一种胎盘提取物的制备方法及其应用.pdf

本发明涉及一种胎盘提取物的制备方法和制得胎盘提取物在制备治疗白癜风药物中的应用。所述的制备方法包括：取健康胎盘捣碎，用重量比1∶1的20％～95％乙醇浸泡1～7天，过滤，得滤液a；加入1～5倍20％～95％的乙醇，在－4℃～40℃陈化2～10天，过滤，得滤液b；将滤液b陈化2～5天，过滤，得滤液为胎盘提取物。本提取工艺操作简单、成本低廉。所制得的胎盘提取物，用于治疗白癜风，特别是对治疗较困难的头皮白癜风和儿童白癜风效果好、安全、无毒副反应。

1、  一种胎盘提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取健康胎盘捣碎，用重量比1∶1的20％～95％乙醇浸泡1～7天，过滤，得滤液a；
(2)将滤液a加入1～5倍20％～95％的乙醇，在-4℃～40℃陈化2～10天，过滤，得滤液b；
(3)将步聚(2)所得滤液b陈化2～5天，过滤，得滤液为胎盘提取物。

2、  如权利要求1所述的胎盘提取物的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)中，乙醇浓度为80％～95％。

3、  如权利要求1所述的胎盘提取物的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中，乙醇浓度为40％～45％。

4、  如权利要求1所述的胎盘提取物的制备方法，其特征在于按如下步骤制备：
(1)取健康胎盘捣碎，用重量比1∶1的80％乙醇浸泡4天，过滤，得滤液a；
(2)将滤液a加入3倍40％的乙醇，在3～5℃陈化3天，过滤，得滤液b；
(3)将步骤(2)所得滤液b陈化3～4天，过滤，得滤液为胎盘提取物。

5、  如权利要求1所述的胎盘提取物的制备方法，其特征在于所述的健康胎盘在-40℃～4℃冰冻保存3～10天后捣碎。

6、  按权利要求1～5所述的方法制得胎盘提取物在制备治疗白癜风药物中的应用。

7、  如权利要求6所述的胎盘提取物在制备治疗白癜风药物中的应用，其特征在于所述的药物为外用搽剂。

8、  如权利要求7所述的胎盘提取物在制备治疗白癜风药物中的应用，其特征在于所述的药物为外用搽剂时，含有浓度为0.05～1％的氯化钙。

一种胎盘提取物的制备方法及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种胎盘提取物的制备方法和制得胎盘提取物在制备治疗白癜风药物中的应用。
(二)背景技术
白癜风是一种常见多发性色素皮肤病，发病率为1-2％，这种疾病主要是由于表皮中产生黑素的细胞缺失所致。到目前为止它的发病机理尚不清楚，也没有一种确定的治疗方法。患者处于一种神经高度紧张状态下，表皮中的黑素逐渐消失，这种症状影响病人的心理和社会行为。发病部位通常在脸上、肢体及身体的暴露部位。
目前对于该病的治疗相当困难，尤其是头顶部和儿童白癜风。1986年古巴人Cao用乙醇从正常人胎盘中提取了melagenine，认为其是含有一种能促进黑素合成和黑素细胞增殖的脂蛋白，用其注射治疗白癜风取得了84％的有效率(CaO CM.Series of NationalReports，1986.)。1995年Rabindra Roy等进一步分析了melagenine大致化学成份，认为其含内皮素、神经节苷脂、磷脂等活性物质(RoyR et al.Int J Dermatol，1995；34：61)，但提取方法需过滤、过柱层析、冷冻干燥，操作复杂，特别是这种方法需过柱，不适宜大生产的需要，生产成本也很高。
早在1986年，Meyer A等报告钙离子对皮肤色素具有一定的活性(13^th International Pigment Cell Conference.Oct 5-6.Tveson ArigUSA)。1995年Carberg等指出钙离子可以刺激人体的黑素细胞产生黑素(J Dermatological Science，1995，9：157-164)。同年Schallreuter等应用psendocatalase和钙离子合并红外线局部照射治疗白癜风，取得了一定的疗效(Dermatology，1995，190：223-229)。
(三)发明内容
本发明提供了一种操作简单、成本低廉的治疗白癜风的胎盘提取物的制备方法。
本发明所述的治疗白癜风的胎盘提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取健康胎盘捣碎，用重量比1∶1的20％～95％乙醇浸泡1～7天，过滤，得滤液a；
(2)将滤液a加入1～5倍20％～95％的乙醇，在-4℃～40℃陈化2～10天，过滤，得滤液b；
(3)将步聚(2)所得滤液b陈化3～5天，过滤，得滤液为胎盘提取物。
上述的健康胎盘指乙肝、丙肝、梅毒、HIV等传染病检测均呈阴性的新鲜胎盘，其可以直接捣碎或者在-40℃～4℃冰冻保存3～10天后捣碎。
上述的制法步骤(1)中，乙醇浓度优选为80％～95％，上述的步骤(2)中，乙醇浓度优选为40％～45％。
按照上述胎盘提取物的制备方法，推荐以如下参数按下列步骤制备：
(1)取健康胎盘捣碎，用重量比1∶1的80％乙醇浸泡4天，过滤，得滤液a；
(2)将滤液a加入3倍40％的乙醇，在3～5℃陈化3天，过滤，得滤液b；
(3)将步聚(2)所得滤液b陈化3～4天，过滤，得滤液为胎盘提取物。
将上述制得胎盘提取物进行内皮素含量测定。内皮素也叫血管紧张肽，是一种由21个氨基酸残基组成的短肽。内皮素的主要作用是维持血管的张力，此外还具有促进细胞分裂的功能，已有报道角质形成细胞分泌的内皮素具有促进黑素细胞分裂的功能。Roy等人认为胎盘提取物中可能存在内皮素(ET)，内皮素被认为对MC的有丝分裂有关键性作用。1991年Yada等发现人体MC上有ET受体。ET-1、ET-2能通过受体介导的信号传递途径刺激MC增殖及黑素合成，而人胎盘中含有丰富的ET。利用本发明提取的胎盘提取物中含有内皮素的量为105.6-265pg/ml，此外还含有神经节苷脂和一些蛋白质，可能这些活性成份参与了促进黑素细胞的增殖和黑素合成的过程。
通过测定胎盘提取物中唾液酸的含量确定其中含有唾液酸的神经节苷脂。神经节苷脂是含有一个或几个唾液酸的糖鞘脂，除大量存在于神经元细胞质膜上还广泛分布于其它细胞，其作为细胞膜上的受体和特异性的抗原物质参与了细胞间的相互识别、细胞生长和分化等功能。胎盘提取物中含有的神经节苷脂可能会促进白癜风病人角质形成细胞与黑素细胞间的识别和联系，加快黑素的运输和成熟，从而使皮肤颜色恢复正常。
按上述方法制得的胎盘提取物在制备治疗白癜风药物中的应用，所述的胎盘提取物直接用作外用搽剂。外用搽剂还可含有0.05～1％的氯化钙，钙离子可以加速色素的沉着过程，从而较快使药物产生治疗效果。
所述的胎盘提取物在制备治疗白癜风药物中的应用时，还可将所述的药物制成注射液。所述的注射液的制备方法为：胎盘提取物用葡聚糖凝胶G-50层析，洗脱液为PBS，收集峰值的层析液，将所收层析液过滤除菌，分装后，4℃保存备用，使用时通常用于皮下注射。
用胎盘提取物的外用搽剂配合红外线照射治疗、表皮移植加胎盘提取物治疗或者皮下直接注射治疗患者，一定时间后观察疗效。疗效判定标准采用中国中西医结合皮肤性病学会色素病学组的分型和疗效标准。有效率为痊愈、显效和有效的总和。
本提取工艺操作简单、成本低廉。所制得的胎盘提取物，用于治疗白癜风，特别是对治疗较困难的头皮白癜风和儿童白癜风效果好、安全、无毒副反应。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1胎盘提取物的制备
取健康人新鲜胎盘在-20℃冰冻保存7天后捣碎。用重量比1∶1的80％浓度地乙醇浸泡4天后，用滤纸过滤，所得滤液加入3倍量40％的乙醇，在4℃陈化3天，取上清液过滤后，滤液在室温陈化2天，取上清液过滤，滤液即胎盘提取物，于4℃保存备用。
实施例2胎盘提取物的制备
取健康人新鲜胎盘在-20℃冰冻保存1天后捣碎。用重量比1∶1的50％浓度的乙醇浸泡7天后，用滤纸过滤，所得滤液加入2倍量75％的乙醇，在4℃陈化8天，取上清液过滤后，滤液在室温陈化5天，取上清液过滤，滤液即胎盘提取物，于4℃保存备用。
实施例3胎盘提取物的制备
取健康人新鲜胎盘在-20℃冰冻保存4天后捣碎。用重量比1∶1的95％浓度的乙醇浸泡1天后，用滤纸过滤，所得滤液加入5倍量50％的乙醇，在30℃陈化8天，取上清液过滤后，滤液在室温陈化3天，取上清液过滤，滤液即胎盘提取物，于4℃保存备用。
实施例4注射液的制备
将实施例1制备的胎盘提取物用葡聚糖凝胶G-50层析，洗脱液为PBS，收集峰值的层析液，将所收层析液用PBS调整浓度为1.0mg/ml(总蛋白含量)，过滤除菌，分装后灭菌，4℃保存备用。
实施例5胎盘提取物成份分析
1.材料与方法
1.1材料
实施例1～3所得胎盘提取物；硅胶为青岛海洋化工有限工司产；唾液酸测定试剂盒为温州伊利康生物有限公司产。
1.2方法
1.2.1 TLC分析：采用硅胶G制薄层板：110℃活化0.5小时；点样5～10μl；展开，展开剂为氯仿(55)：甲醇(45)：0.2％CaCl₂溶液(10)；碘蒸气显色。
1.2.2内皮素含量测定：内皮素测定采用放射免疫分析法(RIA)，试剂盒由北京东亚免疫技术研究所提供。分别将标准品和胎盘提取物、胎盘组织液及内皮素抗体放入放免分析缓冲液中，混匀后4℃孵育24小时，次日加入¹²⁵I标记的内皮素，混匀后4℃过夜，再加二抗分离结合和游离的¹²⁵I标记的内皮素，再测每管沉淀物的每分钟放射活性计数值(cpm)。
1.2.3唾液酸含量测定：采用温州伊利康尘物有限公司产试剂盒，采用比色法，将标准品、胎盘提取物与呈色液混合，100℃水浴15分钟，在冷水中冷却至室温，3000r/min离心5分钟，560nm比色
2.结果：
2.1 TLC分析：取5u1冷冻浓缩样品TLC分析，实施例1～3的样品均出现5个明显的斑点，其迁移率分别为0.123、0.469、0.605、0.840和0.975。迁移率为0.975的斑点中推测其为脂类混合物，其它四个斑点为一些含有氨基、及二硫键的疏水性蛋白。
2.2内皮素含量测定：用RIA法测出实施例1、实施例2、实施例3的胎盘提取物中内皮素含量在105.6-265pg/ml；分别是265pg/ml105.6pg/ml；183pg/ml；显著高于正常人血液中内皮素(含量为3.1-76.1pg/ml)。
测定胎盘提取物中内皮素含量显著大于正常人体血液中的含量，所以这种提取物具有促进黑素细胞分裂的功能。
2.3唾液酸含量测定：按试剂盒提供方法，100℃水浴中反应15分钟后，比色法测定实施例1、实施例2、实施例3的胎盘提取物中唾液酸含量在112-163μg/ml之间，含量分别为143μg/ml；163μg/ml；112μg/ml。
实施例6：胎盘提取物的动物急性毒性试验
1、试验材料：
1.1、实施例4制得胎盘提取物注射液
1.2、动物：昆明种小鼠，体重17-23g，雌雄各半。由南京医科大学实验动物中心提供，合格证书号：苏动93084。
2、动物试验：
2.1、给药途径：选用皮下注射和腹腔注射给药。
2.2、预试验及最大耐受量试验：
先作小鼠皮下与腹腔注射的急性毒性预试验，结果胎盘提取物注射液最大给药量均无动物死亡，预计不能测出半数致死量(LD50)因此作最大耐受量试验，分别以小鼠20只(雌雄各半)，用两种注射途径给药，观察期7天，室温20-24℃。
2.3、小鼠皮下注射毒性试验：按90ml/kg(含总蛋白98mg)给予20只小鼠，分3次皮下注射.每次注射容积0.3ml/10g，间隔2.5h，观察7天，隔日称体重一次.结果无动物死亡，对小鼠的行为活动、外观、食欲、体重、大小便无明显影响，亦未发现其他不良反应(如惊厥、步态不稳、竖毛、瘫痪、呼吸困难和抑制等)，将小鼠处死，尸体解剖，肉眼观察未见异常变化。
2.4、小鼠腹腔注射毒性试验：按80ml/kg(含总蛋白87.2mg)给予20只小鼠分四次腹腔注射，每次容积为0.2ml/s，间隔2h。观察7天，隔日称体重一次，结果未发现有动物死亡，除有少数小鼠注射当日活动稍有减少(第二天即恢复正常)，对小鼠行为活动、食欲、体重大小便等均无影响，亦未出现其他不良反应(如惊厥、步态不稳、竖毛、呼吸困难和抑制等)，将小鼠处死，解剖后肉眼观察未见异常变化。
3、试验结果分析：
3.1、胎盘提取物注射液皮下注射的小鼠最大耐受量为90ml/kg，按体重计相当于人单次临床用量的900倍(计算方法：人单次临床用量为5ml/50kg体重，即0.1ml/kg，现动物用90ml/kg÷0.1ml/kg＝900倍)。
3.2、黑色素生成素注射液腹腔注射的小鼠最大耐受量为80ml/kg，按体重计相当于人单次临床用量的800倍，(计算方法：依上法算出人单次剂量为0.1ml/kg，现动物用量80ml/kg÷0.1ml/kg＝800倍)。
4.结论：
因不能求出LD50，且两种绐药途径最大耐受量均大于人用量的100倍以上，故本制剂为一安全无毒性制剂。
实施例7：胎盘提取物过敏实验
1、试验材料：
1.1、药物
(1)实施例4制得的胎盘提取物注射液。
(2)阳性对照品：1％蛋清生理盐水溶液。
(3)空白对照：生理盐水。
1.2、动物：健康豚鼠，体重250-300g，雌雄各半，南京医科大学实验动物中心提供。合格证书号：苏动93084。
2、试验方法：
2.1、试验分组：豚鼠30只，分为3组，每组10只，空白对照组：生理盐水，阳性对照组：1％蛋清生理盐水溶液，受试药物组：胎盘提取物注射液。
2.2、给药方法：上述各组分别腹腔注射给药，剂量1.0mi/Lg，隔日1次，连续3次，各组给药第14天，再给药1次，剂量按致敏攻击量(即原剂量的2倍)，均为静脉给药，观察给药后有无过敏反应症状，分为4级：0级为无症状，1级用爪搔鼻、打喷嚏等，2级抽搐等，3级呼吸困难、直至死亡。
3、结果判断：
如表1所示，胎盘提取物注射液组与空白对照组的豚鼠均为0级反应，未出现过敏反应症状及死亡现象，蛋清对照组的10只豚鼠为4级反应，均出现打喷嚏、抽搐、呼吸困难等过敏反应症状直至出现死亡现象。
结论：胎盘提取物注射液过敏反应为阴性。
                  表1胎盘提取物注射液对豚鼠过敏试验的结果
组别        动物数    致敏剂量      致敏攻击量            致敏反应数(只)
                      (ml/kg)        (mgl/kg)       死亡数、出现过敏反应症状数
空白对照组    10        1.0            2.0            0            0
蛋清对照组    10        1.0            2.0            10           10
受试药物组    10        1.0            2.0            0            0
实施例8：胎盘提取物注射液刺激试验
1、试验材料：
1.1、实施例4制得的胎盘提取物注射液。
1.2、对照品：灭菌生理盐水。
1.3、动物：健康家兔2.0-2.4kg，雌雄不拘。昆明种小鼠，18-22g，雌雄各半。南京医科大学实验动物中心提供，合格证书号：苏动93084。
2、试验方法：
2.1、兔股四头肌刺激试验：家兔4只，将每只家兔两侧臀部股四头肌部位表面皮肤剪毛，并用洒精棉球消毒(注射器和针头预先消毒)于右侧部位肌肉注射胎盘提取物注射液1.0ml，右侧部位注射等量生理盐水作对照，48h后将动物放血处死，纵向切开注射部位肌肉，观察有无充血、水肿、变性和坏死现象，并各取出小块组织作病理切片检查。
2.2、小鼠腹腔刺激试验：取小鼠20只，分为两组，每组10只雌雄各半。分别腹腔注射胎盘提取物注射液和生理盐水各0.1ml/kg，注射后记录10min内产生扭体反应的次数，(表现为腹部收缩内陷，躯体扭曲，后肢伸张等)，如出现扭体反应为阳性，即该药物有疼痛反应。
3、试验结果判断与评价：
3.1、注射药物48h，家兔健康如常，解剖两侧股四头肌注射部位，4只家兔均未见充血、水肿、变性及坏死等现象，按表2刺激反应分级标准，肌肉组织无异常改变，反应级数为零级，故为无刺激性。病理组织切片检查结果：未发现异常病变。
3.2、两组小鼠腹腔注射受试药品及生理盐水后，均未出现扭体反应，为阴性，表明黑色素细胞生成注射液无疼痛刺激反应。
4.结论
本试验表明，受试药品胎盘提取物注射液为无刺激性制剂。
       表2注射剂刺激反应评分标准
反应级数                    刺激反应
0               给药部位无明显反应
1               给药部位轻度充血，直径在0.5cm以下
2               结药部位中度充血，直径在1.0cm以下
3               给药部位重度充血、红肿、肌肉有变性
4               出现肌肉褐色变性、坏死，直径在0.5cm以下
5               肌肉严重变性，出现大片坏死
实施例9胎盘提取物对豚鼠表皮黑素细胞的影响
1、材料和方法
1.1动物皮肤样品：健康雄性棕黄色豚鼠4只(浙江省中医学院实验动物中心提供，普通级)，体重300g左右，每只豚鼠在背部棕黄色区脱毛后外搽胎盘提取物，并立即用红外线照20min，每天二次，连续5周；在同一鼠背部搽药部对侧同色皮肤处，以不搽药、不照红外线作为空白对照。
1.2药物来源：胎盘提取物由实施例1制得。
1.3染色方法：
1.3.1 HE染色：常规石蜡切片，苏木-伊红：染色。
1.3.2 lmokawa法染色；0.1M PBS(PH6.8)冲洗皮肤标本(2×2cm²)；置1M溴化钠中37℃下孵育5h分离表皮、毛囊和真皮；10％冷福尔马林用固定表皮和毛囊30min、0.1M PBS液(PH6.8)冲洗2遍；0.1％二羟基苯丙氨酸(DOPA)、0.1M PBS(PH6.8)染色5h。黑素细胞为黑褐色。
1.3.3 Schmonl法染色：切片水洗；用新鲜配制1％氯化铁30ml、1％铁氰化钾4ml和6ml蒸馏水混合液处理10min；流水冲洗；胞核用1％藏红花对比染色15-30min；水洗、脱水、透明、常规封固。黑素染色为黄褐、黑色颗粒。
1.4光镜观察：
1.4.1多巴阳性细胞计数：Imokowa染色后100倍光镜下计数5个视野的表皮基底层所含多巴阳性黑素细胞数。
1.4.2黑素颗粒细胞计数：Schmorl染色后400倍光镜下取5个视野，计数出每100个角质形成细胞中含有黑素颗粒的细胞数。
1.4.3黑素含量指数(melain content index，MCl)：使用多媒体病理图象分析系统(复旦郎珈公司)，对schmorl染色切片进行MCI计数：
MCI-1：选择10个丛底层含黑素颗粒细胞，测定受检细胞黑素颗粒面积占该细胞总面积的百分比平均值；
MCI-2：选择10处表皮，测定受检基底层以上各层角质形成细胞内黑素颗粒面积占该处表皮基底层以上各层细胞总面积的百分比平均值。
1.5透射电镜观察：0.25％戊二醛磷酸盐缓冲液固定皮肤4h，1％锇酸固定液固定；环氧树脂包埋：半薄切片定位；超薄切片；日立H-800型透射电镜观察、拍照。
2、结果
2.1皮肤反应：豚鼠背部皮肤外用胎盘提取物并配合红外线照5周后，肉眼未见明显的色素沉着。
2.2胎盘提取物对棕黄色豚鼠背部皮肤黑素细胞增殖的影响：Imokawa法染色后光镜检测(×100)发现：用胎盘提取物处理后豚鼠背部皮肤中多巴阳性细胞数平均每视野204.71个，而对照平均每视野44.86个，用胎盘提取物后比不用多巴阳性细胞数明显增高；在毛囊与皮肤交界处，多巴阳性细胞数明显增多，阳性细胞胞体较大，树突较短，双极细胞数目明显增多。
2.3胎盘提取物对棕黄色豚鼠背部皮肤黑素合成的影响：黑素生成素处理表皮中含黑素颗粒细胞数也明显增高，Schmonl法染色后，用胎盘提取物后为76.33/100细胞，而对照为24.63/100细胞。
2.4棕黄色豚鼠背部皮肤表皮黑素含量指数测定：
胎盘提取物处理后黑素颗粒在丛底层及棘层增多。用胎盘提取物后基底层细胞MCI-1为0.28，对照组基底层细胞MCI-1为0.03；对照组基底层以上各层细胞MCI-2为0.04，用胎盘提取物后基底层以上各层细胞MCI-2为0.20。黑素生成素处理明显提高了皮肤中黑素含量指数，所以胎盘提取物对皮肤黑素合成具有促进作用。
2.5透射电镜观察：
透射电镜下观察，胎盘提取物处理的表皮中的黑素细胞细胞膜完整，胞浆内含有丰富的与合成黑素有关的细胞器，可见大量线粒体和粗面内质网，在细胞核旁可见I、II期黑素小体，在胞浆周边可见较多已黑素化的III、IV期黑素小体，在其伸出的树枝状突起两侧可见许多成熟IV期的黑色小体排列在两旁，输送到树突顶端。在黑色细胞附近的角质形成细胞内可见较多III、IV期黑色小体分布于胞浆，在真皮浅层组织细胞内可见有较多被吞噬的III、IV期黑色小体。于之相对比，在对照组中I～III期黑色小体明显少，无IV期黑色小体可见。
3结论
豚鼠棕黄色皮肤用胎盘提取物外搽并配合红外线照，一天两次，连续5周后，通过染色观察发现：多巴阳性细胞数及含黑素颗粒细胞数比不用胎盘提取物的明显增多，在毛囊与皮肤交界处也增多，皮肤黑素含量指数也较对照增高，提示黑素生成素对皮肤黑素化有促进作用；通过超微结构的观察发现：用胎盘提取物后III、IV期黑素小体增多。上述发现表明：胎盘提取物能促进黑素的合成及黑素细胞的增殖。
实施例10：胎盘提取物对黑素细胞增殖和黑素合成作用
1.材料与方法
1.1  材料
胎盘提取物为实施例1制得；黑素细胞由本科细胞培养室提供；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购于上海华美生物工程公司；合成黑素为Sigma产品：Dynatech-MR4100酶标仪为美国产；96孔培养板及培养皿为丹麦产。
1.2方法
1.2.1、MC增殖的测定：四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)，选择对数生长期的细胞，用0.25％胰酶37℃消化5-8分钟，将细胞浓度调为5×10⁴个/ml，加于96孔培养板，每孔100μl，再加胎盘提取物，使终浓度为0、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32mg/ml，并设置培养液对照。置37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养56-72个小时，于结束前4小时加入MTT 10μl/孔。4小时后弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)100μl/孔，振荡10分钟左右。置酶标仪测A值(OD值)，波长为490nm，按下公式计算促增值率：
促增值率＝(加MelagenineA值一不加MelagenineA值)/(不加MelagenineA值一培养液A值)×100％。实验结果应用t检验进行统计学分析。
1.2.2、黑素合成测定：我们用Oikawa法测胎盘提取物对体外培养MC黑素合成的影响。选择对数生长期细胞，将细胞浓度调为3×105/ml，加入培养皿，每孔1ml，再加培养液1ml/孔，加入胎盘提取物120ul，使其浓度为0.16mg/ml，对照不加，放入37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养4天后，倾去培养液，用0.9％NaCl洗2次，用0.25胰酶消化5-8分钟，将细胞收集入离心管，进行细胞计数后，300g离心10分钟，弃上清液，加蒸馏水超声处理后离心、沉淀，沉淀用10％三氯乙酸洗2次，乙醇洗1次后1200g离心5分钟，弃上清液，加入1mlNaOH(含10％DMSO)于80℃水浴2小时，在470nm测A值，同时用合成黑素制备标准曲线。
1.2.3、透射电镜观察：选择对数生长期MC，加入培养皿，再加黑索生成素，使其浓度为0.16mg/ml，对照不加，培养4天后，送电镜观察。
2.结果
2.1.MTT测定结果：胎盘提取物对体外培养的MC增值有促进作用(见表3)。在浓度为0.16mg/ml对细胞增值作用最佳，此浓度组与不加胎盘提取物相比，对MC的增值有显著性差异(t＝14.76，P＜0.01)。将胎盘提取物浓度和促增殖率进行回归计算发现，两者具有显著相关，相关系数为0.9936。
表3 MTT法测定胎盘提取物对黑素细胞增殖作用结果
胎盘提取物浓度(mg/ml)    促增殖率(％)    细胞数10⁴/ml
0                                             6.2
0.02                        20.0              7.5
0.04                        26.5              8
0.08                        33.0              8.1
0.16                        42.8              9.0
0.32                        29.1              7.8
2.2黑素合成测定：对照组为4.5fg/细胞，而加胎盘提取物为5.5fg/细胞，加胎盘提取物的黑素量比不加时有所增加。
2.3电镜观察：可见加胎盘提取物后黑素小体增多。
3  结果分析
胎盘提取物被认为是一种能促进黑素合成和黑素细胞增殖的活性物质。MTT法检测结果显示0.16mg/ml胎盘提取物对MC促增殖率为42.8％，胎盘提取物对体外培养的MC增值有促进作用。对黑素含量测定，也表明加胎盘提取物比不加胎盘提取物含量相对增加(不加胎盘提取物为4.5fg/细胞，加胎盘提取物为5.5fg/细胞)。电镜结果也显示胎盘提取物促使黑素小体增多，以上这些实验研究证明胎盘提取物能促进黑素合成和黑素细胞增殖。
实施例11外用搽剂的制备
实施例1制得胎盘提取物加入氯化钙，使氯化钙的浓度为0.05％，制成外用搽剂。
实施例12外用搽剂的制备
实施例2制得胎盘提取物加入氯化钙，使氯化钙的浓度为0.07％，制成外用搽剂。
实施例13外用搽剂治疗白癜风
参与实验的白癜风患者共150例均为稳定期，其中节段型73例，局限型57例；男70例，女80例；患者年龄4～60岁，其中＜16岁的有77例，平均年龄18.9岁；病程1～15年，平均4.6年；150例中头顶部36例，面颈部42例，腰胸部32例，手臂部17例，大小腿、足背23例；白斑面积为2.0cm×2.6cm～16.3cm×7.2cm。
将其随机分为3组，每组50例，一组采用实施例11的所得外用搽剂，一组采用实施例12的所得外用搽剂，一组采用实施例3所得胎盘提取物直接作为外用搽剂，搽后立即用红外线灯照(功率为250W)，一天两次，每次照20min，以3个月为1个疗程。同时在治未使疗期间用其他治疗白癜风的药物。在治疗前后检查血、尿常规和肝肾功能。
患者在治疗过程中均未出现不良反应，血尿常规和肝肾功能均正常。在使用2个疗程后，150例中痊愈27例(占18％，患者在治疗2～3周后在白斑处出现色素点，后逐渐扩大、融合，快者5周后痊愈，慢者2个疗程后痊愈)，显效45例(占30％)，有效36例(占24％)，无效42例(占28％)，总有效率为72％。随访半年以上都未见色素斑脱失，最长随访2年，色素仍保持完好，所有患者治疗后均无复发。
在年龄＜16的77例儿童患者中，痊愈有16例(占20.8％)，显效27例(占35.1％)，有效20例(占26.0％)，总有效率为81.8％，疗效好于年龄＞16岁的患者(总有效率60.3％，痊愈10例，占13.7％；显效18例，占24.7％；有效16例，占22.0％)。
头皮部36例有32例有效(痊愈10例，占27.8％；显效15例，占41.7％；有效7例，占19.4％)，总有效率为88.9％，明显好于其他部位。
各组的疗效见表4，三组治疗白癜风都有较好的疗效，尤其是由
实施例11治疗。
                                         表4
              平均年龄(岁)    平均病程    痊愈    显效    有效    无效    有效率
实施例11组       19.6           5.1        11      16      13      10      80％
实施例12组       18.7           4.5        8       15      13      14      72％
实施例3组        18.4           4.2        8       14      10      18      64％
实施例14表皮移植加胎盘提取物治疗
我们对5例经多次表皮片移植失败的白癜风患者(非表皮片1周内脱落及感染因素造成)，在移植术中加胎盘提取物，得到全部成活，并且色素斑加深及扩大明显。
10例白癜风患者均为稳定期，其中男4例，女6例；年龄18-45岁。节段型5例，泛发型3例，局限型2例；病期1-15年不等。10例共28片移植皮片曾经2次以上移植，4周后植皮区无色素出现。将实施例4所得胎盘提取物注射液滴加在白斑去表皮的裸露面上，让其吸收1-2分钟，然后把浸过胎盘提取物的供皮区水疱的整个疱壁平整地移植在白斑创面，用消毒纱布或油纱布包扎一周。
结果术后一周、一个月、二个月观察，34片移植片全部成活，随访1年，有2例(7片)色素斑直径达15-20mm，超过原来移植面积的1.5-2倍。
实施例15皮下直接注射
稳定期白癜风10例，男6例，女4例；年龄16-41岁。节段型5例，局限型5例；病期4-13年不等。将实施例4所得注射液直接在患者白斑处皮下注射，7天一次，一个半月为一疗程。在治疗2个疗程后3例显效，3例有效，4例无效。