DNA内切酶片段多态性在中药材鉴别中的应用 本发明涉及用现代分子生物学技术鉴定和鉴别中药材。传统的鉴定中药材的方法，主要是通过对产品形态的观察，凭经验作出判断。这对于鉴别形态相似的药材，或鉴定已经加工成片状或粉末状的产品难以适用。近年来，也有用化学成分分析法鉴定中药材的(Lang等，1993)。但该方法受材料年龄、生长状况和加工手段诸因素影响，检测结果难以一致可靠。
中药材有效的鉴别和鉴定，可以保障消费者的正当权益，减低不公平的商业竞争，防止误用赝品所引起的中毒或其他医疗事故。因此，寻找有效的中药材鉴别鉴定方法对中医药事业和药材工业的健康发展至关紧要。
植物核糖体脱氧核糖核酸(rDNA)以顺反子18S-ITS1-5.8S-ITS2-26S的形式存在。植物大多拥有该顺反子的重复序列，以头尾相连的方式聚集在染色体上。目前研究显示，18S、5.8S和26S等rDNA基因的碱基对序列非常保守，不同植物间的差别很小；而位于植物rDNA基因之间的ITS1(转录空隙区1)和ITS2(转录空隙区2)的碱基对序列则差别较大。同时由于基因转化和交换地作用，就同一品种植物而言，其rDNA序列大致雷同(Hillis和Dixon，1991)。动物之rDNA也有类似情形。
不同种的动植物，其rDNA序列有较大差异；而这种差别进而导致内切酶片段多态性(RFLP)。基于此，本发明阐述了一种可靠准确地鉴定，鉴别形态相似中药材的新方法。
本发明利用rDNA的遗传属性，取rDNA保守区段的DNA序列为DNA多聚酶引物，扩增相邻的rDNA非保守区段的DNA，然后选用适当的DNA内切酶将扩增之DNA水解，从而建立具有该品种特征的内切图谱，并根据该图谱进行动植物品种的鉴定与鉴别。本发明所述方法并不局限于产生rDNA之RFLP图谱，应可用于产生其他基因或DNA序列之RFLP。因此，本发明的鉴定方法包括下列步骤：(1)提取样品DNA；(2)取保守区段DNA序列为引物，选择性地扩增与之相邻非保守区段的DNA；(3)选择适当的内切酶水解扩增的DNA以形成RFLP图谱；(4)比较样品与真品之RFLP图谱以确定样品的真伪。
在本发明中ITS1-5.8S-ITS2区段的定义是(1)位处寡核苷酸引物18d和28cc(见图6)之间的DNA序列；或(2)位于18d相类似之引物和28cc相类似之引物之间的DNA序列。本发明的技术方案如下：A、提取动植物DNA：
植物DNA提取方法与Draper和Scott(Draper和Scott，1988)所述大致相同，简述如下：干燥的植物材料经70％乙醇和蒸馏水冲洗表面后，在乳钵中与液氮混合并研磨成粉末。粉末样品与12倍体积的CTAB混匀，在56℃水浴中保温30分钟，加入等量的氯仿--异戊醇(24∶1)，离心，取上清液，加0.1体积的10％CTAB溶液，室温放置10分钟后复用氯仿--异戊醇抽取一次，取上清液加等量的CTAB沉淀液，室温放置1小时后以13000g离心15分钟。DNA沉淀物经乙醇纯化后溶解于TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA)备用。动物DNA之提取方法也大致相同。B、扩增ITS1-5.8S-ITS2 DNA：
ITS1-5.8S-ITS2 DNA系由PCR扩增得到。反应所用的引物为18d和28cc(Hillis和Dixon，1991)。18d采自植物18S保守区段：3’AGCCATCCTCGCTGCCCGCCACAC3’28cc采自植物26S保守区段5’ACTCGCCGTTACTAGGGGAA3’反应溶液包括：1ng植物DNA，1X Taq缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.3，0.001％明胶)，0.2mM dNTPs，1uM引物(18d和28cc)，以及1个单位的Taq DNA多聚。反应条件为：94℃，5分钟预处理，然后35循环：94℃，1分钟，60℃，1分钟，72℃，2分钟；最后72℃，10分钟延伸。动物rDNA扩增之引物另外设定。C、ITS1-5.8S-ITS2 DNA序列的测定
DNA碱基对序列测定以上述PCR扩增之植物DNA为模板，使用下列诸引物(Hillis和Dixon，1991)：18d：CACACCGCCCGTCGCTCCTACCGA5.8C：TTGCGTTCAAAGACTCGATG5.8d：AACCATCGAGTCTTTGAACGCA28CC：ACTCGCCGTTACTAGGGGAAD、RFLP图谱
使用引物18d和28cc扩增之ITS1-5.8S-ITS2植物DNA经琼胶电泳分离纯化后，选用适当的DNA限制性内切酶水解之。水解产物经苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提去蛋白后溶解于20ul的蒸馏水中，然后行5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，用硝酸银染色法显示RFLP图谱。以下以植物rDNA RFLP为例，说明本发明的优点
1、由于不同植物之18S和26S rDNA碱基对序列高度相似，而置于18S和26S rDNA之间的ITS1和ITS2之碱基对序列则差别较大，本发明可被广泛应用于植物的鉴定和鉴别；
2、本发明所述的方法重复性高，不受样品材料，物理状况，保存时间等环境因素的制约；
3、本发明所述的方法灵敏度高，数十毫克(mg)样品即能进行实验；
4、使用不同的内切酶可从同一动植物取得多款具有该样品特征的RFLP图谱，从而增加鉴定，鉴别的可靠性；
5、可测定样品的纯度和查验混杂于真品之中的赝品。
附图及其说明：图1：西洋参ITS1-5.8S-ITS2 DNA序列。图2：人参ITS1-5.8S-ITS2 DNA序列。图3：日本人参ITS1-5.8S-ITS2 DNA序列。图4：三七ITS1-5.8S-ITS2 DNA序列。图5：三叶参ITS1-5.8S-ITS2 DNA序列。图6：用于扩增rDNA ITS1-5.8S-ITS2区段之引物。
18d：3’AGCCATCCTCGCTGCCCGCCACAC 5’
28cc：5’ACTCGCCGTTACTAGGGGAA 3’图7：西洋参，人参及其赝品之Hinf1 RFLP图谱。M：DNA分子量标准，1：西洋参；2：人参；
3：紫茉莉；
4：商陆；
5-9：不同比例混合之人参，西洋参混合物；
5：西洋参和人参，9∶1；
6：西洋参和人参，7∶3；
7：西洋参和人参，1∶1；
8：西洋参和人参，3∶7；
9：西洋参和人参，1∶9。
图8：西洋参，人参及其赝品之Taq1 RFLP图谱，其余说明与图7同。
图9：西洋参，人参及其赝品之Sau3A RFLP图谱，其余说明与图7同。
现以鉴定西洋参和人参的鉴别为实例，具体阐述本发明如下：
西洋参采集自加拿大，人参采集自中国，紫茉莉和商陆取自香港。实验所用的植物(干品)为50mg。西洋参，人参，紫茉莉与商陆DNA之提取，ITS1-5.8S-ITS2 rDNA之扩增，DNA序列之确定以及内切图谱之产生均按前面所述。西洋参、人参混合物系按不同比例混合两者之粉末而成。西洋参，人参，三七，日本人参(P.japonicusC.A.Mey.)，三叶参(P.trifolius L.)之ITS1-5.8S-ITS2 rDNA碱基对序列已先经确定(见图1至图5)。从西洋参，人参的DNA序列可知两者ITS1-5.8S-ITS2区段存在内切Sau3A1，Hinf1及Taq1RFLP。内切水解rDNA PCR产物的条件如下：rDNA所用量为1.5ug/反应，反应体积为50ul。Taq1反应缓冲液含有100mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM硫基乙醇，pH8.4，以及5ug牛血清清蛋白；反应条件是65℃，4小时。Sau3A1反应缓冲液含有100mMNaCl，10mM Tris-HCl，10mMMgCl2，pH7.3，以及5ug牛血清蛋白；反应条件是37℃，4小时。Hinf1反应缓冲液含有50mMNaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，pH7.9；反应条件与Sau3A1反应相同。
该三种内切酶作用于西洋参、人参、紫茉莉及商陆所形成的RFLP，载于图7至图9。如图所示该四种植物各有不同之Taq1，Hinf1和Sau3A1 RFLP图谱，互相之间的差异显著，容易辨认。同时RFLP图谱可显示真品的纯度和是否存在赝品，一如图7，图8及图9所示。