一种提取分离夫西地酸的方法 技术领域：
本发明涉及一种从夫西地酸发酵中分离提取夫西地酸的方法。
背景技术：
夫西地酸(Fusidic Acid，CAS6990-06-3)是一种无色的结晶体，含半个结晶水，不溶于水，溶于苯、甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂，可以从梭链孢酸酯球真菌发酵液中提取分离出来，该物质是夫西地烷类中最具抗菌活性的化合物，广泛用于治疗严重的葡萄球菌感染，例如败血病、心内膜炎、骨髓炎、创伤性感染及皮肤感染等疾病。
夫西地酸主要通过发酵法制备，从发酵液提取分离夫西地酸的方法很多，主要有离子交换法、有机溶剂萃取法等，离子交换法是利用夫西地酸和其它物质在离子交换树脂上交换或吸附能力的不同，利用离子交换树脂柱，实现夫西地酸和其它物质的分离。虽然离子交换技术具有优异的分离选择性和很高的浓缩倍数，操作方便，效果突出，提取成本低廉，但目前的收率和纯度还不能令人满意，需结合其它精制方法才能取得较好的结果。有机溶剂提取法是利用夫西地酸和其它物质在有机溶剂中分配系数的不同，通过在发酵液中加入特定的有机溶剂萃取，从而实现夫西地酸和其它物质的分离，该方法使用的有机溶剂通常为乙醚或各种酯类，工艺也较为简单，但由于大量使用有机溶剂，对溶剂的选择性和再生能力提出了较高要求，而且这种有毒、易爆、易挥发溶剂的使用，对环境造成了严重污染，给操作也带来不便。同时有机溶剂价格昂贵，其易挥发的特性也使得工业运行的成本大幅度提高。
中国专利200680049547.4、200810045003.1和国内专利RU1499922C、GB2224649A分别公开了一些夫西地酸的提取分离的生产方法，因此，夫西地酸的生产方法已经不少，但是，这些方法运用在工业生产中，都存在不少困难。
发明内容：
本发明的目的是提供一种提取分离夫西地酸的方法，该方法具有生产工艺短、能耗低、收率高、污染小、成本低等特点。
本发明是通过如下步骤实现的：
1)、超滤提取分离夫西地酸浓缩液：夫西地酸发酵液经过压滤(板框或抽滤)或离心去除菌体后，超滤去除菌体和大分子杂质、树脂吸附脱除无机盐、真空蒸发浓缩得到夫西地酸浓缩液；
2)、夫西地酸浓缩液制备夫西地酸结晶体：夫西地酸浓缩液经过溶剂萃取、脱色、结晶分离、干燥、粉碎、筛分、检验、成品包装等生产步骤得到合格的夫西地酸。
具体步骤如下：
(1)将夫西地酸发酵液经过板框过滤或抽滤或泵入离心机中分离，将分离后的清液输入贮罐中。
(2)将经过分离菌体后的夫西地酸发酵液清液再经超滤过滤除去残余菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子，并用2～5倍的水洗涤菌渣中残留的夫西地酸，边清洗，边超滤以获得高的产品收率。超滤所用的膜组件为无机膜组件，主要由1根、3根、7根、19根、37根多通道、管式、平板式、蜂窝体等膜元件组成，膜材料为截留分子量5000～200000的陶瓷膜、沸石膜、玻璃膜。
(3)夫西地酸发酵液也可以直接经过超滤过滤除去残余菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子，并用2～5倍的水洗涤菌渣中残留的夫西地酸，边清洗，边超滤以获得高的产品收率。超滤所用的膜组件为无机膜组件，主要由1根、3根、7根、19根、37根多通道、管式、平板式、蜂窝体等膜元件组成，膜材料为截留分子量5000～200000的陶瓷膜、沸石膜、玻璃膜。
(4)将经超滤去杂质所得的夫西地酸发酵液的超滤透析液和残余菌液洗涤水超滤透析液合并，经过D4020和D312型树脂串联的树脂吸附柱，流速控制在1～10BV/hr，用40％乙醇洗脱1～2次，再用15％乙醇洗涤2～3次，收集高含量部分洗脱液。
(5)将夫西地酸洗脱液加入真空旋转蒸发器中，在10～40Kpa、30～60℃条件下减压蒸发去除乙醇，得到夫西地酸含量大于5000μg/ml夫西地酸浓缩液。
(6)向夫西地酸浓缩液中加入20％～40％的萃取剂，如甲酸乙酯、乙酸乙酯，分离去除水相，并向有机相中加入1％～3％的活性炭脱色，再经过真空旋转蒸发器脱除萃取剂，得到含量大于95％的夫西地酸粗品。
(7)将夫西地酸粗品溶解到2～4倍的正己烷中进行两次结晶，再经过离心或抽滤得到精制的夫西地酸。
(8)将精制的夫西地酸控制在小于或等于60℃烘干，经粉碎过筛、经质量检测合格后包装得夫西地酸成品。
与已有的方法比较，本发明所采用的技术具有如下优点：
1、通过超滤和树脂吸附两步分离技术的有机结合，直接从夫西地酸发酵液中分离得到夫西地酸，提高了夫西地酸产品的收率。
2、夫西地酸是一种不稳定的生化产品，而膜分离是一种无相变低温操作的工艺过程，前端工艺采用陶瓷膜等无机膜超滤，可有效保护夫西地酸产品结构不被破坏。
3、采用超滤和树脂吸附两步法分离，再结合真空旋转蒸发，精制的夫西地酸溶液被高度浓缩，使萃取步骤所用的萃取剂用量大幅降低，因而在收率上也将大大超过其它工艺方法。
4、利用超滤和树脂吸附两步法除菌丝、菌体、色素、盐类等，结合后续的重结晶工艺可获得高质量、高纯度的夫西地酸产品。
5、本发明分离提取所得的夫西地酸产品工艺稳定、操作简便，是一种高效低成本的分离提取夫西地酸的技术，特别适合工业化生产。
具体实施方式：
实施例一
1、离心过滤：将经过普通过滤的夫西地酸发酵液泵入离心机中分离，将离心液输入中转贮罐作为下步超滤的原料。(该步收率大于98％)
2、超滤过滤去杂：将100L离心液泵入管式超滤系统超滤过滤，并不断加入纯水稀释冲洗浓缩液，得到除去残余菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子超滤透析液和含有残余菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子的120L超滤浓缩液。超滤所用的膜材料为截留分子量5000的陶瓷膜，工作条件为：常温，进压3.5bar，出压2.0bar。
3、树脂吸附与解析：将120L超滤浓缩液通过大孔吸附树脂进行吸附，饱和地树脂用15％乙醇水溶液洗涤，再用30％乙醇溶液解析，得到42L解析液；所用树脂为D4020和D312型树脂串联的树脂吸附柱，工作条件为：常温，流速控制在2～4BV/hr。
4、真空旋转蒸发浓缩：将42L夫西地酸解析液加入真空旋转蒸发器中，在10～40Kpa、30～60℃条件下减压蒸发去除乙醇，得到夫西地酸含量大于5000μg/ml夫西地酸浓缩液，所得乙醇再进行提纯，循环使用。
5、萃取：向夫西地酸浓缩液中加入12L乙酸乙酯提取分层，在乙酸乙酯相加入2％的活性炭脱色15分钟，过滤，得到脱炭液，向脱炭液中加入15L水，用3％氢氧化钠溶液调节水相pH＝10.0，静置分层后，水相用5％盐酸调节pH＝5.0，并加入6L的乙酸乙酯提取夫西地酸；合并酯相提取液经真空旋转蒸发器浓缩到总体积约为1L，得到含量大于95％的夫西地酸粗品。
6、精制：将夫西地酸粗品加入到1L正己烷中，在35℃条件下搅拌30分钟，经过静置、冷却、结晶、过滤，得到含量大于98.5％的夫西地酸。同样方法进行重结晶，得到含量大于99.8％的夫西地酸。
7、烘干：将精制的夫西地酸结晶体于60℃烘干，经粉碎过筛、质量检测，夫西地酸含量≥99.8％，包装得夫西地酸成品。
实施例二
1、离心过滤：与实施例一相同。
2、超滤过滤去杂：将100L离心液泵入管式超滤系统超滤过滤，并不断加入纯水稀释冲洗浓缩液，得到除去残余菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子超滤透析液和含有残余菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子的120L超滤浓缩液。超滤所用的膜材料为截留分子量10000的陶瓷膜，工作条件为：常温，进压4.5bar，出压3.2bar。
3、树脂吸附与解析：将120L超滤浓缩液通过大孔吸附树脂进行吸附，饱和的树脂用15％乙醇水溶液洗涤，再用35％乙醇溶液解析，得42L解析液；所用树脂为D4020和D312型树脂串联的树脂吸附柱，工作条件为：常温，流速控制在4～7BV/hr。
4、真空旋转蒸发浓缩：将42L夫西地酸解析液加入真空旋转蒸发器中，在20Kpa、30～55℃条件下减压蒸发去除乙醇，得到夫西地酸含量大于5000μg/ml夫西地酸浓缩液，所得乙醇再进行提纯，循环使用。
5、萃取：向夫西地酸浓缩液中加入12L甲酸乙酯提取分层，在甲酸乙酯相加入2％的活性炭脱色15分钟，过滤，得到脱炭液，向脱炭液中加入15L水，用3％氢氧化钠溶液调节水相pH＝10.0，静置分层后，水相用5％盐酸调节pH＝5.0，并加入6L的甲酸乙酯提取夫西地酸；合并酯相提取液经真空旋转蒸发器浓缩到总体积约为1L，得到含量大于95％的夫西地酸粗品。
6、精制：将夫西地酸粗品加入到1L正已烷中，在35℃条件下搅拌30分钟，经过静置、冷却、结晶、过滤，得到含量大于98.5％的夫西地酸。同样方法进行重结晶，得到含量大于99.8％的夫西地酸。
7、烘干：将精制的夫西地酸结晶体于60℃烘干，经粉碎过筛、经质量检测，夫西地酸含量≥99.8％，包装得夫西地酸成品。
实施例三
1、离心过滤：与实施例一相同。
2、超滤过滤去杂：将100L离心液泵入管式超滤系统超滤过滤，并不断加入纯水稀释冲洗浓缩液，得到除去残余菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子超滤透析液和含有残余菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子的120L超滤浓缩液。超滤所用的膜材料为截留分子量20000的陶瓷膜，工作条件为：常温，进压5.5bar，出压3.6bar。
3、树脂吸附与解析：将120L超滤浓缩液通过大孔吸附树脂进行吸附，饱和的树脂用15％乙醇水溶液洗涤，再用35％乙醇溶液解析，得到42L解析液；所用树脂为D4020和D312型树脂串联的树脂吸附柱，工作条件为：常温，流速控制在4～7BV/hr。
4、真空旋转蒸发浓缩：将42L夫西地酸解析液加入真空旋转蒸发器中，在20Kpa、30～55℃条件下减压蒸发去除乙醇，得到夫西地酸含量大于5000μg/ml夫西地酸浓缩液，所得乙醇再进行提纯，循环使用。
5、萃取：向夫西地酸浓缩液中加入12L乙酸乙酯提取分层，在乙酸乙酯相加入2％的活性炭脱色15分钟，过滤，得到脱炭液，向脱炭液中加入15L水，用3％氢氧化钠溶液调节水相pH＝10.0，静置分层后，水相用5％盐酸调节pH＝5.0，并加入6L的乙酸乙酯提取夫西地酸；合并酯相提取液经真空旋转蒸发器浓缩到总体积约为1L，得到含量大于97％的夫西地酸粗品。
6、精制：将夫西地酸粗品加入到1L正己烷中，在35℃条件下搅拌30分钟，经过静置、冷却、结晶、过滤，得到含量大于99.0％的夫西地酸。同样方法进行重结晶，得到含量大于99.9％的夫西地酸。
7、烘干：将精制的夫西地酸结晶体于60℃烘干，经粉碎过筛、经质量检测，夫西地酸含量≥99.9％，包装得夫西地酸成品。
实施例四
1、离心过滤：与实施例一相同。
2、超滤过滤去杂：将100L离心液泵入管式超滤系统超滤过滤，并不断加入纯水稀释冲洗浓缩液，得到除去残余菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子超滤透析液和含有残余菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子的120L超滤浓缩液。超滤所用的膜材料为截留分子量20000的陶瓷膜，工作条件为：常温，进压5.5bar，出压3.6bar。
3、树脂吸附与解析：将120L超滤浓缩液通过大孔吸附树脂进行吸附，饱和的树脂用15％乙醇水溶液洗涤，再用35％乙醇溶液解析，得42L解析液；所用树脂为D4020和D312型树脂串联的树脂吸附柱，工作条件为：常温，流速控制在4～7BV/hr。
4、真空旋转蒸发浓缩：将42L夫西地酸解析液加入真空旋转蒸发器中，在20Kpa、30～55℃条件下减压蒸发去除乙醇，得到夫西地酸含量大于5000μg/ml夫西地酸浓缩液，所得乙醇再进行提纯，循环使用。
5、萃取：向夫西地酸浓缩液中加入12L甲酸乙酯提取分层，在甲酸乙酯相加入2％的活性炭脱色15分钟，过滤，得到脱炭液，向脱炭液中加入15L水，用3％氢氧化钠溶液调节水相pH＝10.0，静置分层后，水相用5％盐酸调节pH＝5.0，并加入6L的甲酸乙酯提取夫西地酸；合并酯相提取液经真空旋转蒸发器浓缩到总体积约为1L，得到含量大于96％的夫西地酸粗品。
6、精制：将夫西地酸粗品加入到1L正已烷中，在35℃条件下搅拌30分钟，经过静置、冷却、结晶、过滤，得到含量大于98.5％的夫西地酸。同样方法进行重结晶，得到含量大于99.8％的夫西地酸。
7、烘干：将精制的夫西地酸结晶体于60℃烘干，经粉碎过筛、经质量检测，夫西地酸含量≥99.8％，包装得夫西地酸成品。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。