同源性犬埃里希体28千道尔顿免疫优势蛋白质基因及其用途 【发明背景】
【发明领域】
本发明主要涉及分子生物学领域。更具体说，本发明涉及犬埃里希体中同源性28-kDa蛋白质基因和编码犬埃里希体28-kDa同源性蛋白质的多基因基因座的分子克隆和特征确定及它们的用途。
相关领域描述
犬埃里希病，即犬热带全血细胞减少症，是1935年在非洲和1963年在美国首先报道的犬蜱传立克次氏体病(Donatien和Lestoquard，1935；Ewing，1963)。自越南战争期间在美国军犬中流行性发作后，对这种疾病有了更好的认识(Walker等人，1970)。
犬埃里希病的病原微生物是犬埃里希体(Ehrlichia canis)，一种小型、革兰氏阴性、专性胞内菌，对单核吞噬细胞表现出向性(Nyindo等人，1971)，由一种棕色犬虱(Rhipicephalus sanguineus)传播(Groves等人，1975)。犬埃里希病的发病有三个阶段，急性、亚临床性和慢性。急性阶段的特征是发烧、厌食、抑郁、淋巴结病和血小板轻度减少(Troy和Forrester，1990)。犬类通常可以从急性阶段恢复，但会在几个月或几年中成为该微生物持续感染携带者而无疾病的临床征象(Harrus等人，1998)。一些病犬中慢性期发展的特征是血小板减少、血球蛋白过多、厌食、憔悴和出血，尤其是出鼻血，随后死亡(Troy和Forrester，1990)。
根据对16S rRNA基因的分子分类分析已确定：犬埃里希体和恰菲埃里希体(E.chaffeensis)(一种人单核细胞埃里希病(HME)的病原微生物)密切相关(Anderson等人，1991；Anderson等人，1992；Dawson等人，1991；Chen等人，1994)。已报道了犬埃里希体和恰菲埃里希体之间64、47、40、30、29和23-kDa抗原的相当程度的交叉反应性(Chen等人，1994；Chen等人，1997；Rikihisa等人，1994；Rikihisa等人，1992)。用免疫印迹分析了与人和犬恢复期血清起免疫反应的抗原，鉴定了犬埃里希体多个免疫优势蛋白，包括30-kDa蛋白质(Chen等人，1997)。另外，犬埃里希体的30-kDa蛋白也被视为在免疫应答中被早期识别的主要免疫优势抗原，这与恰菲埃里希体的30-kDa蛋白的抗原性不同(Rikihisa等人，1992；Rikihisa等人，1994)。还鉴定了分子量范围20到30-kDa的犬埃里希体的其他免疫优势蛋白(Brouqui等人，1992；Nyindo等人，1991；Chen等人，1994；Chen等人，1997)。
最近，已有恰菲埃里希体编码23到28-kDa蛋白的多基因家族(omp-1)的克隆和测序的描述(Ohashi等人，1998)。克隆了恰菲埃里希体的28-kDa免疫优势外膜蛋白质基因(p28)，该基因与反刍类考德里氏体(Cowdriaruminantium)map-1基因同源。用重组p28免疫接种的小鼠受到保护能抵抗同源菌株地感染攻击，这是依据攻击后第5天外周血的PCR分析结果(Ohashi等人，1998)。还报道了分子克隆了犬埃里希体的两种类似的、但不相同的串联排列的28-kDa基因，它们与恰菲埃里希体的omp-1基因家族和反刍类考德里氏体的map-1基因同源(Reddy等人，1998)。
现有技术的缺陷在于，没有对犬埃里希体的新的同源性28-kDa免疫反应性蛋白质基因和含同源28-kDa蛋白质基因的单个多基因基因座进行克隆并确定特征。另外，现有技术的缺陷还在于，没有这些犬埃里希体免疫反应性基因的重组蛋白质。本发明填补了本领域该长期以来的需要和愿望。
发明概述
本发明描述了犬埃里希体的同源性成熟28-kDa免疫反应性蛋白质基因(命名为Eca28-1、ECa28SA3和ECa28SA2)的分子克隆、测序、特性分析和表达，以及含5个犬埃里希体28-kDa蛋白质基因(ECa28SA1、ECa28SA2、ECa28SA3、ECa28-1和ECa28-2)的单基因座(5.592-kb)的鉴定。与恰菲埃里希体相比，在犬埃里希体28-kDa蛋白质基因中，ECa28-1具有与恰菲埃里希体omp-1多基因家族最大的氨基酸同源性，且在犬埃里希体分离物中高度保守。预计这5个28-kDa蛋白含有形成成熟蛋白质的信号肽和同源范围51-72％的氨基酸。基因间隔区分析揭示了各基因的假设启动子区，提示这些基因独立和差异性表达。基因间非编码区域的大小范围为229到335-bp，且48-71％同源。
在本发明的一个实施例中，提供了DNA序列，它们编码犬埃里希体的30-kDa免疫反应性蛋白质。优选的，该蛋白质具有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的氨基酸序列。该基因具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的核酸序列，而且是多态基因家族的成员。通常，该蛋白质的N端信号序列在翻译后加工后被切下，从而产生成熟的28-kDa蛋白质。优选地，在一个多基因基因座中包含编码诸28-kDa蛋白质的DNA，该基因座的大小为5.592kb，且编码所有这5种犬埃里希体同源性28-kDa蛋白质。
在本发明的一个优选例中，提供了一种表达载体，该载体含有一个基因，它编码犬埃里希体的28kDa免疫反应性蛋白质，而且当该载体被引入细胞时，能表达该基因。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种重组蛋白质，该蛋白质含有一个选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的氨基酸序列。优选氨基酸序列是由一个选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的核酸序列编码的。优选地，该重组蛋白质含有4个表面外露的、亲水性和抗原性可变区。该重组蛋白质可用作抗原。
在本发明的一个优选例中，提供了一种产生该重组蛋白质的方法，包括如下步骤：获得含有一表达区的载体，该表达区含有编码选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：6的氨基酸序列的序列，该序列和一启动子可操纵性连接；将该载体转染入细胞；并在有效表达该表达区的条件下培养细胞。
在某些实施例中，还描述了本发明抑制个体内犬埃里希体感染的方法，包括如下步骤：鉴定怀疑接触过或被犬埃里希体感染的个体；并给予剂量能有效抑制犬埃里希体感染的、含有犬埃里希体28-kDa抗原的组合物。该抑制可通过任何方法，如刺激个体的体液或细胞免疫应答，或用其它方法，如抑制28-kDa抗原的正常功能，或甚至与该抗原竞争和个体内某些(传染)因子相互作用。
本发明的其它和进一步的方面、特征和优点将经过下面为了公开的目的给出的本发明的优选例的描述而变得明白。
附图简述
因此，将获得并详细理解本发明上述特征、优点和目的中的内容，以及其它将变得清楚的内容，更具体的、对本发明上面简述的内容将参考某些带附图说明的实施例。这些图是说明书的一部分。然而要注意的是，附图说明了本发明的优选例，而不应认为是对本发明范围的限制。
图1显示了包括相邻5’和3’非编码区域的ECa28-1基因的核酸序列(SEQID NO：1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。粗体显示了ATG起始密码子和TAA终止子，对23氨基酸前导信号序列加下划线。
图2显示表达的50-kDa重组ECa28-1-硫氧还蛋白融合蛋白(泳道1，箭头)和16-kDa硫氧还蛋白对照(泳道2，箭头)的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，和由恢复期犬埃里希体犬类抗血清识别的重组ECa28-1-硫氧还蛋白融合蛋白的相应免疫印迹(泳道3)。未用犬埃里希体抗血清检测硫氧还蛋白对照(没有显示)。
图3显示了ECa28-1蛋白质(SEQ ID NO：2)、ECa28SA2(部分序列，SEQID NO：7)和ECa28SA1(SEQ ID NO：8)、恰菲埃里希体P28(SEQ ID NO：9)、恰菲埃里希体OMP-1家族(SEQ ID NO：10-14)和反刍类考德里氏体MAP-1(SEQ ID NO：15)的氨基酸序列的排列对比。Eca28-1氨基酸序列作为共有序列。没有显示出字母的是与ECa28-1相同的氨基酸，用点表示。用相应的单字母缩写显示趋异的氨基酸。用划线指出为最大程度进行氨基酸序列的排列对比而引入的空隙。可变区加下划线，且命名为VR1、VR2、VR3和VR4。箭头指出信号肽的预计的信号肽酶切割位点。
图4用不平衡的树结构显示了犬埃里希体ECa28-1与ECa28SA2(部分序列)和ECa28SA1、恰菲埃里希体omp-1多基因家族的6个成员、和反刍类考德里氏体map-1(演绎出的氨基酸序列)的系统发生相关性。每对树枝的长度代表各对氨基酸序列之间的差异距离。由比例尺确定序列间的差异距离。
图5显示了用6种独立的限制性内切酶完全消化、与ECa28-1 DIG-标记的探针杂交(泳道2-7)；DIG-标记的分子量标记(泳道1和8)对犬埃里希体基因组DNA进行的Southern印迹分析。
图6显示了ECa28-1(Jake菌株)和恰菲埃里希体P28(Arkansas菌株)预计的蛋白质特征的比较。用六肽作为窗口，表面可能性预测表面残基。表面残基是任何带有水可接进的表面区域＞2.0nm2的残基。此值大于1的六肽被视为表面区。抗原性指数可预测潜在的抗原性决定簇。此值大于0的区域是潜在的抗原性决定簇。通过用具有残基1-甘氨酸或极性氨基酸、残基2-疏水氨基酸、残基3-疏水氨基酸、残基4-疏水氨基酸或脯氨酸，和残基5-极性氨基酸或甘氨酸的一种5氨基酸基序，T细胞基序定位了潜在的T细胞抗原性决定簇。这些比例尺表明氨基酸的位置。
图7显示了犬埃里希体28-kDa蛋白质基因ECa28SA2(核苷酸1-849；SEQID NO：3；氨基酸序列：SEQ ID NO：4)和ECa28SA3(核苷酸1195-2031；SEQ IDNO：5；氨基酸序列：SEQ ID NO：6)的核酸序列和推导的氨基酸序列，包括基因间非编码序列(NC2，核苷酸850-1194；SEQ ID NO：31)。以粗体显示ATG起始密码子和终止密码子。
图8显示了5个犬埃里希体28-kDa蛋白质基因的基因座(5.59-Kb)的图解，表明基因组取向和基因间非编码区(28NC1-4)。基因座1和2(阴影)中所显示的28-kDa蛋白质基因已有人描述过(McBride等人，1999；Reddy等人，1998；Ohashi等人，1998)。命名和测定了ECaSA2和新型28-kDa蛋白质基因(命名为ECa28SA3-无阴影)的完整序列。ECaSA2、ECa28SA3和ECa28-1之间的非编码基因间区(28NC2-3)完成了对上述不连接的基因座1和2的连接。
图9用不平衡的树结构，根据氨基酸序列显示了五个犬埃里希体28-kDa蛋白质基因成员的系统发生相关性。每对树枝的长度代表各对氨基酸序列间的差异距离。由比例尺确定序列间的差异距离。
图10显示了犬埃里希体28-kDa蛋白质基因的基因间非编码核酸序列(SEQID NO：30-33)的排列对比。没有显示的、用点(.)表示的核酸是与非编码区1(28NC1)相同的。用相应的单字母缩写显示趋异。用划线(-)指出为最大程度进行氨基酸序列的排列对比而引入的空隙。推定的转录启动子区域(-10和-35)和核糖体结合位点(RBS)加框。
发明详述
本发明描述了犬埃里希体的编码30-千道尔顿(kDa)蛋白质的同源基因的克隆、测序和表达。还进行了七种犬埃里希体分离物和恰菲埃里希体omp-1多基因家族中同源基因的分子比较分析。鉴定出两种新型28-kDa蛋白质基因，ECa28-1和ECa28SA3。ECa28-1含有编码278个氨基酸蛋白质(SEQ ID NO：2)834-bp的开放读框，该蛋白质预计分子量为30.5-kDa。鉴定了N端信号序列表明该蛋白在翻译后被修饰成27.7-kDa的成熟蛋白质。ECa28SA3含有编码280氨基酸蛋白质(SEQ ID NO：6)的840-bp开放读框。
用PCR完成了对犬埃里希体的28-kDa蛋白质基因(一种ECa28SA2先前未测序过的区域)的扩增。测序分析ECa28SA2表明849-bp开放读框编码283氨基酸蛋白质(SEQ ID NO：4)。用对28-kDa蛋白质基因的基因间非编码区域特异性的引物进行PCR扩增，将两个上述分开的基因座连接起来，鉴定了含有所有5个28-kDa蛋白质基因的单个基因座(5.592kb)。预计这5个28-kDa蛋白质具有形成成熟蛋白质的信号肽，且氨基酸的同源性范围为51-72％。基因间隔区分析显示了各基因的假定启动子区域，提示这些基因可能是独自和差异性表达的。基因间非编码区域(28NCl-4)的大小范围为299到355bp，且48-71％同源。
本发明涉及犬埃里希体中的两种新型同源28-kDa蛋白质基因(ECa28-1和ECa28SA3)，和上述部分测序的ECa28SA2的完整序列。还公开了编码犬埃里希体所有5个同源性28-kDa外膜蛋白质的多基因基因座。
在本发明的一实例中，提供了编码一种犬埃里希体30-kDa免疫反应性蛋白质的DNA序列。较佳地，该蛋白具有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：6的氨基酸序列，该基因具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的核酸序列，且是多态性多基因家族的成员。更优选地，该蛋白质具有的N端信号序列在翻译后加工后被切除，从而产生成熟的28-kDa蛋白质。还优选地，在单个多基因基因座中含有编码28-kDa蛋白质的DNA，该基因座的大小为5.592kb，编码所有五种犬埃里希体的同源28-kDa蛋白质。
在本发明的一个优选例中，提供了一种表达载体，它含有编码犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质的基因，能在该载体被引入细胞时，表达该基因。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种重组蛋白质，该蛋白质含有一个选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的氨基酸序列。优选氨基酸序列是由一个选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的核酸序列编码的。优选地，该重组蛋白质含有4个表面外露的、亲水性和抗原性可变区。还优选地，该重组蛋白质是一种抗原。
在本发明的一个优选例中，提供了一种产生该重组蛋白质的方法，包括如下步骤：获得含有一表达区的载体，该表达区含有编码选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：6的氨基酸序列的序列，该序列和一启动子可操纵性连接；将载体转染入细胞；并在有效表达该表达区的条件下培养细胞。
在某些实施例中，还描述本发明抑制个体内犬埃里希体感染的方法，包括如下步骤：鉴定怀疑接触过或被犬埃里希体感染的个体；并给予剂量能有效抑制犬埃里希体感染的、含有犬埃里希体28-kDa抗原的组合物。该抑制可通过任何方法，如刺激个体的体液或细胞免疫应答，或用其它方法，如抑制28-kDa抗原的正常功能，或甚至与该抗原竞争和个体内某些(转染)因子相互作用。
根据本发明，使用本领域内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中已有充分解释。见例如，Maniatis，Fritsch & Sambrook，“分子克隆：实验手册”(1982)；“DNA克隆：实践方法”，卷I和II(D.N.Glover编，1985)；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait编，1984)；“核酸杂交”[B.D.Hames& S.J.Higgins编(1985)]；“转录和翻译”[B.D.Hames & S.J.Higgins编(1984)]；“动物细胞培养”[R.I.Freshney编(1986)]；“固定化细胞和酶”[IRLPress(1986)]；B.Perbal，“分子克隆实践指南”(1984)。
因此，如果在本文中出现，下列术语具有以下定义。
“复制子”是一种基因元件(如质粒、染色体、病毒)在体内起到DNA复制的自发单位作用；即能在其自身的控制下复制。
“载体”是一种复制子，如质粒、噬菌体和粘粒，另一条DNA节段可与其结合，从而引起该结合节段的复制。
“DNA分子”指脱氧核糖核酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶)的聚合形式，不论单链形式还是双链螺旋。该术语仅指分子的一级和二级结构，不将其限于任何特定的三级形式。因此，该术语尤其包括在线性DNA分子(如限制性片段)、病毒、质粒和染色体中发现的双链DNA。在讨论结构时，根据常规，本文仅给出沿DNA非转录链(即与mRNA序列同源的链)5’到3’方向的序列。
DNA“编码序列”是双链DNA序列，当其置于合适的调控序列的控制下时，在体内被转录并翻译成多肽。5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定了编码序列的边界。编码序列可包括，但不限于：原核序列、来自真核生物mRNA的cDNA、真核生物(如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和甚至合成的DNA序列。聚腺苷酸信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’端。
转录和翻译控制序列是DNA调控序列，如启动子、增强子、聚腺苷酸信号、终止子等，提供了宿主细胞中编码序列的表达。
“启动子序列”是能在细胞中结合RNA聚合酶，并引发下游(3’方向)编码序列转录的DNA调控区。为了本发明的定义，启动子序列的边界在其3’端为转录起始位点，并向上游(5’方向)延伸包括引发的超过背景的可检测水平的转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列中，可找到一转录起始位点，和蛋白结合域(共有序列)，负责RNA聚合酶的结合。真核启动子常常，但不是总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核启动子含有Shine-Dalgarno序列和-10和-35共有序列。
“表达控制序列”是控制和调节另一DNA序列转录和翻译的DNA序列。当编码序列在细胞中的转录和翻译控制序列的“控制下”，RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA，然后翻译成编码序列所编码的蛋白质。
“信号序列”可包括在编码序列附近。该序列编码信号肽，该多肽的N-末端，与宿主细胞联系，指引该多肽到细胞表面或将该多肽分泌到介质中，而且在蛋白离开细胞前，宿主细胞将信号肽切下。可发现信号序列与各种原核和真核生物天然的蛋白有关。
本文所用的术语“寡核苷酸”指本发明的探针，定义为含有两和多个，优选三个以上脱氧核糖核苷酸的分子。它的确切大小取决于许多因素，这些因素进而又取决于该寡核苷酸最终的功能和用途。
本文所用的术语“引物”指一条寡核苷酸，不论是天然的纯化的限制性消化物，或是合成产生的，当其置于引物延伸产物合成的条件下，能作为合成起始点。在存在核苷酸和诱导剂，如DNA聚合酶和合适温度和pH下合成的引物延伸产物与一核酸链互补。引物可以是单链或双链，而且必须足够长，以在诱导剂存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用的方法。例如，为了诊断用途，由靶序列的复杂程度而定，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多的核苷酸，虽然它可含有较少的核苷酸。
本文选择的引物与具体靶DNA序列的不同链“充分”互补。这意味着引物必须是充分互补，与它们各自链杂交。因此，引物序列不需要反映模板的确切序列。例如，可将非互补的核苷酸片段与引物的5’末端结合，而引物剩余的序列和该链互补。另外，可将非互补碱基或较长的序列分散在引物中，只要引物序列与该序列充分互补或与其杂交，从而形成延伸产物合成的模板。
用外源或异源DNA“转化”细胞，当这样的DNA被引入细胞时。转化的DNA可以或可以不整合(共价连接)入细胞基因组。在例如原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化的DNA可维持在附加型元件，如质粒上。对于真核细胞，稳定转化的细胞是一种其中转化DNA整合在染色体内，从而通过染色体复制被子代细胞继承的细胞。该稳定性可由真核细胞建立一群含有转化DNA的子代细胞的细胞系或克隆的能力所证实。“克隆”是由一个细胞或一个祖先通过有丝分裂产生的一群细胞。“细胞系”是能在体外稳定生长许多代的一原代细胞的克隆。
两条DNA序列当在其确定的长度中至少约75％(较佳至少约80％，和最佳至少约90％或95％)核苷酸匹配时，这两条DNA序列是“充分同源的”。可用在序列数据库中得到的标准软件，或在Southern杂交实验中(该实验在该特定系统确定的严谨条件下进行)，比较二序列来鉴定充分同源的序列。确定合适的杂交条件是本领域技术范围内的。见例如Maniatis等，见上；DNA克隆，卷I&II见上；核酸杂交，见上。
DNA构建物的“异源”区是较大DNA分子中一种可鉴定的DNA节段，发现它与自然中的较大分子无关。因此，当异源区编码一哺乳动物基因时，该基因两侧的DNA常常不是来源生物体基因组中该哺乳动物基因组两侧的DNA。在另一个例子中，编码序列是一种构建物，其中该编码序列本身在自然中未发现(如基因组编码序列含有内含子或具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。等位变体或天然发生的突变不会产生本文定义的DNA异源区域。
这些研究最常用的标记是放射性元素、酶、在暴露于紫外光时会发荧光的化学物质等。许多荧光物质是已知的，可用作标记。这些物质包括例如：荧光素、罗丹明、金胺、Texas Red、AMCA蓝和Lucifer Yellow。特别的检测材料是在山羊中制备的抗-兔抗体，并和荧光素通过异硫氰酸偶联。
还可用放射性元素或酶标记蛋白质。可用任何现有计数程序检测放射性标记。优选同位素可选自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re.
同样可使用酶标记，并可用任何现在使用的比色、分光光度、荧光分光光度、电流量分析或气量分析技术检测。酶和所选颗粒通过与桥联分子，如碳二亚胺、二硫氰酸、戊二醛等反应而偶联。可用于这些过程的许多酶是已知的。优选的是过氧化物酶、β-葡萄糖苷酸酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、尿酶、葡萄糖氧化酶加过氧化物酶和碱性磷酸酶。参见美国专利号3,654,090，3,850,752和4,016,043所公开的其它标记物质和方法。
本文所用的术语“宿主”指不仅包括原核生物，还包括真核生物，如酵母、植物和动物细胞。可用编码本发明犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白的重组DNA分子或基因，使用本领域普通技术人员已知的技术来转化宿主。尤其优选的是采用载体(该载体含有编码本发明犬埃里希体28-kDa的免疫反应性蛋白质的基因的编码序列)转化原核生物。
原核宿主可包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(S.tymphimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcesens)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括酵母如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
一般与宿主联用含有启动子序列(促进插入的DNA片段有效转录)的表达载体。表达载体通常含有一复制起始点、启动子、终止子和能在转化细胞中提供表型选择性的特异性基因。可按照本领域已知方法发酵或培养转化的宿主，以实现最佳细胞生长。
本发明包括一种足够纯的、编码犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质的DNA，该DNA的一条链在高度严谨条件下，将与含有SEQ ID NO：1的至少15个连续核苷酸序列的探针杂交。本发明的DNA编码的蛋白质与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中列出的氨基酸具有至少80％(较佳85％，更佳90％，最佳95％)相同的序列。更优选的，该DNA包括SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸编码序列或该序列的简并变体。
与本发明的DNA杂交的探针优选包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：5中列出的核苷酸编码序列或其互补序列的至少20个，较佳40个，更佳50个，最佳100个或更多(多达100％编码序列)连续核苷酸的序列。这样的探针可用于检测人细胞中犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质的表达，使用的方法包括步骤：(a)使获自人细胞的mRNA与标记的杂交探针接触；和(b)检测探针与mRNA的杂交。
本发明还包括一种足够纯的DNA，它含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中列出的核苷酸区域的至少15个(较佳20个，更佳30个，再更佳50个，最佳全部)连续核苷酸的序列。
“高度严谨性”指以高温和低盐浓度为特征的DNA杂交和洗涤条件，如65℃，盐浓度约0.1×SSC的洗涤条件，或作用相当的条件。例如，高度严谨条件可包括在约50％甲酰胺的存在下，约42℃杂交；用含有1％SDS的约2×SSC在约65℃第一次洗涤；然后用约0.1×SSC在约65℃第二次洗涤。
“基本纯的DNA”指没有该DNA天然存在环境伴随部分的DNA，可通过分离(部分或完全纯化)该环境中的某些或所有分子，或通过改变所称DNA的旁侧序列而得到。因此该术语包括例如：掺入载体、自身会复制的质粒或病毒中的、或掺入原核或真核生物的基因组DNA中的；或作为分离分子(如聚合酶链式反应(PCR)或限制性内切酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)存在的，独立于其它序列之外的重组DNA。它还包括如下重组DNA，即编码其它多肽序列，如融合蛋白的杂交基因的一部分。还包括如下重组DNA，它包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中列出的核苷酸的一部分，它编码一种编码犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质的基因的另一种剪接变体。
该DNA可具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中列出的核苷酸编码序列至少约70％，较佳至少75％(如，至少80％)；和最佳至少90％相同的序列。两条序列之间的相同性是相匹配或相同位置数的直接函数。当两条序列中的一个亚基位置为相同单体亚基占据时，例如，如果两条DNA分子中的某给定位置都为腺苷酸占据，那么它们在该位置是相同的。例如，如果在长度为10个核苷酸的序列中，有7个位置和第二条10个核苷酸序列中相应位置是相同的，那么这两条序列具有70％相同的序列。比较序列的长度一般至少是50个核苷酸，优选至少60个核苷酸，更优选至少75个核苷酸，最优选100个核苷酸。通常用序列分析软件(如Genetics Computer Group，University ofWisconsin Biotechnology Center，1710 Unversity Avenue，Madison，WI 53705的序列分析软件包)测量序列相同性。
本发明包括一个载体，它含有一条编码一基因的DNA序列，该基因编码犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质，所述载体能在宿主中复制，它包括可操纵连接的；a)复制起始点；b)启动子；和c)编码所述蛋白质的DNA序列。优选的，本发明的载体含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中所示DNA序列的一部分。
“载体”可定义为可复制性核酸构建物，如质粒或病毒核酸。可用载体扩增和/或表达编码犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质的核酸。表达载体是一种可复制性构建物，其中编码多肽的核酸序列与能影响该多肽在细胞中表达的合适的控制序列可操纵性连接。对控制序列的需要视所选的细胞和所选的转化方法而不同。一般，控制序列包括转录启动子和/或增强子，合适的mRNA核糖体结合位点，和控制转录和翻译终止的序列。可用本领域技术人员熟知的方法构建含有合适转录和翻译控制信号的表达载体。见例如，Sambrook等人，1989，分子克隆：实验手册(第二版)Cold Spring，Harbor Press，N.Y.所述的技术。如果转录控制序列有效控制某基因的转录，该基因及其转录控制序列就定义为已被“可操纵性连接”。本发明的载体包括但不限于，质粒载体和病毒载体。本发明优选的病毒载体是衍生自反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40病毒或疱疹病毒的载体。
“基本纯的蛋白质”指与至少一部分天然伴随成分相分离的蛋白质。通常，当某蛋白质从与其在体内天然相伴的蛋白质或其它天然存在的有机分子中分离出至少60％重量时，它是基本纯的。较佳的，制备物的纯度至少是75％，更佳至少90％，最佳至少99％(重量)。可通过从天然来源抽提；通过编码犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质的重组核酸的表达；或通过化学合成蛋白质，获得足够纯的犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质。可用任何合适的方法，如柱层析(例如，使用对犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质特异性的抗体进行免疫亲和层析)，聚丙烯酰胺凝胶电泳，或HPLC分析测定纯度。当蛋白质与其天然状态时伴随的至少某些污染物相分离时，它是基本无天然伴随成分的。化学合成的、或在不同于天然起源细胞的细胞系统中产生的蛋白质，从定义上讲，是基本没有其天然伴随成分的。因此，足够纯的蛋白质包括在大肠杆菌、其它原核生物中或其它该蛋白质天然不存在的生物体中合成的真核蛋白质。
除了基本上全长的蛋白质外，本发明还包括犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6)的片段(如抗原性片段)。本文所用的“片段”用于多肽时，一般是长度至少10个残基，更常至少20个残基，和优选至少30个(如50个)残基，但小于全长的完整序列。可用本领域技术人员已知的方法产生犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质的片段，例如通过酶促消化天然存在的或重组的犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质，通过使用编码犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质的确定片段的表达载体的重组DNA技术，或通过化学合成。可用本文所述的方法评价候选片段显示犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质特性(如与犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质特异性抗体结合)的能力。可用纯化的犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质或犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质的抗原性片段来产生新的抗体，或测试已存在的抗体(如在诊断试验中作为阳性对照)，使用本领域技术人员已知的标准方法。本发明包括用犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质或犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质的片段作为免疫原在例如兔中，产生多克隆抗血清。可使用本领域技术人员已知的产生单克隆和多克隆抗体的标准方法。可筛选该方法产生的单克隆抗体识别重组犬埃里希体cDNA克隆，和将它们和已知cDNA克隆相鉴别的能力。
本发明还包括犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质的片段，它是由至少一部分SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5(如可变mRNA剪接或可变蛋白质加工的产物，或其中序列的一个节段已缺失的)所编码的。可将该片段或完整的犬埃里希体28-kDa免疫反应性蛋白质与另一多肽如(如作为标记、配体的多肽或能提高免疫原性的蛋白)共价连接。
词组“药物学上可接受的”指当给予人时，不会产生过敏或类似不良反应的分子或组合物。含有作为活性成分的蛋白质的水性组合物的制剂是本领域熟知的。通常，将这些组合物制备成可注射的溶液或悬液；还可制备成可在注射前适于溶解或悬浮于液体中的固态形式。也可乳化该制备物。
可将蛋白以中性或盐形式配制在组合物中。药物学上可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)，并和无机酸，如盐酸或磷酸，或乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等有机酸形成的盐。还可与无机碱，如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，和有机碱，如异丙基胺、三甲基胺、组氨酸、普鲁卡因等衍生的游离羧基形成盐。
配制后，以与剂量配方相容的方式，和治疗有效量给予这些溶液。易以各种剂型，如可注射溶液给予这些制剂。
对于水溶液肠胃外给药，如需要可将该溶液制成适当的缓冲液，首先用足够的盐水或葡萄糖将稀释液变成等渗。这些具体水溶液特别适合静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。就此而言，本领域技术人员，根据本文公开内容将了解可使用的无菌水相介质。例如，可将一剂量溶于1毫升等渗NaCl溶液中，加到1000毫升皮下灌注液中或注射到预定输液位点(见例如“Remington药物科学”15版，1035-1038页和1570-1580)。根据待治疗个体的情况，必须对剂量作某些改动。负责给药的人员将在任何情况下确定该个体的合适剂量。
如本领域熟知的，某给定多肽的免疫原性可能变化。因此，常必须将免疫原(如本发明的多肽)与一载体偶联。示范性和优选的载体包括匙孔血蓝蛋白(KLH)和人血清白蛋白。其它载体可包括各种淋巴因子和佐剂，如IL2、IL4、IL8等。
偶联多肽与载体蛋白质的方法是本领域熟知的，包括戊二醛、m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和双-二氮杂二氨基联苯。还可理解的是，该肽可与一蛋白质通过本领域熟知的基因工程技术偶联。
如本领域还熟知的，可使用非特异性的免疫应答刺激剂(称为佐剂)来增强对具体免疫原的免疫原性。示范性和优选的佐剂包括完整的BCG、Detox(RIBI，Imminochem Research Inc.)ISCOMS和氢氧化铝佐剂(Superphos，Biosector)。
本文所用的术语“互补序列”是指能和第一核酸序列杂交，在严谨条件下形成双链分子的核酸链。严谨条件是使两条高度同源的核酸序列杂交，但排除随机序列杂交的条件。例如，低温和/或高离子强度的杂交被称为低严谨度，而高温和/或低离子强度的杂交称为高严谨度。可理解可将所需严谨度的温度和离子强度应用于特定长度探针，序列的长度和碱基成分和杂交混合物中甲酰胺的存在。
本文所用的术语“工程改造的”或“重组的”细胞将指在其中已引入重组基因如编码恰菲埃里希体抗原的基因的细胞。因此，工程改造的细胞与不含重组引入的基因的天然细胞不同。因此，工程改造的细胞是具有通过人工引入的一个或多个基因的细胞。重组引入的基因可以是cDNA基因或基因组基因拷贝的形式，或可包括位于启动子毗邻，但天然不伴随所引入基因的基因。另外，可将该重组基因整合入宿主基因组，或可将其包含于载体、或细菌基因组中，转染入宿主细胞。
给出下列例子，用于说明本发明的各种实施例，而不意味以任何方式限制本发明。
实施例1
埃里希体和纯化
Dr.Edward B.Breitschwerdt(College of Veterinary Medicine，NorthCalorina State University，Raleigh，NC)提供了犬埃里希体(Florida株和分离物Demon、DJ、Jake和Fuzzy)。Dr.Richard.Corstvet(School ofVeterinary Medicine，Louisiana State University，Baton Rouge，LA)提供了犬埃里希体(Louisiana株)，Dr.Jacqueline Dawson(Centers of DiseaseControl and Prevention，Atlanta，GA)提供了犬埃里希体(Oklahoma菌株)。用补充有10％小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的DMEM，37℃在DH82细胞中繁殖埃里希体。用一般细胞染色方法，通过存在埃里希体桑椹胚，监测其在DH82细胞中的细胞内生长。当100％细胞受埃里希体感染时，收集细胞，17,000xg离心20分钟沉淀细胞。用Braun-Sonic 2000超声发生器以40W，在冰上粉碎细胞沉淀30秒2次。如上所述，纯化埃里希体(Weiss等人，1975)。将细胞裂解液加到42％-36％-30％肾造影剂(renografin)的不连续梯度上，然后80,000xg离心1小时。收集含埃里希体的重带和轻带，并用蔗糖-磷酸-谷氨酰胺缓冲液(SPG，218mM蔗糖、3.8mM KH2PO4、7.2mM K2HPO4、4.9mM谷氨酰胺，pH7.0)洗涤，离心沉淀。
实施例2
制备核酸
将肾造影剂-纯化的埃里希体重悬在含有1％十二烷基硫酸钠(SDS，w/v)和100ng/ml蛋白酶的600μl 10mMTris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，来制备犬埃里希体基因组DNA，如上所述(McBride等人，1996)。56℃培养此混合物1小时，然后用苯酚/氯仿/异戊醇(24∶24∶1)混合物提取核酸2次。用无水乙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗1次，干燥，重悬在10mM Tris(pH7.5)中。用高纯度质粒分离试剂盒(Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，IN)纯化了质粒DNA，并用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN Inc.，Santa Clarita，CA)纯化了PCR产物。
实施例3
犬埃里希体28-kDa蛋白质基因的PCR扩增
根据从恰菲埃里希体p28和反刍类考德里氏体map-1基因的Jotun-Hein法排列对比产生的共有序列中观察到的同源性(＞90％)，选择了用于PCR扩增的犬埃里希体ECa28-1基因的区域。正向引物793(5’-GCAGGAGCTGTTGGTTACTC-3’)(SEQ ID NO：16)和反向引物1330(5’-CCTTCCTCCAAGTTCTATGCC-3’)(SEQ ID NO：17)相应于反刍类考德里氏体MAP-1的核苷酸313-332和823-843以及恰菲埃里希体P28的核苷酸307-326和834-814。用引物793和1330，以95℃2分钟热循环，经30轮，95℃30秒，62℃1分钟，72℃2分钟，然后72℃延伸10分钟，4℃保持，来扩增犬埃里希体(一种North Carolina分离物，Jake)的DNA。在1％琼脂糖凝胶上分析PCR产物。直接用引物793和1330对扩增的PCR产物测序。
将ECa28SA2基因特异性的引物，命名为46f(5’-ATATACTTCCTACCTAATGTCTCA-3’，SEQ ID NO：18)和引物1330(SEQ ID NO：17)用来扩增靶向区域。凝胶纯化扩增的产物，并克隆入TA克隆载体中(Invitrogen，Santa Clarita，CA)。用引物：与该载体反向的M13，46f，Eca28SA2(5’-AGTGCAGAGTCTTCGGTTTC-3’，SEQ ID NO：19)、ECa5.3(5’-GTTACTTGCGGAGGACAT-3’，SEQ ID NO：20)，进行该克隆的双向测序。以95℃2分钟热循环，经30轮，95℃30秒，48℃1分钟，72℃1分钟，然后72℃延伸10分钟，4℃保持，来扩增DNA。
实施例4
测定ECa28-1基因未知5’和3’区域的序列
按制造商提供的方法用Universal GenomeWalker试剂盒(CLONTECH，PlaoAlto，CA)测定ECa28-1的全长序列。用五种限制性内切酶(DraI、EcoRV、PvuII、ScaI、StuI)完全消化基因组犬埃里希体(Jake分离物)的DNA，产生平端DNA。使试剂盒中提供的衔接子(AP1)连接犬埃里希体DNA的各端。以基因组文库为模板，用互补于ECa28-1序列已知部分的引物和对衔接子AP1特异性的引物，作PCR发现ECa28-1基因的未知DNA序列。由衍生PCR扩增的ECa28-1(用引物793(SEQ ID NO：16)和1330(SEQ ID NO：17))的已知DNA序列设计了用于基因组漫步(walk)的ECa28-1特异性引物。引物394(5’-GCATTTCCACAGGATCATAGGTAA-3’；核苷酸687-710；SEQ ID NO：21)和394C(5’-TTACCTATGATCCTGTGGAAATGC-3’；核苷酸710-687，SEQ ID NO：22)与提供的引物AP1一起用于PCR扩增ECa28-1基因的未知的5’和3’区域。用引物793C(5’-GAGTAACCAACAGCTCCTGC-3’，SEQ ID NO：23)单向测定了对应于引物PCR394C和AP1(2000-bp)所扩增的ECa28-1基因5’区域的PCR产物的序列。用相同的引物双向测定了对应于ECa28-1基因3’区域的PCR产物(用引物394和AP1(580-bp)扩增的)的序列。测定5’和3’结构域上毗邻于开放读框的非编码区域的序列，并且设计了互补于这些区域的引物EC28OM-F(5’-TCTACTTTGCACTTCCACTATTGT-3’，SEQ ID NO：24)和EC28OM-R(5’-ATTCTTTTGCCACTATTTTTCTTT-3’，SEQ ID NO：25)，以扩增整个ECa28-1基因。
实施例5
犬埃里希体分离物的测序
用ABI Prism377 DNA测序仪(Perkin-Elmer Applied Biosystems，FosterCity，CA)对DNA测序。用引物EC28OM-F(SEQ ID NO：24)和EC28OM-R(SEQID NO：25)，以95℃5分钟热循环，经30轮，95℃30秒，62℃1分钟，72℃2分钟，然后72℃延伸10分钟，PCR扩增了7种犬埃里希体分离物(North Carolina四种，Oklahoma、Florida和Louisiana各一种)的整个ECa28-1基因。用相同的引物对得到的PCR产物双向测序。
实施例6
犬埃里希体ECa28-1的克隆和表达
用引物EC28OM-F和EC28OM-R对整个犬埃里希体ECa28-1基因进行PCR扩增，并克隆入pCR2.1-TOPO TA克隆载体，以得到所需的一组限制性内切酶位点(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用BstX1从pCR2.1-TOPO中切下插入物，并连接入pcDNA3.1真核细胞表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，命名为pcDNA3.1/EC28，进行后续研究。扩增pcDNA3.1/EC28质粒，用KpnI-XbaI双消化切割此基因，直接连接入pThioHis原核细胞表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。该克隆(命名为pThioHis/EC28)在大肠杆菌BL21中产生重组硫氧还蛋白融合蛋白。离心在不溶相中粗纯的此重组融合蛋白。在天然条件下，用镍-NTA自旋柱(Qiagen，Santa Clarita，CA)，从溶解的细胞裂解液中纯化了对照硫氧还蛋白融合蛋白。
实施例7
Western免疫印迹分析
将重组犬埃里希体ECa28-1融合蛋白在4-15％Tris-HCl梯度凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)上进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并用半干转移槽(Bio-Rad，Hercules，CA)转移到纯硝化纤维(Schleicher &Schuell，Keene，NH)上。该膜与1∶5000稀释的犬埃里希体感染犬的恢复期抗血清培育1小时，洗涤，然后与1∶1000的抗犬IgG(H & L)碱性磷酸酶偶联的亲和纯化的第二抗体(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)培育1小时。用5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氮蓝四唑(BCIP/NBT)底物(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)显色观察结合的抗体。
实施例8
Southern印迹分析
为了确定犬埃里希体基因组中是否存在与ECa28-1基因同源的多种基因，用标准方法(Sambrook等人，1989)进行基因组Southern印迹分析。用各限制性内切酶BanII、EcoRV、HaeII、KpnI和SpeI(不切割ECa28-1基因)和AseI(切割ECa28-1中的核苷酸34、43和656)来完全消化犬埃里希体DNA。用引物EC28OM-F和EC28OM-R以及洋地黄毒苷(BIG)标记的脱氧核苷三磷酸(dNTPs)(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)进行PCR扩增产生探针，并用AseI消化。通过琼脂糖凝胶电泳、凝胶纯化分离出此消化的探针(566-bp)，然后用于杂交。将完全消化的基因组犬埃里希体DNA跑电泳，转移到尼龙膜(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)上，40℃按制造商方法在DIG Easy Hyb缓冲液(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)中与ECa28-1基因DIG-标记的探针杂交16小时。用抗DIG碱性磷酸酶-偶联抗体和发光底物(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)探测结合的探针，并曝光BioMax科学成像胶片(Eastman Kodak，Rochester，NY)。
实施例9
测序分析和比较
从国家生物技术信息中心(NCBI)(World Wide Web site atURL：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)获得恰菲埃里希体p28和反刍类考德里氏体map-1的DNA序列。用LASERGENE软件(DNASTAR，Inc.，Madison.WI)进行核苷酸和推导的氨基酸序列、蛋白质和系统发生分析。用McGeoch和von Heijine的信号序列识别方法用PSORT程序(McGeoch，1985；vonHeijine，1986)，进行翻译后加工的分析(World Wide Web site at URL：PRIVATEHREF＝http：//www.imcb.osaka-u.ac.jp/nakai/form.htm，MACROBUTTONHtmlResAnchor http：//www.imcb.osaka-u.ac.jp/nakai/form.htm)。
在本研究中描述的犬埃里希体ECa28-1基因的氨基酸序列和核酸序列的GenBank登录号为：Jake，AF082744；Louisiana，AF082745；Oklahoma，AF082746；Demon，AF082747；DJ，AF082748；Fuzzy，AF082749；FLorida，AF082750。
用为扩增全基因设计的引物进行7株不同犬埃里希体ECa28-1的序列分析。分析表明在North Carolina(四种)、Louisiana、Florida和Oklahoma的分离物中该基因的序列是保守的。
实施例10
ECa28-1的PCR扩增、克隆、测序和表达
用Jotun-Hein算法，从恰菲埃里希体p28和反刍类考德里氏体map-1的核酸序列排列对比产生了高度同源性(＞90％)区域的共有序列。靶向这些同源性区域(反刍类考德里氏体map-1的核苷酸313-332和823-843；恰菲埃里希体p28的核苷酸307-326和814-834)作为PCR扩增的引物退火部位。用引物793和1330实施犬埃里希体ECa28-1和恰菲埃里希体p28基因的PCR扩增，得到518-bp的PCR产物。直接用引物793和1330测定产物的序列，得到犬埃里希体PCR产物的核酸序列。对该序列分析表明一开放读框编码一170个氨基酸的蛋白质，将犬埃里希体PCR扩增得到的518-bp序列与恰菲埃里希体p28基因的DNA序列排列对比，表明相似性大于70％，表明这些基因是同源性的。用衔接子PCR和引物394和793C进行全基因序列的5’和3’节段的测定。引物394产生四种PCR产物(3-kb、2-kb、1-kb和0.8-kb)，用引物394和AP1对0.8-bp的产物进行双向测序。推导出的序列与518-bp产物的3’端重叠，将开放读框12-bp延伸至终止密码子。还对ECa28-1基因的3’端非表明序列的另外625-bp进行了测序。用引物394C和添加的引物AP1扩增ECa28-1基因的5’端，得到三种PCR产物(3.3-kb、3-kb和2-kb)。用引物793C对2-kb片段单向测序。该测序提供了推定的ECa28-1起始密码子，且完成了编码278个氨基酸的蛋白质的834-bp开放读框。在ECa28-1基因的5’非编码区域中产生了另外一个144-bp的可读序列。从毗邻于ECa28-1基因的互补非编码区域设计了引物EC28OM-F和EC28OM-R。
对用这些引物扩增的PCR产物直接用相同的引物进行测序。图1显示了犬埃里希体ECa28-1基因的全DNA序列(SEQ ID NO：1)。用这些引物扩增的ECa28-1PCR片段含有完整的开放读框和17个其他氨基酸(来自5’非编码引物区域)。将该基因直接亚克隆入pThioHis表达载体，用此构建物转化大肠杆菌(BL21)。表达的ECa28-1-硫氧还蛋白融合蛋白是不溶的。该表达蛋白质含有与硫氧还蛋白相结合的114个附加氨基酸，5个为肠激酶识别位点的氨基酸，和32个来自多克隆位点和N’端5’非编码引物区域的氨基酸。受犬埃里希体感染的狗的恢复期抗血清识别了该表达的重组融合蛋白，但不与硫氧还蛋白对照反应(图2)。
实施例11
序列同源性
用Clustal方法对比了含有信号序列(ECa28-1、omp-1A、B、C、D、E和F)的恰菲埃里希体omp-1家族的基因和ECa28-1(834-bp)的核酸序列，以检验这些基因间的同源性(没有显示排列对比)。ECa28-1和恰菲埃里希体p28和omp-1F之间的核酸同源性同等保守(68.9％)。恰菲埃里希体omp-1家族中的其他推定的外膜蛋白质基因也与ECa28-1是同源性的，omp-1D(68.2％)、omp-1E(66.7％)、omp-1C(64.1％)、反刍类考德里氏体map-1(61.8％)、犬埃里希体28-kDa蛋白质1基因(60％)和28-kDa蛋白质2基因(部分)(59.5％)。恰菲埃里希体omp-1B与ECa28-1的核酸同源性最小(45.1％)。
ECa28-1(SEQ ID NO：2)与恰菲埃里希体预计的氨基酸序列的对比表明氨基酸取代导致产生四个可变区(VR)。鉴定了氨基酸序列的取代或缺失以及ECa28-1和恰菲埃里希体OMP-1家族的可变区的位置(图3)。包括信号肽的氨基酸比较表明ECa28-1具有与恰菲埃里希体OMP-1家族的OMP-1F最大的同源性(68％)，随后是恰菲埃里希体P28(65.5％)、OMP-1E(65.1％)、OMP-1D(62.9％)、OMP-1C(62.9％)、反刍类考德里氏体MAP-1(59.4)、犬埃里希体28-kDa蛋白质1(55.6％)和28-kDa蛋白质2(部分)(53.6％)以及OMP-1B(43.2％)。基于氨基酸序列的系统发生关系表明ECa28-1和反刍类考德里氏体MAP-1、恰菲埃里希体OMP-1蛋白质和犬埃里希体28-kDa蛋白质1和2(部分)是相关的(图4)。
实施例12
预计的表面可能性和免疫反应性
用亲水性和亲水性分布图分析犬埃里希体ECa28-1，预测了ECa28-1上表面暴露区域(图6)。在ECa28-1上鉴定到由3-9个氨基酸组成的8个主要外露区域，它们与恰菲埃里希体P28上外露区域的分布相似(图6)。ECa28-1上较大的5个外露区域位于该蛋白质的N-端区域。在ECa28-1的所有4个可变区中都发现外露亲水性区域。用Rothbard-Taylor算法(Rothbard和Taylor，1988)预测了ECa28-1中的10个T-细胞基序，并由Jameson-Wolf抗原性算法预测了ECa28-1的高抗原性(图6)(Jameson和Wolf，1988)。在ECa28-1和恰菲埃里希体P28之间观察到抗原性和T-细胞基序的相似性。
实施例13
检测ECa28-1基因的同源性基因组拷贝
用限制性内切酶BanII、EcorV、HaeII、KpnI、SpeI(它们在ECa28-1基于中无限制性内切酶位点)和AseI(在核苷酸34、43和656上有内在的限制性内切酶位点)各自完全消化犬埃里希体DNA作基因组Southern印迹分析表明存在至少三种同源性ECa28-1基因拷贝(图5)。虽然ECa28-1含有内在AseI内在限制性内切酶位点，用于杂交实验的DIG-标记探针靶向由AseI消化该基因产生的一个DNA片段中的基因区域。用AseI消化产生了三个与ECa28-1DNA探针杂交的条带(约566-bp、850-bp和3-kb)表明在该基因组中存在与ECa28-1同源的多个基因。用EcoRV和SpeI消化产生了两个与ECa28-1基因探针杂交的条带。
实施例14
鉴定28-kDa蛋白质基因座
用相应于ECa28SA3中诸区域的特异性引物，命名为ECaSA3-2(5’-CTAGGATTAGGTTATAGTATAAGTT-3’，SEQ ID NO：26)，和与ECa28-1一区域退火的引物793C(SEQ ID NO：23)，来扩增基因SA3和ECa28-1之间的基因间区。用相同的引物对800-bp产物测序。用95℃2分钟热循环，经30轮，95℃30秒，50℃1分钟，72℃1分钟，然后72℃延伸10分钟，4℃保持，来扩增DNA。
实施例15
PCR扩增28-kDa蛋白质基因和鉴定多基因基因座
为了特异性扩增ECa28SA2下游可能未知的基因，用对ECa28SA2特异性的引物46f和靶向ECa28-1基因3’端保守区域的引物1330来扩增。用这些含有2个开放读框的引物来扩增了2-kb PCR产物。第一个开放读框含有基因的已知区域ECaSA2和该基因上述未测序的3’部分。在ECsSA2的下游发现一未鉴定的但同源性的28-kDa蛋白质基因，命名为ECa28SA3。用对ECa28SA3基因3’端特异性的引物SA3-2，结合在ECa28-1的5’端退火的反向引物793C一起扩增，将此两个已知的基因座连接。扩增了一800-bpPCR产物，其含有ECa28SA3的3’端、ECa28SA3和ECa28-1(28NC3)之间的基因间区，和ECa28-1的5’端，连接上述分开的基因座(图8)。ECa28SA2的849-bp开放读框编码283个氨基酸的蛋白质，且ECa28SA3含有编码280个氨基酸蛋白质的840-bp开放读框。ECa28SA3和ECa28-1之间的基因间非编码区域的长度为345-bp(图7和8)。
实施例16
核酸和氨基酸的同源性
用Clustal方法对比了5种犬埃里希体28-kDa蛋白质基因的核酸和氨基酸序列，以检验这些基因之间的同源性。核酸的同源性范围为58-75％，且在犬埃里希体28-kDa蛋白质基因成员中观察到类似的氨基酸同源性范围为67-72％(图9)。
实施例17
转录启动子区域
通过与大肠杆菌启动子区域和恰菲埃里希体启动子的共有序列比较，分析了28-kDa蛋白质基因之间基因间区的启动子序列(Yu等人，1997；McClure.1985)。
在4种相应于基因ECa28SA2、ECa28SA3、ECa28-1和ECa28-2的基因间序列中鉴定到含有RBS、-10和-35区域的推定启动子序列(图10)。ECa28SA1的上游非编码区域是未知的，没有作分析。
实施例18
N-端信号序列
氨基酸序列分析表明全犬埃里希体ECa28-1的推导分子量为30.5-kDa，全Eca28SA3的推导分子量为30.7-kDa。这两种蛋白质都含有预计的23个氨基酸的N-端信号肽(MNCKKILITTALMSLMYYAPSIS，SEQ ID NO：27)，这与预计的恰菲埃里希体P28(MNYKKILITSALISLISSLPGVSFS，SEQ ID NO：28)和OMP-1蛋白质家族相类似(Yu等人，1998；Ohashi等人，1998b)。发现信号肽酶(SIS；Ser-X-Ser)(Oliver，1985)优选的切割位点在ECa28-1的氨基酸21、22和23。还存在与恰菲埃里希体P28(SFS)预计切割位点相同的另一个推定的切割位点在氨基酸位置25(MNCKKILITTALISLMYSIPSISSFS，SEQ ID NO：29)，这导致产生预计分子量为27.7-kDa的成熟ECa28-1。预计ECa28SA2上述报道的部分序列的信号切割位点在氨基酸30。但信号序列分析预测ECa28SA1含有一不能切割的信号序列。
小结
已鉴定了分子量类似的蛋白质，并从多种立克次氏体(包括犬埃里希体、恰菲埃里希体和反刍类考德里氏体)克隆到(Reddy等人，1998；Jongejan等人，1993；Ohashi等人，1998)。先前已描述了在含有6种同源性p28基因的恰菲埃里希体中的单个基因座和犬埃里希体中的两个基因座(各含有若干同源性28-kDa蛋白质基因)。
本发明示范了编码犬埃里希体成熟28-kDa蛋白质的基因的克隆、表达和特性，这些基因与恰菲埃里希体的omp-1多基因家族和反刍类考德里氏体map-1基因同源。鉴定了两种新型28-kDa蛋白质基因，ECa28-1和ECa28SA3。另一种已部分测序过的(Reddy等人，1998)的犬埃里希体28-kDa蛋白质基因，ECa28SA2，本发明对其进行了完整测序。本发明还公开了含有5种犬埃里希体28-kDa蛋白质基因的犬埃里希体的单个基因座的鉴定和特性。
犬埃里希体28-kDa蛋白质与恰菲埃里希体OMP-1家族和反刍类考德里氏体MAP-1蛋白质同源。最大同源性的犬埃里希体28-kDa蛋白质(ECa28SA3、ECa28-1和ECa28-2)在该基因座中依次排列。这些蛋白质的同源性范围为67.5％到72.3％。这些28-kDa蛋白质的差异为27.35％到38.6％。犬埃里希体28-kDa蛋白质ECa28SA1和ECa28SA2的同源性最小，同源性范围为50.9％到59.4％，差异为53.3％到69.9％。基因之间的差异主要在于四个超变区，并表明这些区域是表面外露的，且受免疫系统的选择性压力。已报道了7种犬埃里希体分离物中ECa28-1的保守性(McBride等人，1999)，表明犬埃里希体在北美可能是纯系的。相反，还有关于恰菲埃里希体分离物中p28显著多样性的报道(Yu等人，1998)。
所有犬埃里希体28-kDa蛋白质看来是由30-kD蛋白质翻译后加工成为成熟的28-kD蛋白质的。最近，在恰菲埃里希体P28中鉴定到一信号序列(Yu等人，1998)，N-端氨基酸测序证明该蛋白质是经翻译后加工导致切去信号序列而产生成熟蛋白质(Ohashi等人，1998)。还提出OMP-1F和OMP-1E的前导序列为前导信号肽(Ohashi等人，1998)。恰菲埃里希体OMP-1F、OMP-1E和P28上鉴定到的信号序列与犬埃里希体28-kDa蛋白质的前导序列是同源的。实验研究没有确定p28基因的启动子序列，但通过与大肠杆菌和其他埃里希体的RBS、-10和-35启动子区域的共有序列作比较，鉴定到假定的启动子区域(Yu等人，1997；McClure，1985)。这些启动子序列使各基因潜在地被转录和翻译，表明这些基因可能在宿主中差异性表达。犬对感染的耐性可能与p28基因的易变性表达相关，这些多样性表达导致体内抗原性变化，从而使微生物逃脱免疫应答。
发现犬埃里希体28-kDa蛋白质基因表现出与恰菲埃里希体omp-1基因家族和反刍类考德里氏体map-1基因的核酸和氨基酸序列同源。上述研究鉴定到一种能与恢复期抗恰菲埃里希体的抗血清起反应的犬埃里希体30-kDa蛋白质，但认为抗原性上不同(Rikihisa等人，1994)。基于犬埃里希体28-kDa蛋白质四个可变区中氨基酸取代基比较的发现支持这种可能性。综合这些发现还表明造成犬埃里希体和恰菲埃里希体P28之间抗原性差异的氨基酸位于这些可变区中，且易接触免疫系统。有报道说免疫反应性肽位于反刍类考德里氏体、恰菲埃里希体和犬埃里希体的28-kDa蛋白质的可变区中(Reddy等人，1998)。对犬埃里希体和恰菲埃里希体P28的分析表明所有这些可变区都含有预计的外露氨基酸。对犬的研究证明犬埃里希体和恰菲埃里希体之间缺乏交叉保护(Dawson和Ewing，1992)。这一观察可能与P28可变区中以及这些埃里希体品种的其他免疫性重要抗原中的抗原性差异相关。另一研究发现恰菲埃里希体感染的患者恢复期的人抗血清识别了恰菲埃里希体29/28-kDa蛋白质，且与犬埃里希体的同源蛋白质起反应(Chen等人，1997)。犬埃里希体28-kDa蛋白质和恰菲埃里希体P28上的同源和交叉反应表位看来能为免疫系统所识别。
犬埃里希体28-kDa蛋白质可能是重要的免疫保护性抗原。一些报道已证明犬埃里希体30-kDa抗原表现出强免疫反应性(Rikihisa等人，1994；Rikihisa等人，1992)。人和犬恢复期抗血清中的抗体与恰菲埃里希体和犬埃里希体这种大小范围的蛋白质所起的反应相一致，表明它们可能是重要的免疫保护性抗原(Rikihisa等人，1994；Chen等人，1994；Chen等人，1997)。另外，在对犬埃里希体免疫应答的早期产生了对30、24和21-kDa蛋白质的抗体(Rikihison等人1994，1992)，表明这些蛋白质在疾病急性期的免疫应答中尤其重要。最近，在恰菲埃里希体中鉴定到编码28-kDa分子量外膜蛋白质的一同源基因家族，且用重组恰菲埃里希体P28免疫接种的小鼠表现出产生了抗同源攻击的免疫力(Ohashi等人，1998)。已证明在外膜中存在着恰菲埃里希体的P28，且免疫电镜将P28定位于该微生物的表面，从而表明其可能起粘附素作用(Ohashi等人，1998)。本研究中鉴定的犬埃里希体的28-kDa蛋白质可能处于相同的位置且可能起做着类似的功能。
比较了犬埃里希体不同菌株的ECa28-1，表明该基因明显完全保守。包括恰菲埃里希体的研究证明了ECa28-1差异的免疫学和分子证据。受恰菲埃里希体感染的患者对29/28-kDa蛋白质具有可变的免疫反应性，提示存在抗原性差异(Chen等人，1997)。最近已有的分子学证据支持恰菲埃里希体p28基因中的抗原性差异(Yu等人，1998)。5种恰菲埃里希体分离物的比较表明两种分离物(Sapulpa和St.Vincent)100％相同，但另三种(Arkansas、Jax和91HE17)在氨基酸水平上的差异多达13.4％。ECa28-1的保守性表明美国发现的犬埃里希体菌株遗传学上可能是相同的，所以犬埃里希体28-kDa蛋白质是一种用于美国犬埃里希病的有吸引力的候选疫苗。进一步分析美国以外的犬埃里希体分离物可以提供犬埃里希体起源和进化的信息。28-kDa蛋白质的保守性使其成为一种用于犬埃里希病可靠血清学诊断的重要候选物。
在这点上多种同源基因的作用是未知的，但犬中犬埃里希体感染的持续相信可能与因同源性28-kDa蛋白质基因的易变性表达所致的抗原性易变性相关，从而使犬埃里希体能够逃避免疫监护。边缘无形体(A.marginale)的msp-3基因的变异部分引起了MSP-3蛋白质的变异，导致持续性感染(Alleman等人，1997)。检测急性和慢性感染的犬中埃里希体28-kDa蛋白质基因表达的研究，将更深入地了解28-kDa蛋白质基因家族在感染持续性中的作用。
本文引用了下列参考文献。
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本说明书提到的任何专利或出版物表明了本发明涉及的领域中技术人员的水平。这些专利和出版物引入本文以供参考，程度相同，如同各独立出版物单独引入以供参考表明的那样。
本领域技术人员将不难理解，本发明适合于实施所述的目的和获得所述的结果和优点，以及与之相关的那样。本文描述的实施例、方法、程序、处理、分子和特定的化合物以优选例为代表，是示范性的，而不意味着限制本发明的范围。本领域技术人员对其中所作的改变和其它用途都将包括在权利要求所述的本发明的范围内。
<110>Walker，David H.
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<150>09/261,358
<151>1999-03-03
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<212>DNA
<213>犬埃里希体
<220>
<223>ECa28-1的核酸序列
<400>1
attttattta ttaccaatct tatataatat attaaatttc tcttacaaaa 50
atctctaatg ttttatacct aatatatata ttctggcttg tatctacttt 100
gcacttccac tattgttaat ttattttcac tattttaggt gtaatatgaa 150
ttgcaaaaaa attcttataa caactgcatt aatatcatta atgtactcta 200
ttccaagcat atctttttct gatactatac aagatggtaa catgggtggt 250
aacttctata ttagtggaaa gtatgtacca agtgtctcac attttggtag 300
cttctcagct aaagaagaaa gcaaatcaac tgttggagtt tttggattaa 350
aacatgattg ggatggaagt ccaatactta agaataaaca cgctgacttt 400
actgttccaa actattcgtt cagatacgag aacaatccat ttctagggtt 450
tgcaggagct atcggttact caatgggtgg cccaagaata gaattcgaaa 500
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gacgcgcaca ggtactgcgc tctatctcat cacacatcgg cagccatgga 600
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ttaatccgga aacctctgtt ttcatcggtg ggcatttcca caggatcata 850
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gtttagaact tggaggaaga tttaacttct aattttattg ttgccacata 1000
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ccaatcttat ataatatatt aaatttctct tacaaaaatc actagtattt 1250
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tacaatg 1607
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<400>2
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Met Tyr Ser Ile Pro Ser Ile Ser Phe Ser Asp Thr Ile Gln Asp
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Gly Asn Met Gly Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Val Pro
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Ser Val Ser His Phe Gly Ser Phe Ser Ala Lys Glu Glu Ser Lys
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Ser Thr Val Gly Val Phe Gly Leu Lys His Asp Trp Asp Gly Ser
65 70 75
Pro Ile Leu Lys Asn Lys His Ala Asp Phe Thr Val Pro Asn Tyr
80 85 90
Ser Phe Arg Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala
95 100 105
Ile Gly Tyr Ser Met Gly Gly Pro Arg Ile Glu Phe Glu Ile Ser
110 115 120
Tyr Glu Ala Phe Asp Val Lys Ser Pro Asn Ile Asn Tyr Gln Asn
125 130 135
Asp Ala His Arg Tyr Cys Ala Leu Ser His His Thr Ser Ala Ala
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Met Glu Ala Asp Lys Phe Val Phe Leu Lys Asn Glu Gly Leu Ile
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Asp Ile Ser Leu Ala Ile Asn Ala Cys Tyr Asp Ile Ile Asn Asp
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Leu Ile Ser Met Phe Glu Ala Thr Ser Pro Lys Ile Ser Tyr Gln
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Gly Lys Leu Gly Ile Ser Tyr Ser Ile Asn Pro Glu Thr Ser Val
215 220 225
Phe Ile Gly Gly His Phe His Arg Ile Ile Gly Asn Glu Phe Arg
230 235 240
Asp Ile Pro Ala Ile Val Pro Ser Asn Ser Thr Thr Ile Ser Gly
245 250 255
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5 10 15
Thr Ser Phe Thr His Phe Ile Pro Phe Tyr Ser Pro Ala Arg Ala
20 25 30
Ser Thr Ile His Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Met Pro Thr
35 40 45
Ala Ser His Phe Gly Ile Phe Ser Ala Lys Glu Glu Gln Ser Phe
50 55 60
Thr Lys Val Leu Val Gly Leu Asp Gln Arg Leu Ser His Asn Ile
65 70 75
Ile Asn Asn Asn Asp Thr Ala Lys Ser Leu Lys Val Gln Asn Tyr
80 85 90
Ser Phe Lys Tyr Lys Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala
95 100 105
Ile Gly Tyr Ser Ile Gly Asn Ser Arg Ile Glu Leu Glu Val Ser
110 115 120
His Glu Ile Phe Asp Thr Lys Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Leu Asn
125 130 135
Asp Ser His Lys Tyr Cys Ala Leu Ser His Gly Ser His Ile Cys
140 145 150
Ser Asp Gly Asn Ser Gly Asp Trp Tyr Thr Ala Lys Thr Asp Lys
155 160 165
Phe Val Leu Leu Lys Asn Glu Gly Leu Leu Asp Val Ser Phe Met
170 175 180
Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Ile Thr Thr Glu Lys Met Pro Phe Ser
185 190 195
Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Ile Gly Thr Asp Leu Ile Ser Met Phe
200 205 210
Glu Thr Thr Gln Asn Lys Ile Ser Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Leu
215 220 225
Asn Tyr Thr Ile Asn Ser Arg Val Ser Val Phe Ala Gly Gly His
230 235 240
Phe His Lys Val Ile Gly Asn Glu Phe Lys Gly Ile Pro Thr Leu
245 250 255
Leu Pro Asp Gly Ser Asn Ile Lys Val Gln Gln Ser Ala Thr Val
260 265 270
Thr Leu Asp Val Cys His Phe Gly Leu Glu Ile Gly Ser Arg Phe
275 280 285
Phe Phe
<210>9
<211>281
<212>PRT
<213>恰菲埃里希体
<220>
<223>恰菲埃里希体P28的氨基酸序列
<400>9
Met Asn Tyr Lys Lys Val Phe Ile Thr Ser Ala Leu Ile Ser Leu
5 10 15
Ile Ser Ser Leu Pro Gly Val Ser Phe Ser Asp Pro Ala Gly Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Met Pro Ser
35 40 45
Ala Ser His Phe Gly Val Phe Ser Ala Lys Glu Glu Arg Asn Thr
50 55 60
Thr Val Gly Val Phe Gly Leu Lys Gln Asn Trp Asp Gly Ser Ala
65 70 75
Ile Ser Asn Ser Ser Pro Asn Asp Val Phe Thr Val Ser Asn Tyr
80 85 90
Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala
95 100 105
Ile Gly Tyr Ser Met Asp Gly Pro Arg Ile Glu Leu Glu Val Ser
110 115 120
Tyr Glu Thr Phe Asp Val Lys Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Lys Asn
125 130 135
Glu Ala His Arg Tyr Cys Ala Leu Ser His Asn Ser Ala Ala Asp
140 145 150
Met Ser Ser Ala Ser Asn Asn Phe Val Phe Leu Lys Asn Glu Gly
155 160 165
Leu Leu Asp Ile Ser Phe Met Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Val Val
170 175 180
Gly Glu Gly Ile Pro Phe Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Ile Gly
185 190 195
Thr Asp Leu Val Ser Met Phe Glu Ala Thr Asn Pro Lys Ile Ser
200 205 2I0
Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Leu Ser Tyr Ser Ile Ser Pro Glu Ala
215 220 225
Ser Val Phe Ile Gly Gly His Phe His Lys Val Ile Gly Asn Glu
230 235 240
Phe Arg Asp Ile Pro Thr Ile Ile Pro Thr Gly Ser Thr Leu Ala
245 250 255
Gly Lys Gly Asn Tyr Pro Ala Ile Val Ile Leu Asp Val Cys His
260 265 270
Phe Gly Ile Glu Leu Gly Gly Arg Phe Ala Phe
275 280
<210>10
<211>283
<212>PRT
<213>恰菲埃里希体
<220>
<223>恰菲埃里希体OMP-1B的氨基酸序列
<400>10
Met Asn Tyr Lys Lys Ile Phe Val Ser Ser Ala Leu Ile Ser Leu
5 10 15
Met Ser Ile Leu Pro Tyr Gln Ser Phe Ala Asp Pro Val Thr Ser
20 25 30
Asn Asp Thr Gly Ile Asn Asp Ser Arg Glu Gly Phe Tyr Ile Ser
35 40 45
Val Lys Tyr Asn Pro Ser Ile Ser His Phe Arg Lys Phe Ser Ala
50 55 60
Glu Glu Ala Pro Ile Asn Gly Asn Thr Ser Ile Thr Lys Lys Val
65 70 75
Phe Gly Leu Lys Lys Asp Gly Asp Ile Ala Gln Ser Ala Asn Phe
80 85 90
Asn Arg Thr Asp Pro Ala Leu Glu Phe Gln Asn Asn Leu Ile Ser
95 100 105
Gly Phe Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Met Asp Gly Pro Arg Ile
110 115 120
Glu Leu Glu Ala Ala Tyr Gln Lys Phe Asp Ala Lys Asn Pro Asp
125 130 135
Asn Asn Asp Thr Asn Ser Gly Asp Tyr Tyr Lys Tyr Phe Gly Leu
140 145 150
Ser Arg Glu Asp Ala Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Val Val Leu Lys
155 160 165
Asn Glu Gly Ile Thr Phe Met Ser Leu Met Val Asn Thr Cys Tyr
170 175 180
Asp Ile Thr Ala Glu Gly Val Pro Phe Ile Pro Tyr Ala Cys Ala
185 190 195
Gly Val Gly Ala Asp Leu Ile Asn Val Phe Lys Asp Phe Asn Leu
200 205 210
Lys Phe Ser Tyr Gln Gly Lys Ile Gly Ile Ser Tyr Pro Ile Thr
215 220 225
Pro Glu Val Ser Ala Phe Ile Gly Gly Tyr Tyr His Gly Val Ile
230 235 240
Gly Asn Asn Phe Asn Lys Ile Pro Val Ile Thr Pro Val Val Leu
245 250 255
Glu Gly Ala Pro Gln Thr Thr Ser Ala Leu Val Thr Ile Asp Thr
260 265 270
Gly Tyr Phe Gly Gly Glu Val Gly Val Arg Phe Thr Phe
275 280
<210>11
<211>280
<212>PRT
<213>恰菲埃里希体
<220>
<223>恰菲埃里希体OMP-1C的氨基酸序列
<400>11
Met Asn Cys Lys Lys Phe Phe Ile Thr Thr Ala Leu Ala Leu Pro
5 10 15
Met Ser Phe Leu Pro Gly Ile Leu Leu Ser Glu Pro Val Gln Asp
20 25 30
Asp Ser Val Ser Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Met Pro
35 40 45
Ser Ala Ser His Phe Gly Val Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Asn
50 55 60
Pro Thr Val Ala Leu Tyr Gly Leu Lys Gln Asp Trp Asn Gly Val
65 70 75
Ser Ala Ser Ser His Ala Asp Ala Asp Phe Asn Asn Lys Gly Tyr
80 85 90
Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala
95 100 105
Ile Gly Tyr Ser Met Gly Gly Pro Arg Ile Glu Phe Glu Val Ser
110 115 120
Tyr Glu Thr Phe Asp Val Lys Asn Gln Gly Gly Asn Tyr Lys Asn
125 130 135
Asp Ala His Arg Tyr Cys Ala Leu Asp Arg Lys Ala Ser Ser Thr
140 145 150
Asn Ala Thr Ala Ser His Tyr Val Leu Leu Lys Asn Glu Gly Leu
155 160 165
Leu Asp Ile Ser Leu Met Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Val Val Ser
170 175 180
Glu Gly Ile Pro Phe Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Val Gly Thr
185 190 195
Asp Leu Ile Ser Met Phe Glu Ala Ile Asn Pro Lys Ile Ser Tyr
200 205 210
Gln Gly Lys Leu Gly Leu Ser Tyr Ser Ile Asn Pro Glu Ala Ser
215 220 225
Val Phe Val Gly Gly His Phe His Lys Val Ala Gly Asn Glu Phe
230 235 240
Arg Asp Ile Ser Thr Leu Lys Ala Phe Ala Thr Pro Ser Ser Ala
245 250 255
Ala Thr Pro Asp Leu Ala Thr Val Thr Leu Ser Val Cys His Phe
260 265 270
Gly Val Glu Leu Gly Gly Arg Phe Asn Phe
275 280
<210>12
<211>286
<212>PRT
<213>恰菲埃里希体
<220>
<223>恰菲埃里希体OMP-1D的氨基酸序列
<400>12
Met Asn Cys Glu Lys Phe Phe Ile Thr Thr Ala Leu Thr Leu Leu
5 10 15
Met Ser Phe Leu Pro Gly Ile Ser Leu Ser Asp Pro Val Gln Asp
20 25 30
Asp Asn Ile Ser Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Met Pro
35 40 45
Ser Ala Ser His Phe Gly Val Phe Ser Ala Lys Glu Glu Arg Asn
50 55 60
Thr Thr Val Gly Val Phe Gly Ile Glu Gln Asp Trp Asp Arg Cys
65 70 75
Val Ile Ser Arg Thr Thr Leu Ser Asp Ile Phe Thr Val Pro Asn
80 85 90
Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Leu Phe Ser Gly Phe Ala Gly
95 100 105
Ala Ile Gly Tyr Ser Met Asp Gly Pro Arg Ile Glu Leu Glu Val
110 115 120
Ser Tyr Glu Ala Phe Asp Val Lys Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Lys
125 130 135
Asn Glu Ala His Arg Tyr Tyr Ala Leu Ser His Leu Leu Gly Thr
140 145 150
Glu Thr Gln Ile Asp Gly Ala Gly Ser Ala Ser Val Phe Leu Ile
155 160 165
Asn Glu Gly Leu Leu Asp Lys Ser Phe Met Leu Asn Ala Cys Tyr
170 175 180
Asp Val Ile Ser Glu Gly Ile Pro Phe Ser Pro Tyr Ile Cys Ala
185 190 195
Gly Ile Gly Ile Asp Leu Val Ser Met Phe Glu Ala Ile Asn Pro
200 205 210
Lys Ile Ser Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Leu Ser Tyr Pro Ile Ser
215 220 225
Pro Glu Ala Ser Val Phe Ile Gly Gly His Phe His Lys Val Ile
230 235 240
Gly Asn Glu Phe Arg Asp Ile Pro Thr Met Ile Pro Ser Glu Ser
245 250 255
Ala Leu Ala Gly Lys Gly Asn Tyr Pro Ala Ile Val Thr Leu Asp
260 265 270
Val Phe Tyr Phe Gly Ile Glu Leu Gly Gly Arg Phe Asn Phe Gln
275 280 285
Leu
<210>13
<211>278
<212>PRT
<213>恰菲埃里希体
<220>
<223>恰菲埃里希体OMP-1E的氨基酸序列
<400>13
Met Asn Cys Lys Lys Phe Phe Ile Thr Thr Ala Leu Val Ser Leu
5 10 15
Met Ser Phe Leu Pro Gly Ile Ser Phe Ser Asp Pro Val Gln Gly
20 25 30
Asp Asn Ile Ser Gly Asn Phe Tyr Val Ser Gly Lys Tyr Met Pro
35 40 45
Ser Ala Ser His Phe Gly Met Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Asn
50 55 60
Pro Thr Val Ala Leu Tyr Gly Leu Lys Gln Asp Trp Glu Gly Ile
65 70 75
Ser Ser Ser Ser His Asn Asp Asn His Phe Asn Asn Lys Gly Tyr
80 85 90
Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala
95 100 105
Ile Gly Tyr Ser Met Gly Gly Pro Arg Val Glu Phe Glu Val Ser
110 115 120
Tyr Glu Thr Phe Asp Val Lys Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Lys Asn
125 130 135
Asp Ala His Arg Tyr Cys Ala Leu Gly Gln Gln Asp Asn Ser Gly
140 145 150
Ile Pro Lys Thr Ser Lys Tyr Val Leu Leu Lys Ser Glu Gly Leu
155 160 165
Leu Asp Ile Ser Phe Met Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Ile Ile Asn
170 175 180
Glu Ser Ile Pro Leu Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Val Gly Thr
185 190 195
Asp Leu Ile Ser Met Phe Glu Ala Thr Asn Pro Lys Ile Ser Tyr
200 205 210
Gln Gly Lys Leu Gly Leu Ser Tyr Ser Ile Asn Pro Glu Ala Ser
215 220 225
Val Phe Ile Gly Gly His Phe His Lys Val Ile Gly Asn Glu Phe
230 235 240
Arg Asp Ile Pro Thr Leu Lys Ala Phe Val Thr Ser Ser Ala Thr
245 250 255
Pro Asp Leu Ala Ile Val Thr Leu Ser Val Cys His Phe Gly Ile
260 265 270
Glu Leu Gly Gly Arg Phe Asn Phe
275
<210>14
<211>280
<212>PRT
<213>恰菲埃里希体
<220>
<223>恰菲埃里希体OMP-1F的氨基酸序列
<400>14
Met Asn Cys Lys Lys Phe Phe Ile Thr Thr Thr Leu Val Ser Leu
5 10 15
Met Ser Phe Leu Pro Gly Ile Ser Phe Ser Asp Ala Val Gln Asn
20 25 30
Asp Asn Val Gly Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Val Pro
35 40 45
Ser Val Ser His Phe Gly Val Phe Ser Ala Lys Gln Glu Arg Asn
50 55 60
Thr Thr Thr Gly Val Phe Gly Leu Lys Gln Asp Trp Asp Gly Ser
65 70 75
Thr Ile Ser Lys Asn Ser Pro Glu Asn Thr Phe Asn Val Pro Asn
80 85 90
Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly
95 100 105
Ala Val Gly Tyr Leu Met Asn Gly Pro Arg Ile Glu Leu Glu Met
110 115 120
Ser Tyr Glu Thr Phe Asp Val Lys Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Lys
125 130 135
Asn Asp Ala His Lys Tyr Tyr Ala Leu Thr His Asn Ser Gly Gly
140 145 150
Lys Leu Ser Asn Ala Gly Asp Lys Phe Val Phe Leu Lys Asn Glu
155 160 165
Gly Leu Leu Asp Ile Ser Leu Met Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Val
170 175 180
Ile Ser Glu Gly Ile Pro Phe Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Val
185 190 195
Gly Thr Asp Leu Ile Ser Met Phe Glu Ala Ile Asn Pro Lys Ile
200 205 210
Ser Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Leu Ser Tyr Ser Ile Ser Pro Glu
215 220 225
Ala Ser Val Phe Val Gly Gly His Phe His Lys Val Ile Gly Asn
230 235 240
Glu Phe Arg Asp Ile Pro Ala Met Ile Pro Ser Thr Ser Thr Leu
245 250 255
Thr Gly Asn His Phe Thr Ile Val Thr Leu Ser Val Cys His Phe
260 265 270
Gly Val Glu Leu Gly Gly Arg Phe Asn Phe
275 280
<210>15
<211>284
<212>PRT
<213>反刍类考德里氏体
<220>
<223>反刍类考德里氏体MAP-1的氨基酸序列
<400>15
Met Asn Cys Lys Lys Ile Phe Ile Thr Ser Thr Leu Ile Ser Leu
5 10 15
Val Ser Phe Leu Pro Gly Val Ser Phe Ser Asp Val Ile Gln Glu
20 25 30
Glu Asn Asn Pro Val Gly Ser Val Tyr Ile Ser Ala Lys Tyr Met
35 40 45
Pro Thr Ala Ser His Phe Gly Lys Met Ser Ile Lys Glu Asp Ser
50 55 60
Arg Asp Thr Lys Ala Val Phe Gly Leu Lys Lys Asp Trp Asp Gly
65 70 75
Val Lys Thr Pro Ser Gly Asn Thr Asn Ser Ile Phe Thr Glu Lys
80 85 90
Asp Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala
95 100 105
Gly Ala Val Gly Tyr Ser Met Asn Gly Pro Arg Ile Glu Phe Glu
110 115 120
Val Ser Tyr Glu Thr Phe Asp Val Arg Asn Pro Gly Gly Asn Tyr
125 130 135
Lys Asn Asp Ala His Met Tyr Cys Ala Leu Asp Thr Ala Ser Ser
140 145 150
Ser Thr Ala Gly Ala Thr Thr Ser Val Met Val Lys Asn Glu Asn
155 160 165
Leu Thr Asp Ile Ser Leu Met Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Ile Met
170 175 180
Leu Asp Gly Met Pro Val Ser Pro Tyr Val Cys Ala Gly Ile Gly
185 190 195
Thr Asp Leu Val Ser Val Ile Asn Ala Thr Asn Pro Lys Leu Ser
200 205 210
Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Ile Ser Tyr Ser Ile Asn Pro Glu Ala
215 220 225
Ser Ile Phe Ile Gly Gly His Phe His Arg Val Ile Gly Asn Glu
230 235 240
Phe Lys Asp Ile Ala Thr Ser Lys Val Phe Thr Ser Ser Gly Asn
245 250 255
Ala Ser Ser Ala Val Ser Pro Gly Phe Ala Ser Ala Ile Leu Asp
260 265 270
Val Cys His Phe Gly Ile Glu Ile Gly Gly Arg Phe Val Phe
275 280
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物_结合
<222>反刍类考德里氏体MAP-1的核苷酸313-332，
恰菲埃里希体P28的核苷酸307-326
<223>用于PCR的正向引物793
<400>16
gcaggagctg ttggttactc 20
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物_结合
<222>反刍类考德里氏体MAP-1的核苷酸823-843，
恰菲埃里希体P28的核苷酸814-834
<223>用于PCR的反向引物1330
<400>17
ccttcctcca agttctatgc c 21
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物_结合
<223>引物46f，对ECa28SA2基因特异性
<400>18
atatacttcc tacctaatgt ctca 24
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物_结合
<223>用于犬埃里希体中28-kDa蛋白质基因测序的引物
<400>19
agtgcagagt cttcggtttc 20
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物_结合
<223>用于犬埃里希体中28-kDa蛋白质基因测序的引物
<400>20
gttacttgcg gaggacat 18
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物_结合
<222>ECa28-1的核苷酸687-710
<223>用于PCR的引物394
<400>21
gcatttccac aggatcatag gtaa 24
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物_结合
<222>ECa28-1的核苷酸710-687
<223>用于PCR的引物394C
<400>22
ttacctatga tcctgtggaa atgc 24
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物_结合
<223>引物793C，其与Eca28-1的一区域退火，
用于扩增基因ECa28SA3和ECa28-1间的基因区
<400>23
gagtaaccaa cagctcctgc 20
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物_结合
<222>
<223>引物EC28OM-F，互补于ECa28-1开放读框毗邻的非编码区域
<400>24
tctactttgc acttccacta ttgt 24
<210>25
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物_结合
<223>引物EC28OM-R，互补于ECa28-1开放读框毗邻的非编码区域
<400>25
attcttttgc cactattttt cttt 24
<210>26
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物_结合
<223>引物ECaSA3-2，相应于ECa28SA3中的区域，用于扩增
基因ECa28SA3和ECa28-1之间的基因间区NC3
<400>26
ctaggattag gttatagtat aagtt 25
<210>27
<211>23
<212>PRT
<213>犬埃里希体
<220>
<221>肽
<223>预计的ECa28-1和ECa28SA3 N-端信号肽
<400>27
Met Asn Cys Lys Lys Ile Leu Ile Thr Thr Ala Leu Met Ser Leu
5 10 15
Met Tyr Tyr Ala Pro Ser Ile Ser
20
<210>28
<211>25
<212>PRT
<213>恰菲埃里希体
<220>
<223>恰菲埃里希体P28 N-端信号肽的氨基酸序列
<400>28
Met Asn Tyr Lys Lys Ile Leu Ile Thr Ser Ala Leu Ile Ser Leu
5 10 15
Ile Ser Ser Leu Pro Gly Val Ser Phe Ser
20 25
<210>29
<211>26
<212>PRT
<213>犬埃里希体
<220>
<223>推定的ECa28-1切割位点的氨基酸序列
<400>29
Met Asn Cys Lys Lys Ile Leu Ile Thr Thr Ala Leu Ile Ser Leu
5 10 15
Met Tyr Ser Ile Pro Ser Ile Ser Ser Phe Ser
20 25
<210>30
<211>299
<212>DNA
<213>犬埃里希体
<220>
<223>基因间非编码区域1的核酸序列(28NCl)
<400>30
taatacttct attgtacatg ttaaaaatag tactagtttg cttctgtggt 50
ttataaacgc aagagagaaa tagttagtaa taaattagaa agttaaatat 100
tagaaaagtc atatgttttt cattgtcatt gatactcaac taaaagtagt 150
ataaatgtta cttattaata attttacgta gtatattaaa tttcccttac 200
aaaagccact agtattttat actaaaagct atactttggc ttgtatttaa 250
tttgtatttt tactactgtt aatttacttt cactgtttct ggtgtaaat 299
<210>31
<211>345
<212>DNA
<213>犬埃里希体
<220>
<223>基因间非编码区域2的核酸序列(28NC2)
<400>31
taatttcgtg gtacacatat cacgaagcta aaattgtttt tttatctctg 50
ctgtatacaa gagaaaaaat agtagtgaaa attacctaac aatatgacag 100
tacaagttta ccaagcttat tctcacaaaa cttcttgtgt cttttatctc 150
tttacaatga aatgtacact tagcttcact actgtagagt gtgtttatca 200
atgctttgtt tattaatact ctacataata tgttaaattt ttcttacaaa 250
actcactagt aatttatact agaatatata ttctgacttg tatttgcttt 300
atacttccac tattgttaat ttattttcac tattttaggt gtaat 345
<210>32
<211>345
<212>DNA
<213>犬埃里希体
<220>
<223>基因间非编码区域3的核酸序列(28NC3)
<400>32
tgattttatt gttgccacat attaaaaatg atctaaactt gtttttatta 50
ttgctacata caaaaaaaag aaaaatagtg gcaaaagaat gtagcaataa 100
gagggggggg ggggactaaa tttaccttct attcttctaa tattctttac 150
tatattcaaa tagcacaact caatgcttcc aggaaaatat gtttctaata 200
ttttatttat taccaatcct tatataatat attaaatttc tcttacaaaa 250
atctctaatg ttttatactt aatatatata ttctggcttg tatttacttt 300
gcacttccac tattgttaat ttattttcac tattttaggt gtaat 345
<210>33
<211>355
<212>DNA
<213>犬埃里希体
<220>
<223>基因间非编码区域4的核酸序列(28NC4)
<400>33
taattttatt gttgccacat attaaaaatg atctaaactt gtttttawta 50
ttgctacata caaaaaaaga aaaatagtgg caaaagaatg tagcaataag 100
aggggggggg gggaccaaat ttatcttcta tgcttcccaa gttttttcyc 150
gctatttatg acttaaacaa cagaaggtaa tatcctcacg gaaaacttat 200
cttcaaatat tttatttatt accaatctta tataatatat taaatttctc 250
ttacaaaaat cactagtatt ttataccaaa atatatattc tgacttgctt 300
ttcttctgca cttctactat ttttaattta tttgtcacta ttaggttata 350
ataaw 355