一种 IL-2 基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应 用 【技术领域】
本发明涉及一种试剂盒， 具体地说关于一种 IL-2 基因的原位杂交检测试剂盒及 其检测方法和应用 【背景技术】
癌症也叫恶性肿瘤， 肿瘤是指机体在各种致瘤因素作用下， 局部组织的细胞异常 增生而形成的局部肿块。癌症病变的基本单位是癌细胞。人体细胞老化死亡后会有新生 细胞取代它， 以维持机体功能， 人体绝大部分细胞都可以增生， 但这种增生是有限度的， 而 癌细胞的增生则是无止境的， 这使患者体内的营养物质被大量消耗。 同时， 癌细胞还能释放 出多种毒素， 使人体产生一系列症状， 晚期时它转移到全身各处生长繁殖， 最后导致人体消 瘦、 无力、 贫血、 食欲不振、 发热及脏器功能受损等， 器官功能衰竭而死亡。
根据国内外权威机构提供的资料， 我国每年癌症的新增人数 160 万， 死亡人数近 160 万， 患者 600 万， 全球每年新增癌症患者 800 万， 死亡人数接近 800 万， 患者约有 8400 万 人， 到 2020 年以上人数将翻一番， 这是一组可怕的数字。而且， 绝大部分癌症患者都只有很 短的生存期， 人类到目前为止还没战胜癌症这一恶疾， 如何做到治愈癌症的关键是要做到 基因水平的早期诊断。
IL-2 是细胞因子， 它在肿瘤的发生过程中起十分重要的作用， 一旦机体 IL-2 的表 达降低， 肿瘤就会朝恶性方向发展。IL-2 通过以下几方面的功能作用来达到消灭和杀死癌 细胞 ： 1.IL-2 是淋巴 T 细胞的生长因子， 能延长 T 细胞的活性， 刺激 T 细胞进入细胞分裂周 期， 增强 T 细胞的杀伤活性 ； 在体内能增强抗原诱导的细胞毒性 T 细胞 (TC) 的活性， 可以辅 助抗原和半抗原直接在体内诱导产生 (TC)。 二者均能对癌细胞进行攻击和杀伤作用。 2. 可 促进 NK 细胞的增殖， 维持 NK 细胞的长期生长。肿瘤病人经 IL-2 治疗后， 血中 NK 细胞数量 明显增加。3.IL-2 可促进 LAK、 TIL 细胞的功能活性， 同时能延长 LAK、 TIL 细胞存活， 也能 扩增和活化 LAK、 TIL 细胞， LAK 是淋巴细胞与 IL-2 接触后产生的一种具有高效抗肿瘤效 应的杀伤细胞， 只有在 IL-2 存在下 LAK 才能产生， 也只有在 IL-2 的存在下 LAK 才能发挥效 果。4. 可促进 B 细胞的增殖和产生免疫球蛋白， 并刺激巨噬细胞， 提高巨噬细胞的吞噬能 力。5.IL-2 能刺激 NO( 一氧化氮 ) 的产生， 消灭癌细胞。IL-2 通过以上等途径来消灭癌细 胞， 当癌症发生时机体的 IL-2 分泌会降低， 同样机体 IL-2 的降低也会使癌细胞生长。人类 的各种癌症都有 IL-2 的表达降低， IL-2 在血液中的浓度变化可用于癌症病人的早期的检 测和预测指标。
癌症从癌前变到形成癌症， 需要几年时间， 如何做到早期检测和诊断及预后的检 测及诊治后的复发、 转移早期检出， 是降低发病率和死亡率的关键。采用核酸原位杂交技 术检测 IL-2 基因， 对癌症的早期基因水平的诊断有重要的临床价值。IL-2 基因序列号 ： NM_000586， 822bp， mRNA， 4q26-q27″， cds ： 56… 517bp。
随着分子生物技术日益完善， 功能基因组学， 癌症基因组学等研究的深入展开， 至今， 我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断， 在癌变前期或癌细胞形成 ( 单克隆 时 ) 就能做到早期预测诊断。
原位杂交技术 (in situ hybridization) 是将分子生物学与细胞化学技术结合起 来， 以标记的核酸分子为探针， 在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。 其原理是使含 有特异序列、 经过标记的核酸单链 ( 即探针 )， 在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链 即靶核酸发生杂交， 再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测， 从而在细 胞原位显示特异的 DNA 或 RNA 分子。 【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供一种 IL-2 基因的原位杂交检测试 剂盒的用途。
本发明的再一的目的是， 提供一种 IL-2 基因的原位杂交检测试剂盒。
本发明的另一的目的是， 提供一种 IL-2 基因的原位杂交检测方法。
为实现上述目的， 本发明采取的技术方案是 ：
一种 IL-2 基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用， 所述 的试剂盒包括杂交探针、 标记物， 所述的杂交探针序列如 SEQ ID NO.1 所示。 所述的杂交探针序列如 SEQ ID NO.1 所示的 RNA 序列。
所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。 35 125
所述的放射性核素选自 3H、 S、 I 或 32P 中的一种。
所述的非放射性标记物选自生物素、 地高辛、 碱性磷酸酶、 辣根过氧化酶或荧光素 中的一种。
所述的非放射性标记物优选自地高辛。
所述的试剂盒还包括增效剂， 所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。
为实现上述第二个目的， 本发明采取的技术方案是 ：
一种 IL-2 基因的原位杂交检测试剂盒， 包括杂交探针、 标记物， 其中所述的杂交 探针序列如 SEQ ID NO.1 所示， 所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。
为实现上述第三个目的， 本发明采取的技术方案是 ：
一种 IL-2 基因的原位杂交检测方法， 该方法包括以下步骤 ：
a、 将试剂盒中的杂交探针与底物中待测 RNA 接触， 形成杂交复合体 ；
b、 检测 a 步骤得到的杂交复合体。
本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针， 杂交液， 显色剂， 增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知， 具体操作步骤是标本处理、 预杂交、 杂 交、 免疫组化染色、 镜下进行定量分析、 结果报告， 其中杂交的具体步骤包括 ：
仪器操作 ：
1). 将待测标本放入反应槽中 ；
2). 仪器自动弃去液体， 自动加消化液 ；
3). 仪器自动弃去液体， 自动后固定 ；
4). 仪器自动弃去液体， 自动预杂交 (42℃ ) ；
5). 仪器自动弃去液体， 自动清洗 ；
6). 仪器自动弃去液体， 自动杂交 (42℃ ) ；
7). 仪器自动弃去液体， 自动清洗 ；
8). 仪器自动弃去液体， 自动与 DIG 抗体培养 ( 室温 ) ；
9). 仪器自动弃去液体， 自动清洗， 显色 ；
10). 取出封片镜检。
本发明优点在于 ：
1、 本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、 特异性强的特点。
2、 本发明的检测方法操作方便、 简单， 能在区级以上医院普遍使用和推广。
3、 本发明的临床意义是更早期跟踪检测癌症发生动态过程， 以及用于癌症预防医 学的检测和筛选工具。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物， 以及影像 医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上检测 IL-2 异常表达， 在影像医学检查及其 它检查未发现占位性癌症病灶之前， 癌症生化指标未产生异常之前， 亦未形成肿块之前， 能 及早做到以上基因表达异常的信息采集， 给临床癌症病患一个真正的预后早期诊断。这样 才有可能实施癌症的早期诊断、 早期预防、 早期治疗， 有可能从源头上彻底根治癌症恶疾。 【附图说明】
图 1 是是本发明实施例中癌症病人 IL-2 基因过量表达图片。
图 2 是正常人 IL-2 基因表达图片。 【具体实施方式】
下面结合附图对本发明具体实施方式作详细说明。
实施例 1
一种 IL-2 基因的原位杂交检测试剂盒， 包括杂交探针、 标记物、 增效剂， 其中， 所 述的杂交探针序列如 SEQ ID NO.1 所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和 标本组成如下 ：
消化液 100μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
保护液 100μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
预杂交液 1300μl/ 管 2管/盒 无色透明液体
正义杂交液 10μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
反义杂交液 10μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
封闭液 1000μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
碱性磷酸酶抗体 1μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
显色剂 A 175μl/ 管 1管/盒 黄色液体
显色剂 B 320μl/ 管 1管/盒 无色透明液体
缓冲液 I 10x 90ml/ 瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体
缓冲液 II 10x 80ml/ 瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体
缓冲液 III 10x 20m/ 瓶 3瓶/盒 浅黄色或无色透明液体
缓冲液 IV 10x 90ml/ 瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体
固定液 90ml/ 瓶 1瓶/盒 无色透明液体阳性对照标本 6片/盒 上述试剂成分说明 ： ( 所有试剂购自 SIGMA) 1、 消化液 ： 20mg/ml 蛋白酶 K， 100mg 蛋白酶 K， 加 DEPC-H2O 5ml ； 2、 保护液 ： 0.2g 的 glycine 加入 1ml 的 1× 缓冲液 I ； 3、 预杂交液 ： 1× 缓冲液 II 7.5ml 50×D 3ml 10mg/ml yest t-RNA 750ul 11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul 0.04M EDTA 3ml 50％ formamide 15ml 4、 封闭液 ： 0.03g 的 bloking( 购买自罗氏公司 ) 加入 1ml 1× 缓冲液 III ； 5、 10x 缓冲液 I ： (PH7.1-7.4) NaCl 80g Na2HPO4.12H2O 360g KCl 2gKH2PO4 2g
加三蒸水至 1l， 并高压灭菌 ；
6、 10x 缓冲液 II ： (PH7.0)
NaCl 175.3g
柠檬酸钠 88.2g
HCl 几滴
加三蒸水至 1l， 并高压灭菌 ；
7、 缓冲液 III ： (PH7.9)
Tris 121.1g
NaCl 87.66g
HCl 60ml 左右
加三蒸水至 1l， 并高压灭菌 ；
8、 缓冲液 IV ：
1M Tris-HCl(PH9.5) ： Tirs 121.1g 加 HCl 3ml 左右， 加水 900ml， 调 PH 至 9.5， 加 水至 1l， 并高压灭菌 ；
1M NaCl ： NaCl 58.44 加水至 1l， 并高压灭菌 ；
0.5M MgCl2 ： 101.65g MgCl2.6H2O 加水至 1l， 并高压灭菌 ；
9、 固定液 ： 多聚甲醛 40g 加 1× 缓冲液 I 至 1l， 稍加热 ( 约 50-60 度 ) 搅拌至溶 解；
10、 显色剂 A ： NBT 1g 加 70％ DMF11.44ml ；
11、 显色剂 B ： BCIP 1g 加 100％ DMF30ml。
本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。
实施例 2
一种 IL-2 基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用一、 标本处理
1、 用 10ml 的离心管， 装 4.5ml 淋巴细胞分离液， 再将 3ml 抗凝血缓慢加入含有淋 巴细胞分离液 ( 血∶淋巴细胞分离液＝ 1 ∶ 1.5) 的离心管中， 2000r/min 离心 10min ；
2、 吸取中间层白细胞至另一离心管中， 再在此管中加入约两倍的 1× 缓冲液 I， 混 匀， 1500g/min 离心 10min ；
3、 弃上清 . 沉淀加入约两倍的 1× 缓冲液 I， 混匀， 1500g/min 离心 10min ；
4、 弃上清， 并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。 再将沉淀制成悬液， 滴在玻片上 推片， 自然干燥。( 有条件的医院可以用制片机制片。)3ml 血， 可以做 4 张片子 ；
5、 用 40ml 4％固定液， 在玻璃缸中， 固定 30min， 再用 1× 缓冲液 I 洗 5min。每缸 可以放 16 片 ；
6、 标本可保存在 -20℃， 或继续做实验。
二、 将试剂盒中试剂配制成使用浓度
1、 将 10× 缓冲液 I 用三蒸水按 1 ∶ 10 稀释成 1× 缓冲液 I ；
2、 将 20× 缓冲液 II 用三蒸水按 1 ∶ 10 稀释成 2× 缓冲液 II ；
按 1 ∶ 100 稀释成 0.2× 缓冲液 II ； 按 1 ∶ 200 稀释成 0.1× 缓冲液 II ； 3、 将 10× 缓冲液 III 用三蒸水按 1 ∶ 10 稀释成 1× 缓冲液 III ；
4、 10× 缓冲液 IV 用三蒸水按 1 ∶ 10 稀释成 × 缓冲液 IV( 取 1#， 2#， 3# 各 10ml， 加水至 100ml 既可 )。
三、 实验步骤 ：
1、 取每位待检者标本两张， ( 另外两张留作复查用 ) 及阳性对照标本两张 ( 每次 实验做一对阳性对照 ) ；
2、 在 玻 璃 缸 里 加 消 化 液 ( 消 化 液 100ul 加 1× 缓 冲 液 199.9ml， 即为使用浓 度 )20ml。37℃水浴预热 10 分钟。放进 16 张玻片， 37℃处理 12min， 再用 1× 缓冲液 I 洗 5min ；
3、 用 0.2％的保护液 ( 保护液 1ml 加 1× 缓冲液 I99ml 即为使用浓度 ) 洗 10min， 三蒸水洗 5min， 以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥 ；
4、 将玻片放入保湿盒内， 加预杂交液 20ul/ 片 . 盖上盖玻片， 盖紧保湿盒， 放在 42℃恒温水浴箱中 3h 以上 ；
5、 取出玻片， 弃去盖玻片， 将玻片放入玻璃缸内， 用 70 ％， 90 ％， 95 ％的乙醇各洗 2min， 自然干燥 ；
6、 将玻片放入保湿盒内， 每位病人标本两张， 一张加正义杂交液 20ul/ 片， 另一张 加反义杂交液 20ul/ 片， 盖上盖玻片， 盖紧保湿盒， 放在 42℃恒温水浴箱中 16-24h ；
7、 取出玻片， 弃去盖玻片， 将玻片放入玻璃缸内
在 42℃恒温水浴箱中用 2× 缓冲液 II 洗两次， 每次 15min
在 42℃恒温水浴箱中用 0.2× 缓冲液 II 洗一次， 每次 15min
在 42℃恒温水浴箱中用 0.1× 缓冲液 II 洗两次， 每次 15min ；
8、 用 1× 缓冲液 III 洗 30s， 取出玻片， 自然干燥 ；
9、 将 玻 片 放 入 保 湿 盒 内， 加 0.5 ％ l 封 闭 液 (1ml 封 闭 液 加 5ml1× 缓 冲 液 III)100ul/ 片， 盖紧保湿盒， 在室温下作用 30min ；
10、 取出玻片， 用 1× 缓冲液 III 洗 30s， 自然干燥 ；
11、 将玻片放入保湿盒内， 加碱性磷酸酶抗体 ( 加入 1.8ml1× 缓冲液 III)100ul/ 片， 盖紧保湿盒在室温下作用 30min ；
12、 取出玻片， 用 1× 缓冲液 III 洗 3 次， 每次 15min ；
13、 1× 缓 冲 液 IV 洗 2min， 加 显 色 剂 ( 显 色 剂 A73.3ul， 显 色 剂 B157.5ul 加 到 30ml1× 缓冲液 IV 中， 混匀 )， 室温避光 12h 以上 ；
14、 用三蒸水洗 5min， 自然干燥， ( 用甘油加 10％的 1× 缓冲液 I 混匀 ) 封片镜检。
四、 结果判断
在光镜下计数 100-300 个细胞， 计算染上紫色细胞的百分比。
阳性对照标本加反义杂交液的应该 80％以上染上紫色。
所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。
地高辛标记的 cDNA、 RNA 和寡核苷酸探针， 不但探针的具有生物素标记优点， 还克 服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点 )， 将该杂交探 针与人体血液白细胞的待测 RNA 核酸进行杂交， 再用免疫组化的方法显色， 在光镜下观察 mRNA 的存在和定位， 根据染色的细胞数， 判断目的基因的表达量。 本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术， 该方法通过检测底物细胞中的 IL-2 基因表达量， 用来确定癌症是否发生。临床研究表明， IL-2 基因是癌症的特异基因， 因为 IL-2 基因在正常人中不表达， 唯独在癌表达， 说明癌症已经发生， 用来确定癌症是否发生， 或是正常。从而获得癌症的诊断信息。
本发明实施例采样为 ： 癌症病人 5 名， 正常对照组 5 名。抽所有待检人的外周血 3-5 毫升 ( 分离白细胞 ) 做原位杂交。结果表示， 所有癌症患者 IL-2 基因有过度表达， 细胞 染色 ； 正常对照组 IL-2 基因不表达， 细胞无染色。具体结果请见图 1 和图 2。
实施例 3
用 IL-2 基因试剂盒检测癌症疾病与用 CD147 基因试剂盒检测癌症疾病之间平行 实验。
为了科学评价上述基因各自在癌症疾病的特异性、 敏感性、 准确性。 我们用平行试 验的方法， 同时检测上述基因的 mRNA， 检测技术采用核酸原位杂交技术， 用同一例癌症疾病 患者的外周血， 同时检测 IL-2 基因和 CD147(CD147 基因 -CD147 序列号 ： AB085790， 972bp， cds ： 40…849bp) 基因的 mRNA( 进行核酸原位杂交、 免疫组化染色、 镜下记数、 结果报告等均 采用实施例 1 和实施例 2 的原位杂交技术的相同方法和步骤及试剂 )。发现 IL-2 基因在 癌症疾病病人中表达量比 CD147 基因在同一疾病病人的表达量要高。结果表明， IL-2 基因 对癌症疾病诊断的特异性、 敏感性、 准确性比 CD147 基因更好， 原位杂交基因表达图显示， IL-2 基因的表达量是 70％， CD147 基因的表达量是 40％。本发明的试剂盒作于癌症疾病诊 断的指标有非常重要的临床意义。
SEQUENCE LISTING
<110> 芮屈生物技术 ( 上海 ) 有限公司
<120> 一种 IL-2 基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用
<130>/
<160>1
<170>PatentIn version 3.3 <210>1 <211>822 <212>DNA <213> 智人 (Homo sapiens) <400>1 agttccctat cactctcttt aatcactact caggatgcaa ctcctgtctt gcattgcact tacttcaagt tctacaaaga aaacacagct gatgattttg aatggaatta ataattacaa taagttttac atgcccaaga aggccacaga actcaaacct ctggaggaag tgctaaattt cagggactta atcagcaata tcaacgtaat attcatgtgt gaatatgctg atgagacagc taccttttgt caaagcatca tctcaacact acatatcagg ccttctattt atttaaatat gtttgctacc tattgtaact attattctta gattcttttt gtaagcccta ggggctctaa tattattatg ttgaatgtta aatatagtat taaatttgat aaatataaaa aaaaaaaaaacacagtaacc aagtcttgca acaactggag gaatcccaaa actgaaacat agctcaaagc agttctggaa aaccattgta gacttgataa ttaaatttta atcttaaaac aatggtttca ctatgtagat aaaaaaaaaatcaactcctg cttgtcacaa catttactgc ctcaccagga cttcagtgtc aaaaactttc ctaaagggat gaatttctga ttaagtgctt tatttattgt tataaatatg cttatttatc tggttagtaa aaccacaatgta acagtgcacc tggatttaca tgctcacatt tagaagaaga acttaagacc ctgaaacaac acagatggat cccacttaaa tgaatgtatg gatcttttat ccaaaatatt aactatttaa60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 822