生物组织原位三维测量细胞化学成份含量技术 本发明属于生物组织的测定或检验方法技术领域，具体涉及一种测量生物细胞化学成份含量的技术方法。
目前，生物组织原位观察完整细胞形态或测量其化学成份的含量技术，均采用连续的组织薄切片和三维重构技术来实现，这种方法获得完整细胞形态与其化学成份含量的速度慢，难以获得大量具有统计学意义的结果，而且，所需仪器价格昂贵，不易普及。
本发明针对现有技术存在的上述不足，目的在于提供一种能对大批量细胞的化学成份含量进行迅速准确地检测，并获得完整细胞信息的生物组织原位三维测量细胞化学成份含量的测量和分析技术。
本发明的理论基础：
1.细胞化学成份含量的多少应以其单个完整细胞的测量为基础。因此，具有下列关系：
单个完整细胞
总量＝完整细胞化学成份浓度×完整细胞体积①
某化学成份
2.吸光度(又称光密度)是物质吸收光的程度的度量，亦可籍此了解吸光物质的浓度。进行显微图象二维吸光度测量可表述成下式：
A＝Log[Io(x，y)/I(x，y)]＝K(x，y)C(x，y)L(x，y)；②
A：吸光度 I0：出射光强度 I：入射光强度
K：吸光系数 C：被测物质浓度 L：被测物质厚度
(x，y)：显微图像中测量像素点的空间位置
②式可变换成下式：
C(x，y)＝A/K(x，y)L(x，y) ③
从③式不难看出，只要组织切片上细胞内吸光物质的吸光系数和切片厚度不改变，其切面内各测量像素点的吸光度的平均(平均光密度)即可作为该单位切片厚度内的吸光物质地浓度。只要所测细胞切面的抽样满足随机抽样的要求，其平均光密度的分布即是该单位切片厚度内的吸光特浓度的概率分布。
3.体视学的发展为在组织原位测量单个完整细胞体积及其群体的体积大小分布状态奠定了基础。采用体视框抽样和核距测量技术可以获得各向同性切片、垂直切片或任意切片上数目加权的单个细胞体积及其体积大小分布。只要遵循体视学的抽样要求，其单个细胞数目加权的体积大小分布即是该细胞群体体积大小的概率分布。
4.测量单个完整细胞化学成份含量的目的是了解不同群体间的含量和含量分布状态的差异。根据独立概率事件的定义可知，①式中的浓度与体积是两个独立的概率事件，因此，①式中单个完整细胞群体的某化学成份含量的均值即可用组织中该类细胞某化学成份浓度的概率分布与该类细胞体积的概率分布的乘积求得。
5.比较两组物质的量的多少，通常采用两种数学方式表达：
a.两组物质的量的绝对值相减即：C＝A物质的量-B物质的量
b.两组物质的量的绝对值相除即：C＝A物质的量/B物质的量
当C＝0或C＝1时，A物质的量＝B物质的量
当C＞0或C＞1时，A物质的量＞B物质的量
当C＜0或C＞1时，A物质的量＜B物质的量
采用相减的方式比较两组物质的量的多少，可以因不同的测试时间、不同的测试仪器、不同的测试条件以及不同的人员操作而得出不同的测试结果，不易得出一致的结论。而采用相除的方式(即指数方式)比较两组物质相对量的多少，足以克服上述缺陷，并且易于满足③式的要求，与许多生物组织的检测和研究的需要一致。
本发明所需要的设备
1.光学显微镜
2.带通光学滤片(根据所测化学成份的吸光特性确定波长范围)或分光
装置
3.显微图像分析仪(必须满足以下性能指标)：
A.鸡红细胞核涂片，Feulgen染色，其二维面积测量值的CV小于10％；
B.同一目标在图像帧存体内三十个不同位置测得的积分光密度的CV小
于3％；
C.图像帧存体内相同积分光密度目标群体(如鸡红细胞核，激光流式细
胞仪测得其DNA含量的CV可小于3％)的单个个体的积分光密度CV小于8％；
D.相同积分光密度目标群体(如鸡红细胞核)的单个个体与两个、三个、
四个集群群体的积分光密度值呈线性；
E.具有对目标进行核距测量的算法软件。
本发明的测量方法如下：
一、测量三维目标细胞群体的某化学成份含量及其含量分布频率
1.取材：切取两张不同厚度的各向同性切片或垂直切片或任意切片(视目标的分布特性而定)。一张3-4μm的薄切片(尽量使切片内的厚薄均一)作化学成份特异染色或不染色(需有该化学成份特异光谱的分光装置)，另一张较厚的切片(能刚好包容完整目标如细胞核的厚度为宜，通常10μm左右)作能清晰反映目标轮廓的染色。
2.测量目标细胞体积及其体积大小分布：
(1)抽样：采用较厚(通常10μm左右)的各向同性切片或垂直切片或任意切片(视目标的分布特性而定)；使用大数值孔径的显微镜物镜，调节显微镜微调，组织切片内的细胞发生小→大→小或恒定(轮廓较大)→小变化的单个细胞或细胞核最大轮廓图像为抽样和测量对象，每抽样一个细胞或细胞核后，改变摄象机与显微镜视场平面在平行方向上相互间的角度(抽样前中先随机确定)，如图像仪具有核距测量法要求的自动旋转核距测量尺有度功能，可省约此操作。可将所抽样的单个细胞最大轮廓贮存在磁盘内，集中测量；
(2)测量：采用体视学核距测量法的计算公式，用鼠标人为移动图象仪上“+”字形光标的纵横交点于单个细胞最大轮廓灰图象的核心(即中心或重心)处，再移动“+”字光标的四个短端线与细胞最大轮廓的边缘重合，以确定经过核心的四个核距，图象仪自动计算该细胞的体积；或图象仪自动确定单个细胞最大轮廓二值图象的核心(即中心或重心)和经过核心的四个核距，并自动计算该细胞或细胞核的体积。如未采用改变摄象机成像平面与显微镜视场平面在平行方向上相互间角度抽样细胞最大轮廓图象，则每测量一个细胞后，图象仪需按事先人为或随机确定的角度自动旋转距尺的方向，测量另一个细胞最大轮廓图象。本测量方法在细胞最大轮廓图象上主要使用“十”字型90度互相垂直的四个核距尺测量目标细胞体积，也包括采用180度相反方向的两个核距尺和120度间隔的三个核距尺以及60度间隔的六具核距尺和更多方向的核距尺。
按上述方法抽样和测量的细胞的体积及其大小分布即为该类细胞群体体积的概率分布。上述方法也适用于对非生物组织切片内粒子体积的测量。
3.测量目标细胞切片平均光密度及其大小分布：
(1)测量系统设置：使用较小数值孔径的显微镜物镜(通常20×物镜)，按满足测量光密度性能指标的显微图象分析的操作要求调整该系统的设置；根据所测细胞化学成份的光谱特性选用适当波长的滤光片或特定波长的照明光；
(2)抽样：采用较薄(通常3-4μm)的各向同性切片或垂直切片或任意切片(视目标的分布特性而定)，作细胞化学成份特异染色或不染色(用特定波长的光作照明光)，均匀随机抽取显微镜视场摄象；
(3)按显微图象分析仪的操作要求，比较准确测量目标细胞或细胞核轮廓内的平均光密度及其群体内的大小分布。该分布即为目标细胞或细胞核内某化学成份的浓度的概率分布。
4.分析计算目标细胞或细胞核体积积分光密度及其大小分布：
将上述分别获得的该类细胞或细胞核体积和平均光密度的概率分布，按每一个体在概率分布中的权重相乘后积分，获得目标细胞或细胞核体积积分的光密度均值及其大小频率分布。该体积积分的光密度均值及其大小频率分布即是该细胞群体的某化学成份的含量均值及其不同含量个体差异的分布(含有被测细胞化学成份吸光系数的信息和切片厚度单位的信息)。只要获得了2和3的原始测量数量；不论谁先完成测量，拥有上述计算方法程序的显微图象分析仪或计算机的专用分析软件均能迅速地完成这一分析计算。
为了更精细准确地对拥有多种体积或平均光密度的细胞群体的总的体积积分光密度均值及其分布进行分析计算，在完成上述分析计算之前，采用下述方法较准确地确定各细胞亚群的体积与其平均光密度的对应关系，进而分析计算出决群体的测量均值及其分布：①使用核距测量法(包括其它方法)测量细胞体积的同时，测量单个细胞最大轮廓图象的面积和直径；②测量二维切片图象上单个细胞平均光密度的同时，测量它们的面积，面积积分光密度，光密度离差，长短轴比，形状因子，分维数，纹理等参数；③分别将上述的各个参数作直方图分析，了解整个群体的各参数分布状态；④取①中的体积分别与面积或直径作二维散点图；取②中的平均光密度分别与②中的其余各参数作二维散点图；⑤参照各参数直方图分布状态的分析结果，分别确定各细胞亚群的体积和平均光密度与其它各参数在二维散点图内的对应分布区域，分别将两散点图对应分布区域内的测量数据的概率分布进行概率相乘，获得各亚群的体积积分光密度均值及其分布，由各亚群的体积积分光密度计算值合成整个群体的体积积分光密度均值及其分布；也可由体积直方图计算的各亚群概率分布与平均光密度和面积的二维散点图内对应分布区域的概率分布进行概率相乘，获得不同体积亚群的体积积分光密度均值及其分布。
二、三维目标细胞群体间某化学成份含量的比较
从③式可知，采用本技术在组织切片上获得三维目标细胞群体的某化学成份含量，与另一三维目标细胞群体的相同化学成份含量进行比较，必须满足下述条件：
1.用于测量的细胞化学成份平均光密度的薄组织切片的吸光系数应一致，这可通过恒定测量条件和一致的样品制备方法来实现。
2.用于测量的细胞化学成份平均光密度的薄组织切片的厚度相同，这可通过将欲比较的两类细胞群体的组织作同一包括埋块切片(通常同一切片内的厚度是比较均一的)；或准确测量两类细胞群体各自所在切片的厚度(切片间的厚度难以准确一致)，分析计算细胞或细胞核体积积分光密度及其大小分布时，将切片厚度值输入计算机作归一化处理，获得具有可比性的测量结果。
在获得了满足上述条件的两组或两组以上的三维目标细胞群体化学成份含量值以后，以其中参照细胞群体组的某化学成份的体积积分光密度均值或中值或峰值(其CV值应尽可能小)作分母，以目标细胞群体的体积积分光密度的概率分布为分子，相除获得三维目标细胞群体与参照细胞群体某化学成份含量差异的密度指数分布。该分布值是三维目标细胞群体与参照细胞群体某化学成份真实含量值差异的比率，分子分母相除消除了某化学成份的吸光系数和切片厚度对测理值的贡献，若能采用其它方法确定参照细胞群体某化学成份真实含量的绝对值，即可确定目标细胞群体某化学成份真实含量绝对值的分布状态。
本发明方法通过应用于符合本发明上述设备条件的细胞图象分析仪中，用于测量罩丸组织切片上生精细胞DNA含量，获得初级精母细胞的DNA含量是精原组织DNA含量的两倍，是精子细胞DNA含量的四倍，精原细胞的DNA含量是精子细胞DNA含量的两倍，这种比率关系与用其它研究方法得出的结果一致。
本技术也适用于非生物组织切片内某类粒子的化学成份含量的测定。
采用本测量分析技术，可大批量地测量生物细胞，获得大量的统计量，并可获得完整的细胞信息，提高了测量的准确性和速度。