微生物检测和计数 本发明涉及检测和计数样品中物种嗜肺军团杆菌 (Legionellapneumophila) 存 活微生物的方法。本发明也包括适用于此方法的试剂盒。此方法和试剂盒使存活微生物的 定量更快速。
军团杆菌 (Legionella) 细菌在潮湿或湿润环境例如土壤和非海水生生境中普遍 存在。也可以在温水和冷水设施、 空调系统的冷却塔和加湿器中找到它们。
军团杆菌特别是嗜肺军团杆菌是病原体， 可引起急性细菌性肺炎， 通常称为 “军团 病” ， 在感染的个体中经常是致命的。
嗜肺军团杆菌的传统检测和计数是通过细胞培养进行。 此方法可使用平板计数通 过测量可培养的细菌进行， 或应用滤过膜方法测量微菌落进行。这些技术通过存活细菌形 成菌落或微菌落的能力评估存活细菌。不幸的是， 这些方法通常需要 3 至 10 天以形成菌落 或微菌落。当用水装置仍然在运行时， 在这期间存在感染人的不可接受的风险。
检测总军团杆菌微生物的其他方法包括 PCR( 聚合酶链式反应 ) 技术。PCR 应用 DNA 聚合酶通过体外酶促复制扩增一段 DNA。在技术进行中， 生成的 DNA 作为复制的模板使 用从而导致 DNA 模板指数扩增的链式反应。PCR 通过生成百万或更多拷贝的 DNA 段使单个 或较少拷贝的一段 DNA 扩增。一般的这些方法在 Diederen 等人， J Med Microbiol.2007 Jan ； 56(Pt1) ： 94-101 中描述。
然而 PCR 的一个缺点是样品容易包含聚合反应抑制剂， 因此不能一致的提供量化 结果。此外， 该技术依赖于之前的 DNA 纯化步骤， 所述步骤可导致 DNA 的损失从而导致低估 存在的军团杆菌。在一定程度上定量实时 PCR 克服了这些缺点。然而， 该技术不能区分存 活细胞和非存活细胞。
另一个技术是荧光原位杂交 (FISH)， 其中荧光物质标记的寡核苷酸探针渗入细 菌细胞。其中核糖体核酸 (rRNA) 具有针对探针的正确序列即靶标， 探针将与其靶标吸 附， 并且在任意后续清洗步骤中不被去除。固定了探针的细菌之后将发射荧光信号。此 荧光信号可通过例如流式细胞术、 固相细胞术或表面荧光显微镜技术 (epifluorescent microscopy) 定 量。 一 般 的 FISH 技 术 在 Dutil S et al J Appl Microbiol.2006May ； 100(5) ： 955-63 中描述。然而， 单独使用 FISH 技术可检测存活的嗜肺军团杆菌总数， 但不 幸的是该方法无法专门鉴定能够分裂并从而形成菌落的嗜肺军团杆菌细菌。
计 数 存 活 嗜 肺 军 团 杆 菌 的 另 一 个 方 法 涉 及 ChemChrome V6，在 Delgado-Viscogliosi 等， Appl Environ Microbiol.2005Jul ； 71(7) ： 4086-96 中描述。此 方法允许量化嗜肺军团杆菌， 并能够区分存活和非存活细菌。此方法结合了用抗体和细菌 存活标记 (ChemChrome V6) 特异性检测军团杆菌细胞和应用表面荧光显微镜术计数。 然而， 尽管此技术可区分存活和非存活细胞， 但不能单独鉴定那些形成菌落的细菌。
US 20070218522 描述了检测和定量存活军团杆菌和其他异养需氧细菌的方法和 组合物， 所述方法包括使用包括吸收性培养基、 生长促进和生长选择性物质的蘸片快速检 测和定量军团杆菌微菌落。此技术不能计数损伤的细菌。
EP 1329515 涉及检测包含过氧化氢的气态环境中微生物存在的方法， 通过将气态
环境与包含丙酮酸盐的琼脂生长培养基接触， 允许微生物菌落的发展。
一般认为涉及在生长培养基例如营养琼脂板上生长菌落的技术更准确。 因此平板 计数方法仍然是获得总活菌数的优选方法。 这一般表示将疑为包含微生物的样品应用于包 含固体营养来源或生长培养基的平板上。这一技术一般称为平板接种。提及总活菌数， 我 们的意思是能够产生观察者可识别群体的细菌总数。 一般的这表示在生长培养基例如营养 琼脂板表面的可见菌落。
然而， 环境中的微生物例如嗜肺军团杆菌可能经受一种或多种阻碍微生物在其环 境条件下生长和繁殖的胁迫。 这些受胁迫的微生物在常规培养条件下完全不会分裂或不形 成可见菌落。在环境中一部分微生物细胞一般会承受由于环境条件例如饥饿、 杀生物剂的 存在、 热休克和干燥的压力。此外， 这些细胞可能处于脆弱的生理状态， 平板接种微生物技 术可能加重已经受胁迫的微生物的胁迫， 原因是大气中氧气的存在。此外这可能导致受胁 迫细菌的人为死亡， 从而导致总活菌数的低估。
此外， 由于其致病性， 平板接种方法导致的存活嗜肺军团杆菌的低估可能是危险 的。
由于在 20 世纪 70 年代已有报导， 应当使用活性氧族 (ROS) 的清除剂限制在平 板接种过程中的氧化应激效应。这在 Speck 等人， repair andenumeration of injured coliforms by a plating procedure， ApplMicrobiol 29， 549-50(1975) ； Martin 等 人 Catalase ： its effect onmicrobial enumeration.Appl Environ Microbiol 32， 731-4(1976) ； Brewer 等 人 Beneficial effects of catalase or pyruvate in amost-probable-number technique for the detection of Staphylococcusaureus. Appl Environ Microbiol 34， 797-800(1977) ； McDonald 等 人， Enhanced recovery of injured Escherichia coli by compounds thatdegrade hydrogen peroxide or block its formation.Appl EnvironMicrobiol 45， 360-5(1983) ； Marthi 等 人 Resuscitation effects ofcatalase on airborne bacteria.Appl Environ Microbiol 57， 2775-6(1991) ； Busch 和 Donnelly Development of a repair-enrichment brothfor resuscitation of heat-injured Listeria monocytogenes andListeria innocua. Appl Environ Microbiol 58， 14-20(1992) ； 和 Dukan 等人， Oxidative stress defense and deterioration of growth-arrestedEscherichia coli cells.J Biol Chem 274， 26027-32(1999) 中报导。
然而， 在所有上述情况下本发明的发明者相信 ROS 可通过直接途径降低， 其中化 合物与 ROS 发生化学反应。
Bérubé 等 人， ″ Rapid detection and identification ofLegionella pneumophila by membrane immunoassay″， Applied andEnvironmental Microbiology， 1989， 55， 1640-1641 描述了嗜肺军团杆菌的检测和鉴定， 通过使用单克隆抗体的免疫印迹 方法。( 文中 ) 没有提供处理损伤细菌问题的方法。
Pine 等人 (Role of keto acids and reduced-oxygen-scavengingenzymes in the growth of Legionella species.J Clin Microbiol 23， 33-42(1986)) 的文章描述了 添加酮酸和还原氧 (reduced oxygen) 清除酶的必要性以优化嗜肺军团杆菌的生长， 并建议 在用于此微生物标准计数的培养基中使用这些物质。然而单独使用酮酸和还原氧清除酶不足以修复待修复的受胁迫嗜肺军团杆菌和 使计数准确。当使用嗜肺军团杆菌的特异性生长培养基例如缓冲炭酵母提取物 (BCYE) 琼 脂培养基时尤其如此。事实上， 没有关于用于嗜肺军团杆菌准确计数的标准培养基优化的 数据。
因此本发明的一个目的是寻找准确计数嗜肺军团杆菌的方法。 特别是关于使用平 板接种技术的标准方法。
因此根据本发明我们提供了在疑为包含所述微生物的样品中检测和计数存活微 生物的方法 ：
(1) 将所述样品的所述微生物与至少一种修复化合物和生长培养基接触， 和
(2) 培养步骤 (1) 的产物， 和
(3) 检测和定量所述存活微生物，
其中微生物物种为嗜肺军团杆菌， 其中修复化合物直接或间接影响代谢以降低微 生物的氧化应激。
提及氧化应激， 我们的意思是 ROS( 内源 (endogene) 产生或外源 (exogene) 内收 (adduction)) 浓度和微生物易于清除活性中间体或有效修复所产生损伤能力之间的不平 衡。 这些微生物正常代谢途径的损坏由于自由基和氧化剂例如过氧化物的形成可引起毒效 应， 这可导致微生物细胞组分 ( 例如 DNA、 蛋白质或脂 ) 的损伤。
影响微生物的代谢表示在微生物细胞内的天然化学途径中引起改变。
提及内源表示改变是在微生物细胞内产生的以降低氧化应激。 这可能是例如在微 生物内代谢途径的改变。这也可包括在微生物细胞内去除 ROS。
理想的修复化合物可为或包括至少一种抑制 ROS 形成或降解 ROS 的化合物。大体 上这可通过代谢修饰得到。
然而， 修复化合物可为或包括至少一种间接抑制 ROS 形成或降解 ROS 的化合物。 对 ROS 间接施加作用的这样的化合物可通过干扰微生物代谢起作用。这样的化合物可视为间 接内源降低 ROS， 例如在需氧呼吸中。
我们已发现本方法诱导受胁迫嗜肺军团杆菌细胞的修复， 因此更精确的提供了总 活菌数。出乎意料的我们还发现所述方法缩短了需要的培养时间。大体上我们发现所述方 法可将培养时间缩短几小时， 在有些情况下至少 1 天。在一些情况下本发明的方法和传统 方法相比可减少培养时间达几天， 例如达 5 天。
出乎意料的我们还发现本发明方法可导致干扰微生物的降低， 即那些嗜肺军团杆 菌以外的微生物。
本发明方法理想的包含将受胁迫嗜肺军团杆菌微生物细胞与至少一种抑制 ROS 形成和 / 或降低 ROS 和 / 或去除 ROS 的化合物接触， 这将诱导受胁迫细胞的修复。
在收集样品后， 嗜肺军团杆菌微生物可与修复化合物直接接触。因此用来收集认 为包含微生物的水样品的容器可已经包含修复化合物。可选的， 当已收集包含嗜肺军团杆 菌的水样品后， 可使用包含修复化合物的稀释水稀释以用于分析。 另外可选的， 任选已被稀 释样品， 可与包含修复化合物的生长培养基接触或修复化合物可在微生物和生长培养基接 触后应用。
本发明的一种形式理想的包含将所述样品和包含所述修复化合物的修复培养基，优选非选择性修复培养基接触， 之后再与生长培养基， 优选选择性生长培养基接触。 优选的 修复培养基为液体， 更优选的为肉汤 (broth)。 当修复培养基为液体时这被合适的称为液体 修复法。一般的在液体修复法中首先将样品引入包含修复化合物的液体培养基。理想的液 体修复法允许受胁迫细菌在非选择性液体培养基中修复。 优选的液体修复法可应用肉汤作 为液体培养基。大体上包含微生物的液体培养基之后转移至生长培养基。受胁迫的微生物 或者在转移至生长培养基之前已修复， 或者在与生长培养基接触时修复。更优选的生长培 养基为选择性生长培养基。 一般的将包含微生物的液体培养基铺板在选择性生长培养基平 板上， 例如选择性琼脂生长培养基平板。
在一个可选的优选形式中， 步骤 (1) 包含将所述样品与包含所述修复化合物的生 长培养基， 优选的非选择性生长培养基接触， 之后再与也包含所述修复化合物的修复培养 基接触。 优选的修复培养基为非选择性修复培养基， 更优选的为固体， 特别优选的为选择性 琼脂生长培养基。当修复培养基为固体时这被称为固体修复法。一般的固体修复法包括将 样品与包含修复化合物的非选择性生长培养基接触。 之后可再与包含修复化合物的选择性 生长培养基接触。在此形式中阻止 ROS 形成、 降低或去除 ROS 的选择性成分和单一化合物 或多种化合物将扩散进入非选择性培养基中。 理想的非选择性生长培养基可为非选择性琼 脂生长培养基。合适的在此形式中样品可涂在任意非选择性琼脂培养基上， 之后将包含阻 止 ROS 形成、 降低或去除 ROS 的单一化合物或多种化合物的选择性琼脂生长培养基覆盖在 非选择性琼脂培养基上。 在另一个可选的形式中样品可应用于已经包含修复化合物的选择性生长培养基 中。 这样的选择性生长培养基可为选择性琼脂生长培养基。 样品的平板接种可如前述进行。
在另一个可选的形式中样品可从水中以气雾 (aerosol) 的形式收集。一般的气雾 位于冷却塔或空调中。 理想的在根据本发明方法检测前， 水从气雾中冷凝。 在可选的优选形 式中步骤 (1) 包含将所述气雾中样品与包含修复培养基 ( 优选的包含所述修复化合物的非 选择性修复培养基 ) 的稀释水接触， 之后再与也包含所述修复化合物的生长培养基接触。
在本发明的所有前述形式中， 生长培养基应当适于嗜肺军团杆菌的生长。合适的 生长培养基类型在文献中有记载， 是技术人员所熟知的。通常的生长培养基应当包括活性 碳和半胱氨酸。
优选的， 选择性生长培养基为选择性琼脂生长培养基， 更优选的为缓冲炭酵母提 取物 (BCYE) 琼脂生长培养基。BCYE 生长培养基在加入抗生素添加物后变为选择性的。十 分理想的包含抗生素的 BCYE 生长培养基被称为 GVPC( 甘氨酸、 万古霉素、 多粘菌素 B 和放 线酮 )。
平板接种方法在文献中有记载， 是技术人员所熟知的。一般的方法包括应用一定 量的这些水样品于培养皿中的琼脂凝胶上。这可称为培养皿法或琼脂板接种法。琼脂板接 种的目的是将疑为包含微生物的等分试剂， 一般是 100μl 水 ( 称为细菌悬液 ) 涂在培养皿 中的固体培养基上。可使用玻璃珠或细胞刮刀将细菌悬液涂在琼脂板上。在涂板后， 大部 分液体被琼脂吸收， 一薄层细菌保留在琼脂表面。 经过培养， 细菌以菌落形式在琼脂表面生 长。培养在最适合微生物的温度下进行， 这在文献中有记载， 是技术人员所熟知的。一般的 温度在 30℃和 50℃之间， 例如约 37℃。
修复化合物应当以降低微生物氧化应激的有效量加入。 优选的为降低或基本上去
除微生物细胞中 ROS 的有效量。
在本发明的一个优选形式中修复化合物至少包括巯基乙酸或其盐。 理想的巯基乙 酸为巯基乙酸盐的形式， 通常为巯基乙酸钠盐的形式。 巯基乙酸或盐外源清除 ROS。 优选的 培养基中存在的巯基乙酸或盐的量为 0.01 和 1％重量浓度之间 ( 以巯基乙酸盐计算 )。
在另一个本发明的优选形式中修复化合物包括至少一种选自过氧化氢酶、 抗坏血 酸 ( 或其盐 )、 偏亚硫酸 (metabisulphurous acid)( 或其盐 )、 二甲亚砜 (DMSO)、 3， 3′ - 硫 代二丙酸 (TDPA)( 或其盐 ) 和丙酮酸 ( 或其盐 ) 的化合物。已发现这些化合物均可降低或 去除 ROS。当使用抗坏血酸和丙酮酸时， 优选的培养基中存在的抗坏血酸和丙酮酸为 0.01 和 1％重量浓度之间， 以钠盐计算。 DMSO 优选的以 0.01 和 0.1％间的重量浓度使用， 过氧化 氢酶理想的为 0.001 至 0.1％重量浓度范围内。丙酮酸， 特别是丙酮酸钠， 是特别优选的。
在本发明的更优选的形式中修复培养基或生长培养基包含巯基乙酸 ( 或盐 ) 和至 少一种选自过氧化氢酶、 抗坏血酸 ( 或其盐 )、 偏亚硫酸 (metabisulphurous acid)( 或其 盐 )、 二甲亚砜 (DMSO)、 3， 3′ - 硫代二丙酸 (TDPA)( 或其盐 ) 和丙酮酸 ( 或其盐 ) 的化合 物这二者。巯基乙酸盐和丙酮酸钠组合是特别优选的。
在修复化合物可能为或包括至少一种间接抑制 ROS 形成和 / 或降解 ROS 的化合物 的情况下， 所述化合物可通过干扰微生物代谢导致降低的 ROS 水平。一般的这些化合物包 括氨基酸或其盐。特别优选的化合物为谷氨酸或谷氨酸盐。 在本发明的另一个优选的形式中修复化合物可包括谷氨酸或谷氨酸盐， 特别是钠 盐。大体上谷氨酸或谷氨酸盐的量在 0.01 和 5％重量浓度之间， 以钠盐计算。
特别优选的， 修复化合物可包括丙酮酸或丙酮酸盐 ( 特别是钠盐 ) 和谷氨酸或谷 氨酸盐 ( 特别是钠盐 ) 二者。丙酮酸或丙酮酸盐和谷氨酸或谷氨酸盐组合似乎可诱导协同 效应， 因为和单独使用其中任意一种化合物相比， 上述组合可得到可培养军团杆菌的更高 估计 ( 和因此更准确的估计 )。此外我们发现此组合在嗜肺军团杆菌生长中可导致迟滞期 的缩短， 特别是在液体培养基中。液体培养基中的这一迟滞期的缩短导致在琼脂板上获得 可见菌落需要的时间缩短。
理想的丙酮酸盐和谷氨酸盐的量如前述。 特别优选的谷氨酸盐比丙酮酸盐的比率 在 1 ∶ 1 和 50 ∶ 1 范围之间， 特别的在 5 ∶ 1 和 20 ∶ 1 之间， 更特别的在 7 ∶ 1 和 15 ∶ 1 之间。
已知谷氨酸盐不是抗氧化剂。然而， 似乎间接地谷氨酸盐可降低在生长中自然形 成的 ROS 的内源产生， 或其对大分子的影响 ( 氧化 )。
没有理论局限， 推测谷氨酸改变了军团杆菌的代谢以提高丙酮酸盐的作用， 此对 军团杆菌的代谢干扰间接抑制了 ROS 的形成和 / 或降解细胞内 ROS。
在修复培养基和 / 或生长培养基中包括酮酸和 / 或还原氧清除酶也是理想的。根 据本发明， 不认为酮酸和 / 或还原氧清除酶是修复化合物。然而， 包括一种或两种这些化合 物与任意上述修复化合物或其组合共同使用是有益的。
检测和定量存活微生物可通过文献记载的任意已知技术进行。 一般的这表示计数 生长培养基例如营养琼脂板表面的可见菌落。
根据本发明的方法使准确定量测定嗜肺军团杆菌的存在更容易。 此外培养时间可 显著缩短。所述方法适用于检测任意来自工业冷却水、 饮用水和天然水样品中的嗜肺军团
杆菌。 本发明还包含试剂盒， 用于更准确检测和计数疑为包含所述微生物的样品中的嗜 肺军团杆菌存活微生物， 所述试剂盒包含 ：
(1) 至少一种修复化合物，
(2) 生长培养基，
(3) 培养方法
(4) 检测和定量微生物的方法，
其中修复化合物直接或间接影响代谢以降低微生物的氧化应激。
其中微生物物种为嗜肺军团杆菌， 其中修复化合物直接或间接影响代谢以降低微 生物的氧化应激。
试剂盒还包含任意有关本发明第一个方面描述的实施方案。
试剂盒适用于以本发明的方法使用， 使嗜肺军团杆菌的计数更准确。
以下实施例举例说明本发明。
实施例 1 ：
将嗜肺军团杆菌悬液以 108 细菌 /ml 终浓度加入 5 个包含 50ml 无菌磷酸缓冲液 (PBS) 的烧瓶中。加入杀生物剂溶液至终浓度在 10 至 30mg/L 范围内。一个烧瓶平行操作
作为无杀生物剂的对照。使用的杀生物剂为 THPS( 四羟甲基硫酸磷 )。
在均匀化后， 所有悬液在 37±1℃， 黑暗和摇晃下培养 60min。在细菌计数前， 用 PBS 清洗 2 次 (5,000xg， 10min) 去除杀生物剂。连续稀释后， 将相同稀释液的 100μl 的 2 等分试样涂在 BCYE 和添加 0.1％丙酮酸盐的 BCYE 琼脂板上。
结果显示于图 1。图 1 显示了用杀生物剂处理后在 BCYE 培养基 ( 正方形 ) 和添加 0.1％丙酮酸盐的 BCYE 培养基 ( 菱形 ) 上的可培养嗜肺军团杆菌的计数。杀生物剂的存在 是为了引入微生物胁迫。结果显示在丙酮酸盐存在下， 受胁迫的微生物得到高得多的微生 物计数。在不存在杀生物剂时微生物是不受胁迫的。在这种情况下可以看到丙酮酸盐的存 在与否给出相同的结果。这证明了在丙酮酸盐的存在下， 受胁迫微生物嗜肺军团杆菌被修 复， 因此提供了更准确的读数。
实施例 2 ：
将嗜肺军团杆菌悬液以 108 细菌 /ml 终浓度加入 1 个包含 50ml 无菌磷酸缓冲液 (PBS) 的烧瓶中。加入杀生物剂溶液至终浓度 15mg/L。使用的杀生物剂为 THPS( 四羟甲基 硫酸磷 )。
在均匀化后， 所有悬液在 37±1℃， 黑暗和摇晃下培养 60min。在细菌计数前， 用 PBS 清洗 2 次 (5,000xg， 10min) 去除杀生物剂。连续稀释后， 将相同稀释液的 100μl 2 等 分试样涂在 BCYE、 添加 0.1％丙酮酸盐的 BCYE、 添加 0.1％丙酮酸盐和 1％谷氨酸的 BCYE 及 添加 1％谷氨酸的 BCYE 琼脂板上。结果显示于图 2。图 2 显示了标准培养基 (BCYE) 上得 到的可培养军团杆菌数和添加本专利描述的 2 种化合物 ( 丙酮酸盐和谷氨酸 ) 的培养基上 得到的可培养军团杆菌数的比率。
在用杀生物剂处理后， 在标准培养基 (BCYE) 中加入丙酮酸盐导致检测的可培养 军团杆菌的增加 ( 在 “BCYE+ 丙酮酸盐” 板上的可培养军团杆菌数比标准培养基上的可培养 军团杆菌数高 45 倍 )。在标准培养基 (BCYE) 中单独加入谷氨酸导致在用杀生物剂处理后检测的可培养军团杆菌减少 (x0.2)。令人惊讶的， 加入丙酮酸盐和谷氨酸导致可培养军团 杆菌的增加， 比在加入单独化合物中观察到的菌数更多。 这证明在丙酮酸盐的存在下， 谷氨 酸的加入使受胁迫微生物嗜肺军团杆菌进一步修复， 因此提供了更准确的读数。
实施例 3 ：
将嗜肺军团杆菌悬液以 3×102 细菌 /L 终浓度加入 1 个包含 1L 无菌磷酸缓冲液 (PBS) 的烧瓶中。 经过滤浓缩后， 将相同悬液的 100μl 2 等分试样涂于 GVPC(GVPC) 和添加 0.1％丙酮酸盐和 1％谷氨酸的 GVPC(GVPC+X) 琼脂板上。在 37℃培养 0、 3、 5 和 10 天后计 数菌落数。结果显示于图 3。在培养 3 天后， 当 GVPC 添加培养基上已经能够计数 300 个菌 落时， GVPC 培养基上没有可见菌落。在培养 5 和 10 天后， GVPC 培养基上能够计数 100 个菌 落， 而 GVPC 添加培养基上能够计数 300 个菌落。通过使用添加培养基， 在标准 GVPC 可计数 前至少 2 天可检测到菌落。
实施例 4 ：
包含可培养军团杆菌的环境样品经过滤浓缩。浓缩后， 将相同悬液的 100μl 2 等 分试样涂于 GVPC(GVPC) 和添加 0.1％丙酮酸盐和 1％谷氨酸的 GVPC(GVPC+X) 琼脂板上。 在 37℃培养 5 天后计数菌落数。在此情况下， 在标准培养基 (GVPC) 上没有可计数的军团杆菌 菌落， 而可计数 17 个非军团杆菌菌落。相对的， 在添加培养基 (GVPC+X) 上至少可计数 10 个军团杆菌菌落， 而仅有 2 个非军团杆菌菌落。结果显示于图 4。
实施例 5 ：
将嗜肺军团杆菌悬液以 108 细菌 /ml 终浓度加入 1 个包含 50ml 无菌磷酸缓冲液 (PBS) 的烧瓶中。加入杀生物剂溶液至终浓度 15mg/L。使用的杀生物剂为 THPS( 四羟甲基 硫酸磷 )。
在均匀化后， 所有悬液在 37±1℃， 黑暗和摇晃下培养 60min。在细菌计数前， 用 PBS 清洗 2 次 (5,000xg， 10min) 去除杀生物剂。连续稀释在 PBS 或添加 0.5％丙酮酸盐的 PBS 中进行。从各个稀释液 ( 添加或不添加丙酮酸盐 ) 中， 将 100μl 2 等分试样涂于 BCYE 和添加 0.1％丙酮酸盐的 BCYE 琼脂板。结果显示于图 5。图 5 显示了在 PBS( 刮痕条 ) 或 PBS+ 丙酮酸盐 ( 深色条 ) 中稀释后， 标准培养基 (BCYE) 上得到的可培养嗜肺军团杆菌数和 添加丙酮酸盐的标准培养基上得到的可培养嗜肺军团杆菌数。
如已经观察到的， 当仅用 PBS 作为稀释液时， 在用杀生物剂处理后， 在标准培养基 (BCYE) 中加入丙酮酸盐导致检测的可培养嗜肺军团杆菌的增加。令人惊讶的， 在稀释液中 加入丙酮酸盐不仅导致在标准培养基 (BCYE) 上检测的可培养嗜肺军团杆菌的增加， 而且 导致在添加丙酮酸盐的标准培养基上检测的可培养嗜肺军团杆菌的增加。 这证明稀释液中 的丙酮酸盐使受胁迫的嗜肺军团杆菌进一步修复。