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本发明提供一种重组载体、利用该载体制备的重组杆状病毒以及该病毒在疟疾疫苗制备中的应用。该重组载体由一段重组序列插入到pFastBacDual载体中构建而成，所述重组序列为根据CMV、Ph、SP、TM序列，在SP和TM间加入EcoR I酶切位点和Xho I酶切位点，CMV-F前加入KpnI酶切位点，TM-R后加入HindIII酶切位点形成。该重组杆状病毒由约氏疟原虫Pys25抗原基因插入到该重组载体并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，然后转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到。该重组杆状病毒通过简单地分离纯化，制备抗体具有良好的效价，能够为P25疟疾疫苗的研究提供参考。

权利要求书
1.  一种重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM，其特征在于：由一段重组序列插入到pFastBacDual载体中构建而成，所述重组序列为根据CMV、Ph、SP、TM已知序列，在SP和TM核苷酸序列间加入EcoR I酶切位点和Xho I酶切位点，CMV-F前加入KpnI酶切位点，TM-R后加入HindIII酶切位点形成，所述重组序列全长为923bp，如SEQ ID NO：1所示。

2.  根据权利要求1所述的重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM，其特征在于：所述重组序列具体插入到pFastBacDual载体的KpnI酶切位点和HindIII酶切位点之间。

3.  利用权利要求1所述的重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM构建的重组杆状病毒BmPys25，其特征在于：由约氏疟原虫Pys25抗原基因插入到重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到表面展示有约氏疟原虫Pys25抗原的重组杆状病毒。

4.  根据权利要求3所述的重组杆状病毒BmPys25，其特征在于：所述约氏疟原虫Pys25抗原基因具体插入到重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM的EcoR I酶切位点和Xho I酶切位点之间。

5.  根据权利要求3所述的重组杆状病毒BmPys25，其特征在于：所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。

6.  权利要求3-5任一权利要求所述的重组杆状病毒BmPys25的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）通过PCR扩增的方法得到约氏疟原虫Pys25抗原基因，然后将约氏疟原虫Pys25抗原基因连接到重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM的EcoRI酶切位点和XhoI酶切位点之间，得到重组转座质粒pFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys25-TM；
（2）将重组转座质粒pFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys25-TM转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，进行同源重组，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板上进行蓝白斑筛选，避光培养40-48h后挑取白斑，白斑继续培养24-48h后抽提重组杆状病毒基因组DNA进行PCR鉴定；
（3）取步骤（2）鉴定正确的重组杆状病毒基因组DNA通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，鉴定正确的即为表面展示约氏疟原虫Pys25抗原的重组杆状病毒BmPys25。

7.  权利要求3-5任一权利要求所述的重组杆状病毒BmPys25所表达的融合蛋白 SP-Pys25-TM，其特征在于：由约氏疟原虫Pys25蛋白的N端接gp64分泌性信号肽（SP）、C端接gp64跨膜结构域（TM）构成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

8.  权利要求3-5任一权利要求所述的重组杆状病毒BmPys25在疟疾疫苗制备中的应用。

9.  权利要求7所述的融合蛋白SP-Pys25-TM在疟疾疫苗制备中的应用。

说明书一种重组载体、利用该载体制备的重组杆状病毒以及该病毒在疟疾疫苗制备中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种经改造的杆状病毒载体即重组载体，利用该载体制备的含目的基因（约氏疟原虫表面蛋白Pys25基因）的重组杆状病毒，该重组杆状病毒的制备方法，该重组杆状病毒表达的融合蛋白，以及该重组杆状病毒和该融合蛋白在疟疾疫苗制备中的应用。 
背景技术
由媒介蚊虫传播的疟疾是一种严重威胁人类生命健康的感染性疾病。据2011年WHO《2011年世界疟疾报告》指出，2010年，在全球106个疟疾流行国家及地区共发现约2.16亿病历，其中86%的疟疾病历是5岁以下儿童。据估计，在2010年，全球共有超过65万例疟疾死亡病历。疟疾疫苗的研制和开发是控制疟疾传播的重要策略之一，且随着越来越多的疟原虫耐药株被发现，疟疾疫苗的研制显得尤为重要。 
约氏疟原虫表面蛋白Pys25是其有性生殖阶段动合子时期的表面蛋白，其结构高度保守，并和其他疟原虫的P25蛋白有较高的同源性，常被用作实验室建立模型为其他疟疾的研究提供参考。 
目前世界上常用大肠杆菌和酵母表达蛋白制备疫苗，而用大肠杆菌表达的蛋白大多数无免疫原性和保护性，酵母表达制备的疫苗效果也不是很理想。哺乳细胞表达系统（CHO）等表达系统虽然效果好，但因表达量低，同时需大量培养基和牛血清蛋白，成本高，不适合生产需要。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种重组杆状病毒载体，利用该载体构建表面展示约氏疟原虫Pys25抗原的重组杆状病毒，通过简单地分离纯化病毒粒子，制备抗体具有良好的抗体效价，能够为P25疟疾疫苗的研究提供参考。 
本发明所采用的技术方案为： 
一种重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM，该重组载体由一段重组序列插入到pFastBacDual载体中构建而成，所述重组序列为根据CMV、Ph、SP、TM已知序列，在SP和TM核苷酸序列间加入EcoR I酶切位点和Xho I酶切位点，CMV-F前加入KpnI酶切位点，TM-R后加入HindIII酶切位点形成，所述重组序列全长为923bp，如SEQ ID  NO：1所示。 
具体地，所述重组序列插入到pFastBacDual载体的KpnI酶切位点和HindIII酶切位点之间。 
本发明进一步提供利用上述重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM构建的重组杆状病毒BmPys25，该重组杆状病毒由约氏疟原虫Pys25抗原基因插入到重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到表面展示有约氏疟原虫Pys25抗原的重组杆状病毒。 
具体地，所述约氏疟原虫Pys25抗原基因插入到重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM的EcoR I酶切位点和Xho I酶切位点之间。 
具体地，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。 
穿梭载体Bacmid（即Baculovirusplasmid）为带有杆状病毒基因组的质粒，可在细菌和昆虫细胞之间穿梭，是Bac-to-bac杆状病毒表达系统的成员之一，该系统还包括供体质粒和辅助质粒及大肠杆菌，为现有技术。 
载体pFastBacDual是Bac-to-bac表达系统的供体质粒，可以插入外源基因并在辅助质粒编码的转座酶作用下，将外源基因插入到Bacmid中。载体pFastBacDual已经商品化；CMV启动子为哺乳动物启动子，将其插入杆状病毒后，杆状病毒可以在哺乳动物里表达外源基因。 
上述重组杆状病毒BmPys25的制备方法，包括以下步骤： 
（1）通过PCR扩增的方法得到约氏疟原虫Pys25抗原基因，然后将约氏疟原虫Pys25抗原基因连接到重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM的EcoR I酶切位点和Xho I酶切位点之间，得到重组转座质粒pFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys25-TM； 
（2）将重组转座质粒pFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys25-TM转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，进行同源重组，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板上进行蓝白斑筛选，避光培养40-48h后挑取白斑，白斑继续培养24-48h后抽提重组杆状病毒基因组DNA进行PCR鉴定； 
（3）取步骤（2）鉴定正确的重组杆状病毒基因组DNA通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，鉴定正确的即为表面展示约氏疟原虫Pys25抗原的重组杆状病毒BmPys25。 
上述重组杆状病毒BmPys25所表达的融合蛋白SP-Pys25-TM，由约氏疟原虫Pys25蛋白的N端接gp64分泌性信号肽（SP）、C端接gp64跨膜结构域（TM）构成，其氨基 酸序列如SEQ ID NO：10所示。 
本发明进一步提供上述重组杆状病毒BmPys25在疟疾疫苗制备中的应用。 
本发明还进一步提供上述重组杆状病毒BmPys25表达的融合蛋白SP-Pys25-TM在疟疾疫苗制备中的应用。 
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果： 
（1）本发明通过分析约氏疟原虫Pys25基因，发现其编码217个氨基酸，其两端为疏水区，中间段为亲水区，且其N-端含有20个氨基酸残基的信号肽，Pys25蛋白第177至192氨基酸残基为EGF-like结构域（CdCkdGFklsveeekC）如SEQ ID NO：9所示，表明其具有表皮生长因子等相关功能，同时BLAST分析表明，其与其他疟疾的P25蛋白有很高的同源性，因此可以作为一种模型用于其他疟疾的研究。 
（2）本发明将约氏疟原虫Pys25蛋白基因与家蚕杆状病毒囊膜蛋白gp64基因融合，家蚕杆状病毒囊膜蛋白gp64含有两个高度疏水区：N-末端的分泌性信号肽（SP）和C-末端的跨膜结构域(TM)，与跨膜结构域相连的是亲水性结构域，可以把病毒囊膜与宿主细胞膜内的糖蛋白连接在一起，从而使本发明实现了目的Pys25蛋白在病毒衣壳上的表面展示。 
（3）本发明构建的表面展示约氏疟原虫Pys25蛋白的重组杆状病毒，可以利用家蚕BmN细胞作为生物反应器，通过家蚕杆状病毒表达系统高效表达约氏疟原虫Pys25蛋白，其可以制备疫苗，为其他疟疾的研究提供参考。家蚕生物反应器作为一种真核表达系统，适用于大规模生产，成本低，产量高，所生产的疫苗应用价值大。 
（4）目前Pys25疫苗尚无利用杆状病毒表面展示技术生产，家蚕杆状病毒表达系统是真核表达，具有翻译后修饰功能，能使表达的蛋白其结构更接近于其天然构象，通过简单地分离纯化病毒粒子，免疫Balb/c小鼠，获得的抗体具有良好的抗体效价。 
附图说明
图1所示的是载体pFastBacDual的结构示意图。 
图2所示的是重组转座质粒pFstBacDual-CMV-Ph-SP-Pys25-TM的构建图，其中CMV：哺乳动物启动子；Ph：多角体启动子；SP：gp64基因的信号肽序列；Pys25蛋白：约氏疟原虫动合子时期表面蛋白；TM：gp64基因的跨膜区序列；Kpn I、EcoR I、Xho I、Hind III：酶切位点。 
图3所示的是重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM电泳鉴定图，其中M：DNA分子量标准；1：CMV-Ph-SP-TM基因PCR扩增产物，箭头位置为目的序列，923bp；2：重组载体双酶切产物。 
图4所示的是重组转座质粒pFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys25-TM的PCR鉴定电泳图，其中M：DNA分子量标准，1：Pys25目的基因PCR扩增产物，2：Pys25目的基因双酶切产物。 
图5所示的是重组杆状病毒基因组BmPys25的PCR产物电泳鉴定结果，其中，M：DNA分子量标准，1：Pys25-F和Pys25-R为引物扩增的片段，2：Pys25-F和M13-R为引物扩增的片段，3：Pys25-R和M13-F为引物扩增的片段，4：M13-F和M13-R为引物扩增的片段。 
图6所示的是重组杆状病毒BmPys25的Pys25蛋白WesternBlot检测结果（Pys25蛋白鼠抗检测），M：蛋白分子量标准，1：细胞表达Pys25蛋白，2：阴性对照。 
图7所示的是间接ELISA测定抗体的效价结果，其中上面的线为含Pys25抗体的血清，下面的线为阴性对照，阴性对照为注射等量PBS取的血清。 
序列表信息： 
SEQ ID NO：1：CMV-Ph-SP-TM序列； 
SEQ ID NO：2：上游引物CMV-F； 
SEQ ID NO：3：下游引物TM-R； 
SEQ ID NO：4：Pys25基因； 
SEQ ID NO：5：上游引物Pys25-F； 
SEQ ID NO：6：下游引物Pys25-R； 
SEQ ID NO：7：上游引物M13-F； 
SEQ ID NO：8：下游引物M13-R； 
SEQ ID NO：9：EGF-like结构域； 
SEQ ID NO：10：融合蛋白SP-Pys25-TM。 
具体实施方式
以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明所使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。 
本发明通过PCR扩增获得约氏疟原虫Pys25蛋白的编码基因序列，得到Pys25基因，同时扩增CMV-Ph-SP-TM基因，将CMV-Ph-SP-TM基因和pFastBacDual载体通过KpnI和HindIII双酶切后连在一起，构建成重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM，将此重组载体和Pys25基因通过EcoR I、Xho I双酶切，连接在一起，获得重组转座质粒（命名为pFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys25-TM），重组转座质粒转化含杆状病毒穿梭载体 Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA（重组质粒命名为Bacmid-Pys25），将其通过脂质体转染家蚕BmN细胞，在细胞内装配形成表面展示约氏疟原虫Pys25蛋白的重组杆状病毒（命名为BmPys25），并复制扩增，用第三代BmPys25接种家蚕BmN细胞，经3～5天后收集病毒液，离心、分离纯化，制成疟疾疫苗，其产生的抗体具有良好的抗体效价，对其他P25蛋白的研究具有良好的参考价值。 
以下结合实施例详细阐述本发明的具体内容。 
1、本实施例涉及的合成序列CMV-Ph-SP-TM，Pys25基因及各引物，由北京华大基因有限公司合成。 
2、材料： 
载体pFastBacDual、含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞、家蚕BmN细胞购自Invitrogen公司，LB培养平板、培养液购自上海生工生物公司，Balb/c小鼠购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心（动物许可证号：SCXK（京）2012-0001，合格证号：11400700020779）。 
3、主要试剂： 
Taq DNA聚合酶、各类内切酶购自Fermentas公司，脂质体转染试剂Cellfectin ⅡReagent购自Invitrogen公司，其它使用到的试剂均属于普通市售生物实验试剂。 
实施例1：重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM的构建 
根据CMV、Ph、SP、TM已知序列，在SP和TM核苷酸序列间加入EcoRI酶切位点（GAATTC）和Xho I酶切位点（CTCGAG），CMV-F前加入KpnI酶切位点，TM-R后加入HindIII酶切位点，合成CMV-Ph-SP-TM序列（如SEQ ID NO：1所示），并设计引物CMV-F（如SEQ ID NO：2所示）、TM-R（如SEQ ID NO：3所示）。引物如下： 
CMV-F5'-CCCGGTACCTAGTTATTAATAG-3' 
TM-R5'-CCCAAGCTTTTAATATTGTCTAC-3' 
其中下划线处为其酶切位点。 
以合成的CMV-Ph-SP-TM序列为模板，以CMV-F、TM-R为上下游引物PCR扩增目的片段，PCR的反应体系为50μL，具体成分为：10×PCRBuffer5μL，2.5mmol/mL的dNTPs5μL，0.01nmol/μL的CMV-F和TM-R各1μL，模板2μL，TaqDNA聚合酶2μL，ddH2O34μL。各组分混匀后，放入PCR仪中，PCR反应参数：95℃预变性5min，95℃变性1min，57℃退火30s,72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。待反应结束后，电泳鉴定扩增产物片断，目的片断大小为923bp，同时切胶回收目的片断。 
将回收的PCR目的片段与pFastBacDual载体（如图1所示）同时用KpnI和HindIII双酶切，并连接、转化、涂板并挑斑鉴定，就构建成了重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM。重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM的PCR和双酶切鉴定电泳图如图3所示。 
这样，当我们在SP和TM之间插入外源基因后，外源基因N-端有SP信号肽序列，C-端有TM跨膜区，表达的蛋白为具有信号肽和跨膜区的融合蛋白，这样就可以将融合蛋白展示在细胞表面，当其在家蚕细胞中表达时，家蚕多角体蛋白启动子Ph起作用，启动表达，当将其导入哺乳动物中后，哺乳动物启动子CMV起作用，表达融合蛋白，这样我们后期构建的病毒既能在家蚕细胞中表达，又能在哺乳动物中表达，具有双重作用。 
实施例2：重组转座质粒pFstBacDual-CMV-Ph-SP-Pys25-TM的构建 
以Pys25目的基因（如SEQ ID NO：4所示）为模板，以Pys25-F（如SEQ ID NO：5所示）、Pys25-R（如SEQ ID NO：6所示）为上下游引物PCR扩增目的基因Pys25。 
Pys25-F5'-CGGAATTCATGAACACATACTAC-3' 
Pys25-R5'-GGAATTCATGTTGAGCTTCTTTGGC-3' 
其中下划线处为其酶切位点。 
PCR的反应体系为50μL，具体成分为：10×PCRBuffer5μL，2.5mmol/mL的dNTPs5μL，0.01nmol/μL的Pys25-F和Pys25-R各1μL，模板2μL，TaqDNA聚合酶2μL，ddH2O34μL。各组分混匀后，放入PCR仪中，PCR反应参数：95℃预变性5min，95℃变性1min，53℃退火30s,72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min。待反应结束后，电泳鉴定扩增产物片断，目的片断大小为651bp，同时切胶回收目的片断。 
将回收的PCR目的片段与实施例1构建的重组载体同时用EcoR I和Xho I双酶切，并连接、转化、涂板并挑斑鉴定，就构建成了重组质粒pFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys25-TM。重组转座质粒pFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys25-TM的构建示意图如图2所示。构建完成的重组转座质粒通过酶切分析和双向测序鉴定基因序列正确后，重组转座质粒构建成功。图4为重组转座质粒pFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys25-TM的PCR和双酶切鉴定电泳图。 
实施例3：家蚕重组杆状病毒BmPys25的获得 
将鉴定重组成功的重组转座质粒pFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys25-TM转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板（按照说明书进行操作）上培养，通过转座进行 同源重组后进行蓝白斑筛选，避光培养48h后挑取白斑，白斑继续在含四环素、卡那霉素、庆大霉素、X-gal和IPTG的LB培养液中摇菌培养48h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组DNA，用M13通用引物（M13-F如SEQ ID NO：7所示，M13-R如SEQ ID NO：8所示）、Pys25-F和Pys25-R通过PCR扩增鉴定重组Bacmid中目的基因插入情况，插入成功的质粒命名为Bacmid-Pys25（即重组杆状病毒基因组）。 
其中，M13通用引物序列： 
M13-F：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'。 
M13-R5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'。 
鉴定成功的质粒Bacmid-Pys25通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，转染使用Invitrogen公司脂质体转染试剂Cellfectin Ⅱ Reagent，转染方法参照该转染试剂说明书，转染具体步骤： 
前一天晚上将16μL的质粒Bacmid-Pys25和8μL转染试剂加到76μL的无血清培养基中，室温孵育20min，使脂质体充分包裹质粒Bacmid-Pys25，然后将其加入到1mL生长良好的家蚕BmN细胞中，置入培养箱培养过夜，第二天早上将无血清培养基吸走，换成有血清培养基培养5～7天，待细胞发病。 
细胞发病后（显微镜观察）获得一代病毒悬液4℃保存，提取病毒基因组用M13-F、M13-R、Pys25-F、Pys25-R鉴定，鉴定结果见图5，结果表明病毒构建成功，获得表面展示约氏疟原虫Pys25蛋白的重组杆状病毒，命名为BmPys25。 
实施例4：Pys25蛋白在家蚕BmN细胞的表达 
将重组杆状病毒BmPys25以3×10-6pfu/cell的剂量感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增，感染3～5天后，收集病毒液，经分离纯化，取10μL上清液加入等体积的2×蛋白质上样缓冲液(100MmTris-HCl，4%SDS，0.15%溴酚蓝，10%甘油)，100℃加热10min，取加热后的混合液10μL进行SDS-PAGE和Westernblotting分析，结果表明，该家蚕重组杆状病毒成功表达Pys25融合蛋白SP-Pys25-TM（如SEQ ID NO：10所示），见图6，其中泳道1为真核表达的融合蛋白；泳道2是空白对照结果，空白对照为正常家蚕细胞。 
实施例5：从家蚕BmN细胞中分离纯化BmPys25病毒及抗体的制备与效价检测 
（1）将第3代BmPys25病毒大量接种BmN细胞，待细胞发病几乎均漂浮后，收集病毒液； 
（2）将步骤（1）获得的病毒液加入50mL离心管中，8000rpm离心30min，取上清，重复三次以除去细胞残渣； 
（3）将步骤（2）获得的离心上清液倒入50mL离心管，15000rpm离心60min，取 上清，重复三次； 
（4）将步骤（3）获得的离心上清液，放入日立CP70MX离心机以转速50000rpm离心40min，所得黑团用超滤液（即磷酸缓冲液PBS）重悬，获得纯化的重组杆状病毒。 
（5）步骤（4）获得纯化的重组杆状病毒稀释到1mg/mL，第一次与等体积弗氏完全佐剂等体积乳化，免疫Balb/c小鼠，腹腔注射，每只50μL，以后每隔一周免疫一次，将病毒粒子与等体积弗氏不完全佐剂等体积乳化，免疫Balb/c小鼠，腹腔注射，每只50μL，共3次，免疫完成后，通过眼球取血，获得含抗体的血清。 
（6）步骤（5）获得的血清通过间接ELISA检测抗体效价，结果表明抗体效价能达到1:12800，见图7。 
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。 
序列表： 
SEQ ID NO：1： 
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTATCATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCCGGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGGCGCGATGGTAGGCGCTATTGTTTTATACGTGCTTTTGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGCGGAATTCCTCGAGATGGCTGAAGGCGAATTGGCCGCCAAATTGACTTCGTTCATGTTTGGTCATGTAGCCACTTTTGTAATTGTATTTATTGTAATTTTATTTTTGTACTGTATGGTTAGAAACCGTAATAGTAGACAATATTAA 
SEQ ID NO：2： 
CCCGGTACCTAGTTATTAATAG 
SEQ ID NO：3： 
CCCAAGCTTTTAATATTGTCTAC 
SEQ ID NO：4： 
ATGAACACATACTACAGCGTGTTCCTGTTCATTTACGCGTTCCTGGGCATTAACTACTACAACGCGGCGATTACACCGGCGACACAATGCAAGAACGGCTTCCTGGCGCAAATGAGCAACCACCTGGAATGCCGCTGCAACAACAACTTCGTGCACGTGAGCAACGACACATGCGAAACAAAGGTGGAATGCAGCAAGGCGACAGTGAACAAGCCGTG CGGCGAGTTCAGCAAGTGCACCATGCACGAAGACGAAGGCGTGGAAACATACACATGCGACTGCCTGGACACATACATTAAGAAGAACGACGTGTGCGTGCCGGAAACCTGCCAAAACATTGACTGCGGCAACGGCAAGTGCATTATTAACGAAGACGCGGTGAACGACCCGCCGACATGCAGCTGCAACATTGGCTACGTGGTGAACGTGGACGACGGCAGCAAATGCACCAAAGAAGGCGACACACTGTGCAGCCTGGTGTGCAACAAGGAAGAACAAATTTGCAAGAAGGTGGACAGCTACTACCGCTGCGACTGCAAGGACGGCTTCAAGCTGAGCGTGGAAGAAGAAAAGTGCATTAGCCACAGCATTTACAGCATGTTCAACCTGAGCATTATTTTCGCGATTCTGCTGCTGTTCAGCAACATCATC 
SEQ ID NO：5： 
CGGAATTCATGAACACATACTAC 
SEQ ID NO：6： 
GGAATTCATGTTGAGCTTCTTTGGC 
SEQ ID NO：7： 
GTTTTCCCAGTCACGAC 
SEQ ID NO：8： 
CAGGAAACAGCTATGAC 
SEQ ID NO：9： 
CdCkdGFklsveeekC 
SEQ ID NO：10： 
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