93 页品种位置 编号相对种 子产量GSL 含量 μmol/ 克 9％ 水分含量的 种子 13.6RNX 3404 RNX 3405 RNX 3407 RNX 3501 RNX 3502 RNX 3504 RNX 3505 RNX 3506 RNX 35074RHS49.43106.244.34RHS45.8998.641.819.012.04RHS44.9796.643.418.616.64RHS48.15103.542.618.312.34RHS47.99103.143.918.814.94RHS49.32106.043.018.012.24RHS49.74106.943.218.611.04RHS48.28103.743.218.19.84RHS48.49104.242.318.412.1德国 2007 Taurus Elektra RNX 3401 RNX 3404 9 9 9 msl msl RHS 44.95 41.76 49.84 103.7 96.3 115.0 43.9 42.7 42.1 18.9 19.4 19.8 14.6 21.0 14.39RHS49.09113.242.119.416.592101861390 A CN 101861391说系统 在 dt/ha 中， 绝对 种子产 量明书9％水分 含量的种 子中含油 量％ 9％水分含 量的种子中 蛋白质含量 ％ 18.783/93 页品种位置 编号相对种 子产量GSL 含量 μmol/ 克 9％ 水分含量的 种子 13.7RNX 3504 RNX 3621 RNX 3622 RNX 3623 RNX 3624 波兰 2007 Elektra NELSO N RNX 3401 RNX 3402 RNX 3403 RNX 3404 RNX 35049RHS49.54114.342.29RHS50.53116.541.718.913.29RHS49.92115.142.119.714.89RHS50.14115.642.719.414.79RHS48.63112.242.918.815.59 9msl INRA Ogura RHS38.68 43.2994.4 105.641.0 39.920.4 20.218.5 22.6942.81104.540.620.715.59RHS45.18110.241.919.414.99RHS46.65113.842.019.314.29RHS44.04107.541.219.916.29RHS45.68111.440.619.515.893101861390 A CN 101861391说系统 在 dt/ha 中， 绝对 种子产 量明书9％水分 含量的种 子中含油 量％ 9％水分含 量的种子中 蛋白质含量 ％ 20.484/93 页品种位置 编号相对种 子产量GSL 含量 μmol/ 克 9％ 水分含量的 种子 14.7RNX 3505 RNX 3507 RNX 3621 RNX 3622 RNX 3623 RNX 3624 RNX 3625 RNX 3726 法国 2007 EXAGO NE MENTI ON RNX 3404 RNX 34039RHS43.38105.840.39RHS44.04107.539.020.416.79RHS44.66109.040.919.513.89RHS45.02109.941.220.314.99RHS44.99109.841.620.015.29RHS44.58108.842.319.015.09RHS44.50108.641.120.014.09RHS45.17110.240.619.414.611INRA Ogura msl36.83102.643.718.619.51134.9497.443.217.014.411RHS35.7199.544.317.415.311RHS35.94100.144.816.814.294101861390 A CN 101861391说系统 在 dt/ha 中， 绝对 种子产 量明书9％水分 含量的种 子中含油 量％ 9％水分含 量的种子中 蛋白质含量 ％ 17.485/93 页品种位置 编号相对种 子产量GSL 含量 μmol/ 克 9％ 水分含量的 种子 13.1RNX 3621
     11RHS35.8399.943.6参考文献
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资源描述

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本发明涉及一种欧洲油菜(Brassicanapus)核条件性雄性不育系统。本发明的实施方案提供了预基础(雄性不育)雌性系(MsMsrfrf)、(雄性能育)保持系(msmsrfrf)、(雄性不育)基础雌性系(Msmsrfrf)和杂交系。进一步提供了用于生产那些品系的方法。本发明的进一步的实施方案涉及与不育性、能育性和保持系等位基因相关的标记，以及那些标记在提供杂交系统中的应用。。

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