制备用于青贮青饲料的组合制剂的方法 本发明涉及含有产乳酸菌、用于青贮青饲料的组合制剂的制备方法。
在青贮饲料法中，已知可应用含有产乳酸菌(LAB)和脂族脂肪酸碱金属盐的制剂作为青贮剂(ensiling agents)以酸化青饲料和防止发生需氧降解过程。DE-A-39 16 563描述了一种组合制剂，它含有甲酸的碱金属和/或碱土金属盐、LAB和如果需要的话还含有常用载体和/或助剂。该制剂可以可分散混合物形式应用，它是在加入待转化为青贮饲料的物料之前通过将呈冻干(冷冻干燥的)形式的LAB与其它组分混合而直接制备的。也可将该细菌和该甲酸盐分别加入待转化为青贮饲料的物料中。分别加入的缺点在于，青贮法中必须进行两步操作。
DE-A-40 34 749公开了作为青贮剂的一种组合制剂，它含有处于脂族脂肪酸碱金属盐水溶液中的LAB。该制剂呈悬浮液形式，但它在制备后必须尽可能快地应用，因为LAB在短时间内就会死去。因此若贮存较长时间，建议分别将脂族脂肪酸碱金属盐的水溶液和冻干的细菌培养物传送给用户，使得可在应用前不久混合这些组分。然而，该方法的缺点也在于，细菌在混合操作后很快就会死去，因而如果青贮法延迟的话例如当机器损坏、下雨或出现其它情况时，则青贮剂不再能用。此处另一个问题在于，由于这两种组分组合后细菌会死去，所以在定量配用、尤其是在田野中定量配用时，很难弄清尚存活的细菌量。
本发明的一个目的是提供用于青贮青饲料的组合制剂，该组合制剂保证LAB有更大的稳定性。
我们发现：通过先将LAB与载体混合，再使该混合物与脂族脂肪酸盐混合，即可实现该目地且LAB的稳定性得以大为提高。意外地发现，与已知的将LAB溶于丙酸钠或丙酸钙溶液形成对比，该情况下几乎没有LAB死去而且，甚至延长贮存时，活细菌比率仍非常高。
因此，本发明涉及组合制剂的制备方法，该组合制剂含有LAB、脂族脂肪酸的碱金属和/或碱土金属盐和如果需要的话还含有常用助剂，其中LAB与载体混合而得一种配制物，该配制物再与至少一种脂肪酸碱金属和/或碱土金属盐和如果需要的话还与常用助剂混合。本发明的优选实施方案限定如下。
适于实施该新方法的LAB本身不受任何限制。合适的LAB菌株大体上是在筒仓中的一般条件下能生长且产生足够乳酸的所有菌株，其中足够乳酸是指生成的乳酸量引起pH降低使其它微生物不能生长。合适的LAB是如下属的LAB：乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)或片球菌属(Pediococcus)。用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)属细菌可获得特别好的结果。该细菌优选以冻干形式应用。
适合于本发明的载体是所有能吸附LAB的载体。碳酸钙或有机载体如麸皮优选是麦麸，或者砂糖是特别合适的。所用有机载体的形式应对于优选为冻干形式的LAB无活性。在本发明优选的实施方案中，与LAB混合之前的载体被粒化处理。大体说来，不再产生粉尘的粒状粉末由粉末粒化而制备。合适的粒化方法是本领域技术人员已知的。应用的LAB量各情况下基于1kg载体为108～1017个、特别是108～1013个、优选是1010～1012个微生物。细菌可与载体以任意要求的方式混合，但应保证细菌不被损伤。如果应用粒状载体，则有必要在混合期间保持粒子使载体不致于变成粉尘。
在该组合制剂的新制备方法中，将LAB与载体的配制物与一种或多种脂族脂肪酸碱金属或碱土金属盐混合。以配制物加盐为100wt％计，配制物的用量为1～99wt％，优选为20～80wt％，特别是40～60wt％。特别适合于本发明的盐是C1-C6一元羧酸的、优选C1-C3一元羧酸的碱金属和/或碱土金属盐。二元羧酸、三元羧酸、特别是柠檬酸和山梨酸的碱金属和/或碱土金属盐也是合适的。特别优选的盐是甲酸钙和丙酸钙。在本发明特别优选的实施方案中，盐在与LAB配制物混合前被粒化。
在本发明进一步优选的实施方案中，在按本发明的制备期间，以LAB配制物加盐为100重量份计，往组合制剂中加入0.1～10、优选为2～5重量份的常用助剂。合适的助剂例如有：氯化钠、其它天然盐、未熟谷物粉、干甜菜废粕、废糖蜜、糖、淀粉水解产物、木材水解产物或碳水化合物分解酶。
于是本发明的组合制剂含有基于载体的LAB成分的配制物、脂族脂肪酸的碱金属或碱土金属盐或者碱金属和碱土金属盐和如果需要的话还含有常用助剂。
可用本发明的组合制剂青贮的青饲料本身不受任何特别限制。例如草、豆科、完整植物，谷类作物和玉米是特别合适的。加入青饲料的组合制剂量，各种情况下基于每1吨青饲料干物质为0.1～10kg，特别是0.5～3kg。
在本发明优选的实施方案中，由生产者将组合制剂的组分相互混合再将成品组合制剂运送给用户。混合作用本身不受任何限制但此处在将LAB与载体混合时，也有必要保证细菌不受损坏，而且如果应用粒化载体，需保持粒子。也可分别将两种组分即LAB配制物和盐运送给用户，再由用户将这两种组分相互混合。组合制剂被撒施到待转化为青贮饲料的物料由撒施机来完成，正如工业上用于撒施这种制剂的已知机械，例如固形物撒施机。该组合制剂可在切碎期间和/或在青饲料的贮存期间或之后加入。
本发明的优点在于实现了至少为6个月的LAB优良稳定性。由于有更高的稳定性，所以有可能准确地定量配用，这与其中细菌会很快死去的已知方法形成对比。于是本发明使之有可能应用组合制剂以酸化青饲料和防止青饲料的需氧降解过程，该组合制剂与已知方法相比其优势在于，无需分别施用脂族脂肪酸盐和LAB或施用低稳定性的LAB水悬浮液。
如下实施例构成本发明进一步优选的实施方案并阐述本发明。实施例1
每种情况下将1g植物乳杆菌属的冻干乳酸菌(5×1011cfu/g)(LAB)与1000g粒化碳酸钙混合而得LAB配制物。再将粒化和非粒化丙酸钙按表1与LAB配制物或冻干的LAB(无载体)以20wt％LAB配制物或冻干的LAB(无载体)对80wt％丙酸钙的比率混合，并立即和在16周之后测定乳酸菌的稳定性。为此，将1g于1升浓度为0.7％的氯化钠溶液中的样品与50mM pH7.5的磷酸钾缓冲剂在4℃下振荡4小时。然后取100μl样品并铺于乳杆菌琼脂板(MRS琼脂，按DEMAN，ROGOSA和SHARPE，得自Merck，Darmstadt)上，板上预先加有基于琼脂计为2％的固体碳酸钙。2天后，计数生长的菌落数。以粒化碳酸钙作载体的纯LAB配制物用作对照物。所得结果示于表1中，以重量百分数表示。
表1如下时间之后的菌落形成单位 (105/mg LAB) 0周 16周100％LAB*，粒化载体 2.7 1.220％LAB*，粒化载体+80％粒化丙酸钙 2.7 1.320％LAB+80％未粒化丙酸钙 2.7 ＜0.120％LAB+80％粒化丙酸钙 2.7 ＜0.120％LAB*，粒化载体+80％未粒化丙酸钙 2.7 0.4
*LAB配制物
如表1所示，当LAB与粒化碳酸钙配制再与粒化丙酸钙混合后，贮存16周后生长速率相对于纯LAB配制物未见降低。与纯LAB配制物的稳定性相比，按本发明制备的组合制剂的稳定性甚至略有升高。只有当载体(碳酸钙)和盐(丙酸钙)二者都粒化后才出现这种效果。实施例2
将1g冻干的植物乳杆菌属的乳酸菌(5×1011cfu/g)与1000g粒化碳酸钙混合而得LAB配制物。使该配制物与粒化甲酸钙以20wt％LAB配制物对80wt％甲酸钙的比率混合，接着与实施例1类似，立即和在16周之后测定乳酸菌的稳定性。结果列于表2，以粒化碳酸钙为载体的纯LAB配制物用作对照物。
表2 如下时间之后的菌落形成单位 (105/mg LAB粒子)： 0周 16周100％LAB* 2.7 1.220％LAB*+80％甲酸钙 2.7 1.3
*LAB配制物
表2示出，当LAB与作载体的碳酸钙混合再将此混合物与甲酸钙混合后，甚至贮存16周后细菌生长速率相对于纯LAB配制物未见降低。类似于表1，此时新方法中LAB的稳定性与纯LAB配制物相比甚至也略有升高。实施例3
应用类似于实施例1的方法，将乳酸菌与粒化碳酸钙混合而得LAB配制物，再将它与粒化丙酸钙以20wt％LAB配制物对80wt％丙酸钙的比率混合。加入青饲料的该组合制剂量基于青饲料的100wt％为0.2wt％。该青饲料含有约82％苜蓿和3％果树园牧草还有麦草、白三叶草、红三叶草和蒲公英。使其枯萎得几乎20％干物质(DM)并且用切碎机切碎。青饲料的成分示于表3。此处的干物质含量(DM含量)基于青饲料的100wt％。由于该青饲料具有较高的粗纤维含量和低含糖量，所以该饲料很难青贮。表3：起始原料的成分DM含量 wt％ 19.6粗灰分 g/kg DM 112粗蛋白 g/kg DM 178粗纤维 g/kg DM 338糖 g/kg DM 44糖/粗蛋白 0.25发酵性糖 在DM中的％ 0.9
添加和未加本组合制剂的青贮试验中青贮6个月后的结果示于表4，其中的数据基于用发酵酸、氨和乙醇校正后的干物质含量且依据标准的DLG(Deutsche Landwirtschaftliche Gesellschaft)方法。表4：添加和未加本组合制剂的青贮饲料青贮6个月后的含量和发酵参数变量未加加有组合制剂校正的DM ％粗灰分g/kg DM粗蛋白粗纤维糖pH乳酸 g/kg DM乙酸丁酸丙酸乙醇v.A./tot.A. ％NH3-N/tot.N ％发酵气损失 ％DLG点18.311620238976.1225552910843811.7-4520.413118334085.85402228495195.9-14
NH3-N/tot.N：作为总氮的一部分的氨氮
v.A./tot.A.：作为总酸一部分的挥发性酸
从表4可见，应用新组合制剂与不加相比大为降低乳酸、丁酸和乙醇含量且氨氮比例更低，因而大大改善青贮饲料法。