CRYPTOCOCCUSTHERMOPHILUS生产耐热超氧化物歧化酶（SOD）的方法.pdf

利用Cryptococcus thermophilus生产超氧化物歧化酶(SOD)，属于生物工程技术领域。本发明采用Cryptococcus thermophilus在液态发酵条件下生产SOD，为胞外酶。耐热SOD产量最高可达2000U/ml，本发明具有良好的工业应用前景。

权利要求书
1.  本发明利用Cryptococcus thermophilus通过液态发酵生产耐热的超氧化 物歧化酶(SOD)。

2.  根据权利要求1所述的Cryptococcus thermophilus，其特征在于可利用的 产SOD的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、乳清。

3.  根据权利要求1所述的Cryptococcus thermophilus，其特征在于可利用的 产SOD的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米浆、豆 饼粉。

说明书Cryptococcus thermophilus生产耐热超氧化物歧化酶(SOD)的方法
技术领域
利用Cryptococcus thermophilus生产超氧化物歧化酶(SOD)，属于生物工 程技术领域。本发明涉及利用菌株Cryptococcus thermophilus保藏号为DSM 19443，通过液态发酵获得耐高温SOD。
背景技术
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)具有良好的防御氧毒性 的作用，能够增强机体抗辐射损伤的能力。近年来，它已经成为治疗炎症、肿 瘤和自身免疫疾病的新型抗炎药物；化妆品和食品行业中用于防晒、防皮肤衰 老和抗炎的添加剂以及用于某些疾病探针的生化试剂。SOD广泛存在于动物、 植物、所有好氧微生物及少数厌氧微生物体内。当前，SOD主要从动物血液(如 猪血或者牛血)中提取(袁烨.超氧化物歧化酶的制备方法[P].申请号, 02147888.0,2002-12-19；徐文中,阎家麒.超氧化物歧化酶大规模生产新工艺[P]. 申请号,01144922.5,2001-12-24)，产量受到很大限制，且容易受到原料来源、安 全性及质量不稳定等因素的影响。由于动物、植物特别是动物血液来源困难， 而微生物可以人工培养，有利于实现工业化生产。根据目前报道，已经可以通 过微生物发酵法生产SOD，但主要为胞内酶(刁治民,姚银霞，张文静.酵母菌 SOD发酵条件的研究[J].青海师范大学学报(自然科学版)，2002,4:48-51；杨 明琰,郭爱莲,沈俭,等.高产SOD酵母菌的诱变选育及发酵条件研究[J].食品 科学,2005,26(10):147-150)，提取工艺较为繁琐。
天然SOD热稳定性较差，在加工和使用过程中容易受热失活。如何有效地 解决SOD在高温工艺条件下酶活力的稳定问题，如何使含SOD的产品在生产 工艺流程中不用顾忌高温是高效利用SOD的关键。利用生物工程生产新一代高 稳定性、高耐热性的SOD是当前SOD开发最重要的途径。
本发明采用Cryptococcus thermophilus生产SOD，Cryptococcus thermophilus 是一种耐热菌,可以产生耐高温的SOD,采用该菌发酵生产SOD具有发酵周期 短，发酵液中SOD活力较高，且能耐高温，开发前景广阔。
发明内容
目前能够产生SOD的菌株比较少，主要为一些酵母，且为胞内酶，需要破 壁后才能提取分离，操作成本高，不利于大规模生产制备。本发明的目的是针 对当前问题，利用菌株Cryptococcus thermophilus保藏号为DSM 19443，通过液 态发酵获得胞外耐热SOD。
本发明的技术方案如下：液态发酵培养基组成是碳源0.5-100g/l，氮源 0.5-100g/l，K2HPO41-4g/l,MgSO47H200.1-0.5g/l，NaCl 1-2g/l。在一定体积的 发酵罐内装入发酵体积60-70％(v/v)的培养基，灭菌冷却后接入Cryptococcus  thermophilus，接种量为1-10％，起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度为 20-45℃，发酵周期为2-6天。最终发酵液中SOD活力最高可达2000U/ml。
本发明所有种子培养基配方与发酵培养基相同。将斜面菌种接种到装有种 子培养基的三角瓶后，种子的培养时间为48小时，种子的培养温度为45℃。
菌种保存用斜面培养基配方为：葡萄糖20g/l，MgSO47H200.2g/l，酵母膏 g/l，琼脂20g/l，pH自然。
SOD活的测定方法是基于SOD抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用。 SOD活力测定方法和SOD活力定义详见：Chin-Wen Lin,Jeng-Huh Yang and  Lieh-Chi Su，The extraction and properties of superoxide dismutase from porcine  blood Chin-Wen Lin,Jeng-Huh Yang and Lieh-Chi Su，Meat Science，1997， 46(3):303-312.
本发明有如下特征：
(1)Cryptococcus thermophilus用于SOD发酵的碳源可以是葡萄糖、果糖、麦 芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖。氮源可以是(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、 NaNO3、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、玉米浆、黄豆饼粉。
(2)Cryptococcus thermophilus发酵SOD采用的发酵罐体积为5-50L。搅拌转 速为70-150r/min，通风量1:0.1-1:0.5v/v/m。结合本领域的基本常识可根 据生产情况调整发酵罐大小。
本发明的有益效果：首次采用Cryptococcus thermophilus进行了SOD的发 酵，不仅酶活高，而且生产的SOD具有良好的耐热效果，该方法适合工业化大 规模生产耐热SOD，不仅解决当前SOD不耐热的缺点，而且提供了大量的SOD 来源。
具体实施方式
实施例1
将斜面菌种接种到装有50ml培养基的250ml三角瓶中，培养基组成为：葡 萄糖20g/l，牛肉膏10g/l，蛋白胨10g/l，NH4NO310g/l，玉米浆粉12g/l，pH自 然。45℃,发酵72小时。发酵结束后，将50ml发酵液10000转/min离心，去除 菌体。上清粗酶液用于测定酶的pH及温度参数。取上清粗酶液0.5ml，分别置 于pH 4，5，6，7，8的柠檬酸－磷酸缓冲液3.5ml中，在55℃下测定SOD活 力分别为1600，1700，2000，1700，1500U/ml。因此该SOD的最适反应pH是 6。分别取上清粗酶液0.5ml,与3.5ml pH 6的柠檬酸－磷酸盐缓冲液混合，在 25，35，45，55，65℃下分别测得酶活为1500，1600，2000，2000，1500U/ml， 因此该酶的最适温度为45-55℃。分别取上清粗酶液0.5ml，与3.5ml pH 6的柠 檬酸－磷酸盐缓冲液混合，在25，35，45，55，65，75℃下保温48小时，然后 测定酶活分别为2000，2000，2000，2000，1800，1700U/ml，结果表明该酶具 有良好的耐热性。不同pH的柠檬酸-磷酸盐缓冲液的配制方法参见：诸葛健， 工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社，1994。
实施例2
将斜面菌种接种到装有50ml的种子培养基的250ml三角瓶中，种子培养基 组成为：葡萄糖20g/l，牛肉膏10g/l，蛋白胨10g/l，NH4NO310g/l，玉米浆粉12g/l， pH自然，121灭菌20min，摇床转速150转/分钟，45℃下培养48小时。该过程 有10个相同的三角瓶，共得到500ml种子液。
将500ml种子液接种入50L发酵罐，发酵培养基组成为：葡萄糖20g/l，牛 肉膏10g/l，蛋白胨3g/l，NH4NO310g/l，玉米浆粉6g/l，pH自然，发酵温度为 45℃，装液量70％，通风量为1:1.5v/v/m。发酵时间为3天。在该条件下，发 酵液中最终SOD活力为1500U/ml。
实施例3
将培养好的1L种子液接种到10L发酵罐中。种子及发酵培养基组成均为： 果糖30g/l，牛肉膏10g/l，玉米浆粉20g/l，K2HPO44g/l,MgSO47H20.5g/l，pH 自然。发酵温度为20℃，装液量70％，通风量为1:0.3v/v/m，发酵时间为5天， 在该条件下，发酵液中最终SOD活力为2000U/ml。
实施例4
将培养好的2L种子液接种到20L发酵罐中。种子及发酵培养基组成为： 乳糖20g/l，NH4NO310g/l，蛋白胨10g/l，pH自然。接种量为10％，培养温度为 45℃，装液量60％，通风量为1:0.5v/v/m，搅拌转速为150r/min，发酵时间为 6天，在该条件下，发酵液中最终SOD活力为1500U/ml。
实施例5
将培养好的300ml种子液接种到5L发酵罐中。种子及发酵培养基组成均 为：蔗糖20g/l，NH4NO310g/l，蛋白胨10g/l，pH自然。发酵温度为40℃，装 液量65％，通风量为1:0.1v/v/m，搅拌转速为70r/min，发酵周期为3天。在该 条件下，发酵液中最终SOD活力为1350U/ml。
实施例6
将培养好的3.5L种子液接种到50L发酵罐中。种子及发酵培养基组成均 为：麦芽糖15g/l，酵母膏5g/l，蛋白胨10g/l，黄豆饼粉5g/l，pH自然，发酵 温度为28℃，装液量70％，通风量为1:0.4v/v/m，搅拌转速为150r/min，发酵 周期为5天。在该条件下，发酵液中最终SOD活力为1400U/ml。
实施例7
将培养好的600ml种子液接种到10L发酵罐中。种子及发酵培养基组成均 为：半乳糖15g/l，酵母膏5g/l，蛋白胨5g/l，尿素5g/l，pH自然。发酵温度为30℃， 装液量60％，通风量为1:0.3v/v/m，搅拌转速为120r/min，发酵时间为4天。 在该条件下，发酵液中最终SOD活力为1650U/ml。
实施例8
将培养好的250ml种子液接种到5L发酵罐中。种子及发酵培养基组成均 为：木糖10g/l，酵母膏5g/l，NaCl 1g/l，K2HPO41g/l,MgSO47H200.1g/l，pH 自然。发酵温度为45℃，装液量50％，通风量为1:1.2v/v/m，发酵时间为2天。 在该条件下，发酵液中最终SOD活力为800U/ml。