猪瘟合成肽疫苗及其应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201010539268.4	申请日：	2010.11.10
公开号：	CN101991848A	公开日：	2011.03.30
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	未缴年费专利权终止IPC(主分类):A61K 39/187申请日:20101110授权公告日:20130327终止日期:20161110\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A61K 39/187申请日:20101110\|\|\|公开
IPC分类号：	A61K39/187; A61K47/48; C07K7/06; A61P31/20	主分类号：	A61K39/187
申请人：	中国农业科学院上海兽医研究所
发明人：	童光志; 李国新; 周艳君; 于海
地址：	200241 上海市闵行区紫月路518号
优先权：
专利代理机构：	上海大邦律师事务所 31252	代理人：	周东萍
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内容摘要

本发明公开了一种猪瘟合成肽疫苗，该合成肽疫苗用分支肽将辅助性T细胞表位和猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位进行连接。本发明猪瘟合成肽疫苗，不仅避免机体产生针对载体的免疫应答，而且提高了合成肽疫苗的免疫原性，其成份单纯，没有毒副作用和生物安全方面的担忧，具有产业化优势。

权利要求书

1：一种猪瘟合成肽疫苗，其特征在于，所述疫苗具有 T-L-B 或 B-L-T 结构，其中， T 为辅助性 T 细胞表位； B 为猪瘟病毒 E2 蛋白 B 细胞表位，该 B 细胞表位的数量大于等于 2 ； L 为连接 T 与 B 的连接肽，该连接肽为分支肽，所述 B 细胞表位连接在该分支肽的分支结构上。
2：根据权利要求 1 所述的猪瘟合成肽疫苗，其特征在于，所述分支肽具有下述通式 (I) ：其中， R1 ～ R6 各选自以下氨基酸中的任意一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸； m 为大于等于零； R7、 R8 选自 H、 COCH2-R5、 COCH2-R6、或下面式 (II) ：式 (II) 中， R9、 R10 选自 H、 COCH2-R5、 COCH2-R6、或下面式 (III) ：
3：根据权利要求 2 所述的猪瘟合成肽疫苗，其特征在于，所述 R1 ～ R4 均为赖氨酸。
4：根据权利要求 2 所述的猪瘟合成肽疫苗，其特征在于，所述 R7、 R8 选自 COCH2-R5、 COCH2-R6，所述 R5、 R6 均为半胱氨酸。
5：根据权利要求 2 至 4 中任一项所述的猪瘟合成肽疫苗，其特征在于，所述分支肽具有下述结构式： 2 其中， K 代表赖氨酸， C 代表半胱氨酸。
6：根据权利要求 1 所述的猪瘟合成肽疫苗，其特征在于，所述辅助性 T 细胞表位包括：通用型辅助性 T 细胞表位、或来源于病原体的辅助性 T 细胞表位。
7：根据权利要求 6 所述的猪瘟合成肽疫苗，其特征在于，所述辅助性 T 细胞表位为通用型辅助性 T 细胞表位，其包含 SEQ ID NO ： 1 所示的氨基酸序列。
8：根据权利要求 1 所述的猪瘟合成肽疫苗，其特征在于，所述猪瘟病毒 E2 蛋白 B 细胞表位包含 SEQ ID NO ： 2 所示的氨基酸序列。
9：一种疫苗组合物，其特征在于，用于免疫动物以对抗猪瘟病毒的感染，所述疫苗组合物包含：权利要求 1 所述的猪瘟合成肽疫苗、以及佐剂。
10：权利要求 1 所述的猪瘟合成肽疫苗在制备预防或治疗猪瘟病的药物中的应用。

说明书

猪瘟合成肽疫苗及其应用
    【技术领域】
     本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种猪瘟合成肽疫苗及其应用。背景技术猪瘟病毒 E2 蛋白可以诱导产生中和抗体，是猪瘟病毒最主要的保护性抗原 (Konig 等， JVirol， 1995， 69 ： 479-86)。关于猪瘟病毒 E2 蛋白抗原表位的鉴定已经取得了一定的进展。其中， E2 蛋白的 829-837 位氨基酸是一个主要的抗原表位，而且是保守的猪瘟特异性的线性表位 (Lin 等， J Virol， 2000， 74 ： 11619-25)。大肠杆菌表达的该表位与 GST 的融合产物诱导了保护性免疫应答 (Liu 等， J Virol Meth， 2006， 134 ： 125-9)，并且串联了 4 个拷贝后，表达的融合蛋白能抵抗猪瘟病毒的攻击 (Liu 等， Vaccine， 2006， 24 ： 7175-7180)。把该表位人工合成的肽链与 BSA 偶联后，免疫猪，仅仅显示了微弱的保护效力 (Dong 等， Vaccine， 2006， 24 ： 1906-1913)。利用合成重叠肽的方法，已经鉴定出了一系列的猪瘟 E2 蛋白的线性中和表位，把上述表位分别与 BSA 偶联后，免疫猪，能诱导产生中和抗体，但并不能对猪提供完全的保护 (Dong 等， Vaccine， 2006， 24 ： 1906-1913 ； Dong 等， Vaccine， 2006， 24 ： 426-434)。上述研究无论是表位与 GST 融合表达还是合成的肽链与 BSA 偶联，都不能对猪进行有效保护，且免疫动物后都不可避免地产生针对载体的免疫应答，这可能会给免疫动物带来一定的风险。而且，短肽链与巨大的载体偶联会更多地诱导机体产生针对载体的免疫应答 (cease 等， Proc Natl Acad Sci USA， 1987， 84(12) ： 4249-53)。
     发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种猪瘟合成肽疫苗，该疫苗不仅避免了载体蛋白诱导不期望的免疫应答，而且提高了肽疫苗的免疫原性，增强了免疫保护作用。
     此外，还需要提供一种猪瘟合成肽疫苗在制备预防或治疗猪瘟病的药物中的应用。
     为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
     在本发明的一个方面，提供了一种猪瘟合成肽疫苗，所述疫苗具有 T-L-B 或 B-L-T 结构，其中，
     T 为辅助性 T 细胞表位；
     B 为猪瘟病毒 E2 蛋白 B 细胞表位，该 B 细胞表位的数量大于等于 2 ；
     L 为连接 T 与 B 的连接肽，该连接肽为分支肽，所述 B 细胞表位连接在该分支肽的分支结构上。
     优选的，所述分支肽具有下述通式 (I) ：
     其中， R1 ～ R6 各选自以下氨基酸中的任意一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸； m 为大于等于零；
     R7、 R8 选自 H、 COCH2-R5、 COCH2-R6、或下面式 (II) ：
     式 (II) 中， R9、 R10 选自 H、 COCH2-R5、 COCH2-R6、或下面式 (III) ：本发明猪瘟合成肽疫苗，用分支肽将辅助性 T 细胞表位和猪瘟病毒 E2 蛋白 B 细胞表位进行连接，该猪瘟病毒 E2 蛋白 B 细胞表位连接在分支肽的分支结构上，其数量大于等于 2。因此，本发明利用分支肽可以提高 B 细胞表位的密度以及模拟表位的空间构象从而提高合成肽的免疫原性。
     更优选的，所述 R1 ～ R4 均为赖氨酸；所述 R7、 R8 选自 COCH2-R5、 COCH2-R6，所述 R5、 R6 均为半胱氨酸。
     特别优选的，所述分支肽具有下述结构式：
     其中， K 代表赖氨酸， C 代表半胱氨酸。
     所述辅助性 T 细胞表位包括：通用型辅助性 T 细胞表位、或来源于病原体的辅助性 T 细胞表位。
     优选的，所述辅助性 T 细胞表位为通用型辅助性 T 细胞表位，其包含下述 SEQ ID NO ： 1 氨基酸序列： ISISEIKGVIVHKIEGILF(SEQ ID NO ： 1)。通用型辅助性 T 细胞表位克服了不同种类动物和不同个体的 MHC 限制，能诱导更有效的免疫应答。
     优选的，所述猪瘟病毒 E2 蛋白 B 细胞表位包含下述 SEQ ID NO ： 2 氨基酸序列：
     CTAVSPTTLRTEVVK(SEQ ID NO ： 2)。
     在本发明的优选实施例中，猪瘟合成肽疫苗具有下述结构：
     在该猪瘟合成肽疫苗中，分支肽的分支结构上连接了 4 个猪瘟病毒 E2 蛋白 B 细胞表位，有效提高了 B 细胞表位的密度，增强了合成肽的免疫原性。
     为了增加上述优选实施例的猪瘟合成肽疫苗结构的稳定性，在肽链的氨基端 ( 即 B 细胞表位的游离末端 ) 可以进行乙酰化修饰，在肽链的羧基端 ( 即通用型辅助性 T 细胞表位的游离末端 ) 可以进行酰胺化修饰。
     本发明的另一方面，提供了一种疫苗组合物，用于免疫动物以对抗猪瘟病毒的感染，所述疫苗组合物包含：上述猪瘟合成肽疫苗、以及佐剂。
     用本领域已知的常规方法人工合成上述猪瘟合成肽疫苗，纯度在 90％以上，将猪瘟合成肽用无菌的 PBS 稀释成浓度为 1 微克每微升的肽溶液，以等量的蛋白质佐剂 ( 如弗氏佐剂等 ) 与肽溶液混合，乳化成疫苗组合物，既可作为免疫原用于免疫动物。
     在本发明的另一方面，还提供了上述猪瘟合成肽疫苗在制备预防或治疗猪瘟病的药物中的应用。
     本发明猪瘟合成肽疫苗，与传统的原核表达或载体偶联方法制得的疫苗相比，不仅避免机体产生针对载体的免疫应答，而且提高了合成肽疫苗的免疫原性。本发明猪瘟合成肽疫苗质量稳定，生产品质易于控制，成份单纯，没有毒副作用和生物安全方面的担忧，具有产业化优势。
     附图说明
     下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。图 1 是本发明实施例 1 以线性肽 E26 为包被抗原做 ELISA 检测免疫兔的抗体滴度图 2 是本发明实施例 1 以分支肽 E28 为包被抗原做 ELISA 检测免疫兔的抗体滴度图 3 是本发明实施例 1 的 IDEXX 试剂盒检测免疫兔血清抗体阻断率柱状图；图 4 是本发明实施例 1 攻毒后试验兔体温曲线图；图 5 是本发明实施例 2 以线性肽 E26 为包被抗原做 ELISA 检测免疫猪的抗体滴度图 6 是本发明实施例 2 以线性肽 E28 为包被抗原做 ELISA 检测免疫猪的抗体滴度图 7 是本发明实施例 2 的 IDEXX 试剂盒检测免疫猪血清抗体阻断率柱状图。图；
     图；
     图；
     图；
     具体实施方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》 (J. 萨姆布鲁克， D.W. 拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译 . 第 3 版，北京：科学出版社， 2002) 中所述的方法进行。
     本发明猪瘟合成肽疫苗，用分支肽将辅助性 T 细胞表位和猪瘟病毒 E2 蛋白 B 细胞表位进行连接，该猪瘟病毒 E2 蛋白 B 细胞表位连接在分支肽的分支结构上，其数量大于等于 2。本发明使用分支肽可以提高 B 细胞表位的密度以及模拟表位的空间构象从而提高合成肽的免疫原性。并且，本发明用辅助性 T 细胞表位替代了现有原核表达或载体偶联方法制得的疫苗中的载体蛋白，避免机体产生针对载体蛋白的免疫应答。优选的，本发明采用通用型辅助性 T 细胞表位，克服了不同种类动物和不同个体的 MHC 限制，能诱导更有效的免疫应答。
     本发明的分支肽具有下述通式 (I) ：
     其中， R1 ～ R6 各选自以下氨基酸中的任意一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸； m 为大于等于零；
     R7、 R8 选自 H、 COCH2-R5、 COCH2-R6、或下面式 (II) ：
     式 (II) 中， R9、 R10 选自 H、 COCH2-R5、 COCH2-R6、或下面式 (III) ：
     优选的， R1 ～ R4 均为赖氨酸； R7、 R8 选自 COCH2-R5、 COCH2-R6， R5、 R6 均为半胱氨酸。特别优选的，分支肽具有下述结构式：
     其中， K 代表赖氨酸， C 代表半胱氨酸。在本发明下述的优选实施例中，猪瘟合成肽疫苗具有如下结构：实施例 1
     用本领域的常规方法人工合成如下所示的分支肽以及线性肽，分别命名为 E28 和 E26。合成肽的纯度都在 90％以上，用无菌的 PBS 把合成肽稀释成浓度为 1 微克每微升的肽溶液，然后以等量的蛋白质佐剂 ( 如弗氏佐剂等 ) 与肽溶液混合，乳化成疫苗，作为免疫原
     用于免疫动物。
     分支肽 -E28线性肽 -E26ISISEIKGVIVHKIEGILFKKCTAVSPTTLRTEVVK
     选择 2 公斤左右的健康家兔 15 只，分为 3 组，每组 5 只，第一组 (1、 2、 3、 4、 5 号兔 ) 免疫线性肽 E26，第二组 (6、 7、 8、 9、 10 号兔 ) 免疫分支肽 E28，第三组 (11、 12、 13、 14、 15 号兔 ) 免疫 PBS 作为阴性对照。肽疫苗免疫剂量为每次 50 微克，总体积 500 微升，皮内多点注射，免疫 2 次，间隔 2 周。第一次用弗氏完全佐剂乳化，第二次用弗氏不完全佐剂乳化。免疫前及免疫后每周采血分离血清，用肽 ELISA 及 IDEXX 猪瘟抗体检测试剂盒检测血清抗体滴度。第二次免疫 2 周后，静脉注射 100 个兔体反应量的猪瘟弱毒，攻毒后，每天测量体温 2 次。如果产生的抗体能够完全中和猪瘟弱毒，则免疫兔体温正常，如果不能中和猪瘟弱毒，兔子会呈现定型热反应，以此来验证疫苗的免疫效力。静脉注射猪瘟弱毒后第 4 天，采集免疫兔子的脾脏，用荧光定量 PCR 方法检测脾脏中的病毒，以此进一步判定猪瘟弱毒在兔体内的繁殖程度。
     结果显示， 2 次免疫后 2 周，用线性肽 E26 做包被抗原做 ELISA 检测的抗体滴度，分支肽 E28 免疫诱导的抗体滴度可达 1 ∶ 38400，低于线性肽 E26 免疫诱导的抗体滴度 1 ∶ 358400( 图 1)。然而，用分支肽 E28 做包被抗原做 ELISA 检测抗体滴度，分支肽 E28 免疫诱导的抗体滴度可达 1 ∶ 140800，远远高于线性肽 E26 免疫诱导的抗体滴度 1 ∶ 1000( 图 2)。用 IDEXX 猪瘟抗体试剂盒检测免疫兔血清抗体，结果显示， 1 次免疫 2 周，分支肽 E28 免疫诱导的抗体，其阻断率可达 57.7％， 2 次免疫后 2 周，抗体阻断率可达 76.3％，远远高于线性肽 E26 的抗体阻断率 26.4％和 39.4％ ( 图 3)。因为 IDEXX 猪瘟抗体试剂盒检测的抗体水平与血清中和试验检测的抗体水平具有相关性，所以以上试验说明分支肽具有很好的
     免疫原性，其诱导产生的抗体也具有中和活性。猪瘟弱毒攻击后，分支肽 E28 免疫兔体温正常，而线性肽 E26 及 PBS 对照组兔体温呈现明显的定型热反应 ( 表 1、图 4)。在攻毒后第四天，兔体温恢复正常后，取脾脏用荧光定量 PCR 检测猪瘟病毒，结果显示，分支肽 E28 免疫组 5 只兔子都呈现阴性，而线性肽 E26 及对照组全部阳性，均检测到病毒 RNA( 表 1)。以上结果说明，分支肽 E28 免疫诱导的抗体完全中和了猪瘟病毒，没有引起免疫兔发生定型热反应。
     表 1 攻毒后兔体温变化及兔脾脏病毒 RNA 载量
     抗体效价的检测结果显示，当用线性肽 E26 做包被抗原检测时，线性肽 E26 免疫诱导的抗体滴度高于分支肽 E28 诱导的抗体滴度，但是当用 E28 做包被抗原做 ELISA 或者是用 IDEXX 试剂盒检测时， E26 诱导的抗体水平远远低于 E28 诱导的。从实验兔的定性热反应以及猪瘟病毒在兔体内的复制情况看，分支肽 E28 诱导的抗体完全抑制了猪瘟病毒在兔体内的繁殖。这说明，线性肽 E26 免疫虽然产生了针对 E26 本身高效价的抗体，但是这种抗体的中和作用较低，并没有完全抑制猪瘟病毒在兔体内的繁殖。因此，从本实验可以看出，单纯针对具有中和活性的线性 B 细胞表位的抗体不一定具有有效的中和作用。为了能够诱导更有效的中和抗体，通过不同的形式对线性 B 细胞表位进行组装或改造是必需的。本发明分支肽 E28 提供了一个成功的案例。
     实施例 2
     如实施例 1 中的方法制备肽疫苗，作为免疫原用于免疫动物。选择 35 日龄左右的猪瘟抗体阴性的健康仔猪 20 头，分为 4 组，每组 5 头，第一组免疫线性肽 E26，第二组免疫本发明制备的分支肽 E28，其余 2 组分别免疫猪瘟弱毒疫苗 (HCLV) 以及 PBS，作为阳性对照与阴性对照。肽疫苗免疫剂量为每次 300 微克，总体积为 1 毫升，肌肉多点注射，免疫 2 次，间隔 2 周。第一次用弗氏完全佐剂乳化，第二次用弗氏不完全佐剂乳化。免疫前及免疫后每周采血分离血清，用肽 ELISA 及 IDEXX 猪瘟抗体检测试剂盒检测血清抗体水平。
     结果显示， 2 次免疫后 2 周，用线性肽 E26 做包被抗原做 ELISA 检测的抗体滴度，分支肽 E28 免疫诱导的抗体滴度可达 1 ∶ 2560，但低于线性肽 E26 免疫诱导的抗体滴度 1 ∶ 40960( 图 5)。然而，用分支肽 E28 做包被抗原做 ELISA 检测抗体滴度，分支肽 E28 免疫诱导的抗体滴度可达 1 ∶ 23040，远远高于线性肽 E26 免疫诱导的抗体滴度 1 ∶ 200( 图 6)。用 IDEXX 猪瘟抗体试剂盒检测免疫兔血清抗体，结果显示， 2 次免疫 2 周，分支肽 E28 免疫诱导的抗体，其阻断率可达 37.8％，远远高于线性肽 E26 的抗体阻断率 10.5％，稍低于猪瘟弱毒疫苗的阻断率 49％ ( 图 7)。从以上结果可以看出，线性肽 E26 与分支肽 E28 免疫所诱导的抗体趋势与兔体实验是一致的，只是诱导的抗体滴度要低于兔体实验，这可能与合成肽的免疫剂量、免疫方式有关。总之，与线性肽 E26 相比，分支肽 E28 诱导了更有效的抗体。
     以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
     序列表
     <110> 中国农业科学院上海兽医研究所
     <120> 猪瘟合成肽疫苗及其应用
     <160>2
     <170>PatentIn version 3.3
     <210>1
     <211>19
     <212>PRT
     <213> 人工序列
     <220>
     <221>MISC_FEATURE
     <222>(1)..(19) <223>T 细胞表位 <400>1 Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val 1 5 Ile Leu Phe <210>2 <211>15 <212>PRT <213>Classical swine fever virus <220> <221>MISC_FEATURE <222>(1)..(15) <223>E2 蛋白 B 细胞表位 <400>2 Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu 1 5Ile Val His Lys Ile Glu Gly 10 15Arg Thr Glu Val Val Lys 10 15

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1、(10)申请公布号 CN 101991848 A(43)申请公布日 2011.03.30CN101991848A*CN101991848A*(21)申请号 201010539268.4(22)申请日 2010.11.10A61K 39/187(2006.01)A61K 47/48(2006.01)C07K 7/06(2006.01)A61P 31/20(2006.01)(71)申请人中国农业科学院上海兽医研究所地址 200241 上海市闵行区紫月路518号(72)发明人童光志李国新周艳君于海(74)专利代理机构上海大邦律师事务所 31252代理人周东萍(54) 发明名称猪瘟合成肽。

2、疫苗及其应用(57) 摘要本发明公开了一种猪瘟合成肽疫苗，该合成肽疫苗用分支肽将辅助性T细胞表位和猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位进行连接。本发明猪瘟合成肽疫苗，不仅避免机体产生针对载体的免疫应答，而且提高了合成肽疫苗的免疫原性，其成份单纯，没有毒副作用和生物安全方面的担忧，具有产业化优势。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 2 页说明书 8 页附图 3 页CN 101991851 A 1/2页21.一种猪瘟合成肽疫苗，其特征在于，所述疫苗具有T-L-B或B-L-T结构，其中，T为辅助性T细胞表位；B为猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位，该B细胞表位。

3、的数量大于等于2；L为连接T与B的连接肽，该连接肽为分支肽，所述B细胞表位连接在该分支肽的分支结构上。2.根据权利要求1所述的猪瘟合成肽疫苗，其特征在于，所述分支肽具有下述通式(I)：其中，R1R6各选自以下氨基酸中的任意一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸；m为大于等于零；R7、R8选自H、COCH2-R5、COCH2-R6、或下面式(II)：式(II)中，R9、R10选自H、COCH2-R5、COCH2-R6、或下面式(III)：3.根据权利要求2所。

4、述的猪瘟合成肽疫苗，其特征在于，所述R1R4均为赖氨酸。4.根据权利要求2所述的猪瘟合成肽疫苗，其特征在于，所述R7、R8选自COCH2-R5、COCH2-R6，所述R5、R6均为半胱氨酸。5.根据权利要求2至4中任一项所述的猪瘟合成肽疫苗，其特征在于，所述分支肽具有下述结构式：权利要求书CN 101991848 ACN 101991851 A 2/2页3其中，K代表赖氨酸，C代表半胱氨酸。6.根据权利要求1所述的猪瘟合成肽疫苗，其特征在于，所述辅助性T细胞表位包括：通用型辅助性T细胞表位、或来源于病原体的辅助性T细胞表位。7.根据权利要求6所述的猪瘟合成肽疫苗，其特征在于，所述辅助性。

5、T细胞表位为通用型辅助性T细胞表位，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。8.根据权利要求1所述的猪瘟合成肽疫苗，其特征在于，所述猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。9.一种疫苗组合物，其特征在于，用于免疫动物以对抗猪瘟病毒的感染，所述疫苗组合物包含：权利要求1所述的猪瘟合成肽疫苗、以及佐剂。10.权利要求1所述的猪瘟合成肽疫苗在制备预防或治疗猪瘟病的药物中的应用。权利要求书CN 101991848 ACN 101991851 A 1/8页4猪瘟合成肽疫苗及其应用技术领域0001 本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种猪瘟合成肽疫苗及其应用。。

6、背景技术0002 猪瘟病毒E2蛋白可以诱导产生中和抗体，是猪瘟病毒最主要的保护性抗原(Konig等，JVirol，1995，69：479-86)。关于猪瘟病毒E2蛋白抗原表位的鉴定已经取得了一定的进展。其中，E2蛋白的829-837位氨基酸是一个主要的抗原表位，而且是保守的猪瘟特异性的线性表位(Lin等，J Virol，2000，74：11619-25)。大肠杆菌表达的该表位与GST的融合产物诱导了保护性免疫应答(Liu等，J Virol Meth，2006，134：125-9)，并且串联了4个拷贝后，表达的融合蛋白能抵抗猪瘟病毒的攻击(Liu等，Vaccine，2006，24：7175-71。

7、80)。把该表位人工合成的肽链与BSA偶联后，免疫猪，仅仅显示了微弱的保护效力(Dong等，Vaccine，2006，24：1906-1913)。利用合成重叠肽的方法，已经鉴定出了一系列的猪瘟E2蛋白的线性中和表位，把上述表位分别与BSA偶联后，免疫猪，能诱导产生中和抗体，但并不能对猪提供完全的保护(Dong等，Vaccine，2006，24：1906-1913；Dong等，Vaccine，2006，24：426-434)。上述研究无论是表位与GST融合表达还是合成的肽链与BSA偶联，都不能对猪进行有效保护，且免疫动物后都不可避免地产生针对载体的免疫应答，这可能会给免疫动物带来一定的风险。而且。

8、，短肽链与巨大的载体偶联会更多地诱导机体产生针对载体的免疫应答(cease等，Proc Natl Acad Sci USA，1987，84(12)：4249-53)。发明内容0003 本发明要解决的技术问题是提供一种猪瘟合成肽疫苗，该疫苗不仅避免了载体蛋白诱导不期望的免疫应答，而且提高了肽疫苗的免疫原性，增强了免疫保护作用。0004 此外，还需要提供一种猪瘟合成肽疫苗在制备预防或治疗猪瘟病的药物中的应用。0005 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：0006 在本发明的一个方面，提供了一种猪瘟合成肽疫苗，所述疫苗具有T-L-B或B-L-T结构，其中，0007 T为辅助性T细胞表位。

9、；0008 B为猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位，该B细胞表位的数量大于等于2；0009 L为连接T与B的连接肽，该连接肽为分支肽，所述B细胞表位连接在该分支肽的分支结构上。0010 优选的，所述分支肽具有下述通式(I)：0011 说明书CN 101991848 ACN 101991851 A 2/8页50012 其中，R1R6各选自以下氨基酸中的任意一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸；m为大于等于零；0013 R7、R8选自H、COCH2-R5、COC。

10、H2-R6、或下面式(II)：0014 0015 式(II)中，R9、R10选自H、COCH2-R5、COCH2-R6、或下面式(III)：0016 0017 本发明猪瘟合成肽疫苗，用分支肽将辅助性T细胞表位和猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位进行连接，该猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位连接在分支肽的分支结构上，其数量大于等于2。因此，本发明利用分支肽可以提高B细胞表位的密度以及模拟表位的空间构象从而提高合成肽的免疫原性。0018 更优选的，所述R1R4均为赖氨酸；所述R7、R8选自COCH2-R5、COCH2-R6，所述R5、R6均为半胱氨酸。0019 特别优选的，所述分支肽具有下述结构式：0020 说。

11、明书CN 101991848 ACN 101991851 A 3/8页60021 其中，K代表赖氨酸，C代表半胱氨酸。0022 所述辅助性T细胞表位包括：通用型辅助性T细胞表位、或来源于病原体的辅助性T细胞表位。0023 优选的，所述辅助性T细胞表位为通用型辅助性T细胞表位，其包含下述SEQ ID NO：1氨基酸序列：ISISEIKGVIVHKIEGILF(SEQ ID NO：1)。通用型辅助性T细胞表位克服了不同种类动物和不同个体的MHC限制，能诱导更有效的免疫应答。0024 优选的，所述猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位包含下述SEQ ID NO：2氨基酸序列：0025 CTAVSPTTLRTE。

12、VVK(SEQ ID NO：2)。0026 在本发明的优选实施例中，猪瘟合成肽疫苗具有下述结构：0027 0028 在该猪瘟合成肽疫苗中，分支肽的分支结构上连接了4个猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位，有效提高了B细胞表位的密度，增强了合成肽的免疫原性。0029 为了增加上述优选实施例的猪瘟合成肽疫苗结构的稳定性，在肽链的氨基端(即B细胞表位的游离末端)可以进行乙酰化修饰，在肽链的羧基端(即通用型辅助性T细胞表位的游离末端)可以进行酰胺化修饰。0030 本发明的另一方面，提供了一种疫苗组合物，用于免疫动物以对抗猪瘟病毒的感染，所述疫苗组合物包含：上述猪瘟合成肽疫苗、以及佐剂。0031 用本领域已知的常。

13、规方法人工合成上述猪瘟合成肽疫苗，纯度在90以上，将猪瘟合成肽用无菌的PBS稀释成浓度为1微克每微升的肽溶液，以等量的蛋白质佐剂(如弗氏佐剂等)与肽溶液混合，乳化成疫苗组合物，既可作为免疫原用于免疫动物。0032 在本发明的另一方面，还提供了上述猪瘟合成肽疫苗在制备预防或治疗猪瘟病的药物中的应用。0033 本发明猪瘟合成肽疫苗，与传统的原核表达或载体偶联方法制得的疫苗相比，不仅避免机体产生针对载体的免疫应答，而且提高了合成肽疫苗的免疫原性。本发明猪瘟合成肽疫苗质量稳定，生产品质易于控制，成份单纯，没有毒副作用和生物安全方面的担忧，具有产业化优势。说明书CN 101991848 ACN 10。

14、1991851 A 4/8页7附图说明0034 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。0035 图1是本发明实施例1以线性肽E26为包被抗原做ELISA检测免疫兔的抗体滴度图；0036 图2是本发明实施例1以分支肽E28为包被抗原做ELISA检测免疫兔的抗体滴度图；0037 图3是本发明实施例1的IDEXX试剂盒检测免疫兔血清抗体阻断率柱状图；0038 图4是本发明实施例1攻毒后试验兔体温曲线图；0039 图5是本发明实施例2以线性肽E26为包被抗原做ELISA检测免疫猪的抗体滴度图；0040 图6是本发明实施例2以线性肽E28为包被抗原做ELISA检测免疫猪的抗体滴度图；00。

15、41 图7是本发明实施例2的IDEXX试剂盒检测免疫猪血清抗体阻断率柱状图。具体实施方式0042 下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如分子克隆实验指南(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。0043 本发明猪瘟合成肽疫苗，用分支肽将辅助性T细胞表位和猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位进行连接，该猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位连接在分支肽的分支结构上，其数量大于等于2。本发明使用分支肽可以提高B细胞表位的密度以及模拟表位的空间构象从而提高合成肽的免疫原性。并且，本发明用辅助性T细胞表位替代了现有原核表达或载。

16、体偶联方法制得的疫苗中的载体蛋白，避免机体产生针对载体蛋白的免疫应答。优选的，本发明采用通用型辅助性T细胞表位，克服了不同种类动物和不同个体的MHC限制，能诱导更有效的免疫应答。0044 本发明的分支肽具有下述通式(I)：0045 0046 其中，R1R6各选自以下氨基酸中的任意一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸；m为大于等于零；0047 R7、R8选自H、COCH2-R5、COCH2-R6、或下面式(II)：说明书CN 101991848 ACN。

17、 101991851 A 5/8页80048 0049 式(II)中，R9、R10选自H、COCH2-R5、COCH2-R6、或下面式(III)：0050 0051 优选的，R1R4均为赖氨酸；R7、R8选自COCH2-R5、COCH2-R6，R5、R6均为半胱氨酸。0052 特别优选的，分支肽具有下述结构式：0053 0054 其中，K代表赖氨酸，C代表半胱氨酸。0055 在本发明下述的优选实施例中，猪瘟合成肽疫苗具有如下结构：0056 0057 实施例10058 用本领域的常规方法人工合成如下所示的分支肽以及线性肽，分别命名为E28和E26。合成肽的纯度都在90以上，用无菌的PBS把合成肽。

18、稀释成浓度为1微克每微升的肽溶液，然后以等量的蛋白质佐剂(如弗氏佐剂等)与肽溶液混合，乳化成疫苗，作为免疫原说明书CN 101991848 ACN 101991851 A 6/8页9用于免疫动物。0059 分支肽-E280060 线性肽-E26ISISEIKGVIVHKIEGILFKKCTAVSPTTLRTEVVK0061 选择2公斤左右的健康家兔15只，分为3组，每组5只，第一组(1、2、3、4、5号兔)免疫线性肽E26，第二组(6、7、8、9、10号兔)免疫分支肽E28，第三组(11、12、13、14、15号兔)免疫PBS作为阴性对照。肽疫苗免疫剂量为每次50微克，总体积500微升，皮。

19、内多点注射，免疫2次，间隔2周。第一次用弗氏完全佐剂乳化，第二次用弗氏不完全佐剂乳化。免疫前及免疫后每周采血分离血清，用肽ELISA及IDEXX猪瘟抗体检测试剂盒检测血清抗体滴度。第二次免疫2周后，静脉注射100个兔体反应量的猪瘟弱毒，攻毒后，每天测量体温2次。如果产生的抗体能够完全中和猪瘟弱毒，则免疫兔体温正常，如果不能中和猪瘟弱毒，兔子会呈现定型热反应，以此来验证疫苗的免疫效力。静脉注射猪瘟弱毒后第4天，采集免疫兔子的脾脏，用荧光定量PCR方法检测脾脏中的病毒，以此进一步判定猪瘟弱毒在兔体内的繁殖程度。0062 结果显示，2次免疫后2周，用线性肽E26做包被抗原做ELISA检测的抗体滴度，。

20、分支肽E28免疫诱导的抗体滴度可达138400，低于线性肽E26免疫诱导的抗体滴度1358400(图1)。然而，用分支肽E28做包被抗原做ELISA检测抗体滴度，分支肽E28免疫诱导的抗体滴度可达1140800，远远高于线性肽E26免疫诱导的抗体滴度11000(图2)。用IDEXX猪瘟抗体试剂盒检测免疫兔血清抗体，结果显示，1次免疫2周，分支肽E28免疫诱导的抗体，其阻断率可达57.7，2次免疫后2周，抗体阻断率可达76.3，远远高于线性肽E26的抗体阻断率26.4和39.4(图3)。因为IDEXX猪瘟抗体试剂盒检测的抗体水平与血清中和试验检测的抗体水平具有相关性，所以以上试验说明分支肽具有很。

21、好的免疫原性，其诱导产生的抗体也具有中和活性。猪瘟弱毒攻击后，分支肽E28免疫兔体温正常，而线性肽E26及PBS对照组兔体温呈现明显的定型热反应(表1、图4)。在攻毒后第四天，兔体温恢复正常后，取脾脏用荧光定量PCR检测猪瘟病毒，结果显示，分支肽E28免疫组5只兔子都呈现阴性，而线性肽E26及对照组全部阳性，均检测到病毒RNA(表1)。以上结果说明，分支肽E28免疫诱导的抗体完全中和了猪瘟病毒，没有引起免疫兔发生定型热反应。0063 表1攻毒后兔体温变化及兔脾脏病毒RNA载量说明书CN 101991848 ACN 101991851 A 7/8页100064 0065 抗体效价的检测结果显。

22、示，当用线性肽E26做包被抗原检测时，线性肽E26免疫诱导的抗体滴度高于分支肽E28诱导的抗体滴度，但是当用E28做包被抗原做ELISA或者是用IDEXX试剂盒检测时，E26诱导的抗体水平远远低于E28诱导的。从实验兔的定性热反应以及猪瘟病毒在兔体内的复制情况看，分支肽E28诱导的抗体完全抑制了猪瘟病毒在兔体内的繁殖。这说明，线性肽E26免疫虽然产生了针对E26本身高效价的抗体，但是这种抗体的中和作用较低，并没有完全抑制猪瘟病毒在兔体内的繁殖。因此，从本实验可以看出，单纯针对具有中和活性的线性B细胞表位的抗体不一定具有有效的中和作用。为了能够诱导更有效的中和抗体，通过不同的形式对线性B细胞表位。

23、进行组装或改造是必需的。本发明分支肽E28提供了一个成功的案例。0066 实施例20067 如实施例1中的方法制备肽疫苗，作为免疫原用于免疫动物。选择35日龄左右的猪瘟抗体阴性的健康仔猪20头，分为4组，每组5头，第一组免疫线性肽E26，第二组免疫本发明制备的分支肽E28，其余2组分别免疫猪瘟弱毒疫苗(HCLV)以及PBS，作为阳性对照与阴性对照。肽疫苗免疫剂量为每次300微克，总体积为1毫升，肌肉多点注射，免疫2次，间隔2周。第一次用弗氏完全佐剂乳化，第二次用弗氏不完全佐剂乳化。免疫前及免疫后每周采血分离血清，用肽ELISA及IDEXX猪瘟抗体检测试剂盒检测血清抗体水平。0068 结果显示，。

24、2次免疫后2周，用线性肽E26做包被抗原做ELISA检测的抗体滴度，分支肽E28免疫诱导的抗体滴度可达12560，但低于线性肽E26免疫诱导的抗体滴度140960(图5)。然而，用分支肽E28做包被抗原做ELISA检测抗体滴度，分支肽E28免疫诱导的抗体滴度可达123040，远远高于线性肽E26免疫诱导的抗体滴度1200(图6)。用IDEXX猪瘟抗体试剂盒检测免疫兔血清抗体，结果显示，2次免疫2周，分支肽E28免疫诱导的抗体，其阻断率可达37.8，远远高于线性肽E26的抗体阻断率10.5，稍低于猪瘟弱毒疫苗的阻断率49(图7)。从以上结果可以看出，线性肽E26与分支肽E28免疫所诱导的抗体趋势与兔体实验是一致的，只是诱导的抗体滴度要低于兔体实验，这可能与合成肽的免疫剂量、免疫方式有关。总之，与线性肽E26相比，分支肽E28诱导了更有效的抗体。说明书CN 101991848 A。

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