一种 CHIP 基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应 用 【技术领域】
本发明涉及一种试剂盒， 具体地说关于一种 CHIP 基因的原位杂交检测试剂盒及 其检测方法和应用 【背景技术】
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一， 据资料统计， 发病率占全身各种恶性肿瘤 的 7-10％， 在妇女仅次于子宫癌。它的发病常与遗传有关， 以及 40-60 岁之间， 绝经期前后 的妇女发病率较高。仅约 1-2％的乳腺患者是男性。通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿 瘤。是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一，
乳腺癌从癌前变到形成癌症， 需要几年时间， 如何做到早期检测、 诊断、 预后的检 测及诊治后的复发、 转移早期检出是降低发病率和死亡率的关键。
日本筑波大学一个研究小组发现， 人体细胞中的蛋白质 “CHIP” 可以抑制乳腺癌细 胞增殖和转移。 这一成果 2 月 9 日发表在英国 《自然 - 细胞生物学》 (Nature Cell Biology) 杂志网络版上。研究人员说， 他们注意到， 在人体细胞中， 蛋白质 “CHIP” 的水平随着乳腺癌 的发展而降低， 用实验鼠进一步研究发现， 减少 “CHIP” 的量， 实验鼠乳腺癌细胞形成大块肿 瘤， 且转移加快 ； 增加 “CHIP” 的量， 乳腺癌细胞增殖和转移能力则受到极大的抑制。研究人 员说， 这一发现表明， 可以通过提高 “CHIP” 蛋白质的量或促使其活跃来抑制乳腺癌细胞的 增殖和转移。这项成果为开发防治乳腺癌新药提供了思路。此外， 由于 “CHIP” 蛋白质也存 在于乳腺以外的组织， 研究人员推测， 它可能还能抑制其他癌症细胞的增殖和转移。
随着分子生物技术日益完善， 功能基因组学， 癌症基因组学等研究的深入展开， 至今， 我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断， 在癌变前期或癌细胞形成 ( 单克 隆时 ) 就能做到早期预测诊断。本发明采用核酸原位杂交技术检测 CHIP 基因的表达量， 对乳腺癌的基因水平的早期诊断有非常重要的临床价值。CHIP 基因序列号 ： NM-005861， 1646bp， CDS ： 412… 1323bp， 在染色体 16p13.3″。
本发明的原位杂交技术 (in situ hybridization) 是将分子生物学与细胞化学技 术结合起来， 以标记的核酸分子为探针， 在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。 其原 理是使含有特异序列、 经过标记的核酸单链 ( 即探针 )， 在适宜条件下与组织细胞中的互补 核酸单链即靶核酸发生杂交， 再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测， 从而在细胞原位显示特异的 DNA 或 RNA 分子。 【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供一种 CHIP 基因的原位杂交检测试 剂盒的用途。
本发明的再一的目的是， 提供一种 CHIP 基因的原位杂交检测试剂盒。
本发明的另一的目的是， 提供一种 CHIP 基因的原位杂交检测方法。为实现上述目的， 本发明采取的技术方案是 ：
一种 CHIP 基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测乳腺癌疾病药物中的应用， 所 述的试剂盒包括杂交探针、 标记物， 所述的杂交探针序列如 SEQ ID NO.1 所示。
所述的杂交探针序列如 SEQ ID NO.1 所示的 RNA 序列。
所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。 35 125
所述的放射性核素选自 3H、 S、 I 或 32P 中的一种。
所述的非放射性标记物选自生物素、 地高辛、 碱性磷酸酶、 辣根过氧化酶或荧光素 中的一种。
所述的非放射性标记物优选自地高辛。
所述的试剂盒还包括增效剂， 所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。
为实现上述第二个目的， 本发明采取的技术方案是 ：
一种 CHIP 基因的原位杂交检测试剂盒， 包括杂交探针、 标记物， 其中所述的杂交 探针序列如 SEQ ID NO.1 所示， 所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。
为实现上述第三个目的， 本发明采取的技术方案是 ：
一种 CHIP 基因的原位杂交检测方法， 该方法包括以下步骤 ： a、 将试剂盒中的杂交探针与底物中待测 RNA 接触， 形成杂交复合体 ；
b、 检测 a 步骤得到的杂交复合体。
本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针， 杂交液， 显色剂， 增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知， 具体操作步骤是标本处理、 预杂交、 杂 交、 免疫组化染色、 镜下进行定量分析、 结果报告， 其中杂交的具体步骤包括 ：
仪器操作 ：
1). 将待测标本放入反应槽中 ；
2). 仪器自动弃去液体， 自动加消化液 ；
3). 仪器自动弃去液体， 自动后固定 ；
4). 仪器自动弃去液体， 自动预杂交 (42℃ ) ；
5). 仪器自动弃去液体， 自动清洗 ；
6). 仪器自动弃去液体， 自动杂交 (42℃ ) ；
7). 仪器自动弃去液体， 自动清洗 ；
8). 仪器自动弃去液体， 自动与 DIG 抗体培养 ( 室温 ) ；
9). 仪器自动弃去液体， 自动清洗， 显色 ；
10). 取出封片镜检。
本发明优点在于 ：
1、 本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、 特异性强的特点。
2、 本发明的检测方法操作方便、 简单， 能在区级以上医院普遍使用和推广。
3、 本发明的临床意义是更早期跟踪检测乳腺癌发生动态过程， 以及用于乳腺癌预 防医学的检测和筛选工具。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物， 以及 影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上检测 CHIP 异常表达， 在影像医学检查 及其它检查未发现占位性乳腺癌病灶之前， 癌症生化指标未产生异常之前， 亦未形成肿块 之前， 能及早做到以上基因表达异常的信息采集， 给临床乳腺癌病患一个真正的预后早期
诊断。这样才有可能实施乳腺癌的早期诊断、 早期预防、 早期治疗， 有可能从源头上彻底根 治乳腺癌恶疾。 【附图说明】
图 1 是本发明实施例中乳腺癌症病人 CHIP 基因表达图片。
图 2 是正常乳腺 CHIP 基因表达图片。 【具体实施方式】
下面结合附图对本发明具体实施方式作详细说明。
实施例 1
一种 CHIP 基因的原位杂交检测试剂盒， 包括杂交探针、 标记物、 增效剂， 其中， 所 述的杂交探针序列如 SEQ ID NO.1 所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和 标本组成如下 ：
消化液 100μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
保护液 100μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
预杂交液 1300μl/ 管 2 管 / 盒 无色透明液体
正义杂交液 10μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
反义杂交液 10μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
封闭液 1000μl/ 管 1 管 / 盒 无色透明液体
碱性磷酸酶抗体 1μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
显色剂 A 175μl/ 管 1管/盒 黄色液体
显色剂 B 320μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
缓冲液 I 10x 90ml/ 瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体
缓冲液 II 10x 80ml/ 瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体
缓冲液 III 10x 20m/ 瓶 3瓶/盒 浅黄色或无色透明液体
缓冲液 IV 10x 90ml/ 瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体
固定液 90ml/ 瓶 1瓶/盒 无色透明液体
阳性对照标本 6片/盒
上述试剂成分说明 ： ( 所有试剂购自 SIGMA)
1、 消化液 ： 20mg/ml 蛋白酶 K， 100mg 蛋白酶 K， 加 DEPC-H2O 5ml ；
2、 保护液 ： 0.2g 的 glycine 加入 1ml 的 1× 缓冲液 I ；
3、 预杂交液 ： 1× 缓冲液 II 7.5ml
50×D 3ml
10mg/ml yest t-RNA 750ul
11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul
0.04M EDTA 3ml
50％ formamide 15ml
4、 封闭液 ： 0.03g 的 bloking( 购买自罗氏公司 ) 加入 1ml 1× 缓冲液 III ；
5、 10x 缓冲液 I ： (PH7.1-7.4)NaCl 80g Na2HPO4.12H2O 360g KCl 2g KH2PO42g 加三蒸水至 1l， 并高压灭菌 ； 6、 10x 缓冲液 II ： (PH7.0) NaCl 175.3g 柠檬酸钠 88.2g HCl 几滴 加三蒸水至 1l， 并高压灭菌 ； 7、 缓冲液 III ： (PH7.9) Tris 121.1g NaCl 87.66g HCl 60ml 左右 加三蒸水至 1l， 并高压灭菌 ；8、 缓冲液 IV ：
1M Tris-HCl(PH9.5) ： Tirs 121.1g 加 HCl 3ml 左右， 加水 900ml， 调 PH 至 9.5， 加 水至 1l， 并高压灭菌 ；
1M NaCl ： NaCl 58.44 加水至 1l， 并高压灭菌 ；
0.5M MgCl2 ： 101.65g MgCl2.6H2O 加水至 1l， 并高压灭菌 ；
9、 固定液 ： 多聚甲醛 40g 加 1× 缓冲液 I 至 1l， 稍加热 ( 约 50-60 度 ) 搅拌至溶 解；
10、 显色剂 A ： NBT 1g 加 70％ DMF11.44ml ；
11、 显色剂 B ： BCIP 1g 加 100％ DMF30ml。
本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。
实施例 2
一种 CHIP 基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用
一、 标本处理
1、 用 10ml 的离心管， 装 4.5ml 淋巴细胞分离液， 再将 3ml 抗凝血缓慢加入含有淋 巴细胞分离液 ( 血∶淋巴细胞分离液＝ 1 ∶ 1.5) 的离心管中， 2000r/min 离心 10min ；
2、 吸取中间层白细胞至另一离心管中， 再在此管中加入约两倍的 1× 缓冲液 I， 混 匀， 1500g/min 离心 10min ；
3、 弃上清 . 沉淀加入约两倍的 1× 缓冲液 I， 混匀， 1500g/min 离心 10min ；
4、 弃上清， 并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。 再将沉淀制成悬液， 滴在玻片上 推片， 自然干燥。( 有条件的医院可以用制片机制片。)3ml 血， 可以做 4 张片子 ；
5、 用 40ml 4％固定液， 在玻璃缸中， 固定 30min， 再用 1× 缓冲液 I 洗 5min。每缸 可以放 16 片 ；
6、 标本可保存在 -20℃， 或继续做实验。
二、 将试剂盒中试剂配制成使用浓度1、 将 10× 缓冲液 I 用三蒸水按 1 ∶ 10 稀释成 1× 缓冲液 I ；
2、 将 20× 缓冲液 II 用三蒸水按 1 ∶ 10 稀释成 2× 缓冲液 II ；
按 1 ∶ 100 稀释成 0.2× 缓冲液 II ； 按 1 ∶ 200 稀释成 0.1× 缓冲液 II ；
3、 将 10× 缓冲液 III 用三蒸水按 1 ∶ 10 稀释成 1× 缓冲液 III ；
4、 10× 缓冲液 IV 用三蒸水按 1 ∶ 10 稀释成 × 缓冲液 IV( 取 1#， 2#， 3# 各 10ml， 加水至 100ml 既可 )。
三、 实验步骤 ：
1、 取每位待检者标本两张， ( 另外两张留作复查用 ) 及阳性对照标本两张 ( 每次 实验做一对阳性对照 ) ；
2、 在 玻 璃 缸 里 加 消 化 液 ( 消 化 液 100ul 加 1× 缓 冲 液 199.9ml， 即为使用浓 度 )20ml。37℃水浴预热 10 分钟。放进 16 张玻片， 37℃处理 12min， 再用 1× 缓冲液 I 洗 5min ；
3、 用 0.2％的保护液 ( 保护液 1ml 加 1× 缓冲液 I99ml 即为使用浓度 ) 洗 10min， 三蒸水洗 5min， 以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥 ；
4、 将玻片放入保湿盒内， 加预杂交液 20ul/ 片 . 盖上盖玻片， 盖紧保湿盒， 放在 42℃恒温水浴箱中 3h 以上 ； 5、 取出玻片， 弃去盖玻片， 将玻片放入玻璃缸内， 用 70 ％， 90 ％， 95 ％的乙醇各洗 2min， 自然干燥 ；
6、 将玻片放入保湿盒内， 每位病人标本两张， 一张加正义杂交液 20ul/ 片， 另一张 加反义杂交液 20ul/ 片， 盖上盖玻片， 盖紧保湿盒， 放在 42℃恒温水浴箱中 16-24h ；
7、 取出玻片， 弃去盖玻片， 将玻片放入玻璃缸内
在 42℃恒温水浴箱中用 2× 缓冲液 II 洗两次， 每次 15min
在 42℃恒温水浴箱中用 0.2× 缓冲液 II 洗一次， 每次 15min
在 42℃恒温水浴箱中用 0.1× 缓冲液 II 洗两次， 每次 15min ；
8、 用 1× 缓冲液 III 洗 30s， 取出玻片， 自然干燥 ；
9、 将玻片放入保湿盒内， 加 0.5％ l 封闭液 (1ml 封闭液加 5ml1× 缓冲液 III)
100ul/ 片， 盖紧保湿盒， 在室温下作用 30min ；
10、 取出玻片， 用 1× 缓冲液 III 洗 30s， 自然干燥 ；
11、 将玻片放入保湿盒内， 加碱性磷酸酶抗体 ( 加入 1.8ml 1× 缓冲液 III)100ul/ 片， 盖紧保湿盒在室温下作用 30min ；
12、 取出玻片， 用 1× 缓冲液 III 洗 3 次， 每次 15min ；
13、 1× 缓冲液 IV 洗 2min， 加显色剂 ( 显色剂 A73.3ul， 显色剂 B157.5ul 加到 30ml 1× 缓冲液 IV 中， 混匀 )， 室温避光 12h 以上 ；
14、 用三蒸水洗 5min， 自然干燥， ( 用甘油加 10％的 1× 缓冲液 I 混匀 ) 封片镜检。
四、 结果判断
在光镜下计数 100-300 个细胞， 计算染上紫色细胞的百分比。
阳性对照标本加反义杂交液的应该 80％以上染上紫色。
所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。
地高辛标记的 cDNA、 RNA 和寡核苷酸探针， 不但探针的具有生物素标记优点， 还克
服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点 )， 将该杂交探 针与人体血液白细胞的待测 RNA 核酸进行杂交， 再用免疫组化的方法显色， 在光镜下观察 mRNA 的存在和定位， 根据染色的细胞数， 判断目的基因的表达量。
本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术， 该方法通过检测底物细胞中的 CHIP 基因表达量， 用来确定乳腺癌的预后。临床研究表明， CHIP 基因在乳腺癌中低表达， 因为 CHIP 基因在正常人高表达， CHIP 基因的低表达说明乳腺癌， CHIP 基因的表达程度与乳癌的 预后有关， 属负相关， 表达愈低预后愈差。从而获得乳腺癌的诊断信息。如上所述， 当检测 到 CHIP 基因表达时， 可预测受试者为乳腺癌情况。具体结果请见图 1 和图 2。
SEQUENCE LISTING
<110> 芮屈生物技术 ( 上海 ) 有限公司
<120> 一种 CHIP 基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用
<130>/
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1646 <212>DNA <213> 智人 (Homo sapiens) <400>1 gctgttgcgg gagcgcgccc tcagcgaagc gtgtgtggcg gccgccgccg aggcgggttc ctacgcgaac gcccaccctt aagagcgcgg cccgacgtcg cgggcccagt gtccccgtcc cgcccccacg cgtgcgtccc cgctggtccc tgggccgggc ccgagcggat cgcgggctcg ccgcgaggcg cggagcttgg gagcggagcc aaggaggaga aggagggcgg cgcacggctg ccgagcgcgc aggagctcaa ggagcagggc gaggcggcgg cctgctacgg ccgcgcgatc accaaccggg ccttgtgcta cctgaagatg cggcgcgccc tggagctgga cgggcagtct cagctggaga tggagagcta tgatgaggcc gccaaggagc agcggctgaa cttcggggac aagaagcgct ggaacagcat tgaggagcgg tacctctcca ggctcattgc cgcggagcgt cacgagggtg atgaggacga cagccacgtc cacgacaagt acatggcgga catggacgag aagcgagaca tccccgacta cctgtgtggc tgcatcacgc ccagtggcat cacctacgac8aagtgaggca cgaagagacc ggacagggaa aggctggttg gcccccggcc ggctgcgggg caggccgtgc ggcgctggcg aatcgtctgt acccggaacc cagcagcacg gtgaaggcgc atcgccaatc gacatcccca cgcatccacc gagagggagc cgggcccagc cttttttctc aagatcagct cgcaaggacatctcactggg tcagcagggc ctggagcgtt ggcgcacgcg ggaagttccg ctccggctgc cgcgcggcgc gcggaagccc tcgtgggccg cgctggtggc agcaggccct acttcttcct tgcagcgagc gcgctcttcg aggagagcga tggaagagtg aggcctgcat aggtggatga ttgagctgat tcgaggagcaaaagtcgaat aggccagggc cctcccagcc cggccccact gcggcggagc gggcgctggg catgaagggc cgagaagagc aaagtacccg cgtgtattac ggccgactgc ggggcagtgc ttacagcctg aatcgcgaag gctgcactcc ccagcgaaac tgaggccaag gaagaggaag gcgggagccg cctgcagcgt60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200101993940 A CN 101993944
说明书aggaacagct atggctgggt ccctgggcag tcccccaagt gccgtgatcg attgccgcca gaaaaaaaaa catccccaac ggaggactac aagcccccgg tctgctgttg tccccctttg ctatctgtgt aaaaaaaaaa7/7 页gtgggtcatt ttggctatga tgaggttccc cccctataca gactctggac tgggctggaa aataaaatcc aaaaaaaaaattgaccccgt gacccggagc aggaggttat tgacgcattc tgccctacct ggcgtcctgg tagtttatgt tcctggccac tgtttcccct ctcagcatcg aagcaggtga gggtgggctg gtgagcacga ggtgggacgt aaaaaaaaaaaaaaaacccctgaccc atctctgaga tccaggggag cccgaccgct cttttgctgg ggctgaggcc gctggtgtgt1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1646