一种IL2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用.pdf

1、(10)申 请 公 布 号 CN 101993946 A(43)申请公布日 2011.03.30CN101993946A*CN101993946A*(21)申请号 200910056183.8(22)申请日 2009.08.10C12Q 1/68(2006.01)(71)申请人芮屈生物技术(上海)有限公司地址 201108 上海市闵行区光华路728号4幢426室(72)发明人张云福 裘建英(74)专利代理机构上海申蒙商标专利代理有限公司 31214代理人周丰(54) 发明名称一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用(57) 摘要本发明涉及一种IL-2(细胞因子2)基因的原位杂交检

2、测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种IL-2基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用。本发明优点在于：本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页CN 101993950 A 1/1页21.一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针

3、序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P中的一种。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物优选自地高辛。7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒还包括增效剂，

4、所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。8.一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。9.一种IL-2基因的原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：a、将权利要求8所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。权 利 要 求 书CN 101993946

5、ACN 101993950 A 1/7页3一种 IL-2 基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用【 技术领域 】0001 本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用【 背景技术 】0002 癌症也叫恶性肿瘤，肿瘤是指机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞异常增生而形成的局部肿块。癌症病变的基本单位是癌细胞。人体细胞老化死亡后会有新生细胞取代它，以维持机体功能，人体绝大部分细胞都可以增生，但这种增生是有限度的，而癌细胞的增生则是无止境的，这使患者体内的营养物质被大量消耗。同时，癌细胞还能释放出多种毒素，使人体产生一系列症状，晚期时它转移到全身各

6、处生长繁殖，最后导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热及脏器功能受损等，器官功能衰竭而死亡。0003 根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数160万，死亡人数近160万，患者600万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。而且，绝大部分癌症患者都只有很短的生存期，人类到目前为止还没战胜癌症这一恶疾，如何做到治愈癌症的关键是要做到基因水平的早期诊断。0004 IL-2是细胞因子，它在肿瘤的发生过程中起十分重要的作用，一旦机体IL-2的表达降低，肿瘤就会朝恶性方向发展。IL-2通过以下几方面的功能

7、作用来达到消灭和杀死癌细胞：1.IL-2是淋巴T细胞的生长因子，能延长T细胞的活性，刺激T细胞进入细胞分裂周期，增强T细胞的杀伤活性；在体内能增强抗原诱导的细胞毒性T细胞(TC)的活性，可以辅助抗原和半抗原直接在体内诱导产生(TC)。二者均能对癌细胞进行攻击和杀伤作用。2.可促进NK细胞的增殖，维持NK细胞的长期生长。肿瘤病人经IL-2治疗后，血中NK细胞数量明显增加。3.IL-2可促进LAK、TIL细胞的功能活性，同时能延长LAK、TIL细胞存活，也能扩增和活化LAK、TIL细胞，LAK是淋巴细胞与IL-2接触后产生的一种具有高效抗肿瘤效应的杀伤细胞，只有在IL-2存在下LAK才能产生，也只

8、有在IL-2的存在下LAK才能发挥效果。4.可促进B细胞的增殖和产生免疫球蛋白，并刺激巨噬细胞，提高巨噬细胞的吞噬能力。5.IL-2能刺激NO(一氧化氮)的产生，消灭癌细胞。IL-2通过以上等途径来消灭癌细胞，当癌症发生时机体的IL-2分泌会降低，同样机体IL-2的降低也会使癌细胞生长。人类的各种癌症都有IL-2的表达降低，IL-2在血液中的浓度变化可用于癌症病人的早期的检测和预测指标。0005 癌症从癌前变到形成癌症，需要几年时间，如何做到早期检测和诊断及预后的检测及诊治后的复发、转移早期检出，是降低发病率和死亡率的关键。采用核酸原位杂交技术检测IL-2基因，对癌症的早期基因水平的诊断有重要

9、的临床价值。IL-2基因序列号：NM_000586，822bp，mRNA，4q26-q27，cds：56517bp。0006 随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至说 明 书CN 101993946 ACN 101993950 A 2/7页4今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)就能做到早期预测诊断。0007 原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针

10、)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。【 发明内容 】0008 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒的用途。0009 本发明的再一的目的是，提供一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒。0010 本发明的另一的目的是，提供一种IL-2基因的原位杂交检测方法。0011 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：0012 一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ

11、 ID NO.1所示。0013 所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。0014 所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。0015 所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P中的一种。0016 所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。0017 所述的非放射性标记物优选自地高辛。0018 所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。0019 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：0020 一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述

12、的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。0021 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：0022 一种IL-2基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤：0023 a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；0024 b、检测a步骤得到的杂交复合体。0025 本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：0026 仪器操作：0027 1).将待测标本放入反应槽中；0028 2).仪器自动弃去液

13、体，自动加消化液；0029 3).仪器自动弃去液体，自动后固定；0030 4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42)；0031 5).仪器自动弃去液体，自动清洗；说 明 书CN 101993946 ACN 101993950 A 3/7页50032 6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42)；0033 7).仪器自动弃去液体，自动清洗；0034 8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；0035 9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；0036 10).取出封片镜检。0037 本发明优点在于：0038 1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。0039 2、本发明的检测方法

14、操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。0040 3、本发明的临床意义是更早期跟踪检测癌症发生动态过程，以及用于癌症预防医学的检测和筛选工具。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上检测IL-2异常表达，在影像医学检查及其它检查未发现占位性癌症病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿块之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床癌症病患一个真正的预后早期诊断。这样才有可能实施癌症的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治癌症恶疾。【 附图说明 】0041 图1是是本发明实施例中癌症病人IL-2基因过量

15、表达图片。0042 图2是正常人IL-2基因表达图片。【 具体实施方式 】0043 下面结合附图对本发明具体实施方式作详细说明。0044 实施例10045 一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下：0046 消化液 100l/管 1管/盒 无色透明液体0047 保护液 100l/管 1管/盒 无色透明液体0048 预杂交液 130 0l/管 2管/盒 无色透明液体0049 正义杂交液 10l/管 1管/盒 无色透明液体0050 反义杂交液 10l/管 1管/盒

16、 无色透明液体0051 封闭液 1000l/管 1管/盒 无色透明液体0052 碱性磷酸酶抗体 1l/管 1管/盒 无色透明液体0053 显色剂A 175l/管 1管/盒 黄色液体0054 显色剂B 320l/管 1管/盒 无色透明液体0055 缓冲液I 10x 90ml/瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体0056 缓冲液II 10x 80ml/瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体0057 缓冲液III 10x 20m/瓶 3瓶/盒 浅黄色或无色透明液体0058 缓冲液IV 10x 90ml/瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体0059 固定液 90ml/瓶 1瓶/盒 无色透明液体说 明 书CN

17、101993946 ACN 101993950 A 4/7页60060 阳性对照标本 6片/盒0061 上述试剂成分说明：(所有试剂购自SIGMA)0062 1、消化液：20mg/ml蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC-H2O 5ml；0063 2、保护液：0.2g的glycine加入1ml的1缓冲液I；0064 3、预杂交液：1缓冲液II 7.5ml0065 50D 3ml0066 10mg/ml yest t-RNA 750ul0067 11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul0068 0.04M EDTA 3ml0069 50 formamide 15ml00

18、70 4、封闭液：0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入1ml 1缓冲液III；0071 5、10x缓冲液I：(PH7.1-7.4)0072 NaCl 80g0073 Na2HPO4.12H2O 360g0074 KCl 2g0075 KH2PO42g0076 加三蒸水至1l，并高压灭菌；0077 6、10x缓冲液II：(PH7.0)0078 NaCl 175.3g0079 柠檬酸钠 88.2g0080 HCl 几滴0081 加三蒸水至1l，并高压灭菌；0082 7、缓冲液III：(PH7.9)0083 Tris 121.1g0084 NaCl 87.66g0085 HCl 60ml

19、左右0086 加三蒸水至1l，并高压灭菌；0087 8、缓冲液IV：0088 1M Tris-HCl(PH9.5)：Tirs 121.1g加HCl 3ml左右，加水900ml，调PH至9.5，加水至1l，并高压灭菌；0089 1M NaCl：NaCl 58.44加水至1l，并高压灭菌；0090 0.5M MgCl2：101.65g MgCl2.6H2O加水至1l，并高压灭菌；0091 9、固定液：多聚甲醛40g加1缓冲液I至1l，稍加热(约50-60度)搅拌至溶解；0092 10、显色剂A：NBT 1g加70DMF11.44ml；0093 11、显色剂B：BCIP 1g加100DMF30ml。

20、0094 本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。0095 实施例20096 一种IL-2基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用说 明 书CN 101993946 ACN 101993950 A 5/7页70097 一、标本处理0098 1、用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血淋巴细胞分离液11.5)的离心管中，2000r/min离心10min；0099 2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；0100 3、弃上清.沉淀加入约两倍的1缓冲液I，混匀，1500g/min离

21、心10min；0101 4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；0102 5、用40ml 4固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1缓冲液I洗5min。每缸可以放16片；0103 6、标本可保存在-20，或继续做实验。0104 二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度0105 1、将10缓冲液I用三蒸水按110稀释成1缓冲液I；0106 2、将20缓冲液II用三蒸水按110稀释成2缓冲液II；0107 按1100稀释成0.2缓冲液II；按1200稀释成0.1缓冲液II；0108 3、将10缓

22、冲液III用三蒸水按110稀释成1缓冲液III；0109 4、10缓冲液IV用三蒸水按110稀释成缓冲液IV(取1#，2#，3#各10ml，加水至100ml既可)。0110 三、实验步骤：0111 1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次实验做一对阳性对照)；0112 2、在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20ml。37水浴预热10分钟。放进16张玻片，37处理12min，再用1缓冲液I洗5min；0113 3、用0.2的保护液(保护液1ml加1缓冲液I99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min，以上过程都在玻

23、璃缸进行。玻片自然干燥；0114 4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42恒温水浴箱中3h以上；0115 5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70，90，95的乙醇各洗2min，自然干燥；0116 6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42恒温水浴箱中16-24h；0117 7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内0118 在42恒温水浴箱中用2缓冲液II洗两次，每次15min0119 在42恒温水浴箱中用0.2缓冲液II洗一次，每次15min0

24、120 在42恒温水浴箱中用0.1缓冲液II洗两次，每次15min；0121 8、用1缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；0122 9、将玻片放入保湿盒内，加0.5l封闭液(1ml封闭液加5ml1缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min；说 明 书CN 101993946 ACN 101993950 A 6/7页80123 10、取出玻片，用1缓冲液III洗30s，自然干燥；0124 11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml1缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min；0125 12、取出玻片，用1缓冲液III洗3次，每次15

25、min；0126 13、1缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3ul，显色剂B157.5ul加到30ml1缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上；0127 14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10的1缓冲液I混匀)封片镜检。0128 四、结果判断0129 在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。0130 阳性对照标本加反义杂交液的应该80以上染上紫色。0131 所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。0132 地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将

26、该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。0133 本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的IL-2基因表达量，用来确定癌症是否发生。临床研究表明，IL-2基因是癌症的特异基因，因为IL-2基因在正常人中不表达，唯独在癌表达，说明癌症已经发生，用来确定癌症是否发生，或是正常。从而获得癌症的诊断信息。0134 本发明实施例采样为：癌症病人5名，正常对照组5名。抽所有待检人的外周血3-5毫升(分离白细胞)做原位杂交。结果表示，所有癌症患者IL-2基因有过度表达，细胞

27、染色；正常对照组IL-2基因不表达，细胞无染色。具体结果请见图1和图2。0135 实施例30136 用IL-2基因试剂盒检测癌症疾病与用CD147基因试剂盒检测癌症疾病之间平行实验。0137 为了科学评价上述基因各自在癌症疾病的特异性、敏感性、准确性。我们用平行试验的方法，同时检测上述基因的mRNA，检测技术采用核酸原位杂交技术，用同一例癌症疾病患者的外周血，同时检测IL-2基因和CD147(CD147基因-CD147序列号：AB085790，972bp，cds：40849bp)基因的mRNA(进行核酸原位杂交、免疫组化染色、镜下记数、结果报告等均采用实施例1和实施例2的原位杂交技术的相同方法

28、和步骤及试剂)。发现IL-2基因在癌症疾病病人中表达量比CD147基因在同一疾病病人的表达量要高。结果表明，IL-2基因对癌症疾病诊断的特异性、敏感性、准确性比CD147基因更好，原位杂交基因表达图显示，IL-2基因的表达量是70，CD147基因的表达量是40。本发明的试剂盒作于癌症疾病诊断的指标有非常重要的临床意义。0138 SEQUENCE LISTING0139 芮屈生物技术(上海)有限公司0140 一种IL-2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用0141 /0142 1说 明 书CN 101993946 ACN 101993950 A 7/7页90143 PatentIn ver

29、sion 3.30144 10145 8220146 DNA0147 智人(Homo sapiens)0148 10149 agttccctat cactctcttt aatcactact cacagtaacc tcaactcctg ccacaatgta 600150 caggatgcaa ctcctgtctt gcattgcact aagtcttgca cttgtcacaa acagtgcacc 1200151 tacttcaagt tctacaaaga aaacacagct acaactggag catttactgc tggatttaca 1800152 gatgattttg aatgga

30、atta ataattacaa gaatcccaaa ctcaccagga tgctcacatt 2400153 taagttttac atgcccaaga aggccacaga actgaaacat cttcagtgtc tagaagaaga 3000154 actcaaacct ctggaggaag tgctaaattt agctcaaagc aaaaactttc acttaagacc 3600155 cagggactta atcagcaata tcaacgtaat agttctggaa ctaaagggat ctgaaacaac 4200156 attcatgtgt gaatatgctg

31、 atgagacagc aaccattgta gaatttctga acagatggat 4800157 taccttttgt caaagcatca tctcaacact gacttgataa ttaagtgctt cccacttaaa 5400158 acatatcagg ccttctattt atttaaatat ttaaatttta tatttattgt tgaatgtatg 6000159 gtttgctacc tattgtaact attattctta atcttaaaac tataaatatg gatcttttat 6600160 gattcttttt gtaagcccta ggggctctaa aatggtttca cttatttatc ccaaaatatt 7200161 tattattatg ttgaatgtta aatatagtat ctatgtagat tggttagtaa aactatttaa 7800162 taaatttgat aaatataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 822说 明 书CN 101993946 ACN 101993950 A 1/1页10图1图2说 明 书 附 图CN 101993946 A