含有至少两种效价的疫苗组合物，其中一种效价 是添加了助剂的，另一种效价是未添加助剂的 本发明的主题具体地是一种稳定化的甲型肝炎/伤寒(HA-Vi)双效价疫苗组合物，其中Vi效价在至少约24小时期间保持其免疫能力。
甲型肝炎和伤寒是两种已经有疫苗的疾病。世界上卫生条件还远未达到最理想的地区，都会发现有这两种疾病。由于各自传染物共同地具有同样的传播途径(口-粪便途径)，还由于这些疾病的流行地区覆盖面非常宽阔，所以将这两种效价合并在同一产品中似乎是很有意义的。特别地，很容易理解在旅行者用的疫苗范围内，HA-Vi结合要比分开服用两种单效价疫苗HA和Vi更具吸引力。
为了证明HA和Vi效价是相容的，特别在无毒、免疫能力和稳定性方面是相容的，已经进行了许多研究工作。这些研究使用了由市场上已经有的单效价疫苗制备的HA-Vi组合，它们主要在于两个方面：一方面，将SmithKline Beecham Biological(Rixensart，比利时)生产的HavrixTM(HA)和(Vi)单效价疫苗组合进行了这些研究，另一方面，将Aventis Pasteur(里昂，法国)生产的AvaximTM(HA)和TyphimViTM(Vi)单效价疫苗组合进行了这些研究。
在这两组研究中，HA单效价疫苗由失活的甲型肝炎病毒构成，并且吸附在氢氧化铝上。同样地，伤寒单效价疫苗由仍是未添加助剂的伤寒沙门氏菌荚膜地多糖构成。最后，以同样方式，将这些相应的单效价疫苗(这些单效价疫苗是以液体形式销售的)简单混合生产出双效价组合。因此，一定剂量的AvaximTM和一定剂量的Typhim ViTM混合在一起得到一定剂量的HA-Vi双效价组合。
在没有实施临床试验范围内的注射之前，使用构建的组合曾进行了不到二十个月的两组研究工作。这些研究工作表明，这些双效价组合与相应的单效价是等效的，特别在免疫能力方面。于是，SmithKlineBeecham Biological的双效价组合满足了英国当局的要求，因此已经准许进入这个国家的市场。但是，这种准入有一个有效期确定为在生产后12个月的限制。
在疫苗领域内，特别考虑到在分配前控制分批所需要的时间时，有效期为12个月是不够的。确定有效期为24个月或更好地为36个月大大有利于这些批疫苗推向市场。
然而，在HA-Vi组合的情况下，本申请人发现在生产日期过16-18个月后，Vi疫苗逐渐失去其免疫能力，并且提出一种有关这种不稳定性根源的假设。事实上，具有Vi免疫原性特征的Vi多糖O-乙酰基团随着时间推移会水解，特别在碱性条件下更是如此。这种水解被认为是造成Vi多糖免疫能力下降的原因，这种水解是由于组分Vi吸附在氢氧化铝上所致，而氢氧化铝是作为HA效价添加剂存在于双效价组合中。单效价疫苗彼此一混合，Vi效价就立刻吸附在铝凝胶上。这种吸附导致Vi多糖保持在碱性环境中。事实上，氢氧化铝带正电荷的吸引介质的OH-离子，这样造成在铝凝胶微环境中pH升高，在吸附后Vi就定位在铝凝胶上。至于O-乙酰基团的水解，这种水解是一种非常缓慢的现象时，其作用是在约16-18个月后才真正觉察出来。
本申请人不仅证明了Vi效价随着时间推移的不稳定性问题，而且本申请人提出一种解决方法，该方法在于在双效价组合中再添加一种化合物，它阻止铝凝胶吸附Vi，同时保持以添加形式的HA效价。有利地，这种化合物可以是一种阴离子，例如磷酸根或柠檬酸根。
在其更一般的教导中，本发明因此涉及一种疫苗组合物，该组合物含有至少两个效价：(i)与氢氧化铝一起添加的第一效价和(ii)含有细菌荚膜多糖的第个二效价，该多糖含有一个或多个O-乙酰基团，并且由于添加了第一效价，氢氧化铝不吸附第二效价，这是由于附加化合物的存在将阻止氢氧化铝吸附第二效价，不干扰第一效价的吸附。
根据一种有利的实施方式，因保护阴离子化合物的存在，可阻止吸附第二效价，其条件是它提供为最终疫苗使用所需要的所有安全保证。这种保护化合物可以是磷酸盐、柠檬酸盐或碳酸盐。还可能使用不同阴离子的组合，例如磷酸根与柠檬酸根的组合。作为典型提示，明确指出特别地可以用含有磷酸一钾、磷酸二钠和氯化钠的溶液提供磷酸根。
使用保护化合物尤其能够长时间地(24个月或24个月以上)，优选地在正常储存温度或更高(例如37℃)温度下在保存过程中稳定第二效价的抗原活性。采用不同的技术，在生产该组合物时测量这种活性，然后随着时间推移或在生产日期过去至少24个月再进行同样的测量，比较所得到的这些结果就可以估算出免疫活性的稳定性。当不能确定数字化数据彼此间在统计上有不同时，则应该认为免疫活性是稳定的。采用ELISA技术，使用在疫苗领域中通常使用的技术，可以实施抗原免疫活性的测定。
第一效价可以是任何疫苗效价，没有类型或结构的限制，其条件当然是需要其添加。特别可以列举甲型肝炎效价(HepA或HA)、乙型肝炎效价(HepB)和肺炎球菌效价。这种第一效价可以由失活病毒构成，失活病毒例如为失活的HA病毒或失活的脊髓灰质炎病毒；减弱的病毒；病毒或细菌亚单位抗原，例如乙型肝炎病毒的表面抗原，白喉或破伤风类毒素。
第二效价按照定义是由共轭或未共轭多糖构成，它们在其重复单元中含有一个或多个O-乙酰基团。伤寒沙门氏菌的荚膜多糖(还称之Vi多糖)和脑膜炎奈瑟球菌群A的荚膜多糖满足这个定义。在这些情况下，因此可以谈到Vi效价，或伤寒效价和甲型脑膜炎(meningo A)效价。
关于“细菌荚膜多糖”，应该理解是由具有荚膜多糖特征的重复单元链构成的多糖，无论其大小，也与其辅助修饰无关。在本发明组合物中的多糖重复单元必须包括至少一个O-乙酰基团。
为了本发明的目的，根据完全常规的技术由源细菌出发可以得到纯化形式的多糖。按照需要，该多糖可以是(i)片段的或非片段的和(ii)与载体多肽共轭或未共轭的，例如白喉或破伤风类毒素。
在更特定的范围内，本发明的目的是一种疫苗组合物，它含有(i)与氢氧化铝一起添加的HA效价和(ii)由Vi多糖构成的伤寒效价；其中Vi效价未被氢氧化铝吸附的组合物。
为了本发明的目的，可以通过用氢氧化铝进行沉淀，或者通过用氢氧化铝吸附的方法来添加第一效价。
用于添加第一效价的氢氧化铝可以是纯氢氧化铝(即只含有Al3+离子和氢氧根的铝化合物)，或以这个名称为人们所知的任何氢氧化铝，即使从化学观点来看，它们不是只由氢氧化铝构成。因此还可能涉及混合的铝化合物，例如以碱式磷酸铝或碱式硫酸铝名称表示的铝化合物。一般地，可能涉及特别地含有羟基基团的铝化合物。作为典型说明，可列举Superfos Biosector公司销售的AlhydrogelTM氢氧化铝。
为阻止吸附第二效价，同时保持呈添加形式的第一效价，应该添加足够数量的磷酸根、柠檬酸根或碳酸根离子(保护化合物)。这个数量取决于各种因素，其中包括第一效价的数量与性质，其添加方式，氢氧化铝的数量与性质，以及第二效价的数量。为了一旦确定了其它因素就可决定用于阻止第二效价吸附的化合物的适当量，疫苗领域里的技术人员可完全直接考虑这些制约因素，以便氢氧化铝被磷酸根离子饱和，同时保持呈添加形式的第一效价。
但是，明确指出市售的疫苗通常含有0.6-1.5mg铝/ml。在市售的Hep A疫苗中，只要氧化铝凝胶的吸附位点远未饱和，就会发现与HepA抗原相比，通常剂量(以铝量表示)的氧化铝凝胶大大过量。因此，实际上，只是铝量似乎是确定应该存在的保护化合物数量的决定因素。
对于含有0.3mg呈氢氧化铝形式和0.5ml体积的铝的本发明组合物，再添加约20mM磷酸根是合适的。如果铝为这同样体积，而量加倍，再添加两倍磷酸根，即40mM是合适的。但是对于1ml体积含有0.6mg铝的本发明组合物，20mM磷酸根就足够了。
作为说明，指出本发明的双效价疫苗体积为0.5ml时可以含有(i)160抗原单位或1440 ELISA单位的失活的甲型肝炎病毒，该病毒吸附在(ii)含有0.3mg铝的氢氧化铝上；(iii)0.025mg Vi多糖；以及(iv)20mM磷酸根。
上述抗原单位和ELISA单位分别是Aventis Pasteur公司和SmithKline Beecham Biological公司(van Hoecke等人，J.Travel.Med.(1998)5：116和André等人，inProg.Med.Virol.，Melnick JLEd，Basel，Karger(1990)37：72)，借助专有标准的ELISA试验所确定的单位。不可能是另外的，因为没有Hep A疫苗的国际标准化标准。
本发明的组合物有利地呈液体形式，疫苗剂量有利地配制成0.5-1ml的体积，其中包括边界。
本发明的组合物可以这样制备：
(i)往含有除伤寒效价之外的通过氢氧化铝添加的效价的制剂中添加磷酸根、柠檬酸根或碳酸根离子；
(ii)把在步骤(i)得到的制剂与含有伤寒效价的制剂混合。
实施例：制备本发明的HA-Vi组合物
A-制备吸附的HA组分
一批失活HA病毒的抗原效价是885U ELISA/ml，把99ml这种HA病毒与5.94ml 25％2-苯氧基-乙醇混合。然后均化15分钟，然后用Millipak 40MPGL 04SH2过滤器过滤制剂。过滤后，得到95ml效价为835U ELISA/ml的制剂。
往这种制剂中添加47.5ml含有3.14mg铝/ml的氧化铝凝胶。用48m l40mM PBS(磷酸盐缓冲液)补足。在5℃下搅拌一夜(18小时)，以便HA组分吸附在氧化铝凝胶上。pH是7.28。
B-制备浓缩10倍的Vi多糖溶液
根据Gotschlich等人，Prog.Immunobiol.Standard(1972)5：485描述的方法制备Vi多糖粉末。在装有16.64mg Vi(9.5g％残留湿度，即15.06mg干重)的30ml瓶中，在连续搅拌下，逐步倒入25.1ml为注射制备的蒸馏水(ppi)。继续在5℃下搅拌24小时，以便使多糖完全溶解。用0.22微米Millex GV SLGV 025过滤器过滤这种制剂。用5ml ppi蒸馏水洗涤该过滤器。最后体积因此是30.1ml。
C-制备HAVi双效价疫苗
往62ml在步骤A得到的制剂(HA)中添加10.6ml 94mM磷酸盐溶液，然后添加8.1ml在步骤B中得到的制剂(Vi)。这样得到疫苗的特征如下：
最后磷酸盐的浓度：20mM
pH：7.3
摩尔渗透压浓度：578mosm/kg。
然后把这种称之为P2制剂的制剂再分成剂量0.5ml的份。
同时还制备了两种其它双效价组合物P2′和P2″，它们不再含有20mM磷酸盐，而分别含有10mM和40mM磷酸盐。为此，根据种类添加了10.6ml 17.6mM或246mM的磷酸盐溶液。
立刻研究P2、P2′和P2″组合物中的HA和Vi组分的性质或在离心后研究这些组合物中的HA和Vi组分性质，给出这些组分在这些组合物中的性质(采用ELISA方法检测这些组分)。观察到，在10mM磷酸盐时，HA仍被吸附，但Vi吸附在氧化铝凝胶上，而在40mM磷酸盐时，Vi不再被吸附，但HA部分被解吸。在20mM磷酸盐时，这些所寻求的条件都满足：HA仍被吸附同时Vi不被吸附。
接着，研究了在5℃±3℃下P2剂量在30个月期间的稳定性。具体地采用ELISA方法评价了从其整体与离心后的上清液(吸附在与凝胶一起沉淀的氧化铝凝胶上的组分)所取疫苗剂量中Vi多糖的抗原本领；这样还能够确定未吸附Vi的百分数。
ELISA是以间接方法方式实施的。待定剂量的Vi抗原是处在覆盖板底部的抗-Vi抗体与小鼠的抗-Vi抗体之间的夹层中。添加生物素基化的抗鼠IgG的抗体，然后添加与辣根过氧化物酶偶合的生物素基化的链霉胍配合物。添加邻亚苯基二胺二盐酸盐(OPD)使该反应显色。OPD的降解表现出着橙褐色，这种着色与Vi抗原量成比例。其强度可用分光光度计测量。
在96-孔板中，分配100μl抗伤寒沙门氏菌血清。在37℃下培育5小时，然后排空该板，再用含有0.05％吐温的PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤三次。添加200μl稀释在PBS中的奶粉溶液，使空位点饱和。在37℃下培育1小时30分钟，然后排空该板，再洗涤三次。制备以倍率2稀释的标准疫苗的系列稀释液，以便达到一定的标准范围。以适当方式对待测定疫苗剂量以及参比剂量(能够证实标准范围)进行稀释；将100μl每种稀释液分配到孔中，再在37℃下培育一夜。排空该板，再进行洗涤。然后向孔中添加100μl适当稀释抗Vi鼠血清。再在37℃下培育1小时，然后排空该板，再进行洗涤。这时固定生物素基化的鼠抗免疫球蛋白(向每个孔中加入100μl适当稀释液)。再在37℃下培育1小时，然后排空该板，再进行洗涤。这时固定与过氧化物酶偶合的生物素基化链霉胍(向每个孔中加入100μl适当稀释液)。再在37℃下培育1小时，然后排空该板，再进行洗涤。向每个孔中添加100μl 1mg/ml OPD在pH5柠檬酸盐磷酸盐缓冲液中的溶液，使该板显色。在100μl 2N硫酸添加到孔中之前，在黑暗中在室温下培育30分钟。使用分光光度计在492nm处读其板。确定了随浓度变化的吸收标准曲线。与标准曲线相比，计算出每种试验稀释液的效价，以ng/ml表示。为了得到每个试验疫苗剂量的平均效价，求出用全部稀释液所得效价的平均值。该效价以μg/剂量给出。
还测量了离心后上清液中存在的Vi多糖的O-乙酰基的数量。使用羟胺，采用比色方法测定了O-乙酰基(Hestrin S.J.Biol.Chim.(1949)180：249)。在碱性介质中羟胺与这些酯生成异羟肟酸，该酸在铁盐存在下给出栗色，可采用分光光度计在540nm处测定其强度。
同时，使用以与P2同样方式制备的称之为制剂P1的制剂进行同样的研究，其唯一不同之处在于在制备双效价疫苗时不添加磷酸盐。在这种情况下，Vi组分没有立刻吸附在氧化铝凝胶上，为了在离心后进行测定，如P2一样，合适的是预先解吸它。通过调节pH和介质的离子强度，可达到这种解吸。在离心后，让氧化铝凝胶与150mM柠檬酸三钠溶液在37℃下接触6小时。然后离心回收上清液，其中有Vi组分。
下表I中列出这些结果。
表I5℃ T0 3 个月 6 个月 9 个月 12 个月 18 个月 24 个月 30 个月整个疫苗中Vi Vi ELISA (μg/剂量) P2 23.6 25.5 21.7 21.3 18.5 23.7 24.3 26.5 P1 24.4 23.3 22.2 19.8 17.9 20.5 18.6 19.3离心后上清液中Vi Vi ELISA (μg/dose) P2 24.3 26 23.1 21.8 17.9 25 21.9 25.8 P1 21 16.9 16.5 15.4 12 14.7 21.8 15.7 O-乙酰基 (μ摩尔/剂量) P2 0.127 0.148 0.116 0.117 0.130 0.134 0.095 0.143 P1 0.081 0.056 0.055 0.055 0.061 0.057 0.090 0.054 多糖 (μg/dose) P2 32.5 30.5 27.6 31 30.4 29.1 31.7 29.3 P1 20.8 22 15.6 16.2 18.5 16.5 17 18.4P1中Vi解吸％ 86％ 72％ 74％ 78％ 67％ 72％ 63％ 81.6％
还研究了在25℃±2℃6个月内与在37℃±3℃3个月内P2配方的稳定性。这些结果列于下面表II和III。
表II25℃ T0 1 个月 3 个月 6 个月整个疫苗中ViVi ELISA(μg/剂量) P2 23.6 23.6 21.7 20.6 P1 24.4 19.6 11.3 7.4离心后上清液中ViVi ELISA(μg/剂量) P2 24.3 25.5 22.6 20.1 P1 21 15 10.3 6.3O-乙酰基(μ摩尔/剂量) P2 0.127 0.130 0.103 0.137 P1 0.081 0.053 0.041 0.029多糖(μg/剂量) P2 32.5 31.6 25.5 27.2 P1 20.8 17.3 10.3 6.3 P1中Vi解吸％ 86％ 77％ 91％ 85％
表III37℃ TO 1 个月 3 个月整个疫苗中Vi Vi ELISA(μg/剂量) P2 23.6 24.1 21 P1 24.4 12.7 5.6离心后上清液中Vi Vi ELISA(μg/剂量) P2 24.3 25.5 21.1 P1 21 9.9 4.7 O-乙酰基(μ摩尔/剂量) P2 0.127 0.143 0.104 P1 0.081 0.050 0.026多糖(μg/剂量) P2 32.5 36 22.5 P1 20.8 15.4 9.9P1中Vi解吸％ 86％ 78％ 84％