具体实施方式
1、水稻培养、PBZ处理、材料收集与抗病性鉴定
取适量稻种,用自来水浸泡片刻,去除瘪谷。再用3%的过氧化氢溶液消毒30min,
之后弃去双氧水,用无菌自来水洗涤数次并在30℃下用无菌自来水浸种3天。待种子露
白后,均匀地铺在衬有4层无菌纱布的搪瓷盘上,27℃下,光照16h/黑暗8h周期下培
养7天。之后用100ppm烯丙异噻唑分别在第1-9天处理水稻,处理方式是根部溶液浸
泡。处理后全部进行接种稻瘟菌,接种方法为:置接种箱内,在26℃下、相对湿度为85
%以上的条件下进行喷雾接种,接种液浓度为1×105孢子/毫升,接种后保湿24hr,取出置
荫棚中喷雾保湿,7d后调查病情。
按接种处理后第1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,12天的时间梯度收集水稻的根、
叶组织,液氮速冻,置于-70℃保存。
2、水稻总RNA的抽提
抽RNA所用的一切器皿均用0.1%的DEPC水处理或200℃烘烤,以去除RNA酶。
(1)热酚法抽提水稻总RNA
取水稻材料2g,置于研钵中,加液氮充分研磨至细粉状,立即转移到10ml离心管中,
加预热至90℃的抽提缓冲液4ml,剧烈振荡混匀,3min后加入2ml氯仿,摇动混匀15-20min,
12,000g离心15min,吸上清,加入1/3V的8M LiCl,混匀,4℃下放置16hr,离心收集沉淀,
分别用2M LiCl和80%乙醇洗涤2次,室温晾干,沉淀溶于100ulDEPC水中。
(2)Trizol法抽提水稻总RNA
分装1ml trizol试剂,作标记。将适量水稻组织从冰箱中取出,迅速于液氮中研磨成
细粉。把粉末放入加有1ml TRIzol试剂的1.5ml离心管中,用力摇匀后室温静置5min(然
后可暂放4℃下);加0.2ml氯仿并摇匀,室温放置3min,4℃下13,000g离心15min,
取上层水相转移至一个新的离心管。水相中加0.5ml异丙醇,室温沉淀10min,4℃下13,
000g离心15min,去上清。加1ml 75%的乙醇洗涤沉淀,13,000g离心5min,去尽上清。
沉淀于室温干燥5min以彻底去除乙醇。加20μl无菌DEPC水溶解RNA,取1μl以1∶
1000稀释,测定O.D.260与O.D.280的紫外吸收值,另取1μl RNA进行电泳,确定RNA的
浓度与纯度。
3、mRNA分离纯化
mRNA分离纯化按mRNA Purification Kit说明进行。
4、抑制消减杂交(SSH)
具体操作按Clontech试剂盒说明书进行。
5、差减cDNA文库的构建(T/A克隆法)
从PCR扩增后的正向和反向差减cDNA群体(共25ul)中取出3ul,1μl pGEM-T
Easy Vector(50ng),1U T4 DNA连接酶加入到1×T4连接酶缓冲液中混匀,4℃下连接过
夜。连接反应完成后,将反应液加入到100μl大肠杆菌JM109感受态细胞中,冰浴30min,
42℃下热激90s,迅速转移至冰上放置3-5min,加入37℃预热的液体LB培养基300
μl,再置于37℃摇床中,150rpm培养60min。将培养好的菌液200μl与40μl X-gal
溶液(10mg/ml)、4μl IPTG溶液(10mg/ml)混合后涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素
的LB平板上。37℃下倒置培养15h。于X-gal/IPTG琼脂平板上挑取白色克隆,点种于
盛有液体LB的96孔板中,培养过夜,加15%甘油,液氮速冻,-80℃保种备用。
将保种质粒分别接种于装有2ml含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB的试管中,置于
摇床内37℃下,240rpm培养过夜。次日碱法抽提质粒。首先将菌液转移到1.5ml离心管
中,13,000g离心1min,去上清,加入100μl冰预冷的溶液I,振荡将菌体细胞打匀;
再加入200μl新配置的溶液II,室温放置3min;加150μl冰预冷的溶液III,冰上放置5
min;然后13,000g离心10min,收集上清,加2倍体积乙醇,室温沉淀2min;13,000g
离心10min,去上清并加入70%乙醇洗涤一次,再以13,000g离心2min,去尽上清并于
室温下开盖晾干5min。最后加40μl无菌水溶解质粒。
6、差示筛选差减cDNA文库
第一轮差示筛选
(1)质粒样品点膜
挑取200个重组子编号,分别抽提质粒,于每个小孔中加入1ul质粒(200ng)
/9ulH2O/10ul0.6N NaOH,混匀。(制备cDNA文库的两套重复拷贝膜),做好记录。室温晾
干30min,尼龙膜含DNA的一面朝上,漂浮置于0.5M Tris-HCl(pH7.5)中和液2-4min,
于无菌水中漂洗,晾干,紫外照射固定。
(2)差示探针制备
分别取正向差减杂交cDNA(以PBZ处理作Tester,非处理作Driver)和反向差减杂
交cDNA(以非处理为Tester,以PBZ处理为Driver)的PCR扩增产物40ul(~400-
1600ng),PCR产物纯化试剂盒回收PCR产物。先后用RsaI(15units,37℃,1hr,SmaI(10units,
R.T,1hr),EaeI(10units,37℃,1hr)酶切消化以充分去除cDNA分子两端的接头。酶切
产物同样用PCR产物纯化试剂盒回收,即为差异筛选探针。探针标记采用随机引物DNA
标记系统。
(3)点杂交
分别取约200ng正向差减cDNA和反向差减cDNA群体标记探针,两种探针分别用
来杂交同一cDNA文库的两套重复拷贝膜。点杂交采用68℃条件
(6xSSC/5xDenhardt’s/0.1%SDS/100ug/ml鲑精DNA)。洗膜条件为(2xSSC/0.5%SDS,68℃,
4×20min;0.2xSSC/0.5%SDS,68℃,4×20min)。
第二轮差示筛选
取初筛的cDNA重组子质粒,以pGEM-T的一对通用引物T7/SP6扩增外源插入片断。
PCR体系为:20ng质粒模板/0.5uM SP6/1 unit Tag/200uM dNTPs/2ul 10xPCR反应缓冲液。
PCR反应程序为:94℃ 5min,60℃ 2min,72℃,2min,1个循环;95℃ 30s,60℃ 100s,
72℃ 2min,30个循环;72℃延长7min。取3ulPCR产物,点样于2%Agarose/EB/1xTAE,
5V/cm电泳,转膜(注:制备两套重复拷贝膜)。
分别取约100ng正向/反向差减cDNA群体制备放射性探针。两种探针分别用来杂交
PCR产物的两套重复拷贝膜,杂交,洗膜条件同上。
7、Northern杂交分析
(1)制备Northern杂交膜
称取一定量的琼脂糖(在胶中的终浓度为1%),加入适量水,加热使琼脂糖溶解,稍
作冷却后加入甲醛(终浓度2.2mol/L)和MOPS缓冲液(终浓度为1×)。在胶凝固期间
处理RNA。每种RNA样品取40μg,加入甲醛(终浓度2.2mol/L)、甲酰胺(终浓度为
50%),MOPS电泳缓冲液(终浓度0.5×),混匀,置于65℃水浴15min,取出后迅速放
在冰上静置3min。样品在加入上样缓冲液后,上样于甲醛变性胶,在4℃下1×MOPS
缓冲液中按3-4V/cm的电压走电泳。电泳留出一个泳道作EB染色,检测电泳质量并确
定条带位置。电泳进行约7h后结束。将胶取出,用DEPC水淋洗数次,放入20×SSC溶
液中浸泡2次共45min去除甲醛。将凝胶中的RNA吸印转移至Hybond-N尼龙膜,转
移约14h后结束。在膜上标记上样孔位置后与凝胶剥离,放入6×SSC溶液中漂洗,晾干。
然后在紫外交联仪中使RNA交联固定。
(2)Northern杂交
探针取自随机挑取复筛的cDNA重组子,T7/SP6扩增出插入子片段,玻璃粉法回收
各片段,放射性同位素标记探针进行Northern杂交。选用的杂交与洗膜温度为65℃。杂
交后放射自显影7天,洗片观察。洗片后用煮沸的0.1%SDS溶液漂洗杂交膜1-3次,
直至探针被完全洗下(通过测膜的放射性来验证)。然后将膜与18 S rRNA探针于68℃
下杂交,最后洗膜时洗到0.1×SSC,放射自显影2天。
(3)PCR扩增产物的电泳分离、胶回收与探针制备
将PCR反应产物与1/6体积的6×上样缓冲液混合,上样于1%的琼脂糖凝胶,1×TAE
缓冲液中90V电泳35分钟。溴化乙锭(EB)染色后,于UV 312nm下将含有目的片段
的凝胶割下置于1.5ml eppendorf,加3倍于凝胶体积的6mol/L NaI溶液,55℃水浴保温
3-5min使胶溶解。然后加入5μl玻璃粉悬浊液,振荡混匀,于冰上放置5min。13,000g
离心1min,去上清;加洗涤缓冲液200μl重悬玻璃粉,13,000g离心1min,去上清;
如此重复洗涤2-3次后,去尽上清,55℃水浴保温5min使残留液体挥发。加15μl无
菌水,振荡混匀,静置10min,13,000g离心1min,取上清即得所需DNA片段。
Northern杂交采用42℃条件下(5xSSC/5xDenhardt’s/1%SDS/100ug/ml鲑精DNA/50
%(V/V)甲酰胺),预杂交4hr,然后加入放射性标记探针,杂交16-24hr,洗膜条件:
2xSSC/0.5%SDS,室温,2×5min;0.2xSSC/0.1%SDS,室温,2×5min;0.2xSSC/0.1%SDS,
42℃,2×15min;0.1xSSC/0.1%SDS,68℃,2×15min。
8、cDNA片段测序与BLAST分析
PCR扩增产物的自动测序
测序前按照Plasmid Purification Kit的操作手册抽提纯化质粒。细菌接种及培养方法
同上。收集4ml菌液中所含的细胞于一个1.5ml离心管中。室温下,每管加入250μl已
包含RNA酶的溶液1,振荡混匀菌体细胞,再加入250μl溶液2,快速混匀,室温放置
3min。之后加入350μl冰预冷的溶液3,颠倒离心管数次,冰上静置5min。然后13,000g
离心10min,将上清转移至套有微型滤柱的另一离心管中。13,000g离心1min,此时质
粒附着于滤柱上。弃去套管中的液体;向滤柱内加500μl溶液4,再以13,000g离心1min,
弃去套管中的液体;向滤柱内加700μl溶液5,13,000g离心1min,弃去套管中的液体;
再离心一次使滤柱甩干。换一个干净套管,往滤柱内加100μl无菌水,13,000g离心1min,
收集套管中的溶液,即得纯化的质粒。电泳鉴定质粒的纯度与浓度。
取300ng质粒和测序引物(T7或SP6)加入到3μl Big Dye反应混合物中,补水至总
体积为7.5μl,短暂离心后放入PCR仪,按以下程序进行测序反应:96℃变性10s;再
按96℃ 5s,50℃ 10s,60℃ 4min进行25个循环.反应结束后加入95%的乙醇30
μl,振荡混匀,置于冰上30min,4℃下以13,000g离心20min,去上清;加70%的乙
醇100μl洗涤,4℃下以13,000g离心10min,去尽上清。4℃下开盖晾干2h以上,
加2μl上样缓冲液溶解沉淀。上样前先95℃变性2min,然后用ABI Prism 377 DNA自
动测序仪进行核苷酸顺序测定。
9、全长cDNA的分离鉴定
(1)cDNA文库杂交膜的制备
接种大肠杆菌XL1-Blue MRF’于含有50μg/ml四环素的LB液体培养基中,37℃下,
240rpm培养过夜。次日将菌液以1∶100的比例接种于不含抗生素的50ml液体LB中,
37℃下,300rpm培养至菌液O.D.600=0.5,1000g离心,去上清,加入8ml 10mmol/L的
硫酸镁溶液重悬细胞。
取制备好的受体菌液5ml与包含至少一个根cDNA文库量(2.7×105个噬菌体)的λ
ZAP Express混合,37℃保温15min使噬菌体充分吸附。取混合液0.7ml与48℃预热的
0.8%顶层琼脂9ml混匀,迅速铺在一块37℃预热的15cm LB平板上。一共铺板7块。
待顶层琼脂凝固后,将平板倒置于37℃培养过夜。
等噬菌斑长满平板后把平板取出,4℃下放置2h以上使平板表面变硬。取一张略小
于平板的Hybond-N+尼龙膜覆盖于平板表面,1min后揭下。将膜依次放入变性液(1.5M
NaCl,0.5M NaOH)、中和液(1.5M NaCl,0.5M pH7.4的Tris-Cl)和2×SSC溶液中处理
3min,5min,1min后,置于干净滤纸上晾干。再放入紫外交联仪(Bio-Rad公司产品)以
C3程序进行紫外交联。
(2)cDNA克隆的筛选
将制备好的杂交膜放入预杂交液(含有6×SSC,5×Denhart’s,0.5%SDS,100μg/ml
变性小牛胸腺DNA)中,68℃预杂交1-2h,同时进行探针的放射性标记。
取实验中制备的带有PCR扩增片段的质粒为模板,限制性酶切、胶电泳,并回收片
段用于探针标记。取200ng回收片段,沸水浴中变性3min后迅速插在冰上冷却。将变性
过的DNA加入到含有下列成分的50μl体系中:dCTP、dGTP、dTTP(终浓度各为20μ
mol/L),[α-32P]dATP(终浓度333nmol/L,放射强度50μ Ci),牛血清白蛋白(终浓度400
mg/L),Klenow酶(终浓度105U/L)。混匀后稍作离心,室温下反应1-2h。标记反应
完成后,加少许蓝色葡聚糖,混匀。同时用滴管做一根简易的Sephadex G-50层析柱。将
反应液过柱,收集蓝色组分。再将收集的液体沸水浴变性5min,迅速置于冰上冷却,即
得杂交探针。
预杂交结束后,将标好的探针加入到预杂交液中,68℃下杂交14h。完成后将杂交
液倒出保存以便于下一轮筛库使用。杂交膜依次用2×SSC,1×SSC,0.5×SSC(均含有
0.1%的SDS)溶液于60℃漂洗。将膜取出,用纸巾吸去多余液体,再将膜用保鲜膜包好,
测定放射强度。-70℃下放射自显影,根据放射性的强弱,压片时间在24小时至一星期
不等。
洗片后,根据X光片上的黑色斑点,在平板上找出相应位置的噬菌斑,用无菌的滴管
挖下,并放到含有1ml SM溶液和40μl氯仿的1.5ml的离心管中。振荡打散后于4℃保
存。取适量噬菌体悬液,按前文所述方法再进行两轮筛选,直至得到纯的噬菌体克隆。
(3)cDNA克隆pBK-CMV质粒的切离
接种大肠杆菌XLOLR于含有50μg/ml四环素的LB液体培养基中,37℃,240rpm
培养过夜。次日将菌液以1∶100的比例接种于不含抗生素的50ml液体LB中,37℃,
300rpm培养至菌液O.D.600=1.0,备用。
将250-500μl筛选到的单噬斑悬液及1μl ExAssist辅助噬菌体加入到200μl
XL1-Blue MRF’(O.D.600=2.0)中,37℃保温15min.加3ml LB液体培养基,摇床中37℃,
240rpm培养2-2.5h,取出,置于70℃水浴15min,然后4000g离心5min,留上清。
将100μl上清液与新制备的XLOLR受体菌混合,37℃保温15min。再加入300μl
液体LB,摇床中37℃,240rpm培养45min。取出,涂布于含有50μg/ml卡那霉素的
LB平板上,37℃倒置培养过夜。能够在抗性平板上长出的菌落即含有pBK-CMV质粒(带
有cDNA插入片段)。
(4)cDNA阳性克隆的鉴定与测序
碱法抽提pBK-CMV质粒,T3/T7引物作PCR鉴定插入片段大小。将插入片段插入到
pBlueScript II SK+质粒,利用位于pBlueScript II SK+质粒多克隆位点两侧的T3/T7引物序
列进行自动测序。
10、基因组文库的筛选
除噬菌体和受体菌分别换成了λEMBL 3和E.coli p2392外,从基因文库中筛选到基
因克隆的方法与筛选cDNA文库的方法基本相同。
11、OsPIG-1基因的分离
用上述方法筛选获得11个OsPIG基因克隆。其中,噬菌体和受体菌分别为λEMBL 3
和E.coli p2392,筛选到的阳性克隆不需作质粒切离。
将分离获得的阳性克隆进行扩增,以得到足够的噬菌体。按上述的方法制备受体菌
p2392的感受态。取105pfu的阳性λ EMBL 3噬菌体与0.1ml受体菌混合,37℃吸附15
min,加入3ml 0.7%顶层琼脂并混匀后,倒入一块新鲜的LB平板。37℃培养6-8h至噬
菌斑长满平板,加入5ml SM溶液,置于4℃数小时,间歇摇动,使噬菌体浸出。吸出SM,
往平板上再加入1ml SM;平板斜放15min,将吸出的SM与第一次的合并。在收集的噬
菌体液中加入0.1ml氯仿,轻微振荡,4℃中以4000g离心10min,回收上清,加40μ
l氯仿,4℃保存。
以低复数感染法扩增噬菌体,经甘油梯度离心纯化后制备噬菌体DNA。先接种受体菌
p2392的单菌落于50ml液体LB中,37℃、240rpm培养过夜。次日根据菌液的OD600值,
按1 OD=8×108个细胞计算细菌浓度。取2份菌液,每份含有1010个细菌,4000g离心10
min,去上清,加3ml SM重悬沉淀。两份样品中分别加入5×107和5×108pfu的重组噬
菌体,37℃保温20min,间或振荡。再将每份样品加入到250ml经37℃预热的液体LB
中,37℃、300rpm培养8-12h,直至细菌培养物接近完全裂解。再往菌液中加入5ml
氯仿,继续培养10min后将培养物取出。
培养物冷却至室温后,加入胰DNase I与胰RNase酶(终浓度均为1μg/ml),室温下
消化30min。加入固体氯化钠和固体聚乙二醇(PEG 6000)至终浓度分别为1mol/L和
10%。待固体溶解后,冰浴1.5h使噬菌体沉淀。4℃下以11000g离心10min,弃上清,
将噬菌体沉淀重悬于10ml TM溶液中(50mmol/L pH7.8 Tris-Cl,10mmol/L MgSO4。)。
向悬浮液中加入等体积氯仿,振荡30s,4℃下以3000g离心15min,回收含噬菌体的水
相。按下列步骤制备甘油分级梯度:
i)将3ml含40%甘油的TM溶液加入超离心管底部。
ii)在40%甘油-TM溶液上小心地铺上4ml含有5%甘油的TM溶液。
iii)将噬菌体悬液小心地铺在5%甘油-TM溶液的上面。
iv)将离心管的剩余空间用TM溶液加满。
4℃下,35000rpm超离心60min。弃上清,加入1ml TM溶液重悬沉淀。即得纯化的重
组噬菌体。
在噬菌体悬液中加入5μg胰DNA酶,1μg胰RNA酶,37℃消化30min。再加入0.5mol/L
pH8.0的EDTA溶液40μl、蛋白酶K50μg、10%SDS溶液50μl,混匀后于56℃保温1h。
消化液冷却至室温后,加入等体积的平衡酚(pH8.0),翻转数次混匀。3000g离心5min,
回收上层水相;再分别用等体积的1∶1的酚∶氯仿和24∶1的氯仿∶异戊醇抽提水相各
一次。然后加入1/10体积的3mol/L pH7.0的乙酸钠溶液,2倍体积的无水乙醇,室温
放置30min。4℃下以13000g离心10min,弃上清并加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀;再于
4℃下以13000g离心2min,去尽上清。DNA沉淀室温干燥后,加100μl pH7.5的TE
缓冲液溶解。
用Sal I等多种限制酶对重组λDNA作酶切分析,构建插入片段的物理图谱。同时将
电泳胶中的DNA酶切片段转移至Hybond-N+膜,以文库筛选所用的探针作Southern blot
分析,确定OsPIG-1基因在插入片段中的位置。将各酶切片段插入到pBlueScript II SK+
质粒,构建亚克隆。以T3/T7引物进行测序,并将各亚克隆的核苷酸顺序进行拼接,得到
OsPIG-1cDNA(SEQ ID No.1)。
12、OsPIG-1基因5’上游调控序列的获得
根据水稻基因组数据库的序列,设计出了两对引物(SEQ ID No.5,SEQ ID No.6,SEQ
ID No.7),扩增出OsPIG-1基因的启动子序列(SEQ ID No.3,SEQ ID No.4)。
ATG上游2205bp片段的扩增:
F:5’GTTTCAAGTAAAGCATGTAGGG 3’
R:5’TGTGGAAGCAAGAGGTATTTAC3’
PCR反应条件:
94℃, 5min
94℃ 46sec
52℃ 46sec
72℃ 1min30sec
循环30次
延伸72℃ 10min
将扩增出的片段回收,克隆(T-Vector),转化LB/Amp酶切鉴定,测序表明从两头测
的结果与Genbank数据一致。
ATG上游1137bp片段的扩增:
F:5’GTTTCAAGTAAAGCATGTAGGG3’
R:5’CCACCTGTCATACACATACTGC3’
PCR反应条件:
94℃, 5min
94℃ 46sec
52℃ 46sec
72℃ 1min30sec
循环30次
延伸72℃ 10min
回收、克隆、转化、测序同上。
13、带OsPIG-1启动子的植物转基因载体的构建与转基因研究
比较带有OsPIG-1基因上游序列T载体和双元转基因载体pCAMBIA 1301(含GUS报
告基因)上的酶切位点。分别挑选出合适的双酶切组合,使载体上原有的CaMV 35S启动
子能被完全切除,且使酶切后的目的片段与载体片段有相同的粘性末端。分别使用NcoI、
EcoRI双酶切,可以获得长度约2.2kb、1.1kb的OsPIG-1基因的上游调控顺序(SEQ ID
No.3、4)。
酶切产物经胶电泳回收后4℃b下连接过夜。次日将连接反应产物转化大肠杆菌TOP 10
感受态细胞,涂布于带有合适抗生素(卡那霉素或氨苄青霉素)的LB平板上,37℃下培
养14h。从平板上挑单菌落接种,37℃下培养过夜,碱法抽提质粒,即得重组后的转基因
载体,分别包含两种长度的OsPIG-1基因上游调控序列。
选取新鲜的洋葱,于超净台中选取靠近核心部分的瓣片,用镊子撕下瓣片的内表皮,
光滑面向下平铺于含1.5%琼脂的MS培养基平板上,其中诱导的实验组,培养基中加入
100mg/L的烯丙异噻唑(PBZ)或含有200mg/L的水杨酸(SA)。生长近1月的Col野生
型拟南芥叶片,打基因枪前从营养钵中的苗上剪下、蒸溜水洗净,用作瞬间表达试验。水
稻成熟胚用作基因瞬间表达试验材料时,先将种子用0.1%的升汞消毒4min;用无菌水洗
去残留升汞,去壳后,用手术刀将胚剥下,再将水稻胚于液体MS培养基中浸泡2天。
称取100mg金粉或钨粉(颗粒直径1.5-3.0μm)放入1.5ml离心管,加1ml无
水乙醇,充分振荡混匀;13000g离心1min,去上清。以1ml无菌水重悬沉淀,超声处
理1min,再以13000g离心1min,去上清。沉淀用无水乙醇洗涤数次后,重悬于1ml
无水乙醇中。将金粉或钨粉悬液振荡混匀,吸取30μl,加入转基因载体(浓度为1μg/
μl)60μl和2.5mol/L氯化钙溶液75μl,振荡混匀。再加入0.1mol/L亚精胺30μl,
振荡混匀。冰浴20min,期间不时取出振荡。13000g离心1min,弃上清;沉淀用乙醇
洗涤两次,重悬于30μl无水乙醇中。
在使用基因枪转化前先用75%乙醇对基因枪(Bio-Rad公司产品)进行消毒。按Bio
-Rad公司提供的操作规程,将带有转基因载体的金粉或钨粉(每皿10μl金粉悬液)打
入植物组织中。选用的氦气压力为1100kPa。
转化后的洋葱表皮、拟南芥叶片和水稻成熟胚在25℃下、白光中培养1天后,置于培
养皿中,加入X-Gluc染色液,37℃下染色约5小时后观察显色结果,经3%的甲醛溶液固
定,在显微镜下拍照。
37℃下染色约5小时后,含上述OsPIG-1上游序列且经PBZ诱导的实验组均可以由
肉眼观察到蓝色的斑点,为诱导表达的GUS蛋白与其底物作用的结果;而未诱导组没有观
察到任何细胞内蓝色反应产物。该组结果说明,OsPIG-1基因的上游2.2kb、1.1kb的调
控顺序均可以诱导调控外源基因表达。
稳定转化后,在拟南芥叶片和根中也观察到上述诱导表达效果。水稻中的诱导表达效
果与上述类似。
本发明涉及的序列
SEQ ID No:1的信息
长度:1749碱基
类型:核酸
链性:单链
拓扑结构:线性
分子类型:cDNA
序列描述:SEQ ID No:1
1 atggagccgc cgaccagcca cgtcaccaac gcgttctccg actcggacag cgcgtccgtg
61 gaggaggggg gcgccgacgc ggacgccgac gtggaggcgc tccgccgcct ctccgacaac
121 ctcgccgcgg cgttccgctc gcccgaggac ttcgcgttcc tcgccgacgc gcgcatcgcc
181 gtcccgggcg gcggcggcgg cggcggcgac ctgctggtgc accgctgcgt gctctccgcg
241 cggagcccct tcctgcgcgg cgtcttcgcg cgccgcgccg ccgccgccgc aggcggcggc
301 ggcgaggatg gcggcgagag gctggagctc cgggaactcc tcggcggcgg cggcgaggag
361 gtggaggtcg ggtacgaggc gctgcggctg gtgctcgact acctctacag cggccgcgtc
421 ggcgacctgc ccaaggcggc gtgcctctgc gtcgacgagg actgcgccca cgtcgggtgc
481 caccccgccg tcgcgttcat ggcgcaggtc ctcttcgccg cctccacctt ccaggtcgcc
541 gagctcacca acctcttcca gcggcgtctc cttgatgtcc ttgataaggt tgaggtagat
601 aaccttctat tgatcttatc tgttgccaac ttatgcaaca aatcttgcat gaaactgctt
661 gaaagatgcc ttgatatggt agtccggtca aaccttgaca tgattactct tgagaagtca
721 ttgcctccag atgttatcaa gcagattatt gatgcacgcc taagcctcgg attaatttca
781 ccagaaaaca agggatttcc taacaaacat gtgaggagga tacacagagc ccttgactct
841 gacgatgtag agctagtcag gatgctgctc actgaaggac agacaaatct tgatgatgcg
901 tttgcactgc actacgccgt cgaacattgt gactccaaaa ttacaaccga gcttttggat
961 ctcgcacttg cagatgttaa tcatagaaac ccaagaggtt atactgttct tcacattgct
1021 gcgaggcgaa gagagcctaa aatcattgtc tcccttttaa ccaagggggc tcggccagca
1081 gatgttacat tcgatgggag aaaagcggtt caaatctcaa aaagactaac aaaacaaggg
1141 gattactttg gggttaccga agaaggaaaa ccttctccaa aagataggtt atgtattgaa
1201 atactggagc aagctgaaag aagggaccca caactcggag aagcatcagt ttctcttgca
1261 atggcaggtg agagtctacg aggaaggttg ctgtatcttg aaaaccgagt tgctttggcg
1321 aggattatgt ttccgatgga ggcaagagta gcaatggata ttgctcaagt ggatggaact
1381 ttggaattta acctgggttc tggtgcaaat ccacctcctg aaagacaacg gacaactgtt
1441 gatctaaatg aaagtccttt cataatgaaa gaagaacact tagctcggat gacggcactc
1501 tccaaaacag tggagctcgg gaaacgcttt ttcccgcgat gttcgaacgt gctcgacaag
1561 atcatggatg atgaaactga tccggtttcc ctcggaagag acacgtccgc ggagaagagg
1621 aagaggtttc atgacctgca ggatgttctt cagaaggcat tccacgagga caaggaggag
1681 aatgacaggt cggggctctc gtcgtcgtcg tcatcgacat cgatcggggc cattcgacca
1741 aggagatga
SEQ ID No:2的信息
长度:2502碱基
类型:核酸
链性:单链
拓扑结构:线性
分子类型:基因组DNA
序列描述:SEQ ID No:2
CAGGATGGCCTTGTTTCAAGTAAAGCATGTAGGGGACATTGTATTATGTGAAATGAATTAGTTTAGT
ATAGTTTAGCTAAGGACTGGGCCTCACACATGCCACTCCCTTCCAACTCCGTGCAAAGTTTGGAGC
AATGACAAGTGGATCCAACTGGTAGAGTCCATAGCCAAACACAATAAAATTATGGGTACACATCCA
AGGCGAAAAAGCAAGTCATTAATCTTTCTTCACATCGACGTGTAGATGTGATCTCTTCTTTGTCAAT
CTTTGTTTTTTCACTTTCTTTAATACGGGCAGCTTCGTTTTGCAATTTGGTCCTTTCAGTTCCTGGAA
AATATAGAGTAAACACTCCTGCGTGTGGTGAACTGGTGACAAGTGACAACTCCTTTTATCTCTTCTT
TAATTGGAGCTGTTTATTACTTTATTGTAAAACTAATATAAGTTAACTACTCCCACTATTTCATAATAT
AAAACATGGTCAAATTTGGTACAATCTCCAACACTAATGTTTAGCTTATAATTTCTCATATAAGGTTT
GTAGCAATCAAATTATAGACATATGAAAGTAAATTTAAATCTCAAACTAATGATATAATTCTTAGCAA
ATAAAATTCATTTCATATTATACTAAGTGTTGGTCAAATGTTTTAAATGTTGATTCTTGAAATACGTG
AGTATAATCTTGTATGAAAAGGATAGAGGAAGAAAATTAAGAAATGTTAACTCTTATGTACTGAGCT
AACTGTATATTCCATTCTTTAGTTTTTCTAAAAGTGTAAGTCCTATTTGTAGTCAATAAGTGCTAAATT
AAATTGTTAATTGGAACCCAAGAAGCCATTCTATTACTTCGTTGTATGTTCATTGGTTTTGGAGTATC
ACACAGTGAATAAATTAATTGCTTCTTAGTCTTGGTGAAAAGAAATAGATTTTAGACTTTTGGAAGG
AGGCAGTTCATGCTTCAAGGTAAATATATTAATTACATAGGTGAGAGGAAAAGAGAAAAATAATTA
GATGCACCCTCAGAGTAAGTTTAATAGTATAGCTTACTACTAACTCCAATTCATTTATAGCCAATCTA
GTAGTCAATTTATACAATAGTTGCCTACTATACTATTAATATATGGTCCCACCTGTCATACACATACTG
CGTCTTGTAGTCCGTACTGCAGCTAGCTACAAATCTGTAGCCCGCTGGTCTTCTCTCTTATCTTTTAT
CTAATTAAAATATACTTATAGCTGGCTAATAGTCTGCTATTGTACTTGCTCTCATAGCTAATATATTATA
TATGTTCGTATTAATACTACTTTATGATTGATTTGTAATTATTTTACTACTAGTATTAAATTTGCTCTTA
CTCCAGTTCATACTACTTCCTCTGTCCACCAATGCAAGAGATTTAAACTAAAAATTATCCATAAACA
TGTTTAGAGTGTATACAGCTTCACCGACCCACTGGTAGTTTAGTCATTTGGCTTTTCAGTAAGCACT
TGATTAATTAATTATTAATTACTATAAATTTGAAGATAAATTTATTTAATATTGTGAAACCTTTTATTTA
GAAAAACTAAAACACACTATTTAGATGTTTTGGAGTTTGTTAATAAAAACGAGGGAGTTATCATCCT
AATATGCAAAAATAAACTAAGCCTTAGGGGCATAACTTCAACCTTAAACTTTGCTAATAGCCTACTC
CTTTCATTATAAAATATACTAGTAGGTCTTTACTACAAAACAAACATATGATAAAAACATATTTAATG
TTAGATTTAATAAAACTAATTTAATATTTTAAATAGTACTAAATTATTCTATAAATTTGGTCAAACTTA
ACAAGTTTGACAAAAGAAAAGTTAAACGACTCATAATATGAAACATAGGAGTATAGGTTATTACAG
TTGAGAAGAAAATATCTGGGTGTCACATGAGAACTTGTTGAGGTGAGAGGCTAGGGTAAGATAAA
AAGAAATTTAAAAAGTGGATGAGGGAGGCTAGAGTATAACACATAGTATTATGTATTATGAATACTC
CTTCCATCCTAAAAAAGCTGACCTAGTTAGGGATAGAAGATAACATAGTACGATGAATATTCATGTC
TAGACTTGCTACGTTAGGTTGTGTTCCATCCTTATTTTATTTTTTTTATGAAGGGAATAATTTCTCG
GAAGAGAGGAGGTGTGTAAGCCATTATTTGTGTGGAAGCAAGAGGTATTTACGTTTGTTGGCTTTC
ACGAGGCACCACCAATTGTGCATTGTCAGTTACTCCAGTCTGGTCAACGAAGGAATGACCTTGTAA
AATCCCTAAATCTACAGGTGCAATGTGCAAAATTGCGGTTTGCACCTCACTCCTCGTTTTACTACTC
CATCCCTTTCGCCTTCGACTTCCTCGCGCCTTCCCACCAGCTCGGGCGGGAGGCCTCCTCCTCGCC
TCGCCTCGCCACGCCGCGCCGCGACGCGACGCGCCGTGGTCAGCTGGTCGCCGGTGCGGGTGCG
GGTGCGCA
SEQ ID No:3的信息
长度:2205碱基
类型:核酸
链性:单链
拓扑结构:线性
分子类型:基因组DNA
序列描述:SEQ ID No:3
GTTTCAAGTAAAGCATGTAGGGGACATTGTATTATGTGAAATGAATTAGTTTAGTATAGTTTAGCTAA
GGACTGGGCCTCACACATGCCACTCCCTTCCAACTTGATTCTTGAAATACGTGAGTATAATCTTGTA
TGAAAAGGATAGAGGAAGAAAATTAAGAATCCGTGCAAAGTTTGGAGCAATGACAAGTGGATCCA
ACTGGTAGAGTCCATAGCCAAACACAATAAAATTATGGGTACACATCCAAGGCGAAAAAGCAAGT
CATTAATCTTTCTTCACATCGACGTGTAGATGTGATCTCTTCTTTGTCAATCTTTGTTTTTTCACTTTC
TTTAATACGGGCAGCTTCGTTTTGCAATTTGGTCCTTTCAGTTCCTGGAAAATATAGAGTAAACACT
CCTGCGTGTGGTGAACTGGTGACAAGTGACAACTCCTTTTATCTCTTCTTTAATTGGAGCTGTTTAT
TACTTTATTGTAAAACTAATATAAGTTAACTACTCCCACTATTTCATAATATAAAACATGGTCAAATTT
GGTACAATCTCCAACACTAATGTTTAGCTTATAATTTCTCATATAAGGTTTGTAGCAATCAAATTATA
GACATATGAAAGTAAATTTAAATCTCAAACTAATGATATAATTCTTAGCAAATAAAATTCATTTCATA
TTATACTAAGTGTTGGTCAAATGTTTTAAATGATGTTAACTCTTATGTACTGAGCTAACTGTATATTCC
ATTCTTTAGTTTTTCTAAAAGTGTAAGTCCTATTTGTAGTCAATAAGTGCTAAATTAAATTGTTAATT
GGAACCCAAGAAGCCATTCTATTACTTCGTTGTATGTTCATTGGTTTTGGAGTATCACACAGTGAAT
AAATTAATTGCTTCTTAGTCTTGGTGAAAAGAAATAGATTTTAGACTTTTGGAAGGAGGCAGTTCAT
GCTTCAAGGTAAATATATTAATTACATAGGTGAGAGGAAAAGAGAAAAATAATTAGATGCACCCTC
AGAGTAAGTTTAATAGTATAGCTTACTACTAACTCCAATTCATTTATAGCCAATCTAGTAGTCAATTTA
TACAATAGTTGCCTACTATACTATTAATATATGGTCCCACCTGTCATACACATACTGCGTCTTGTAGTC
CGTACTGCAGCTAGCTACAAATCTGTAGCCCGCTGGTCTTCTCTCTTATCTTTTATCTAATTAAAATAT
ACTTATAGCTGGCTAATAGTCTGCTATTGTACTTGCTCTCATAGCTAATATATTATATATGTTCGTATTA
ATACTACTTTATGATTGATTTGTAATTATTTTACTACTAGTATTAAATTTGCTCTTACTCCAGTTCATAC
TACTTCCTCTGTCCACCAATGCAAGAGATTTAAACTAAAAATTATCCATAAACATGTTTAGAGTGTAT
ACAGCTTCACCGACCCACTGGTAGTTTAGTCATTTGGCTTTTCAGTAAGCACTTGATTAATTAATTAT
TAATTACTATAAATTTGAAGATAAATTTATTTAATATTGTGAAACCTTTTATTTAGAAAAACTAAAAC
ACACTATTTAGATGTTTTGGAGTTTGTTAATAAAAACGAGGGAGTTATCATCCTAATATGCAAAAAT
AAACTAAGCCTTAGGGGCATAACTTCAACCTTAAACTTTGCTAATAGCCTACTCCTTTCATTATAAA
ATATACTAGTAGGTCTTTACTACAAAACAAACATATGATAAAAACATATTTAATGTTAGATTTAATAA
AACTAATTTAATATTTTAAATAGTACTAAATTATTCTATAAATTTGGTCAAACTTAACAAGTTTGACA
AAAGAAAAGTTAAACGACTCATAATATGAAACATAGGAGTATAGGTTATTACAGTTGAGAAGAAAA
TATCTGGGTGTCACATGAGAACTTGTTGAGGTGAGAGGCTAGGGTAAGATAAAAAGAAATTTAAA
AAGTGGATGAGGGAGGCTAGAGTATAACACATAGTATTATGTATTATGAATACTCCTTCCATCCTAAA
AAAGCTGACCTAGTTAGGGATAGAAGATAACATAGTACGATGAATATTCATGTCTAGACTTGCTACG
TTAGGTTGTGTTCCATCCTTATTTTATTTTTTTTATGAAGGGAATAATTTCTCTCGGAAGAGAGGAGG
TGTGTAAGCCATTATTTGTGTGGAAGCAAGAGGTATTTAC
SEQ ID No:4的信息
长度:1137碱基
类型:核酸
链性:单链
拓扑结构:线性
分子类型:基因组DNA
序列描述:SEQ ID No:4
GTTTCAAGTAAAGCATGTAGGGGACATTGTATTATGTGAAATGAATTAGTTTAGTATAGTTTAGC
TAAGGACTGGGCCTCACACATGCCACTCCCTTCCAACTTGATTCTTGAAATACGTGAGTATAATCTT
GTATGAAAAGGATAGAGGAAGAAAATTAAGAATCCGTGCAAAGTTTGGAGCAATGACAAGTGGAT
CCAACTGGTAGAGTCCATAGCCAAACACAATAAAATTATGGGTACACATCCAAGGCGAAAAAGCA
AGTCATTAATCTTTCTTCACATCGACGTGTAGATGTGATCTCTTCTTTGTCAATCTTTGTTTTTTCAC
TTTCTTTAATACGGGCAGCTTCGTTTTGCAATTTGGTCCTTTCAGTTCCTGGAAAATATAGAGTAAA
CACTCCTGCGTGTGGTGAACTGGTGACAAGTGACAACTCCTTTTATCTCTTCTTTAATTGGAGCTGT
TTATTACTTTATTGTAAAACTAATATAAGTTAACTACTCCCACTATTTCATAATATAAAACATGGTCAA
ATTTGGTACAATCTCCAACACTAATGTTTAGCTTATAATTTCTCATATAAGGTTTGTAGCAATCAAATT
ATAGACATATGAAAGTAAATTTAAATCTCAAACTAATGATATAATTCTTAGCAAATAAAATTCATTTC
ATATTATACTAAGTGTTGGTCAAATGTTTTAAATGATGTTAACTCTTATGTACTGAGCTAACTGTATAT
TCCATTCTTTAGTTTTTCTAAAAGTGTAAGTCCTATTTGTAGTCAATAAGTGCTAAATTAAATTGTTA
ATTGGAACCCAAGAAGCCATTCTATTACTTCGTTGTATGTTCATTGGTTTTGGAGTATCACACAGTG
AATAAATTAATTGCTTCTTAGTCTTGGTGAAAAGAAATAGATTTTAGACTTTTGGAAGGAGGCAGTT
CATGCTTCAAGGTAAATATATTAATTACATAGGTGAGAGGAAAAGAGAAAAATAATTAGATGCACCC
TCAGAGTAAGTTTAATAGTATAGCTTACTACTAACTCCAATTCATTTATAGCCAATCTAGTAGTCAAT
TTATACAATAGTTGCCTACTATACTATTAATATATGGTCCCACCTGTCATACACATACTGC
SEQ ID No:5的信息
长度:22碱基
类型:核酸
链性:单链
拓扑结构:线性
分子类型:寡核苷酸
序列描述:SEQ ID No:5
F:5′GTTTCAAGTAAAGCATGTAGGG 3′
SEQ ID No:6的信息
长度:22碱基
类型:核酸
链性:单链
拓扑结构:线性
分子类型:寡核苷酸
序列描述:SEQ ID No:6
R:5’TGTGGAAGCAAGAGGTATTTAC3’
SEQ ID No:7的信息
长度:22碱基
类型:核酸
链性:单链
拓扑结构:线性
分子类型:寡核苷酸
序列描述:SEQ ID No:7
R:5’CCACCTGTCATACACATACTGC3’