一株凝结芽孢杆菌及其在L-乳酸钠制备中的应用 【技术领域】
本发明涉及一种制备L-乳酸钠的专用菌及其所述菌的应用，尤其涉及一株凝结芽孢杆菌及其在L-乳酸钠制备中的应用；属食品发酵生产技术领域。
背景技术
乳酸钠，分子式C3H5NaO3，分子量为112.06，纯净的乳酸钠为无色或近乎无色的澄清液体。乳酸钠广泛应用于食品、医药和化妆品等行业。在食品行业，乳酸钠可作为食品保鲜剂、乳化剂、保湿剂、风味改进剂、品质改进剂、抗氧化增效剂和pH调节剂，能增强风味、抑制食物内致病细菌的生长、延长产品货架期，已在国外部分替代苯甲酸钠作防腐剂应用于食品行业；在医药行业，乳酸钠主要作为注射针剂，其主要功能为补充体液和调节人体内电解质平衡；在化妆品行业，L-乳酸钠广泛用作护肤品的滋润剂，能使皮肤保持水分，减少皱纹。乳酸钠分子中有一个不对称碳原子，因此具有旋光性。L-乳酸钠为左旋性，D-乳酸钠为右旋性，DL-乳酸钠为消旋性。只有L-乳酸钠能为人体所利用，因此开发高光学纯度L-乳酸钠的生产技术具有重要的意义。
乳酸钠还可用于合成乳酸，进而生产可降解聚合物——聚乳酸。聚乳酸具有生物相容性、生物可降解性及优良的机械性能和物理性能，因而被产业界认为是新世纪最有发展前途的新型包装材料，将有望逐步替代聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等材料，应用前景十分广阔。
经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN1076725C，公告日1993-09-29，记载了一种“好气菌的繁殖或好气发酵的方法”，该技术利用碳酸钠或者氢氧化钠与乳酸直接反应进行乳酸钠生产的工艺，该方法的前提是要有高纯度的乳酸，传统的DL-乳酸价格便宜，但是高光学纯度的L-乳酸价格昂贵，因此不适合与L-乳酸钠的生产；生物法主要是利用产乳酸的微生物进行发酵，在发酵的过程中加入碳酸钙或氢氧化钙进行中和反应，得到乳酸钙，然后再同碳酸钠反应生成乳酸钠。还有一种方法是在发酵的过程中利用氢氧化钠或者碳酸钠为中和剂，这样发酵液中得到的就直接是乳酸钠，但是由于乳酸钠对菌体的毒害作用，通常发酵的产量不高。此外，生物法生产的乳酸钠的构型依赖于所使用的微生物，目前能够获得高光学纯度L-乳酸钠的菌株并不多见，而凝结芽孢杆菌是一种可产生高光学纯度L-乳酸的菌株。
进一步检索发现，中国专利文献号CN101173242，公开日2008-5-7，记载了一种“生产L-乳酸的方法及其专用凝结芽孢杆菌”，该技术利用一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans CASHCGMCC №2184)能够高效的生产L-乳酸，但该专利中利用碳酸钙为中和剂，发酵液中实际得到的是乳酸钙。
美国专利号5079164以及中国专利文献号CN1498265A分别记载了两种利用凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans DSM 5196和凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans SIM-7DSM 14043进行乳酸生产的方法，但该技术最终得到的产物也是乳酸钙。
【发明内容】
本发明针对现有技术存在的上述不足，本发明目的是提供一株凝结芽孢杆菌及其在L-乳酸钠制备中的应用。
本发明所述凝结芽孢杆菌实验室命名为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASN，该菌株从上海嘉定区某香料厂附近土壤中筛选并诱变得到。所述的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CASN已于2010年01月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：武汉市武昌珞珈山)，保藏登记号为CCTCC M 2010035。
本发明所述凝结芽孢杆菌在L乳酸钠制备中的应用；是通过将所述凝结芽孢杆菌进行培养和发酵后获得L-乳酸钠。
其中：
所述的培养是指以下两种方式中的一种实施：
a)依次进行的斜面培养和种子培养；
b)直接进行种子培养。
所述的斜面培养是指：将所述凝结芽孢杆菌接种于含有1.5～2.0g/100ml的琼脂的固体斜面培养基上，培养温度45～60℃，培养时间8～12小时；
所述的菌体培养温度优选是50～55℃；
所述的菌体培养时间优选是9～10小时；
所述的种子培养是指：用斜面培养得到的产物或所述凝结芽孢杆菌接种到种子培养基中，培养温度45～60℃，培养方式为利用漩涡式摇床培养，转速120转/分钟，培养时间6～8小时；
所述种子培养基每升中含有：葡萄糖60～80克，酵母粉10～15克，大豆蛋白胨5～8克，碳酸钙10～20克，余量为水；所述种子培养基的pH为5.5～6。
所述的菌体培养温度优选是50～55℃；
所述的菌体培养时间优选是6～7小时；
所述的发酵是指：以所述凝结芽孢杆菌制得种子液，然后将种子液接入发酵培养基，以温度45～60℃，并通入空气0.1～1.5vvm培养12～24小时，之后停止通气，继续培养18～48小时，发酵过程中控制搅拌转速在100～500转/分钟，得含有L乳酸钠的发酵培养液。进一步优选的方式是：以所述凝结芽孢杆菌制得种子液，然后将种子液接入发酵培养基，以温度50～55℃，并通入空气0.1～0.5vvm培养18～36小时，之后停止通气，继续培养24～48小时，发酵过程中控制搅拌转速在200～300转/分钟，得含有L-乳酸钠的发酵培养液。
其中，所述发酵过程中利用氢氧化钠或者碳酸钠控制pH为5.5～6.0。
上述发酵培养基中含有葡萄糖80～170克/升、氮源5～20克/升，余量为水；其中所述氮源是指：酵母粉5～15克/升、大豆蛋白胨5～15克/升和棉籽蛋白10～20克/升中的一种或其任意重量比例组合。
实验证实：本发明从上海嘉定区某香料厂附近土壤中筛选并诱变得到的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASN CCTCC M 2010035对L-乳酸钠耐受性较已有的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184有明显提高。具体的，将凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CASN CCTCC M 2010035和凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184分别在L-乳酸钠压力培养基中培养20小时后，菌株CASH的干重为0.77克/升，而菌株CASN的干重达到1.3克/升，比菌株CASH提高了68.8％，比较结果见图1。
本发明利用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASN CCTCC M 2010035，实现了以葡萄糖为底物，在45～60℃条件下以90～95％的糖酸转化率高效发酵生产光学纯度99％以上的L-乳酸钠，测试结果显示：L-乳酸钠浓度最高可达162克/升，体积生产效率最高可达5.2克/升/小时，另外在发酵过程中通过改变通风并控制pH值，能有效提高菌株对乳酸钠的耐受性，并减少副产物地生成，提高转化效率。
【附图说明】
图1为本发明菌株同凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184对L-乳酸钠耐受性的比较示意图。
图2为本发明制备过程中葡萄糖和L-乳酸钠的变化曲线。
【具体实施方式】
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASN CCTCC M 2010035的分离诱变筛选及鉴定
1、分离诱变筛选
从上海嘉定区某香料厂附近取得土样，每1克土样加入50毫升营养肉汤培养基(葡萄糖50克/升，酵母粉10克/升，pH为6)中，50℃富集培养8～12小时。然后稀释涂布到含营养琼脂培养基(葡萄糖50克/升，酵母粉10克/升，碳酸钙20克/升，琼脂粉10克/升，pH为6)的培养皿中，50℃培养24小时。待长出单菌落后，挑选菌落面积和透明圈面积大的菌落280个，分别接种到发酵培养基(葡萄糖150克/升，酵母粉20克/升，碳酸钙80克/升，pH为6)中，50℃摇床培养48小时，测定L-乳酸的产量，挑选产量最高的菌株，用于下一步紫外诱变。
将初步挑选的菌株接种于营养肉汤培养基中，50℃摇床培养至对数中期，用生理盐水洗涤后悬浮，调成108个菌/毫升，取5毫升于9厘米培养皿中，距紫外灯30厘米处分别诱变15秒、30秒、1分钟和5分钟，从各不同诱变条件下得到的诱变菌液中分别吸取100微升，涂布到营养琼脂培养基上，在黑暗的条件下50℃培养14小时，用生理盐水将培养皿上的菌洗涤下来，分别取100微升接入含5％(5克/100毫升)L-乳酸钠的营养肉汤培养基(葡萄糖50克/升，酵母粉10克/升，L-乳酸钠50克/升)中，50℃摇床培养，挑选生长最快的一组培养液，稀释该培养液，涂布在含2％(2克/100毫升)L-乳酸钠的营养固体培养基(葡萄糖50克/升，酵母粉10克/升，L-乳酸钠20克/升，琼脂18克/升)平板上，待长出单菌落后，挑选菌落面积大的菌落，接种到含5％L-乳酸钠的营养肉汤培养基中，50℃摇床培养，挑选生长最快的菌株。最终得到L-乳酸钠耐受性最强的菌株。
2、菌株的鉴定
根据“伯杰系统鉴定手册(第八版)”和“常见细菌系统鉴定手册”(科学出版社)提供的鉴定方法对上述L-乳酸钠耐受性最强的菌株进行鉴定，鉴定结果表明该菌为杆状，长2.5～4微米，宽0.8～0.9微米，孢子非球形，牙孢囊不膨大。可在厌氧条件下生长，可在pH5.7下生长，可在60℃生长，不能在65℃生长，能够在2％氯化钠生长，不能在5％氯化钠生长。可利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇，不能利用木糖、果糖，能够水解淀粉、七叶灵，不能水解酪蛋白、吐温80、白明胶，精氨酸水解酶阳性。该菌株脂肪酸分析的结果同典型的凝结芽孢杆菌。
基于以上特征，上述L-乳酸钠耐受性最强的菌株鉴定为凝结芽孢乳杆菌(Bacilluscoagulans)，实验室命名凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASN，该菌株已于2010年01月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：武汉市武昌珞珈山)，保藏登记号为CCTCC M 2010035。
实施例2
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASN CCTCC M 2010035同凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CASH CGMCC №2184对L-乳酸钠耐受性的比较
将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASN CCTCC M 2010035和凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CASH CGMCC №2184分别在L-乳酸钠压力培养基(葡萄糖50克/升，酵母粉10克/升，L-乳酸钠0.5摩尔/升)中培养，20小时后，菌株CASH的干重为0.77克/升，而菌株CASN的干重达到1.3克/升，比菌株CASH提高了68.8％，具体的比较结果见图1。
实施例3
利用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASN CCTCC M 2010035在5升发酵罐中发酵生产L-乳酸钠
该实施例中所用的培养基的组成如下：
斜面培养基：葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/升，琼脂粉15克/升。该培养基的初始pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
种子培养基：葡萄糖70克/升，酵母粉10克/升，大豆蛋白胨5克/升，碳酸钙15克/升。该培养基的初始pH为6.5。115℃条件下灭菌20分钟。
发酵培养基：葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)120克/升，酵母粉(北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01-013)10克/升，大豆蛋白胨(北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01-004)2克/升。该发酵培养基的初始pH为6.5，不灭菌。
该发酵生产L-乳酸钠的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASN CCTCC M 2010035菌种接种于斜面培养基上，50℃条件下，静止培养10小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有100ml种子培养基的300ml三角瓶中，50℃条件下，摇床培养6小时，转速120转/分钟(13mm旋转半径)，制得种子液；
(3)发酵培养：德国贝朗(BIOSTAT B，B.Braun)5升发酵罐中加入4升发酵培养基。在发酵培养基中接入400ml种子培养液，发酵罐搅拌转速200转/分钟(33mm旋转半径)，空气的通入量为0.5vvm，16小时后停止通风，利用10M的氢氧化钠控制发酵液的pH为6.5，50℃条件下发酵30小时。实验共设10次重复。每3个小时取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液检测发酵液中L-乳酸钠浓度、D-乳酸钠浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、体积生产效率和L-乳酸钠的光学纯度。
其中，葡萄糖的测定方法为，发酵液稀释后离心，采用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院)测定。
L-乳酸钠和D-乳酸钠含量的测定方法为，采用Agilent 1100液相色谱仪，配备手性分离柱(日本三菱化学公司，MCI GEL-CRS10W(3μ)4.6ID×50mm，光学异体分离用)。具体操作条件为：0.002mol/L硫酸铜作为流动相，流量0.5ml/min，进样量20μL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25℃。利用L-乳酸钠和D-乳酸钠标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中L-乳酸钠和D-乳酸钠的含量。
本发明中，作为标准品的D-乳酸钠为德国Sigma-Aldrich公司的产品，其货号为77166-1G；作为标准品的L-乳酸钠为德国Sigma-Aldrich公司的产品，其货号为71718-10G。在如上色谱条件下，D-乳酸保留时间为10.150分钟，L-乳酸保留时间为12.293分钟。
光学纯度(optical purity)是衡量旋光性样品中一个对映体超过另一个对映体的量的量度，它可用对映体过量值(enantiomeric excess)表示。本发明中L-乳酸的光学纯度按以下公式计算：(L-乳酸含量-D-乳酸含量)÷(L-乳酸含量+D-乳酸含量)×100％。
糖酸转化率定义为：L-乳酸产量(克/升)÷葡萄糖的消耗量(克/升)×100％。
体积生产效率定义为：L-乳酸钠产量(克/升)÷发酵时间(小时)。
发酵结束后，葡萄糖的浓度为1.4克/升±0.6克/升，L-乳酸钠浓度134克/升±1.8克/升，糖酸转化率91.0％±0.5％，体积生产效率4.5克/升/小时±0.4克/升/小时，L-乳酸钠光学纯度99.5％±0.1％。
实施例4
利用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASN CCTCC M 2010035在5升发酵罐中发酵生产L-乳酸钠
该实施例中所用的斜面和种子的培养基的组成以及培养方式同实施例3。
发酵初始培养基：葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)108克/升，大豆蛋白胨(北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01-004)10克/升，棉籽蛋白(北京康明威培养基技术有限责任公司)8克/升。该发酵培养基的初始pH为6.5，不灭菌。
发酵培养：德国贝朗(BIOSTAT B，B.Braun)5升发酵罐中加入4升发酵初始培养基。在发酵培养基中接入400ml种子培养液，发酵罐搅拌转速300转/分钟(33mm旋转半径)，空气的通入量为0.2vvm，12小时后停止通风，利用10M的碳酸钠控制发酵液的pH为6.0，55℃条件下共发酵24小时。发酵液6,000转/分钟离心5分钟，取上清液检测发酵液中L-乳酸钠浓度、D-乳酸钠浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、体积生产效率和L-乳酸钠光学纯度。
结果表明发酵结束后，葡萄糖的浓度为1.1克/升±0.2克/升，L-乳酸钠浓度125克/升±2.2克/升，糖酸转化率93.5％±0.4％，体积生产效率5.2克/升/小时±0.3克/升/小时，L-乳酸钠光学纯度99.5％±0.2％。
实施例5
利用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASN CCTCC M 2010035在30升发酵罐中发酵生产L-乳酸
该实施例中所用的斜面和种子的培养基的组成以及培养方式同实施例3。
发酵初始培养基：葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)160克/升，酵母粉(北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01-013)5克/升，棉籽蛋白(北京康明威培养基技术有限责任公司)20克/升。该发酵培养基的初始pH为6.5，不灭菌。
发酵培养：上海保兴30升发酵罐中加入20升发酵初始培养基。在发酵培养基中接入2升种子培养液，发酵罐搅拌转速150转/分钟(33mm旋转半径)，空气的通入量为1vvm，20小时后停止通风，利用10M的碳酸钠控制发酵液的pH为6.2，52℃条件下共发酵48小时。其中，发酵到26小时(经检测，此时发酵液中葡萄糖的浓度为19克/升)，停止通风，按照每升发酵液中补加3克酵母粉的量补加酵母粉、按照每升发酵液中补加6克棉籽蛋白的量补加棉籽蛋白；即每个发酵罐中60克酵母粉(北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01-013)、120克棉籽蛋白(北京康明威培养基技术有限责任公司)。实验共设10次重复。发酵液6,000转/分钟离心5分钟，取上清液检测发酵液中L-乳酸钠浓度、D-乳酸钠浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、体积生产效率和L-乳酸钠光学纯度。
结果表明凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASN CCTCC M 2010035发酵生产L-乳酸过程中葡萄糖和L-乳酸钠的变化曲线如图2所示。发酵结束后，葡萄糖的浓度为15.0克/升±2.8克/升，L-乳酸钠浓度162克/升±5.2克/升，糖酸转化率90.2％±1.3％，体积生产效率3.4克/升/小时±0.3克/升/小时，L-乳酸光学纯度99.7％±0.3％。