CD44v6特异性的抗体 【技术领域】
本发明属于肿瘤学领域。本发明是有关具特示序列的抗体，其与为CD44基因变体外显子v6所编码的表位具特异性，以及有关该抗体的衍生物。本发明也提出编码该抗体蛋白质的核酸分子。本发明进一步是有关制备该抗体蛋白质的方法。本发明也提出含有该抗体蛋白质的药物组合物。本发明再者是有关制成药物以治疗癌症的用法。
背景技术
近年已示出，为引起所谓非转移性大鼠胰腺癌细胞株以及非转移性大鼠纤维肉瘤细胞株自主转移行为，表面糖蛋白CD44变体的表达是必要且足够的。(Gunthert et al.，1991)。而最小的CD44同型，标准型CD44s(或CD44std)，广泛表达在包括上皮细胞的不同组织中，某些CD44剪接变体(CD44v，CD44var)仅在某一亚群上皮细胞上表达。CD44变体由另外的剪接而产生，其方式使得10个外显子的序列(v1-v10)在CD44s中完全切除，但可出现在不同组合下较大的变体中(Screation et al.，1992；Tolg et al.，1993；Hofmann et al.，1991)。氨基酸序列有异地变体，在蛋白质细胞外部分的某些位置上嵌入。此变体在各种人类肿瘤细胞以及人类肿瘤组织中可测及。如此，CD44变体的表达近来已在结肠直肠致癌原理的过程中被研究(Heider etal.，1993a)。CD44变体的表达在正常人类结肠上皮中不存在，而在腺窝增殖细胞中仅可测及弱的表达。在肿瘤进展的较晚阶段，如在腺癌，所有的恶性细胞均会表达出CD44变体。变体CD44高水平的组织表达也在来势汹汹的非-霍奇金氏淋巴瘤中出现(Koopman et al.，1993)。
外显子v6尤其在转移散布的过程中似乎扮演特殊角色。(Rudy et al.，1993)。在动物模型中，抗v6特异表位的抗体可预防转移细胞的固定及转移物的长成(Seiter et al.，1993)。在结肠癌中，v6表达和肿瘤进展相互有关(Wielenga et al.，1993)。在胃癌中，v6表达是一个重要的诊断靶标，可将肠型肿瘤与扩散型区分出来(Heider et al.，1993b)。在后二刊物中，v6表达是利用抗v6特异表位的抗体所决定。
因CD44v6已示出是一种与肿瘤有关的抗原，在人类肿瘤及正常组织中有利地表达(Herder et al.，1995；Heider et al.，1996)，因此可应用于以抗体-为基础的诊断及治疗方法上(Heider et al.，1996；WO 95/33771；WO97/21104)。
当利用非人类抗体应用于人体时会有一个严重问题出现，即其会十分快速地生成人类抗-非-人类反应，可减低抗体在病人的效力，及破坏接续的给药。为克服此问题，在技术中已发展出“人源化”非-人类抗体的观念。在第一个途径中，已构筑非-人类/人类嵌合抗体，尝试来人源化非人类抗体，其中非-人类可变区连接至人类恒定区(Boulianne G.L.，HozumiN.and Shulman，M.J.(1984)Production of functional chimeric mouse/humanantibody Nature 312：643)。如此生成的嵌合抗体保有原先非-人类抗体的结合特异性及亲和力。然而，嵌合抗体，虽然显著优于小鼠抗体，仍可在人类中诱生出抗-嵌合的反应(LoBuglio A.F.，Wheeler R.H.，Trang J.，HaynesA.，Rogers K.，Harvey E.B.，Sun L.，Ghrayeb J.and Khazaeli M.B.(1989)Mouse/human chimeric monoclonal antibody in man：Kinetics andImmune response.Proc.Natl.Acad.Sci.86：4220)。此途径由进一步减少非-人类序列的量而得到精练，即将来自非-人类可变区的互补性决定区(CDRs)嫁接至人类可变区，再将这些“改造的人类”可变区连接至人类恒定区(Riechmann L.，Clark M.，Waldmann H.and Winter G.(1988)Reshaping humanantibodies for therapy.Nature 332：323)。CDR-嫁接的或改造的人类抗体含极少或并无蛋白质序列可被鉴定于衍生自鼠抗体。虽然由CDR-嫁接而人源化的抗体仍可诱生某些免疫反应，如抗-同种异型(anti-allotype)或抗-独特型(anti-idiotypic)反应(即使使用天然的人类抗体也可观察到这些反应)，CDR-嫁接的抗体免疫原性显著低于小鼠抗体，因此对病人可有更为延长的治疗。
然而，很快地发觉单独CDR-嫁接时不会生成有足够结合亲和力的抗体。CDR-嫁接抗体和其亲代非-人类抗体比较下，有相当不佳的结合特性，此乃因为除CDR′s内的氨基酸之外还有更多的氨基酸涉及于抗原结合之故。因此，结合亲和力不佳的CDR-嫁接抗体，在治疗上无法视为有用的。因此，尝试生成组合有CDR-嫁接抗体低免疫原性及非-人类亲代抗体良好结合特性的抗体。因此除了CDR-嫁接外，也发展出一种概念，即在人源化框架区中的一至数个氨基酸必须保持像啮齿类供者来源残基一般，以保有结合亲和力(Queen et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.86：10029-10033)。
因为高度潜在利用价值，此抗体可应用于诊断及治疗，因此需有具改进特性的抗体，其适用于人类癌症的治疗。
本发明的基本问题是提供与已知CD44v6特异抗体相比有显著更佳特性的抗体。
发明概述
以上技术问题，可由权利要求书及说明书中鉴定的具体实施方案予以解决。由本发明权利要求书及说明书，可克服技术中上述的缺点。
为了解决上述问题，本发明者设计及产生一种CD44v6特异的人源化抗体，称为BIWA8，其有CDR-嫁接及框架突变，且有低免疫原性组合以高亲和力。
然而，本发明者可生成具有甚至更超级治疗利用价值的抗体，称为BIWA4。虽然和BIWA8比较下，此者有较差的结合亲和力，当其于活体内给药时可令人惊讶的显示较佳的生物分布及肿瘤吸收。
本发明属于肿瘤学领域。本发明是有关具特示序列的抗体，其与由CD44基因变体外显子v6所编码的表位具特异性，以及有关于该抗体的衍生物。本发明也提供编码该抗体蛋白质的核酸分子。本发明进一步是有关制备该抗体蛋白质的方法。本发明也提供含有该抗体蛋白质的药物组合物。本发明进一步是有关制成药物治疗癌症的用法。
附图简述
(也见实施例1)
图1：在竞争性细胞ELISA中测试的相对结合亲和力的评估。IC50：cMAb及hMAbs的浓度，此时mMAb BIWA1结合至经粘附的A431细胞减少50％。图中也示出相对于BIWA2的IC50值。
图2：HNX-OE异种移植-小鼠，在3或4天p.i.下，共注射的125I-及131I-标记的CD44v6-特异性MAbs(10微居里，50微克)的生物分布。三组小鼠，或接受(A)131I-U36(黑线)及125I-BIWA1(阴影)(n＝5)，(B)131I-BIWA4(黑线)及125I-BIWA2(阴影)(n＝6)或接受(C)131I-BIWA4(黑线)及125I-BIWA8(阴影)(n＝6)。在注射3(A)或4天(B，C)后，对小鼠采血，处死，解剖且评估肿瘤，血液及许多器官中的放射活性水平(％ID/克±s.e.m.)。(Blk：血液，Tum：肿瘤，Liv：肝，Spl：脾，Kid：肾，Hrt：心，Stm：胃，Ilm：回肠，Cln：结肠，Blr：膀胱，Str：胸骨，Msc：肌肉，Lng：肺，Skn：皮肤，Tng：舌头)。
图3：HNX-OE异种移植-裸鼠中，186Re-标记的CD44v6-特异MAbs的治疗效力。小鼠接受300微居里186Re-U36(--，图A)，300微居里186Re-BIWA 1(--，图A)，300微居里186Re-BIWA 4(--，图B)，300微居里186Re-BIWA 2(--，图B)，400微居里186Re-BIWA4(--，图C)，400微居里186Re-BIWA8(--，图C)，或盐水(--，图A，B，C)为对照组。于图A及B中对照组是相同的，肿瘤大小以治疗期间的平均肿瘤体积(±s.e.m.)相对于在治疗之初的平均肿瘤体积表示之。
图4：BIWA 4静脉内输液至10个病人，在A部分研究中，在所给药的MAb剂量与所观察的AUC之间的相互关系。
图5：BIWA 4静脉内输液至10个病人，在A部分研究中，在所给药的MAb剂量与所观察的最大血浆BIWA 4浓度之间的相互关系。
本发明优选实施方案
在本发明具体实施方案中，必须注意如此中及所附权利要求书中所示，符号“a”，“an”及“the”包括复数除非内容直接另有所示。因此，如“一种抗体”包括此抗体的复数，而“细胞”是一种以上的细胞，及本领域技术人员已知的其等同物等等。除非另有所定义，此中所用的所有技术及科学术语都具有属于本发明的本领域技术人员一般可了解的相同定义。在实行或测试本发明中，虽然类似或相当于此中所述的任何方法及材料均可使用，目前描述较佳的方法，装置及材料。此中所述的所有刊物基于描述及揭示细胞株，载体及方法之目的已列为本案参考，而以上的细胞株，载体及方法是报告于刊物中，可配合本发明使用。此中无一者可作为许可的限制，即本发明并未授予权利可经由先前发明预期此揭示。
所谓“抗体分子”或“抗体蛋白质”或“抗体”如此中所用视为等同。
“单克隆抗体的互补性决定区”理解为是涉及抗原特异结合的那些氨基酸序列，如Kabat所述(Kabat E.A.，Wu T.T.，Perry H.M.，Gottesman K.S.and Foeller C.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th Ed.)NIH Publication No.91-3242.U.S.Department of Health and Human Services，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.)和Chothia及Lesk所述(Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。
如此中所用的，“框架修饰”指在各个互补性决定区四周可变区中，单一或多个氨基酸的交换，缺失或添加。框架修饰对于抗体蛋白质的免疫原性，可生产性或结合特异性有影响。
本发明提供了含有重链可变区的抗体分子，特征为氨基酸序列如SEQID No.1中所定义，或其片段，等位基因变体，功能性变体，糖基化作用变体，融合分子或化学衍生物。抗体BIWA 4及BIWA 8含有重链可变区，特征为SEQ ID No.1的氨基酸序列。
“片段”依据本发明是一种较短的抗体分子，即任何的多肽亚群，特征在于其由此以下公开的核酸分子短的核酸分子所编码，然而仍保有其抗体结合活性。
依据本发明的抗体分子“功能性变体”是具有生物活性(或功能上或结构上)的抗体分子，该生物活性实质上类似于本发明的抗体分子，即，实质上类似的底物(substrate)特异性或底物的裂解。所谓“功能性变性”也包括“片段”，“等位基因变体”，“功能性变体”，“依简并核酸密码为基础的变体”或“化学衍生物”。此“功能性变体”如，可携有一或多种点突变，一或多种核酸互换，缺失或嵌入，或一或多种氨基酸互换，缺失或嵌入。该功能性变体仍保有其生物活性，如抗体结合活性，至少部分或甚至伴有该生物活性的改进。
抗体分子的“功能性变体”依据本发明是具有生物活性(或功能上或结构上)的抗体分子，该生物活性实质上类似于依据本发明的抗体分子，即，实质上类似的靶标分子的结合活性。所谓“功能性变体”也包括“片段”，“等位基因变体”，“功能性变体”，“以简并核酸密码为基础的变体”或“化学衍生物”。
“等位基因变体”是由于等位基因变异所致的变体，如在人类二个等位基因上的差异。该变体仍保有其生物活性，如抗体靶标的结合活性，至少部分或甚至伴有该生物活性的改进。
“以遗传密码的简并性为基础的变体”是由于以下事实的变体，即某些氨基酸可为许多不同的核苷酸三联体所编码。该变体仍保有其生物活性，如抗体结合活性，至少部分或甚至伴有该生物活性的改进。
“融合分子”依据本发明可为抗体分子并融合至报告分子，如放射性标记物，化学分子如毒素或萤光标记物，或本领域中已知的其他任何分子。
如此中所用，“化学衍生物”依据本发明是依据本发明的抗体分子，经化学修饰或含有额外的化学部分，而该化学部分通常并不是该分子的一部分。此部分可改进分子的活性，如靶标的破坏(如杀死肿瘤细胞)或可改进其溶解度，吸收作用，生物半衰期等。
若二分子有基本类似的结构或生物活性，则此分子与另一分子是“基本上类似的”。因此，若二分子具有类似活性，其可视为变体，如本发明中所用的术语，甚至若分子之一的结构并不见于另一分子，或若氨基酸残基的序列并不相同。
对于本发明抗体的许多用途，希望可有最小可能的抗原-结合，即CD44v6-结合单位。因此在另一较佳具体实施方案中，依据本发明的抗体蛋白质是Fab片段(抗原结合片段＝Fab)。这些CD44v6-特异抗体蛋白质包括二链的可变区，其由相邻恒定区连接一起。这些可由蛋白酶水解形成，如利用胃蛋白酶，水解自传统的抗体，但类似的Fab片段也可利用遗传工程方法制备。在另一较佳具体实施方案中，依据本发明的抗体蛋白质是F(ab′)2片段，其可由胃蛋白酶行蛋白水解而制备。
利用遗传工程方法，有可能可产生短化的抗体片段，其仅含有重链的可变区(VH)，及轻链的可变区(VL)。这些称之为Fv片段(可变区片段＝可变部分的片段)。在另一较佳具体实施方案中，依据本发明的CD44v6-特异抗体分子是此Fv片段。由于这些Fv-片段缺少由恒定链的半胱氨酸的二链共价键结，Fv片段常是稳定的。将重链及轻链的可变区以一个短肽片段，在10至30个氨基酸，较好15个氨基酸，连接是有益的。以此方式，可得到由VH及VL组成，由肽连接子连接的单一肽链。此类型的抗体蛋白质已知单链-Fv(scFv)。由先前技术中已知的此类型scFv-抗体蛋白质实例，述于Huston et al.(1988，PNAS 16：5879-5883)。因此，在另一较佳具体实施方案中，依据本发明的CD44v6-特异抗体蛋白质是单链-Fv蛋白质(scFv)。
近年来，将scFv制备成多聚体衍生物已发展出各种策略。此特别是可生成重组抗体，具有改进的药物动力学及生物分布特性，以及有增加的结合亲合性。为了达到scFv的多聚化，将scFv制备成有多聚化功能域的融合蛋白质。多聚化功能域可以是如IgG的CH3区域，或螺旋状旋管结构(螺旋结构)，如亮氨酸-拉链功能域。然而，也有一种策略是将scFv的VH/VL区间的交互作用用于多聚化作用中(如二-，三-及五元抗体(pentabodies))。因此，在另一较佳具体实施方案中，依据本发明的抗体蛋白质是CD44v6-特异二元体抗体(diabody)片段。而二元体，本领域技术人员表示是二价的同二聚scFv衍生物(Hu et al.，1996，PNAS 16：5879-5883)。将scFv分子中的连接子缩短至5-10个氨基酸，可导致同二聚体的形成，其中会发生链间的VH/VL-重叠。二元体另外可通过二硫键桥的纳入而稳定。现有技术中的二元体-抗体蛋白质实例可见于Perisic et al.(1994，Structure 2：1217-1226)。
而小体(minibody)，熟悉此项技术者表示是二价，同二聚的scFv衍生物。其由融合蛋白质组成，该融合蛋白含有免疫球蛋白，较好是IgG，最好是IgG1的CH3区域，作为二聚化区域，其经由铰链区(如也来自IgG1)及连接子区而连接至scFv。在铰链区中的二硫键桥大多在较高等细胞中形成，而非在原核细胞。在另一较佳具体实施方案中，依据本发明的抗体蛋白质是CD44v6-特异性小体抗体片段。先前技术中的小体-抗体蛋白质实例可见于Hu et al.(1996，Cancer Res.56：3055-61)。
而三元体(triabody)，本领域技术人员表示是三价三聚的scFv衍生物(Kortt et al.1997 Protein Engineering 10：423-433)。scFv衍生物，其中VH-VL在无连接子序列下直接融合，生成三聚体。
本领域技术人员也熟知所谓的小抗体(miniantibody)，其具有二，三，或四价结构，且是衍生自scFv。多聚化作用由二，三，或四元螺旋的旋管结构进行(Pack et al.，1993 Biotechnology 11：1271-1277；Lovejoy et al.1993Science 259：1288-1293；Pack et al.，1995 J.Mol.Biol.246：28-34)。
因此在较佳的具体实施方案中，依据本发明的抗体蛋白质是以上述抗体片段为基础的CD44v6-特异的多聚分子，且可为如：三元体，四价小抗体，或五元体。
在一个较佳具体实施方案中，本发明是有关抗体分子，其中重链的可变区由SEQ ID No.1的氨基酸序列所组成。
在另一个较佳具体实施方案中，本发明是有关含有轻链可变区的抗体分子，特征为氨基酸序列如SEQ ID No.2所定义，或该抗体分子的片段，等位基因变体，功能性变体，糖基化作用变体，融合分子或化学衍生物。抗体BIWA 4如此中所用含有轻链的可变区，如SEQ ID No.2氨基酸序列中所定义。
在另一个较佳具体实施方案中，本发明是有关抗体分子，其中轻链的可变区由SEQ IDNo.2的氨基酸序列所组成。
在另一个较佳具体实施方案中，本发明是有关含有轻链可变区的抗体分子，特征为氨基酸序列如SEQ ID No.3所定义，或该抗体分子的片段，等位基因变体，功能变体，糖基化作用变体，融合分子或其化学衍生物。抗体BIWA 8含有轻链的可变区，特征在于SEQ ID No.3的氨基酸序列。
又另一个较佳具体实施方案中，本发明是有关抗体分子，其中轻链的可变区由SEQ ID No.3的氨基酸序列所组成。
在另一个较佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体分子，含有重链的可变区，特征为如SEQ ID No.1中所定义的氨基酸序列，且含有轻链的可变区，特征为如SEQ ID No.2所定义的氨基酸序列，或该抗体分子的片段，等位基因变体，功能性变体，糖基化作用变体，融合分子或化学衍生物。抗体BIWA 4含有重链的可变区，特征在于SEQ ID No.1的氨基酸序列，及轻链的可变区如SEQ ID No.2氨基酸序列中所定义的。
在最佳具体实施方案中，本发明是有关依据发明的抗体分子，其中重链的可变区由SEQ ID No.1的氨基酸序列所组成，且其中轻链的可变区由SEQ ID No.2的氨基酸序列所组成。
在另一个较佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体分子，含有重链的可变区，特征为氨基酸序列如SEQ ID No.1中所定义，且含有轻链的可变区，特征为如SEQ ID No.3中所定义的氨基酸序列，或该抗体分子的片段，等位基因变体，功能性变体，糖基化作用变体，融合分子或化学衍生物。抗体BIWA 8含有重链的可变区，特征在于SEQ ID No.1的氨基酸序列，及轻链的可变区，如SEQ ID No.3氨基酸序列中所定义。
在另一最佳具体实施方案中，本发明是有关依据发明的抗体分子，其中重链的可变区含有SEQ ID No.1的氨基酸序列，且其中轻链的可变区含有SEQ ID No.3的氨基酸序列。
在另一个较佳具体实施方案中，本发明是有关抗体分子，含有由SEQ IDNo.4中所定义的核酸序列所编码的重链可变区，或该抗体分子的片段，等位基因变体，功能性变体，以简并核酸密码为基础的变体，融合分子或化学衍生物。抗体BIWA 4及BIWA 8含有重链的可变区，特征为SEQ ID No.4的核酸序列。
在另一较佳具体实施方案中，本发明是有关抗体分子，其中重链的可变区为SEQ ID No.4所定义的核酸序列所编码。
在另一个较佳具体实施方案中，本发明是有关抗体含有轻链的可变区，为SEQ ID No.5中所定义的核酸序列所编码，或该抗体分子的片段，等位基因变体，功能性变体，以简并核酸密码为基础的变体，融合分子或化学衍生物。抗体BIWA 4用于此包括轻链的可变区，如SEQ ID No.5核酸序列所定义。
在另一较佳具体实施方案中，本发明是有关抗体分子，其中轻链的可变区为SEQ ID No.5所定义的核酸序列所编码。
在另一个较佳具体实施方案中，本发明是有关抗体分子，含有由SEQ IDNo.6所定义的核酸序列所编码的轻链可变区，或该抗体分子的片段，等位基因变体，功能性变体，以简并核酸密码为基础的变体，融合分子或化学衍生物。抗体BIWA 8含有SEQ ID No.6核酸序列的轻链可变区。
在另一较佳具体实施方案中，本发明是有关抗体分子，其中轻链的可变区为SEQ ID No.6所定义的核酸序列所编码。
在另一个较佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体分子(含有为SEQ ID No.4所定义核酸序列所编码的重链可变区，及如SEQ ID No.5所定义核酸序列所编码的轻链可变区)，或其片段，等位基因变体，功能性变体，以简并性核酸密码为基础的变体，融合分子或化学衍生物。抗体BIWA 4含有重链的可变区，特征在于SEQ ID No.4的核酸序列，及如SEQID No.5核酸序列中所定义的轻链可变区。
又另一最佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体分子，其中重链的可变区为SEQ ID No.4所定义的核酸序列所编码，且其中轻链的可变区由SEQ ID No.5所定义的核酸序列所编码。
在另一个较佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体分子(含有由SEQ ID No.4中所定义的核酸序列所编码的重链可变区，且含有由SEQ ID No.6所定义核酸序列所编码的轻链可变区)，或其片段，等位基因变体，功能性变体，以简并性核酸密码为基础的变体，融合分子或化学衍生物。抗体BIWA 8含有重链的可变区，特征在于SEQ ID No.4的核酸序列，及如SEQ ID No.6核酸序列中所定义的轻链可变区。
在另一最佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体分子，其中重链的可变区为SEQ ID No.4所定义的核酸序列所编码，且其中轻链的可变区为SEQ ID No.6所定义的核酸序列所编码。
为产生人源化的CD44v6-特异抗体蛋白质，所揭示的核酸序列可以本领域中已知的分子生物学方法表达(见下文及实例)。
本发明抗体蛋白质的可变区，通常连接至至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人类免疫球蛋白的恒定区。人类恒定区DNA序列可依据熟知步骤，自各样人类细胞中分离，但较好是永生化的B细胞(见Kabat et al.，下文，及WO 87/02671)。因此，本发明的抗体蛋白质可含有所有的或仅部分的恒定区，只要其可与CD44v6抗原呈现特异的结合。恒定区类型及范围的选择依效应物功能为何而定，如补体固定或抗体依赖性细胞毒性，以及依抗体蛋白质欲求的药理特性而定。本发明的抗体蛋白质通常是一种四聚体，含有二个轻链/重链对，但也可以是二聚体，即含有一个轻链/重链对，如Fab或Fv片段。
因此，在本发明进一步具体实施方案中是有关依据本发明的抗体蛋白质，特征在于其具有可变的轻链区及可变的重链区，各自连接至人类恒定区。特言之，轻链的可变区连接至人类κ恒定区，且重链的可变区连接至人类γ-1恒定区。用于嵌合轻及重链的其他人类恒定区也可为专家所应用。
本领域中已知方法可达到鼠类抗体可变区的人源化作用。EP 0239400揭示将鼠类可变区的CDRs嫁接至人类可变区的框架。WO 90/07861揭示改造CDR-嫁接的可变区的方法，是引入额外的架构修饰。WO 92/11018揭示制备人源化Ig的方法，是将供者CDRs与供者框架高度同源的受者框架组合。WO 92/05274揭示始自鼠类抗体的框架突变的抗体的制备。和鼠类单克隆抗体人源化作用有关的其它现有技术参考有：EP 0368684；EP 0438310；WO 92/07075，或WO 92/22653。
在另一较佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体分子，其特征在于轻链的可变区及重链区的可变区各自分别连接至人类恒定区。
在另一较佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体分子，其中该轻链的人类恒定区是人类κ恒定区。
在另一较佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体蛋白质，其中该重链人类恒定区是人类IgG1恒定区。
较佳者也有含有重链的抗体，特征在于SEQ ID No.7的氨基酸序列和/或轻链特征在于SEQ ID No.8的氨基酸序列，或特征在于SEQ ID No.9的氨基酸序列。
因此，另一重要的具体实施方案是依据本发明的抗体分子，含有重链特征在于SEQ ID No.7所定义的氨基酸序列，且含有轻链特征在于SEQ IDNo.8所定义的氨基酸序列，或该抗体分子的片段，等位基因变体，功能性变体，糖基化作用变体，融合分子或化学衍生物。抗体BIWA 4含有重链，特征在于SEQ ID No.7的氨基酸序列，及轻链的可变区，如SEQ ID No.8氨基酸序列所定义。
在最佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体分子，其中的重链含有SEQ ID No.7氨基酸序列的氨基酸，且其中轻链含有SEQ ID No.8氨基酸序列的氨基酸。抗体BIWA4含有SEQ ID No.7氨基酸序列中所揭示的序列(重链)及SEQ ID No.8的氨基酸序列(轻链)。BIWA4是一种CDR-嫁接的抗体，无框架修饰。令人惊讶地，除了低结合亲和力外，此抗体含有极佳的治疗效力，更佳的生物分布及肿瘤吸收，超过框架-突变的抗体BIWA 8(见实例)。此为上述抗体VFF-18(＝BIWA 1)的人源化版本，在完全人类框架中具有鼠类单克隆抗体VFF-18的互补性决定区，以及一个人类恒定区。因此其为在人体中具极低免疫原性的抗体，具有有利的特征。然而，因其无使抗原的结合更臻完善的鼠类框架残基，有较其亲代抗体VFF-18显著更低的抗原结合亲和力，且因此并不被视为是好的治疗性药物候选者。令人意外地，已发现BIWA4除了其不佳的结合亲和力之外，具有极有益的体内生物分布及肿瘤吸收，使其更胜于具有较高结合亲和力的VFF-18的其他人源化版本。
另一重要的具体实施方案是依据本发明的抗体分子(含有重链特征在于如SEQ ID No.7中所定义的氨基酸序列，且含有轻链，特征为SEQ ID No.9中所定义的氨基酸序列)，或其片段，等位基因变体，功能性变体，糖基化作用变体，融合分子或化学衍生物。抗体BIWA 8含有重链，特征在于SEQ ID No.7的氨基酸序列，及轻链的可变区，如SEQ ID No.9氨基酸序列所定义。
在最佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体分子，其中重链含有SEQ ID No.7氨基酸序列的氨基酸，且其中轻链含有SEQ ID No.9氨基酸序列的氨基酸。抗体BIWA 8含有SEQ ID No.7氨基酸序列中所揭示的序列(重链)，及SEQ ID No.9的氨基酸序列(轻链)。BIWA 8是一种CDR-嫁接的抗体，有框架突变。此抗体有较BIWA 4显著较高的结合亲和力(见实例)。
较佳的也是这样的抗体，其含有由SEQ ID No.10核酸序列所编码的重链和/或由SEQ ID No.11核酸序列所编码的轻链，或特征在于SEQ ID No.12的核酸序列。该序列包括非翻译序列，及前导序列如克隆在载体pAD-CMV1/pAD-CMV19中。
因此，另一个重要的具体实施方案是依据本发明的抗体分子，含有为SEQ ID No.10所定义核酸序列所编码的重链，且含有如SEQ ID No.11所定义核酸序列所编码的轻链，或该抗体分子的片段，等位基因变体，功能性变体，以简并性核酸密码为基础的变体，融合分子或化学衍生物。抗体BIWA4含有如SEQ ID No.10核酸序列所编码的重链，及如SEQ ID No.11核酸序列所编码的轻链可变区。
在最佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体分子，其中重链为SEQ ID No.10核酸序列所编码，且其中轻链为SEQ ID No.12核酸序列所编码。另一个重要的具体实施方案是依据本发明的抗体分子(含有如SEQ ID No.10所定义的核酸序列所编码的重链，且含有如SEQ ID No.12所定义核酸序列的轻链)，或其片段，等位基因变体，功能性变体，以简并性核酸密码为基础的变体，融合分子或化学衍生物。抗体BIWA 8含有如SEQ ID No.10核酸序列所编码的重链，及SEQ ID No.12核酸序列所编码的轻链可变区。
在最佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体分子，其中重链为SEQ ID No.10核酸序列所编码，且其中轻链由SEQ ID No.12核酸序列所编码。
较佳的是这样的抗体，其含有SEQ ID No.13核酸序列所编码的重链和/或由SEQ ID No.14核酸序列的轻链，或特征在于SEQ ID No.15的核酸序列。该序列包括克隆在载体N5KG1val中的前导序列。
因此，另一个重要的具体实施方案是依据本发明的抗体分子(含有为SEQ ID No.13所定义核酸序列所编码的重链，且含有如SEQ ID No.14所定义核酸序列的轻链)，或其片段，等位基因变体，功能性变体，以简并性核酸密码为基础的变体，融合分子或化学衍生物。抗体BIWA4含有如SEQID No.13核酸序列所编码的重链，及SEQ ID No.14核酸序列所编码的轻链可变区。
在最佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体分子，其中重链为SEQ ID No.13核酸序列所编码，且其中轻链为SEQ ID No.14核酸序列所编码。
另一个重要的具体实施方案是依据本发明的抗体分子(含有如SEQ IDNo.13所定义的核酸序列所编码的重链，且含有轻链特征在于SEQ ID No.15所定义的核酸序列)，或其片段，等位基因变体，功能性变体，以简并性核酸密码为基础的变体，融合分子或化学衍生物。抗体BIWA 8含有如SEQID No.13核酸序列所编码的重链，及为SEQ ID No.15核酸序列所编码的轻链可变区。
在一个最佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体分子，其中重链为SEQ ID No.13核酸序列所编码，且其中轻链为SEQ ID No.15核酸序列所编码。最佳的是这样的抗体蛋白质，含有为SEQ ID No.16核酸序列所编码的重及轻链。该序列包括有前导序列，克隆在载体N5KG1val内。
因此，另一高度重要的具体实施方案是依据本发明的抗体分子(含有重及轻链为SEQ ID No.16所定义的核酸序列所编码)，或其片段，等位基因变体，功能性变体，以简并性核酸密码为基础的变体，融合分子或化学衍生物。抗体BIWA 4含有为SEQ ID No.16核酸序列所编码的重及轻链。
在最佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体分子，其中重及轻链为SEQ ID No.16核酸序列所编码。此序列编码整个抗体BIWA 4。
本发明的抗体蛋白质治疗剂靶向CD44v6抗原以提供高度特异的工具。因此，在另一方面，本发明是有关依据本发明的抗体蛋白质，其中该抗体蛋白质可连接至治疗剂。在本领域已知的许多治疗剂中，治疗剂选自下列包括：放射性同位素，毒素，类毒素，致炎剂，酶，反义分子，肽类，细胞因子，且化学治疗剂为较佳者。在放射性同位素中，以γ，β及α-射线放射性同位素可充作治疗剂。β-射线放射性同位素为较佳的治疗性放射线同位素。186铼，188铼，131碘及90钇已证明是实现局部照射及破坏恶性肿瘤细胞方面特别有用的β-射线同位素。因此，选自包括186铼，188铼，131碘及90钇的放射性同位素为连接至本发明抗体蛋白质的尤其优选的治疗剂。例如，本发明抗体的放射性碘化作用，有一方法揭示于WO 93/05804可供应用。
因此，本发明较佳方面是依据本发明的抗体蛋白质，其中该治疗剂是选自包括放射性同位素，毒素，类毒素，前药及化学治疗剂的治疗剂。
本发明较佳方面是依据本发明的抗体蛋白质，其中该治疗剂经由选自下列的连接子可连接至抗体蛋白质，包括MAG-3(US 5082930 A，EP0247866 B1(p2 55-56列-p3 1-23列))；MAG-2 GABA(US 5681927 A，EP0284071 B1(p69-29))；及N2S2((＝酚硫酸酯)US 4897255 A，US 5242679 A，EP 0188256 B1(p2，38列-p3，18列))，以上均列为本案参考。
所述连接子为下式：
本发明的较佳方面是依据本发明的抗体蛋白质，其中的治疗剂经由MAG-2 GABA连接至抗体蛋白质。
本发明较佳方面是依据本发明的抗体蛋白质，其中该放射性同位素是β-射线放射性同位素。
本发明较佳方面是依据本发明的抗体蛋白质，其中该放射性同位素选自下列包括186铼，188铼，131碘及90钇。
本发明较佳方面是依据本发明的抗体蛋白质，其中该放射性同位素是186铼。
本发明进一步方面是有关依据本发明的抗体蛋白质，特征在于其是经标记的。此标记的CD44v6-特异的抗体使CD44v6抗原可于试管内和/或体内被定位和/或检测。标记物的定义为一种标记，可直接或间接地被检测。间接标记可定义为无法本身被检测的标记，但需要与间接标记特异的可直接检测的标记。实现本发明的较佳标记物是可检测的标记。从各样可检测的标记中，可检测标记选自下列包括酶，染料，放射性同位素，洋地黄毒苷(digoxygenin)，且以生物素为最佳。
因此，本发明较佳方面是依据本发明的抗体蛋白质，特征在于其是经标记的。较佳的是依据本发明的抗体蛋白质，其中该标记物是可检测的标记。同时较佳的是依据本发明的抗体蛋白质，其中可检测的标记是选自下列：包括酶，染料，放射性同位素，洋地黄毒苷，或生物素。
本发明另一方面是有关依据本发明的抗体蛋白质，特征在于其是连接至可显影剂。各样的可显影剂，尤其是放射性同位素，是本领域可获得的。为实施本发明，以γ-射线同位素为较佳。最佳者是125碘。
因此，本发明较佳方面是本发明的抗体蛋白质，其是连接至可显像剂。本发明较佳方面是依据本发明的抗体蛋白质，其中可显像剂是一种放射性同位素。本发明较佳方面是依据本发明的抗体蛋白质，其中该放射性同位素是γ-射线放射性同位素。本发明较佳方面是依据本发明的抗体蛋白质，其中该放射性同位素是125I。
因此，本发明的较佳方面是连接至如上述放射性同位素的抗体蛋白质，其中的抗体蛋白质具有由约0.5至约15毫居里/毫克的比活性，或具有由约0.5至约14毫居里/毫克，较好约1至约10毫居里/毫克，较好约1至约5毫居里/毫克，且最好2至6毫居里/毫克或1至3毫居里/毫克的比活性。
本发明另一较佳具体实施方案是药物组合物，含有依据本发明的抗体，及药学上可接受的载体或赋形剂。
药学上可接受的载体可含有生理上可接受的化合物，其作用如：可稳定或增加AMPA谷氨酸受体激动剂，拮剂或调控剂的吸收作用。此生理上可接受的化合物包括如：碳水化合物，如萄萄糖，蔗糖或右旋糖，抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白质或其他稳定剂或赋形剂(也见如Remington′s Pharmaceutical Sciences(1990)，18th ed.Mack Publ.，Easton)。本领域技术人员可知道药学上可接受载体的选用，包括生理上可接受的化合物，可依据如组合物的给药路径而定。
在动物或人体中，已证知利用上述的药物组合物是有益的，可经由静脉内或其他路径，如全身性，区域地或局部地施加至重点组织或器官，依欲处理的疾病或问题的型式及来源而定，如肿瘤。例如，当不同的器官或器官系统是需要治疗时，全身性作用模式是欲求的，如在全身性自身免疫疾病，或过敏，或外来器官或组织的移植，或肿瘤扩散或难以定位时。当仅预期有局部的肿瘤或免疫作用时，如区域性肿瘤时，可考虑局部的作用模式。
含有本发明抗体蛋白质的药物组合物可以本领域技术人员已知的不同应用路径施用，值得注意的是静脉内注射或直接注入靶组织内。于全身性应用时，以静脉内，管腔内，肌肉内，动脉内，腹膜内，口服或鞘内路径为较佳。较区域性的应用可经皮下，皮内，心内，叶间(intralobally)，髓内，肺内，直接达到或接近欲处理组织(结缔-，骨-，肌肉-，神经-，上皮-组织)。依欲求的疗程及治疗效力而定，药物抗体组合物可给药一或数次，也可间歇地，例如在每天的基础上给药数天，数周或数月，且以不同的剂量。
于制备含有抗体制剂的适合的药物组合物以供上述应用时，本领域技术人员可使用已知的可注射，生理上可接受的无菌溶液。于制备供肠外注射或输液用的即可用溶液时，水性等渗溶液，如盐水或相当的血浆蛋白质溶液可容易地取得。药物组合物可呈冷冻干燥型式或无水制剂，其可在使用前直接于无菌条件下以已知的可注射溶液重组之，如组配试剂盒那样。本发明抗体组合物的最终制剂可制成供注射，输液或灌注用，是将依据本发明的经纯化抗体混合以无菌生理上可接受的溶液，其中可添加以已知的载体物质和/或添加剂(如血清白蛋白，右旋糖，亚硫酸氢钠，EDTA)。
抗体应用的剂量依疾病的本质而定。在某些病人中，含于药物组合物中的“裸露”抗体用量，可在0.1及100毫克/米2间，较好5及50毫克/米2，每次施用，较好10毫克/米2至约40毫克/米2，较好10毫克/米2至约30毫克/米2，也较好是20毫克/米2至约30毫克/米2，且最好约25毫克/米2体表面积。同时最佳者是抗体蛋白质剂量为约50毫克/米2体表面积。
每次给药应用至病人的放射活性剂量要足够高才有效，但必须低于毒性限制剂量(dose limiting toxicity)(DLT)。对于含有经放射标记抗体的药物组合物，如有186铼的组合物，必需要决定最大耐受剂量(MTD)，其不可超过治疗设定。放射标记抗体应用至癌症病人可经过低于MTD的剂量的重复(每月或每周)静脉内输注而进行(见Welt et al.(1994)J.Clin.Oncol.12：1193-1203)。以多次给药为较佳，通常以周为间隔；然而，经放射标记的物质应以较长间隙给药，即隔4-24周，较好隔12-20周。然而本领域技术人员可选择，将给药分成二次或二次以上施用，可彼此间隔很短时间应用，或在某些其他预定间隙范围内，如从1天至1周应用。
再者，所应用的放射活性剂量可依下列的准则。一般而言，每次给药的放射活性剂量应在30及75毫居里/米2体表面积(BSA)之间。因此，在本发明药物组合物中放射标记抗体的量，优选以186铼，188铼，99m锝，131碘及90钇，最好是以186铼标记的抗体的量，应用至病人是10，20，30，40，50或60毫居里/米2，较好是50毫居里/米2。在较佳具体实施方案中，本发明是有关药物组合物，其中该放射标记抗体的剂量依本发明是MTD，较好是50毫居里/米2。此在实例3至6的临床研究中有详尽示范。
同时较佳的也有依据本发明的药物组合物，其中含有抗体蛋白质并连接至依据本发明如上文定义的放射性同位素，其中抗体蛋白质的比活性为由约0.5至约15毫居里/毫克，或由约0.5至约14毫居里/毫克，较好约1至约10毫居里/毫克，较好约1至约5毫居里/毫克，且最好2至6毫居里/毫克或1至3毫居里/毫克。
较佳的也包括依据本发明的药物组合物，含有抗体蛋白质连接至依据本发明如上文定义的放射性同位素，其中该抗体或抗体衍生物是在水溶液中pH由约7至约8，且浓度由约0.5至约2.0毫克/毫升。
较佳的具体实施方案是依据本发明的药物组合物，进一步含有一种或一种以上的辐射防护剂，选自包括抗坏血酸，龙胆酸，还原酸，赤藓酸(erythrorbic acid)，对-氨基苯甲酸，4-羟基苯甲酸，尼克酸，尼克酰胺，2，5-二羟基-1，4-苯二磺酸，普维酮(povidone)，肌醇，和/或柠檬酸盐。
较佳的是依据本发明的药物组合物，其中的辐射防护剂是抗坏血酸。
另一较佳具体实施方案是依据本发明的药物组合物，其中该抗体蛋白质含有抗体分子，选自抗体分子BIWA 4或BIWA 8，如上文所述，并连接至186铼(经由MAG-2 GABA)，并进一步含有辐射防护剂抗坏血酸。
本发明另一较佳具体实施方案是依据本发明抗体蛋白质的用法，可制成药物以治疗癌症。在较佳具体实施方案中，本发明是有关依据本发明的抗体蛋白质的用法，可连接至如上述的治疗剂，以治疗癌症。癌症包括与恶性生长有关的任何疾病，如固体肿瘤，肉瘤及白血病。此疾病必要的先决条件是CD44v6的表达。依据本发明的癌症包括下列，但不限于此：
1)上皮癌的治疗包括乳房，肺，结肠直肠，头及颈部，胰脏，卵巢，膀胱，胃，皮肤，内膜，卵巢，睾丸，食道，前列腺以及肾源的癌症；
2)骨骼及软组织肉瘤：骨肉瘤，软骨肉瘤，纤维肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤(MFH)，平滑肌肉瘤；
3)造血系恶变：霍金氏及非霍金氏淋巴瘤，白血病；
4)神经外胚层肿瘤：外周神经肿瘤，星状细胞瘤，黑色素瘤；
5)间皮瘤。
与固体肿瘤有关的癌性疾病状态的实例包括下列，但不限于此：结肠直肠癌，非小细胞肺癌，乳腺癌，头及颈部癌，卵巢癌，肺癌，膀胱癌，胰脏癌及脑的转移性癌。
因此，较佳具体实施方案是依据本发明抗体蛋白质的用法，其中该癌症选自下列包括结肠直肠癌，非小细胞肺癌，乳腺癌，头及颈部癌，卵巢癌，肺癌，膀胱癌，胰脏癌及脑的转移性癌。
较好也包括依据本发明的抗体蛋白质，如上文所定义，可制成药物以治疗癌症，其中抗体蛋白质的量每次应用为0.1及100毫克/米2之间，较好是5及50毫克/米2，较好是10毫克/米2至约40毫克/米2，较好10毫克/米2至约30毫克/米2，也较好是20毫克/米2至约30毫克/米2，且最好约25毫克/米2体表面积。同时最好是约50毫克/米2体表面积的抗体蛋白质剂量。较佳的也有抗体蛋白质连接至依据本发明如上文定义的放射性同位素的用法，可制成药物以治疗癌症，其中每次给药的放射活性剂量为30及75毫居里/米2体表面积(BSA)之间。较佳的是抗体蛋白质连接至依据本发明如上文定义的放射性同位素的用法，可制成药物以治疗癌症，其中依据本发明的抗体蛋白质放射标记以186铼，188铼，99m锝，131碘或90钇，且最好是标记以186铼。又另一较佳具体实施方案中，本发明是有关抗体蛋白质连接至依据本发明的放射性同位素的用法，以制成药物治疗癌症，其中连接至抗体的同位素的剂量是10，20，30，40，50或60毫居里/米2，最好是50毫居里/米2。此在实例3至6的临床研究中有充分示范。
较佳的也有抗体蛋白质连接至依据本发明如上文定义的放射性同位素的用法，可制成药物以治疗癌症，其中该抗体蛋白质的比活性为由约0.5至约15毫居里/毫克，或由约0.5至约14毫居里/毫克，较好约1至约10毫居里/毫克，较好约1至约5毫居里/毫克，且最好2至6毫居里/毫克或1至3毫居里/毫克。
较佳的也有抗体蛋白质连接至依据本发明如上文定义的放射性同位素的用法，可制成药物以治疗癌症，其中该抗体或抗体衍生物是在pH由约7至约8的水溶液中，且浓度由约0.5至约2.0毫克/毫升。
本发明进一步是有关癌症治疗的方法，其中依据本发明的抗体蛋白质给药一至数次至有所需的受试者内，该抗体蛋白质可选择性地结合至CD44v6，经由连接至抗体蛋白质的治疗剂破坏肿瘤细胞，并监测治疗是否成功。该抗体蛋白质可以呈裸露的/未经修饰抗体蛋白质，经修饰的抗体蛋白质，如融合蛋白质，或抗体蛋白质连接至治疗剂，其中包括将肿瘤与有效剂量的该抗体接触。如上述的治疗癌症的方法，于体内或体外均是有效的。癌症为上述的任何癌症。
抗体应用的剂量依疾病的本质而定。在癌症病人，“裸露的”抗体的施用量可在0.1及100毫克/米2间，较好是5至50毫克/米2每次应用，较好10毫克/米2至约40毫克/米2，较好10毫克/米2至约30毫克/米2，也较好20毫克/米2至约30毫克/米2，且最好约25毫克/米2体表面积。同时最佳的是抗体蛋白质剂量为约50毫克/米2体表面积。
每次给药应用至病人的放射活性剂量要足够高才有效，但必须低于毒性限制剂量(DLT)。对于经放射标记的抗体，如以186铼标记的抗体，最大耐受剂量(MTD)必需予以决定，其不可超过治疗设定。经放射标记的抗体至癌症病人的应用可经由重复的(每月或每周)静脉内输注而进行，其剂量是低于MTD(如见Welt et al.(1994)J.Clin.Oncol.12：1193-1203)。以多次给药为较佳，通常以周为间隔；然而经放射标记的物质应以较长间隔来给药，即隔4-24周，较好隔12-20周。然而，本领域技术人员应选用分二次或二次以上给药，各自间隔极短时间应用，或在某些其他预定间隔范围，如由1天至1周应用。
再者，应用的放射活性剂量应依下列的准则而定。一般而言，每次给药的放射活性应在30及75毫居里/米2体表面积(BSA)之间。因此，经放射标记的抗体，较好是标以186铼，188铼，99m锝，131碘或90钇，最好是标以186铼的抗体的剂量，应用至病人是10，20，30，40，50或60毫居里/米2，较好50毫居里/米2。在较佳具体实施方案中，本发明是有关治疗方法，其中如上述的放射标记的抗体给药至受癌症之苦的病人，其中该放射标记的抗体的剂量是MTD，较好是50毫居里/米2，由此该癌症可预防或治疗。此在实例3至6的临床研究中有充分示范。
较佳的也有依据本发明的癌症治疗方法(见上)，其中抗体蛋白质连接至依据本发明如上文定义的放射性同位素，其具有比活性由约0.5至约15毫居里/毫克，或由约0.5至约14毫居里/毫克，较好约1至约10毫居里/毫克，较好约1至约5毫居里/毫克，且最好2至6毫居里/毫克或1至3毫居里/毫克。
较佳的也有依据本发明癌症治疗的方法(如上)，其中抗体蛋白质连接至依据本发明的放射性同位素，其是在pH值由约7至约8的水溶液中，且浓度由约0.5至约2.0毫克/毫升。
较好，本发明是有关依据本发明的方法，其中肿瘤是选自下列包括：结肠直肠癌，非小细胞肺癌，乳癌，头及颈部癌，卵巢癌，肺癌，膀胱癌，胰脏癌及脑的转移癌。
本发明进一步方面是核酸，其特征在于是可编码依据本发明的抗体蛋白质。该核酸可为RNA，或较好是DNA。该DNA分子可化学合成。首先，可以本领域已知的方法合成适合的寡核苷酸(如Gait，M.J.，1984，Oligonucleotide Synthesis.A Practical Approach.IRL Press，Oxford，UK)，其可用来产生合成的基因。产生合成的基因的方法是本领域已知的(如Stemmeret al.1995，Single-step assembly of a gene and entire plasmid from largenumbers of oligodeoxyribonucleotides，Gene 164(1)：49-53；Ye et al.1992，Genesynthesis and expression in E.coli for pump，a human matrix metalloproteinase，Biochem Biophys Res Commun 186(1)：143-9；Hayden et Mandecki 1988，Genesynthesis by serial choning of oligonucleotides，DNA 7(8)：571-7)。这些方法可用来合成本案中所揭示的任何DNA分子，例如编码BIWA 4的DNA。
也较好，依据本发明的核酸特征在于其含有5′或3′或5′和3′非翻译区。依据本发明的核酸可含有其他非翻译区上游和/或下游。非翻译区可含有调控元件，如转录启始单位(启动子)或加强子。该启动子可为组成型的，可诱导型的，或发育控制型的启动子。较好，不要排除其他已知启动子，有人类巨细胞病毒(CMV)及劳氏肉瘤病毒(RSV)的组成型启动子，以及猴病毒40(SV40)及单纯疱疹启动子。依据本发明的可诱导启动子包括对抗生素具抗性的启动子，热-休克启动子，激素-可诱导型的“乳腺肿瘤病毒启动子”及金属硫蛋白启动子。也较好，依据本发明的核酸特征在于其可指导合成依据本发明的抗体蛋白质片段。此指依据本发明多肽的部分。
较好，依据本发明的核酸是如SEQ ID No.4，5，6，10，11，12，13，14，15和/或16所揭示的核酸。最好，该核酸是SEQ ID No.16的核酸。
本发明另一个重要方面是一种重组DNA载体，其特征在于其含有依据本发明的核酸。较好，该载体含有核酸特征在于SEQ ID No.4，5，6，10，11，12，13，14，15和/或16所揭示的核酸。最好，该载体含有特征在于SEQ ID No.16的核酸。
病毒载体的实例有，例如痘苗病毒，Semliki-Forest-病毒及腺病毒。可用于COS-细胞的载体具有SV40的复制起点。可使质粒获得高拷贝数，可用于昆虫细胞的载体，如大肠杆菌转移载体，且含有例如可指导合成多角体的DNA作为启动子。
本发明另一较佳方面是依据本发明的重组DNA载体，特征在于其是载体pAD-CMV或其功能性衍生物。此衍生物如pAD-CMV1，pAD-CMV19或pAD-CMV25。
本发明另一较佳方面是依据本发明的重组DNA载体，其特征在于其是SEQ ID No.17，或其功能性衍生物。
本发明另一较佳方面是依据本发明的重组DNA载体，其特征在于其是SEQ ID No.18或其功能性衍生物。
同时也较好，该载体含有一或多种核酸分子，特征如SEQ ID No.4，5，6，10，11，12，13，14，15和/或16。
较好也有如US 5648267 A或US US 5733779 A所揭示的载体，含有依据本发明的核苷酸序列。较好，该载体含有一或数种核酸分子，特征如SEQID No.4，5，6，10，11，12，13，14，15和/或16。本发明另一较佳方面是依据本发明的重组DNA载体，特征在于其是载体N5KG1Val或其衍生物。
另一重要方面是宿主，特征在于其含有依据本发明的载体。
另一重要方面是依据本发明的宿主，特征在于其是真核宿主细胞。依据本发明的真核宿主细胞包括真菌，如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，裂殖酵母(Schizo saccharo myces)，木霉(Tricho derma)，昆虫细胞(如来自草地粘虫(Spodoptera frugiperda)Sf-9，有杆状病毒表达系统)，植物细胞，如来自烟草(Nicotiana tabacum)，哺乳动物细胞，如COS细胞，BHK，CHO或骨髓瘤细胞。
在免疫系统细胞的子代中，其中抗体蛋白质也在吾等体内形成，依据本发明的抗体蛋白质是特别充分折叠及糖基化的。哺乳动物宿主细胞，较好是CHO或COS细胞为较佳。如CHO DG44(Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77(7)：4216-20(1980))，或CHO-K1(ATCC CCL-61)细胞。因此，另一较佳方面是依据本发明的宿主，特征在于其是BHK，HCO或COS细胞，最好CHO DG44或CHO-K1(ATCC CCL-61)细胞。
另一较佳方面是依据本发明的宿主，其特征在于其是噬菌体。
另一较佳方面是依据本发明的宿主，其特征在于其是原核宿主细胞。原核宿主细胞的实例有：大肠杆菌，枯草杆菌，链霉素或奇异变形菌(proteummirabilis)。
本发明进一步是有关制备依据本发明抗体蛋白质的方法，其特征在于其含有以下步骤：依据本发明的宿主在该抗体蛋白质可为该宿主细胞表达的条件下培养，且分离出该抗体蛋白质。依据本发明的抗体可如下制备。编码轻链及重链的核酸分子可以标准方法化学及酶法合成。首先，适合的寡核苷酸以本领域已知的方法合成(上文详述)。自寡核苷酸产生合成基因的方法是本领域已知的(详述上文中)。编码抗体重及轻链的这些核酸分子，可克隆至表达载体内(或二链均在一个载体分子内，或各链至分别的载体分子内)，其再引入宿主细胞。宿主细胞较好是哺乳动物缩主细胞(上文详述)，如COS，CHO或BHK细胞，较好是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，宿主细胞再培养于适合的培养基，所在的条件可产生抗体，且抗体再自培养基中依标准步骤分离。在宿主细胞和各自的表达载体中从重组DNA产生抗体的步骤是本领域熟知的(如见WO 94/11523，WO 97/9351，EP 0481790)。
本发明较好的有关依据本发明的方法，其特征在于该宿主是哺乳动物细胞，较好是CHO或COS细胞。
本发明较好是有关依据本发明的方法，其特征在于该宿主细胞由二种质粒共转染，该质粒携有轻或重链的表达单位。
以下实施例用以进一步说明本发明；但不欲构成本发明此中所揭示范围的限制。
实施例
实施例1放射免疫治疗
材料及方法
单克隆抗体。mMAb BIWA 1＝VFF 18(其为杂交瘤细胞株分泌，于1994年6月7日以保藏号DSM ACC2174保藏在DSM-Deutsche Sammlung furMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，Deutschland；也见WO 95/33771)是以含有人类CD44功能域v3-v10的谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白质免疫接种BALB/c小鼠而产生的(Heider et al.，1996)。可由BIWA 1识别的表位，已定在CD44功能域Vb中氨基酸360-370(依Kugelman et al.的编号(1992))。用于本研究的批次经过在蛋白质-G Sepharose纯化及对PBS透析后可得。
MAb U36(IgG1)在以HNSCC细胞株UM-SCC-22B免疫接种小鼠后衍生而来，并可识别CD44v6内与BIWA 1所识别不同的表位。U36以在蛋白质A-Sepharose上行亲和层析而自浓缩的组织培养上清液中纯化，并进一步在Q-Sepharose上纯化。
嵌合MAbs及人源化MAbs的产生。mRNA分离自BIWA 1杂交瘤细胞株，利用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。cDNA来自可变重链(VH)及可变轻(VL)链，并由RT-PCR产生。
上述片段克隆至TA克隆载体pCR II(Invitrogen，Groningen，TheNetherlands)并测序之。衍生自质粒pAD CMV1的二个表达载体(Himmler etal.，1990)予以构成，其中分别携有人类γ-1的恒定区及人类κ轻链的恒定区。接下来，BIWA 1的VH及VL片段克隆至相应的表达载体内，于恒定区之前。嵌合抗体命名为cMAb BIWA 2。BIWA 1重及轻链可变区的人源化版本(由CDR嫁接产生)克隆至上述表达载体的免疫球蛋白恒定区之前。为构筑人源化抗体，所用的人类可变区，于重链是衍生自资料库GenPept登录号为S31669的人类免疫球蛋白片段，而于轻链是衍自人类免疫球蛋白HUMIGKAX(重排的抗-骨髓磷脂(anti-myelin)κ链)，Genbank登录号为M29469。生成的MAbs分别命名为hMAb BIWA4及BIWA 8。BIWA 8在轻链框架2内含有二个小鼠类亲代抗体的氨基酸，而BIWA 4在框架中不含有小鼠类残基。
重组MAbs可在二氢叶酸还原酶缺失的中国仓鼠卵巢细胞中稳定地表达，是以重及轻链表达质粒通过电穿孔而进行的。细胞以500及100个细胞/孔洞的密度种植入96孔洞微量滴定板内，在选择性培养基中(α-MEM加有10％经透析的胎牛血清)。当集落变得可见时(在～14天后)，以ELISA测定培养基上清液中的IgG含量，并扩增产生IgG量最多的集落。在氨甲喋呤渐增浓度(20-500nM)存在下培养，以进行基因的扩增。
在含有1％胎牛血清的标准培养基中进行嵌合的MAbs及人源化MAbs的实验室规模制备。IgG级分在蛋白质A sepharose上行亲和层析可自组织培养上清液中纯化。纯度以SDS-PAGE及高性能大小排阻层析法测试。
抗体亲和力的评估。在BIAcore 2000系统上用重组抗原进行动力学及亲和力常数的检测(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)。含有人类CD44v3-v10功能域的谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白质(GST/CD44v3-v10；20微克/毫升)以氨基偶合方法固化在CM5感受片上，依操作指示，利用10mM醋酸钠，pH 5.0为偶合缓冲溶液。35微升在各浓度(8-67nM)下的MAb于HBS(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，3.4mN EDTA，0.05％BIAcore表面活性剂P20)注入涂布有抗原的表面，流速为5微升/分。在缓冲溶液流动中(HBS)评估MAb的解离作用5分钟。在二次分析之间，所述片的表面以15微升30mM HCl的单一脉冲再生。以BIAcore的BIA评估软体，2.1版进行数据分析及动力学常数的估算。并对所有抗体评估结合速率(ka)，解离速率(kd)，及解离常数(Kd)。
经由竞争性细胞ELISA也评估相对结合亲和力。人类A431细胞，源自外阴的上皮样癌，且已知可表达高水平的CD44v6，种入96孔的组织培养板，每孔内有200微升含有10％胎牛血清的RPMI 1640，密度为2.5-5×105细胞/毫升。该培养板于37℃，5％CO2的空气的潮湿温育箱中温育一夜。而在移去培养基后，细胞以PBS洗一次，以96％乙醇固定1分钟，再以PBS洗涤。cMAb BIWA 2，hMAb BIWA 4及hMAb BIWA 8(预行稀释至10微克/毫升)以1∶2连续稀释液(8次稀释步骤)，以100微升/孔，稀释于PBS/0.5％BSA/0.05％吐温20(分析缓冲溶液)中，应用并在室温下温育30分钟。加入100微升预先稀释的mMAb BIWA 1(20纳克/毫升)，该培养板再于回旋震荡槽中以室温温育2小时。对照组样品仅含预先稀释的样品，无BIWA 1(0％对照组)或仅有BIWA 1无任何竞争性抗体(100％对照组)。在以PBS/0.05％吐温20洗涤三次后(洗涤缓冲溶液)，加入100微升第二抗体(过氧化物酶-连接的山羊抗-小鼠Fc，以1∶15,000稀释于分析缓冲溶液中，DAKOCopenhagen，Denmark)以检测mMAb BIWA 1，且该培养板在回旋振荡槽内于室温下温育1小时。在以洗涤缓冲溶液洗涤三次后，该培养板以100微升/孔四甲基联苯胺底物溶液显色(Kierkegaad and Perry Laboratories，Gaithersbure，USA)。反应在15分钟后以50微升/孔的1M磷酸停止的。在ELISA培养板计读器中于450纳米下检测吸光度。(参考波长为610-690纳米)。
抗体的放射性碘化作用。进行MAbs的碘化作用，基本上如Haisma etal.(1986)所述，利用125I(100毫居里/毫升)或131I(200毫居里/毫升)，二者均购自Amersham，Aylesbury，England。1毫克MAb IgG溶于500微升PBS，pH＝7.4，并混合1毫居里125I或131I，于涂布有75微克Iodogen的小瓶内(Pierce，Oud Bijerland，The Netherlands)。在室温下温育5分钟后，自由态碘在PD10-柱上凝胶过滤而移去(Pharmacia-LKB，Woerden，The Netherlands)。移去未结合的125I或131I后，以TLC及HPLC方法确定放射化学纯度始终超过97％，所述方法上文已述(Van Gog et al.，1997)。以HPLC分析评估，并无聚集物或片段形成。
铼186-标记的MAbs的制备。186Re-标记的MAbs依多步骤法制备，其中使用螯合剂S-苄酰基巯基酰基三甘氨酸(S-苄酰基-MAG3)如先前所述(Van Gog et al.，1997a)。在此步骤中，186Re-MAG3的制备的固相合成后，继以2，3，5，6-四氟酚(TFP)的酯化作用，并将反应性186Re-MAG3-TFP酯连接至MAb。连接作用后，186Re-标记的MAb在PD10-柱上纯化。移去未结合的186Re后，放射化学纯度始终超过98％。
放射标记抗体的结合分析。用于生物分布及治疗研究的经标记的MAbs于体外的结合特性，在免疫反应性分析中确定，基本上如先前所述(Van Goget al.，1997a)。为测试碘化的或186Re-标记的MAbs的结合，使用UM-SCC-11B细胞固定在0.1％戊二醛上。UM-SCC-11B细胞慷慨得自Dr.T.E.Carey，University of Michigan，Ann Arbor，MI。以1％BSA于PBS中制备5次连续稀释液(范围由每管5×106细胞至每管3.1×105个细胞)。过量的未标记MAbIgG加至第二管内，并加有最低浓度的细胞以测定非特异的结合。将标记以10,000cpm的125I，131I或186Re的IgG加至各管，且样品在4℃下温育一夜。细胞离心，对团块及上清液中的放射活性于γ计数器中检测(LKB-Wallace1282 CompuGamma，Kabi Pharmacia，Woerden，The Netherlands)，且计算出结合型的及自由态的放射活性的百分率。数据在经修饰的Lineweaver Burk图上图解分析，再通过线性外延至代表无限抗原过量的条件下确定出免疫反应性。
在带有HNSCC的裸鼠中进行生物分布研究。于生物分布实验中，以携有皮下植入人类HNSCC异种移植物(HNX-OE)的裸鼠进行，如先前所述(Van Gog et al.，1997a)。雌性小鼠(Hsd：无胸腺nu/nu，25-32克，Harlan CPB，Zeist，The Netherlands)在实验时是8-10周大。进行三个生物分布实验，以携有1或2个范围由30至470毫米3的肿瘤株小鼠来进行。在第一个实验中，10微居里(50微克)131I-标记的mMAb U36与10微居里(50微克)125I标记的mMAb BIWA 1同时注入有133±28毫米3肿瘤的小鼠体内(n＝20只小鼠，37个肿瘤)。在第二个实验中，10微居里(50微克)131I标记的hMAb BIWA 4及10微居里(50微克)125I-标记的cMAb BIWA 2共同注入有167±31毫米3肿瘤的小鼠体内(n＝21只小鼠，32个肿瘤)。在第三个实验中，10微居里(50微克)131I标记的hMAb BIWA 4及10微居里(50微克)125I-标记的hMAb BIWA8共同注入有130±21毫米3肿瘤的小鼠中(n＝23只小鼠，40个肿瘤)。偶联物在稀释于0.9％NaCl后，以100微升的体积静脉内注射。为了得到共注射的MAbs的可比较的血液/机体清除率，仅混合有相同小鼠或人类同型(isotype)的MAbs。抗体剂量(每只小鼠共100微克)的选用应足够高以避免MAb从血液中快速的同型-相关(isotype-related)的消除作用(Sharkey et al.，1991，Van Gog et al.，1997b)，也要足够低才可避免肿瘤中抗原的饱和。
在注射后所示的时间点时，将小鼠麻醉，采血，杀死并解剖。除了肿瘤，也移出以下器官：肝，脾，肾，心，胃，回肠，结肠，膀胱，胸骨，肌肉，肺，皮肤及舌头。称重后，于双重-同位素γ计数器中(LKB-Wallace1282 CompuGamma)计数在肿瘤，血液及器官内的放射活性，在125I窗设定中自动校正131I-康普顿(131I-comptons)。在这些组织中的放射活性摄取，以每克组织注入剂量的百分率计算(％ID/克)。
一直到MAb给药日，小鼠常规关在无特异病原体的条件下，在无菌栏内置湿度及温度均受控的干净小室，依据Federal Standard 209d为第2000等级。在注射当日，小鼠移至Radio Nuclide Center，并在无菌条件下于通风橱中给药无菌的放射免疫偶联物。
在裸鼠中放射免疫治疗的研究。进行动物RIT研究，以比较标记以186Re的不同MAbs的治疗效力。偶联物的免疫反应性部分始终超过75％。以携有1或2个HNX-OE肿瘤，且范围在45至195毫米3的小鼠进行三个治疗实验。选用的186Re剂量在最大耐受剂量(MTD)水平(即400微居里)或较低(300微居里)。MTD水平的定义为造成体重5-15％丧失的剂量。在第一个实验中，小鼠给予或300微居里(100微克)186Re-标记的mMAb U36或300微居里(100微克)186Re-标记的mMAb BIWA 1单一静脉注射。在第二个实验中，给药或300微居里(100微克)186Re-标记的hMAb BIWA 4及300微居里(100微克)186Re-标记的cMAb BIWA 2，而在第三个实验中，或400微居里(100微克)186Re-标记的hMAb BIWA 4或400微居里(100微克)186Re-标记的hMAbBIWA 8。所有实验组别中的平均肿瘤体积均类似。实验1：95毫米3±34毫米3(n＝7只小鼠，12个肿瘤)于以186Re-mMAb U36处理组中，91毫米3±15毫米3(n＝7只小鼠，12个肿瘤)于以186Re-mMAb BIWA 1处理组中，及99毫米3±54毫米3(n＝6只小鼠，11个肿瘤)于对照组中。实验2：101毫米3±35毫米3(n＝7只小鼠，12个肿瘤)于186Re-hMAb BIWA 4处理组，92毫米3±43毫米3(n＝7只小鼠，12个肿瘤)于186Re-cMAb BIWA 2处理组，而对照组和实验1相同。实验3：105毫米3±43毫米3(n＝8只小鼠，13个肿瘤)于186Re-hMAb BIWA 4处理组，100毫米3±42毫米3(n＝8只小鼠，13个肿瘤)于以186Re-hMAb BIWA 8处理组，及110毫米3±46毫米3(n＝7只小鼠，11个肿瘤)于对照组。于处理过程中，肿瘤每周测二次，且估计出相对于处理之初的肿瘤体积。每周检测体重二次以监测毒性。当肿瘤之一超过1000毫米3时可处死小鼠。
统计学。在各时间点上，统计分析共注射的MAbs间组织摄入的差异，成对的数据利用Student′s t-试验。于各时间点时，统计分析各RIT处理组间平均肿瘤体积的差异，对独立样品采用Student′s t-试验。
结果
CD44v6-特异MAbs的体外结合特性。利用重组抗原以及人类肿瘤细胞株，分析5种MAbs的结合亲和力。利用表面质粒基因组共振(surfaceplasmon resonance)，以GST/CD44v3-v10为固化抗原，可评估动力学及亲和力常数。表1示出结合速率(ka)，解离速率(kd)及解离常数(Kd)。mMAb BIWA1及cMAb BIWA 2，含有相同的可变区，具有类似的ka，kd和Kd，且显示出最高的亲和力。相反的，mMAb U36及hMAb BIWA 4有较低的ka及较高的Kd，造成显著较低的解离常数(分别为常数(factor)35.0及10.5)。hMAbBIWA 8，含有鼠类残基在轻链框架区2中，显示出显著减低的kd，造成亲和力的增加。
表1直接拮抗CD44v6的MAbs的动力学及亲和力常数 抗体 ka(M-1s-1) kd(s-1) Kd(M) 相对于小鼠 BIWA1的Kd小鼠BIWA1 1.3×105 4.2×10-5 3.2×10-10 1.0小鼠U36 1.5×104 1.7×10-4 1.1×10-8 35.0嵌合体BIWA2 1.7×105 4.1×10-5 2.4×10-10 0.7人源化BIWA4 6.5×104 2.2×10-4 3.4×10-9 10.5人源化BIWA8 7.5×104 6.3×10-5 8.4×10-10 2.6
也在竞争性细胞ELISA中评估cMAb及hMAb的相对结合亲和力，利用人类A431肿瘤细胞(图1)。依据在重组抗原上的亲和力检测，cMAb BIWA2是最有效的竞争者，继之为hMAb BIWA 8及hMAb BIWA4。以其他二种人类HNSCC细胞株(FaDu及LICR-LON-NH5)可得到类似的结果(未示出)。
在携有HNSCC的裸鼠中的生物分布。在携有HNX-OE异种移植物的裸鼠中进行生物分布研究。二个有相同小鼠或人类同型的MAbs，标记以125I或131I，并同时注射(各50微克，10微居里)。选择各MAbs对，以在亲和力的差异上提供逐步的减低：mMAb U36的亲和力较mMAb BIWA 1低35.0倍(实验1)，hMAb BIWA 4有较cMAb BIWA 2低14.0倍的亲和力(实验2)且hMAb BIWA有较hMAb BIWA 8低4.0倍的亲和力(实验3)。所有碘化MAbs的免疫反应性部分(fraction)，在外推后至少74％(表2)。
表2碘化MAbs的免疫反应性部分，由结合至
UM-SCC-11R细胞而决定
实验 抗体 标记物 结合至 外推的
编号 5×106细胞(％) 结合a(％)
1 小鼠U36 131I 59.7 87.4
小鼠BIWA1 125I 91.1 91.1
2 人源化BIWA4 131I 77.4 82.3
嵌合的BIWA2 125I 80.5 79.9
3 人源化BIWA4 131I 77.3 74.5
人源化BIWA8 125I 91.8 92.1
a通过线性外推至代表无限抗原过量的条件可测定免疫反应性：见材料及方法
在实验1的生物分布，在注射后1，2，3及7天时测定；在实验2及3的生物分布，在注射后1，2，4及7天时测定。所有三个实验的肿瘤及血液的经估计的平均％ID/克，示于表3中。
表3共注射至携有HNX-OE小鼠后，有不同亲和力的
经碘化的CD44v6-特异MAbs的肿瘤及血液水平 偶联物A(％ID/克) 偶联物B(％ID/克) 偶联物A∶B比率实验编号 注射后 肿瘤 血液 肿瘤 血液 肿瘤 血液 时间1.偶联物A：131I-mMAb U36 1d 15.7 17.9 13.0 17.8 1.2 1.0 偶联物B：125I-mMAb BIWA1 2d 18.4 15.0 13.4 14.9 1.4 1.0 3d 20.6 11.8 13.7 11.0 1.5 1.1 7d 16.5 7.1 7.8 4.8 2.1 1.52.偶联物A：131I-hMAb BIWA4 1d 10.8 10.2 9.1 10.6 1.2 1.0 偶联物B：125I-eMAb BIWA2 2d 12.4 10.2 9.8 10.1 1.3 1.0 4d 12.9 7.2 8.9 7.2 1.5 1.0 7d 7.6 3.3 4.8 2.7 1.6 1.23.偶联物A：131I-hMAb BIWA4 1d 10.5 11.1 9.5 11.4 1.1 1.0 偶联物B：125I-hMAb BIWA8 2d 10.9 10.0 9.6 9.8 1.1 1.0 4d 11.7 6.2 9.6 5.9 1.2 1.0 7d 10.1 4.2 7.8 3.9 1.3 1.1
于各对共注射MAbs，示出肿瘤及血液的吸收比例。肿瘤，血液及各器官在第3(实验1)或4天p.i.(实验2及3)的平均％ID/克及s.e.m.示于图2。
在二个小鼠MAbs的直接比较中，低亲和力U36的肿瘤吸收在所有的时间点时，均显著高于高亲和力BIWA1的吸收p＜0.001(表3)。相反的，这些MAbs在1，2及3天p.i.时血液及正常组织中吸收数值间并未见显著的差异。在第7天p.i.时，BIWA1水平在血液及大多数器官中显著低于(p＜0.05)U36水平，显示BIWA1自血液/体内的清除率较快些。在第3天p.i.时，与BIWA1比较，U36高50％的肿瘤摄入于图2A中说明。
在评估其他二对MAb时可见类似的相互关系。hMAb BIWA4，虽有较低的亲和力，但在所有时间点时均显示出较cMAb BIWA2及hMAb BIWA8显著较高的肿瘤摄入(P＜0.001)(表3)。相反的，对这些MAbs对在1，2及4天p.i.，于血液及正常组织中的MAb水平是类似的。在第7天p.i.，BIWA2及BIWA8水平在血液及大多数器官中是显著低于(P＜0.05)BIWA4水平，提示这些MAb自血液/体内有较快的清除率。与BIWA2比较时，BIWA4有高出45％的肿瘤摄入，于图2B中说明，而与BIWA8比较时，BIWA4有高出20％的肿瘤摄入，于图2C中说明，此为注射后时间点4天而言。
由额外的实验中可得到一致的结果(数据未示出)，其中交换放射标记：125I-BIWA4对131I-BIWA8换上131I-BIWA4对125I-BIWA8。由此后面实验的数据中可排除一个可能性，即放射标记的型式会影响经标记MAb的药物动力学行为。
在携有HNSCC的裸鼠中的放射免疫治疗。由三个生物分布实验中，似乎低亲和力的MAbs可显出比高亲和力的MAbs更高且更具选择性的肿瘤摄入，且因此可能较适合RIT。为测试此可能性，在RIT研究中，比较以下处理组，利用携有HNX-OE的异种移植小鼠来进行：
实验1：以300微居里186Re-U36或300微居里186Re-BIWA1或盐水为对照。实验2：300微居里186Re-BIWA4或300微居里186Re-BIWA2或盐水为对照。实验3：400微居里186Re-BIWA4或400微居里186Re-BIWA8或盐水为对照。
于图3，对照组及处理组的平均相对肿瘤体积(以在第0天的肿瘤体积百分率表示)对时间作图。在所有三个实验中，于对照组中小鼠的肿瘤显示出对数生长，且肿瘤体积加倍的时间为约7天。在以186Re-标记的MAbs处理组中，肿瘤停止生长，在某些例子中伴有肿瘤的消退，此在注入偶联物后立即出现。然而，所有的肿瘤最终均再生长。
于实验1，给药300微居里186Re-BIWA1造成肿瘤生长速率减缓，但平均肿瘤大小并未减少。给药300微居里186Re-U36，可造成平均肿瘤体积减少，在注射后第7天及第17天间由185毫米3减少至120毫米3，之后肿瘤开始再生长。在186Re-U36处理组中，于第14天开始，平均相对肿瘤体积显著小于(P＜0.001)，186Re-BIWA1处理组。
于实验2，给药300微居里186Re-BIWA4或300微居里186Re-BIWA2，在第7天造成肿瘤生长的遏止，而在第17天p.i.再开始生长。从第14天开始，在RIT方面，BIWA4较BIWA2有效，但平均相对肿瘤体积间的显著差异，仅见于第14天p.i.(P＜0.05)。
于实验3，小鼠以400微居里186Re-BIWA4或BIWA8处理，其造成在19天时相对肿瘤体积减至最小，分别为80±62％及98±81％。之后，肿瘤开始再生长。
这些数据显示，在RIT上，低亲和力MAb BIWA4较高亲和力MAbscBIWA2及BIWA8更有效。
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Tolg，C.，Hofmann，M.，Herrlich，P.，and Ponta，H.Splicing choice from tenvariant exons establishes CD44 variability.Nucleic Acids.Res.21：1225-1229(1993).
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实例2序列详述
此实例示出详细的序列，如克隆位点的位置，前导序列及非翻译的区域。
缩写：
aa＝氨基酸
nt＝核苷酸序列
SEQ ID No.1 VH BIWA 4/8aa
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGSY
TYYLDSIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGLDYWGRGTLVTVSS
SEQ ID No.2 VL BIWA 4aa
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSINYIYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNLASGVPAR
FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQWSSNPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID No.3 VL BIWA 8aa
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSINYIYWLQQKPGQAPRILIYLTSNLASGVPARF
SGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQWSSNPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID No.4 VH BIWA 4/8nt
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTAAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGGCTCCGGGG
AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTTACACCTACTATCTAGACAGT
ATAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAAATGAAC
AGTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGACAGGGGTTGGACTACTGGGGT
CGAGGAACCTTAGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID No.5 VL BIWA 4nt
GAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAACCCTGTCTCTGTCTCCAGGGGAGAGGGCCACCCTG
TCCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAATTACATATACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCT
CCTAGACTCTTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCGCGCTTCAGTGGC
AGTGGGTCTGGAACCGACTTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCCGTT
TATTACTGCCTGCAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACATTCGGTGGTGGGACCAAGGTGGAGATT
AAA
SEQ ID No.6 VL BIWA 8nt
GAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAACCCTGTCTCTGTCTCCAGGGGAGAGGGCCACCCTG
TCCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAATTACATATACTGGCTCCAGCAGAAGCCAGGACAGGCT
CCTAGAATCTTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCGCGCTTCAGTGGC
AGTGGGTCTGGAACCGACTTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCCGTT
TATTACTGCCTGCAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACATTCGGTGGTGGGACCAAGGTGGAGATT
AAA
SEQ ID No.7重链(可变+固定)BIWA 4/8aa
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGSY
TYYLDSIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGLDYWGRGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL
LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV
YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID No.8轻链(可变+固定)BIWA 4aa
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSINYIYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNLASGVPAR
FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQWSSNPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS
DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST
LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID No.9轻链(可变+固定)BIWA 8aa
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSINYIYWLQQKPGQAPRILIYLTSNLASGVPARF
SGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQWSSNPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL
TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID No.10重链(可变+固定)BIWA4/8nt；在pAD-CMV1/pAD-CMV19中的插入子，含有内含子(小字盘)在CH1-铰链区，铰链区-CH2，CH2-CH3间，前导序列以下划线表示，非翻译序列为斜体字，克隆位点加粗
aagctttgacagacgcacaaccctggactcccaagtctttctcttcagtgacaaacacagacataggatatcaca
tttgcttctgacacaactgtgttcactagcagcctcaaacagacaccATGAACTTTGGGCTCAGCTTGATTTTCC
TTGTCCTAATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAG
GGTCCCTAAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGGCTC
CGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTTACACCTACTATCTAGACAGTATAAAGG
GCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGGCTGAGGACA
CGGCCGTGTATTACTGTGCAAGACAGGGGTTGGACTACTGGGGTCGAGGAACCTTAGTCACCGTCTCCTCAGCTA
GCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCT
GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACA
CCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGG
GCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTggtgagaggc
cagcacagggagggagggtgtctgctggaagcaggctcagcgctcctgcctggacgcatcccggctatgcagccc
cagtccagggcagcaaggcaggccccgtctgcctcttcacccggagcctctgcccgccccactcatgctcaggga
gagggtcttctggctttttcccaggctctgggcaggcacaggctaggtgcccctaacccaggccctgcacacaaa
ggggcaggtgctgggctcagacctgccaagagccatatccgggaggaccctgcccctgacctaagcccaccccaa
aggccaaactctccactccctcagctcggacaccttctctcctcccagattccagtaactcccaatcttctctct
gcaGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAggtaagccagcccaggcctcgccctcc
agctcaaggcgggacaggtgccctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacacgtccac
ctccatctcttcctcaGCAcCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACAC
CCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT
CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTA
CCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAA
CAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACGATCTCCAAAGCCAAAggtgggacccgtggggtgcgagggccaca
tggacagaggccggctcggcccaccctctgccctgagagtgaccgctgtaccaacctctgtcctacaGGGCAGCC
CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT
GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGAC
CACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCA
GCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT
GTCTCCGGGTAAATGAgtgcgacggccgcgaattc
SEQ ID No.11轻链(可变+固定)BIWA 4nt；在pAD-CMV1/pAD-CMV19中的序列，前导序列底下划线，非翻译序列为斜体字，克隆位点加粗
aagcttgatcttcaggatatcacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccATGG
ATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATGAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGGGGAGAAATTGTTCTCA
CCCAGTCTCCAGCAACCCTGTCTCTGTCTCCAGGGGAGAGGGCCACCCTGTCCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAA
ATTACATATACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCTCCTAGACTCTTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTT
CTGGAGTCCCTGCGCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACCGACTTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGGAGCCTG
AAGATTTTGCCGTTTATTACTGCCTGCAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACATTCGGTGGTGGGACCAAGGTGGAGA
TTAAACGGACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCTA
GCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAAT
CGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGC
TGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCA
CAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGgaattc
SEQ ID No.12轻链(可变+固定)BIWA 8nt；序列在
pAD-CMV1/pAD-CMV19中，前导序列底下划线，非翻译序列为斜体字，克隆位点加粗
aagcttgatcttcaggatatcacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccATGG
ATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATGAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGGGGAGAAATTGTTCTCA
CCCAGTCTCCAGCAACCCTGTCTCTGTCTCCAGGGGAGAGGGCCACCCTGTCCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAA
ATTACATATACTGGCTCCAGCAGAAGCCAGGACAGGCTCCTAGAATCTTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTT
CTGGAGTCCCTGCGCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACCGACTTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGGAGCCTG
AAGATTTTGCCGTTTATTACTGCCTGCAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACATTCGGTGGTGGGACCAAGGTGGAGA
TTAAACGGACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCTA
GCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAAT
CGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGC
TGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCA
CAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGgaattc
SEQ ID No.13重链(可变+固定)BIWA 4/8nt；序列在N5KG1Val中，不含内含子，前导序列底下划线
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTG
CAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTAAGACTCTCCTGTGCA
GCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGG
CTGGAGTGGGTCTCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTTACACCTACTATCTAGACAGTATAAAG
GGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTG
AGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGACAGGGGTTGGACTACTGGGGTCGAGGA
ACCTTAGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCC
TCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAA
CCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC
CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGC
ACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTT
GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGG
GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCT
GAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTAC
GTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG
TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAG
TGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG
CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAG
GTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC
AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC
TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC
TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
AAATGA
SEQ ID No.14轻链(可变+固定)BIWA 4nt；序列在N5KG1Val中，前导序列底下划线
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAA
ATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAACCCTGTCTCTGTCTCCAGGGGAGAGGGCCACCCTGTCC
TGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAATTACATATACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCTCCT
AGACTCTTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCGCGCTTCAGTGGCAGT
GGGTCTGGAACCGACTTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCCGTTTAT
TACTGCCTGCAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACATTCGGTGGTGGGACCAAGGTGGAGATTAAA
CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGA
ACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAG
GTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGAC
AGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC
TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGA
GAGTGTTGA
SEQ ID No.15轻链(可变+固定)BIWA 8nt；序列在N5KG1Val中，前导序列底下划线
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAA
ATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAACCCTGTCTCTGTCTCCAGGGGAGAGGGCCACCCTGTCC
TGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAATTACATATACTGGCTCCAGCAGAAGCCAGGACAGGCTCCT
AGAATCTTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCGCGCTTCAGTGGCAGT
GGGTCTGGAACCGACTTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCCGTTTAT
TACTGCCTGCAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACATTCGGTGGTGGGACCAAGGTGGAGATTAAA
CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGA
ACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAG
GTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGAC
AGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC
TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGA
GAGTGTTGA
SEQ ID No.16 BIWA4于N5KG1Val中
CTGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCG
CTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGT
TCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTT
TACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGGGTCGCGACGTACC
GGGCCCCCCCTCGATTAATTAATCGAGCTACTAGCTTTGCTTCTCAATTTCTTATTTGCATAA
TGAGAAAAAAAGGAAAATTAATTTTAACACCAATTCAGTAGTTGATTGAGCAAATGCGTTGCC
AAAAAGGATGCTTTAGAGACAGTGTTCTCTGCACAGATAAGGACAAACATTATTCAGAGGGAG
TACCCAGAGCTGAGACTCCTAAGCCAGTGAGTGGCACAGCATTCTAGGGAGAAATATGCTTGT
CATCACCGAAGCCTGATTCCGTAGAGCCACACCTTGGTAAGGGCCAATCTGCTCACACAGGAT
AGAGAGGGCAGGAGCCAGGGCAGAGCATATAAGGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCCTCACATTT
GCTTCTGACATAGTTGTGCCAGCATGGAGGAATCGATCCTCCATGCTTGAACAAGATGGATTG
CACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACA
ATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTC
AAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGTAAGTGCGGCCGCTCTAGGCCTCCAA
AAAAGCCTCCTCACTACTTCTGGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTGCATAAA
TAAAAAAAATTAGTCAGCCATGCATGGGGCGGAGAATGGGCGGAACTGGGCGGAGTTAGGGGC
GGGATGGGCGGAGTTAGGGGCGGGACTATGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATA
CTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCTGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATG
CTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCCTAACTGACACACATTC
CACAGAATTAATTCCCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCA
TATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGAC
CCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCAT
TGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCAT
ATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAG
TACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACC
ATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTT
CCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTT
CCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAG
GTCTATATAAGCAGAGCTGGGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCACAGATCT
CTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGATACCACC
GGAGAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAACCCTGTCTCTGTCTCCAGGGGAGAGGGCCACC
CTGTCCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAATTACATATACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAG
GCTCCTAGACTCTTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCGCGCTTCAGT
GGCAGTGGGTCTGGAACCGACTTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCC
GTTTATTACTGCCTGCAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACATTCGGTGGTGGGACCAAGGTGGAG
ATTAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAA
TCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAG
TGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGC
AAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC
AAAGTCTACGCCTGCGAAGTCAC
CCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGAATTCAGAT
CCGTTAACGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGGCCGTGATATCTACGT
ATGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCC
TTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATC
GCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGA
GGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAACCAGCTGGGAC
TAGTAGCTTTGCTTCTCAATTTCTTATTTGCATAATGAGAAAAAAAGGAAAATTAATTTTAAC
ACCAATTCAGTAGTTGATTGAGCAAATGCGTTGCCAAAAAGGATGCTTTAGAGACAGTGTTCT
CTGCACAGATAAGGACAAACATTATTCAGAGGGAGTACCCAGAGCTGAGACTCCTAAGCCAGT
GAGTGGCACAGCATTCTAGGGAGAAATATGCTTGTCATCACCGAAGCCTGATTCCGTAGAGCC
ACACCTTGGTAAGGGCCAATCTGCTCACACAGGATAGAGAGGGCAGGAGCCAGGGCAGAGCAT
ATAAGGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCCTCACATTTGCTTCTGACATAGTTGTGTTGGGAGCTT
GGATAGCTTGGACAGCTCAGGGCTGCGATTTCGCGCCAAACTTGACGGCAATCCTAGCGTGAA
GGCTGGTAGGATTTTATCCCCGCTGCCATCATGGTTCGACCATTGAACTGCATCGTCGCCGTG
TCCCAAAATATGGGGATTGGCAAGAACGGAGACCTACCCTGGCCTCCGCTCAGGAACGAGTTC
AAGTACTTCCAAAGAATGACCACAACCTCTTCAGTGGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATG
GGTAGGAAAACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATA
GTTCTCAGTAGAGAACTCAAAGAACCACCACGAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTTTGGAT
GATGCCTTAAGACTTATTGAACAACCGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACATGGTTTGGATAGTC
GGAGGCAGTTCTGTTTACCAGGAAGCCATGAATCAACCAGGCCACCTTAGACTCTTTGTGACA
AGGATCATGCAGGAATTTGAAAGTGACACGTTTTTCCCAGAAATTGATTTGGGGAAATATAAA
CTTCTCCCAGAATACCCAGGCGTCCTCTCTGAGGTCCAGGAGGAAAAAGGCATCAAGTATAAG
TTTGAAGTCTACGAGAAGAAAGACTAACAGGAAGATGCTTTCAAGTTCTCTGCTCCCCTCCTA
AAGCTATGCATTTTTATAAGACCATGGGACTTTTGCTGGCTTTAGATCAGCCTCGACTGTGCC
TTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGC
CACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCA
TTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAG
GCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAACCAGCTGGGGCTCGAAGCGGCCGCTCCGGATA
TGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGT
ACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA
TGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTC
CAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTC
CAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGG
TCTATATAAGCAGAGCTGGGTACGTCCTCACATTCAGTGATCAGCACTGAACACAGACCCGTC
GACATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAA
GTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTAAGACTCTCCTGT
GCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGGCTCCGGGGAAG
GGGCTGGAGTGGGTCTCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTTACACCTACTATCTAGACAGTATA
AAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAAATGAACAGT
CTGAGGGCTGAGGACACGGCCGT
GTATTACTGTGCAAGACAGGGGTTGGACTACTGGGGTCGAGGAACCTTAGTCACCGTCTCCTC
AGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGG
CACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAA
CTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTA
CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAA
CGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAA
AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTT
CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGT
GGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA
TAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCT
CACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGC
CCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGT
GTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGT
CAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAA
CTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCAC
CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT
GCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGGATCCGTTAACGG
TTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGGCCGTGATATCTACGTATGATCAGCC
TCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACC
CTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTG
AGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAA
GACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAACCAGCTGGGGCTCGACAGCGC
TGCGATCGCCTCGAGGCCGCTACTAACTCTCTCCTCCCTCCTTTTTCCTGCAGGACGAGGCAG
CGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTG
AAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACC
TTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATC
CGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGG
AAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAAC
TGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATG
CCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGC
TGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTG
GCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCA
TCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGA
CCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTT
GGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCT
GGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAG
CATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACT
CATCAATCTATCTTATCATGTCTGGATCGCGGCCGGCCGCACCGCGGTGGAGCTTTAATTAAG
GCGCGCCAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTCGAGCTTGGCGTAATCATG
GTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAA
ATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGG
GTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGG
GAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTA
TTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAG
CGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAA
AGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGT
TTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGC
GAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTC
CTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGC
TTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCT
GTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGT
CCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAG
CGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAA
GGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCT
CTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTA
CGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGT
GGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGA
TCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTG
ACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCA
TAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCA
GTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGC
CAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTA
ATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCA
TTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCC
AACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTC
CTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGC
ATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCA
AGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATA
ATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAA
AACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACT
GATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATG
CCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAAT
ATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGA
AAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACA
SEQ ID No.17 pAD-CMV1，克隆位点加粗
TCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTT
CCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAAT
GACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGC
CCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGC
CTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTAT
TACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCT
CCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTC
CGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAG
AGAACCCACTGCTTAACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTTCTGCAGGTCGAC
ATCGATGGATCCGGTACCTCGAGCGCGAATTCTCTAGAGGATCTTTGTGAAGGAACCTTACTTCTGTGGTGTGAC
ATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAAGCTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAA
ACTACTGATTCTAATTGTTTGTGTATTTTAGATTCCAACCTATGGAACTGATGAATGGGAGCAGTGGTGGAATGC
CTTTAATGAGGAAAACCTGTTTTGCTCAGAAGAAATGCCATCTAGTGATGATGAGGCTACTGCTGACTCTCAACA
TTCTACTCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAGACCCCAAGGACTTTCCTTCAGAATTGCTAAGTTTTTTGAG
TCATGCTGTGTTTAGTAATAGAACTCTTGCTTGCTTTGCTATTTACACCACAAAGGAAAAAGCTGCACTGCTATA
CAAGAAAATTATGGAAAAATATTTGATGTATAGTGCCTTGACTAGAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAG
AGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTG
TTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTT
TTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCAATTCTGAGAAAC
TAGCCTTAAAGACAGACAGCTTTGTTCTAGTCAGCCAGGCAAGCATATGTAAATAAAGTTCCTCAGGGAACTGAG
GTTAAAAGATGTATCCTGGACCTGCCAGACCTGGCCATTCACGTAAACAGAAGATTCCGCCTCAAGTTCCGGTTA
ACAACAGGAGGCAACGAGATCTCAAATCTATTACTTCTAATCGGGTAATTAAAACCTTTCAACTAAAACACGGAC
CCACGGATGTCACCCACTTTTCCTTCCCCGGCTCCGCCCTTCTCAGTACTCCCCACCATTAGGCTCGCTACTCCA
CCTCCACTTCCGGGCGCGACACCCACGTGCCCTCTCCCACCCGACGCTAACCCCGCCCCTGCCCGTCTGACCCCG
CCCACCACCTGGCCCCGCCCCGTTGAGGACAGAAGAAACCCCGGGCAGCCGCAGCCAAGGCGGACGGGTAGACGC
TGGGGGCGCTGAGGAGTCGTCCTCTACCTTCTCTGCTGGCTCGGTGGGGGACGCGGTGGATCTCAGGCTTCCGGA
AGACTGGAAGAACCGGCTCAGAACCGCTTGTCTCCGCGGGGCTTGGGCGGCGGAAGAATGGCCGCTAGACGCGGA
CTTGGTGCGAGGCATCGCAGGATGCAGAAGAGCAAGCCCGCCGGGAGCGCGCGGCTGTACTACCCCGCGCCTGGA
GCGGCCACGCCGGACTGGGCGGGGCCGGCCTGGTGGAGGCGGAGTCTGACCTCGTGGAGGCGGGGCCTCTGATGT
TCAAATAGGATGCTAGGCTTGTTGAGGCGTGGCCTCCGATTCACAAGTGGGAAGCAGCGCCGGGCGACTGCAATT
TCGCGCCAAACTTGGGGGAAGCACAGCGTACAGGCTGCCTAGGTGATCGCTGCTGCTGTCATGGTTCGACCGCTG
AACTGCATCGTCGCCGTGTCCCAGAATATGGGCATCGGCAAGAACGGAGACCTTCCCTGGCCAATGCTCAGGTAC
TGGCTGGATTGGGTTAGGGAAACCGAGGCGGTTCGCTGAATCGGGTCGAGCACTTGGCGGAGACGCGCGGGCCAA
CTACTTAGGGACAGTCATGAGGGGTAGGCCCGCCGGCTGCTGCCCTTGCCCATGCCCGCGGTGATCCCCATGCTG
TGCCAGCCTTTGCCCAGAGGCGCTCTAGCTGGGAGCAAAGTCCGGTCACTGGGCAGCACCACCCCCCGGACTTGC
ATGGGTAGCCGCTGAGATGGAGCCTGAGCACACGTGACAGGGTCCCTGTTAACGCAGTGTTTCTCTAACTTTCAG
GAACGAGTTCAAGTACTTCCAAAGAATGACCACCACCTCCTCAGTGGAAGGTAAACAGAACCTGGTGATTATGGG
CCGGAAAACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATAGTTCTCAGTAGAGA
GCTCAAGGAACCACCACAAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTCTGGACCATGCCTTAAAACTTATTGAACAACC
AGAGTTAGCAGATAAAGTGGACATGGTTTGGATAGTTGGAGGCAGTTCCGTTTACAAGGAAGCCATGAATCAGCC
AGGCCATCTCAGACTCTTTGTGACAAGGATCATGCAGGAATTTGAAAGTGACACGTTCTTCCCAGAAATTGATTT
GGAGAAATATAAACTTCTCCCAGAGTACCCAGGGGTCCTTTCTGAAGTCCAGGAGGAAAAAGGVSTCAAGTATAA
ATTTGAAGTCTATGAGAAGAAAGGCTAACAGAAAGATACTTGCTGATTGACTTCAAGTTCTACTGCTTTCCTCCT
AAAATTATGCATTTTTACAAGACCATGGGACTTGTGTTGGCTTTAGATCCTGTGCATCCTGGGCAACTGTTGTAC
TCTAAGCCACTCCCCAAAGTCATGCCCCAGCCCCTGTATAATTCTAAACAATTAGAATTATTTTCATTTTCATTA
GTCTAACCAGGTTATATTAAATATACTTTAAGAAACACCATTTGCCATAAAGTTCTCAATGCCCCTCCCATGCAG
CCTCAAGTGGCTCCCCAGCAGATGCATAGGGTAGTGTGTGTACAAGAGACCCCAAAGACATAGAGCCCCTGAGAG
CATGAGCTGATATGGGGGCTCATAGAGATAGGAGCTAGATGAATAAGTACAAAGGGCAGAAATGGGTTTTAACCA
GCAGAGCTAGAACTCAGACTTTAAAGAAAATTAGATCAAAGTAGAGACTGAATTATTCTGCACATCAGACTCTGA
GCAGAGTTCTGTTCACTCAGACAGAAAATGGGTAAATTGAGAGCTGGCTCCATTGTGCTCCTTAGAGATGGGAGC
AGGTGGAGGATTATATAAGGTCTGGAACATTTAACTTCTCCGTTTCTCATCTTCAGTGAGATTCCAAGGGATACT
ACAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGC
ATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATG
CATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCC
CATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGT
AGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAAGCTAATTCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCC
CTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGC
GCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGG
GCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGT
AGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTG
TTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCC
TATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCA
GGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCG
CTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGT
GTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAA
GATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGT
TTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATT
GACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACA
GAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCG
GCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTA
ACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTA
GCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGAC
TGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAA
TCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTA
GTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTG
ATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTT
AAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGA
GCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAA
ACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACT
GGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCT
GTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTT
ACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAG
CCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCC
GAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGG
GGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCG
TCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCC
SEQ ID No.18 pAD-CMV19，克隆位点加粗
TCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTT
CCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAAT
GACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGC
CCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGC
CTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTAT
TACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCT
CCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTC
CGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG
TCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGG
CCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTCAGGTAAGTACCGCCTATAGAGAAGACTCTTG
GGTTTCTGATAGGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGCTTAACTGGC
TTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTTCTGCAGGTCGACATCGATGGATCCGGTACCTCG
AGCGCGAATTCTCTAGAGATATCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATT
TCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCT
GGATCAATTCTGAAAAACTAGCCTTAAAGACAGACAGCTTTGTTCTAGTCAGCCAGGCAAGCATATGTAAATAAA
GTTCCTCAGGGAACTGAGGTTAAAAGATGTATCCTGGACCTGCCAGACCTGGCCATTCACGTAAACAGAAGATTC
CGCCTCAAGTTCCGGTTAACAACAGGAGGCAACGAGATCTCAAATCTATTACTTCTAATCGGGTAATTAAAACCT
TTCAACTAAAACACGGACCCACGGATGTCACCCACTTTTCCTTCCCCGGCTCCGCCCTTCTCAGTACTCCCCACC
ATTAGGCTCGCTACTCCACCTCCACTTCCGGGCGCGACACCCACGTGCCCTCTCCCACCCGACGCTAACCCCGCC
CCTGCCCGTCTGACCCCGCCCACCACCTGGCCCCGCCCCGTTGAGGACAGAAGAAACCCCGGGCAGCCGCAGCCA
AGGCGGACGGGTAGACGCTGGGGGCGCTGAGGAGTCGTCCTCTACCTTCTCTGCTGGCTCGGTGGGGGACGCGGT
GGATCTCAGGCTTCCGGAAGACTGGAAGAACCGGCTCAGAACCGCTTGTCTCCGCGGGGCTTGGGCGGCGGAAGA
ATGGCCGCTAGACGCGGACTTGGTGCGAGGCATCGCAGGATGCAGAAGAGCAAGCCCGCCGGGAGCGCGCGGCTG
TACTACCCCGCGCCTGGAGCGGCCACGCCGGACTGGGCGGGGCCGGCCTGGTGGAGGCGGAGTCTGACCTCGTGG
AGGCGGGGCCTCTGATGTTCAAATAGGATGCTAGGCTTGTTGAGGCGTGGCCTCCGATTCACAAGTGGGAAGCAG
CGCCGGGCGACTGCAATTTCGCGCCAAACTTGGGGGAAGCACAGCGTACAGGCTGCCTAGGTGATCGCTGCTGCT
GTCATGGTTCGACCGCTGAACTGCATCGTCGCCGTGTCCCAGAATATGGGCATCGGCAAGAACGGAGACCTTCCC
TGGCCAATGCTCAGGTACTGGCTGGATTGGGTTAGGGAAACCGAGGCGGTTCGCTGAATCGGGTCGAGCACTTGG
CGGAGACGCGCGGGCCAACTACTTAGGGACAGTCATGAGGGGTAGGCCCGCCGGCTGCTGCCCTTGCCCATGCCC
GCGGTGATCCCCATGCTGTGCCAGCCTTTGCCCAGAGGCGCTCTAGCTGGGAGCAAAGTCCGGTCACTGGGCAGC
ACCACCCCCCGGACTTGCATGGGTAGCCGCTGAGATGGAGCCTGAGCACACGTGACAGGGTCCCTGTTAACGCAG
TGTTTCTCTAACTTTCAGGAACGAGTTCAAGTACTTCCAAAGAATGACCACCACCTCCTCAGTGGAAGGTAAACA
GAACCTGGTGATTATGGGCCGGAAAACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAA
TATAGTTCTCAGTAGAGAGCTCAAGGAACCACCACAAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTCTGGACCATGCCTT
AAAACTTATTGAACAACCAGAGTTAGCAGATAAAGTGGACATGGTTTGGATAGTTGGAGGCAGTTCCGTTTACAA
GGAAGCCATGAATCAGCCAGGCCATCTCAGACTCTTTGTGACAAGGATCATGCAGGAATTTGAAAGTGACACGTT
CTTCCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTCCCAGAGTACCCAGGGGTCCTTTCTGAAGTCCAGGAGGA
AAAAGGCATCAAGTATAAATTTGAAGTCTATGAGAAGAAAGGCTAACAGAAAGATACTTGCTGATTGACTTCAAG
TTCTACTGCTTTCCTCCTAAAATTATGCATTTTTACAAGACCATGGGACTTGTGTTGGCTTTAGATCCTGTGCAT
CCTGGGCAACTGTTGTACTCTAAGCCACTCCCCAAAGTCATGCCCCAGCCCCTGTATAATTCTAAACAATTAGAA
TTATTTTCATTTTCATTAGTCTAACCAGGTTATATTAAATATACTTTAAGAAACACCATTTGCCATAAAGTTCTC
AATGCCCCTCCCATGCAGCCTCAAGTGGCTCCCCAGCAGATGCATAGGGTAGTGTGTGTACAAGAGACCCCAAAG
ACATAGAGCCCCTGAGAGCATGAGCTGATATGGGGGCTCATAGAGATAGGAGCTAGATGAATAAGTACAAAGGGC
AGAAATGGGTTTTAACCAGCAGAGCTAGAACTCAGACTTTAAAGAAAATTAGATCAAAGTAGAGACTGAATTATT
CTGCACATCAGACTCTGAGCAGAGTTCTGTTCACTCAGACAGAAAATGGGTAAATTGAGAGCTGGCTCCATTGTG
CTCCTTAGAGATGGGAGCAGGTGGAGGATTATATAAGGTCTGGAACATTTAACTTCTCCGTTTCTCATCTTCAGT
GAGATTCCAAGGGATACTACAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCA
GGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGC
AGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTA
ACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCGCCT
CTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAAGCTAATTCAGCCTGAA
TGGCGAATGGGAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTT
TAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCC
AGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGA
TGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCT
AAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAA
GGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCG
CCGCTACAGGGCGCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATA
CATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATG
AGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAA
ACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGC
GGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGC
GCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTT
GAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACC
ATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCAC
AACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGT
GACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCC
CGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGC
TGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGT
AAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCT
GAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTA
AAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGT
GAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGC
GTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACT
CTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGC
CACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGT
GGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACG
GGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGA
GAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGC
ACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGT
CGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCAGCTGC
实例3临床研究1170.1
1.术语缩写及定义列表
ADCC 抗体依赖的细胞-介导的胞毒作用
AE 不良作用
ALT 丙氨酸氨基转移酶
a.p. 在前在后
AP 碱性磷酸酶
AST 天冬氨酸氨基转移酶
AUC 在浓度-时间曲线下的面积
Bq 克瑞尔(Becquerel)，放射活性克瑞尔的
SI单位(1Bq＝一次衰变/秒)
BSA 牛血清白蛋白
CD44v6 CD44变体同型(isoform)v6
CDS 共同药物安全性(Corporate Drug Safty)
cGy 对放射性活性的厘戈瑞(Centi Gray)检测
CHO 中国仓鼠卵巢细胞
Ci 居里；放射活性单位；1居里＝37×109衰变/秒
＝37GBq
CL 总的机体清除率
cMAb 嵌合型单克隆抗体
cm 厘米
Cmax 所观察到的最大药物浓度
cpm 每分钟的计数
CRF 病例报告/记录表
CT(scan) 电脑断层照相术
CTC 一般毒性标准
CV 变异系数
DLT 毒性限制(Dose Limiting Toxicity)剂量
ECG 心电图
ELISA 酶联免疫吸附试验
ENT 耳鼻喉
f 雌性
FDA 食品及药物检验局
g 克
GBq 放射活性拾亿克瑞尔(Giga Becquerel)的SI单位
(1GBq＝109衰变/秒)
GCP 良好临床实践
GGT γ谷氨酰基转肽酶
GMP 良利制造实践
Gy 戈瑞(Gray)
HAHA 人类抗-人类抗体
Hb 血红蛋白
HER2 人类上皮生长因子受体2
hMAb 人源化的单克隆抗体
HNSCC 头及颈部鳞状细胞癌
HPLC 高性能液相层析
hr/h 小时
hrs 小时
Ht 血细胞比容
131I 碘-131(半衰期8.05天)
ICH 协调国际委员会(International Committee on
harmonisation)
ID 注射剂量
IEC 独立道德委员会
IgG 免疫球蛋白G
INN 国际非专读名称(international Non proprietary
Name)
IRB 研究院总览版
ITT 意图治疗(Intent-To-Treat)
i.v. 静脉内
KeV 仟电子伏特
l/L 升
m 雄性
m2 平方米
MAb 单克隆抗体
MAG2GABA-TFP 巯基乙酰基甘氨酰基甘氨酰基-γ-氨基丁酸-四
氟酚酯(MAG2GABA-TFP)，螯合剂用于将186Re
偶联至单克隆抗体(进一步的方法)
MAG3 巯基乙酰基三甘氨酸，螯合剂用于将99mTc及186Re
偶联至单克隆抗体
MBq 放射活性的SI单位；百万(Mega)克瑞尔(1MBq＝106
衰变/秒)
mCi 毫居里；放射活性单位；1毫居里＝37百万衰变/
秒＝37MBq
MCV 平均红细胞容积
mGy 毫戈瑞
μg 微克
mg 毫克
min 分钟
ml/mL 毫升
mMAb 小鼠单克隆抗体
mmHg 毫米汞柱
μmol 微摩尔
mmol 毫摩尔
MRI 磁共振显影
MRT 平均滞留时间
mSv 毫西弗特(Sievert)
MTD 最大耐受剂量
NA/n.a. 未应用
NCI US国家癌症研究所
ND 未做
ng 纳克
No/N 编号
nos 未特示
NSCLC 非小细胞肺癌
n.y.r. 还未回收
p.a. 在后在前
PBS 磷酸盐缓冲的盐溶液
p.i. 输注后
p.o. 经口
PP 每个策略
Pt./Pat 病人
Pts. 病人
186Re 铼-186，放射核种；半衰期为3.7天(β-粒子的组
织穿透约1.2毫米)
Recov. 回收的
RES 网状内皮系统
RIS 放射免疫闪烁照相术
RIT 放射免疫疗法
ROI 目的区域
SAE 严重的不良作用
SCC 鳞状细胞癌
sCD44v6 可溶性CD44v6
SD 稳定的疾病
sGOT 血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶
sGPT 血清谷氨酸丙酮酸转氨酶
SOC 系统器官类别
SOP 标准操作步骤
SPECT 单一光子发射计算机断层照相法
t1/2 消除半衰期
99mTc 锝99m(半衰期6小时)
TLC 薄层层析
Tmax 可观察到最大药物浓度的时间点
TNM 将肿瘤分阶段的肿瘤淋巴结转移系统
TSH 甲状腺刺激激素
UICC 抗癌的国际联盟
unk 未知
Vss 在稳态条件下分布的表观体积
Vz 在末期分布的表达体积
WBC 白细胞计数
WHO 世界卫生组织
2.研究目的
2.1一般目标/临床目的
本研究的一般目标是评估静脉内给药99mTc及186Re-标记的hMAb BIWA4的安全性及耐受力，以证实99mTc-标记的hMAb BIWA 4在肿瘤中的优先累积，以确定186Re-标记的hMAb BIWA 4的最大耐受放射剂量，以及对第II期的发展提出安全剂量。为了到达此目标，研究分成二部分：
A部分：
目的：
·为确定99mTc-标记的hMAb BIWA 4静脉内给药的单一输注，在有头及颈进展的鳞状细胞癌病人中的安全性及耐受力。
·为确定99mTc-标记的hMAb BIWA 4四种BIWA 4剂量水平单一输注在有头及颈进展的鳞状细胞癌病人中的生物分布。
·为研究99mTc-标记的hMAb BIWA4单一输注的药物动力学。
B部分：
目的：
·为确定186Re-标记的hMAb BIWA 4的定性及定量毒性作用，以及研究毒性副作用的可预见性，作用开始，作用期，强度，可逆性及与剂量的相互关系。
·为确定186Re-标记的hMAb BIWA 4在头及颈癌病人的最大耐受放射剂量。
·为了研究静脉内给药186Re-标记的hMAb BIWA 4在头及颈鳞状细胞癌病人的药物代谢动力学。
·第二目的是确定186Re-标记的hMAb BIWA4的初步治疗作用。
在该策略中所列的下列目的，在试验进行中无法达到。连接子螯合物巯基乙酰基三甘氨酸(MAG3)用来将99mTc及186Re偶联至单克隆抗体，此程序的发展被中断，因此试验结束。以BIWA 4的进一步发展可继续，利用连接子巯基乙酰基甘氨酰基甘氨酰基-γ-氨基丁酸四氟酚酯(MAG2GABA-TFP)。
·首先鉴定单一剂量治疗的MTD，再加入更多病人以定义出MTD，供186Re-
标记的hMAb BIWA4的第二次治疗参考。
·为186Re-标记的hMAb BIWA 4的第一次及继续输注提出安全剂量，以为进一步研究。
·为了对剂量预定表得出最初结果以供重复给药。
2.2初步参数
·安全性：临床实验室试验，人类-抗人类-抗体(HAHA)评估，生命体征检测及不良作用。
·效力：活检得到生物分布数据(仅A部分)及放射免疫闪烁断层照相法(A及B部分包括试验B部分的剂量法)。
·药物动力学结果。
2.3二次参数
研究中的二次参数是肿瘤应答(仅B部分)。
3.研究计划
3.1整体研究设计及计划-说明
此试验分二部分进行。A部分评估冷的BIWA 4最佳剂量，及定量出肿瘤的吸收，而B部分研究186Re-BIWA 4的最大耐受剂量。
3.1.1A部分：
此临床试验部分是不受控的，提高剂量的连续组别研究。其经设计可在99mTc-hMAb BIWA 4单一输注的安全性及耐受力上提供最初数据，以研究生物分布的型式及水平，并确定hMAb BIWA4在有头及颈部癌症病人中的药物动力学概况。在此研究的A部分中采用三种hMAb BIWA蛋白质剂量，每剂量水平有三位病人计划经受处理。
病人由耳鼻喉科常规检查，以确定肿瘤程度。此包括身体检查，电脑断层照相法(CT)或头及颈部的MRI扫描，及广视野膀胱镜检(视所需地)。在这些步骤中，组织样品，疑似肿瘤，取出并检查有否鳞状细胞癌的出现。依据这些检查结果，病人决定是否进行手术，包括颈部解剖。
注入经放射标记的抗体，观察病人有否发生不良反应。手术前，而输注后(p.i.)21小时进行放射免疫闪烁照相扫描。在输注入具放射性标记的hMAb BIWA4 48小时后进行手术。病理医师检查颈部解剖样品以确定确实的肿瘤负荷。再者，也检测在手术待检品中，来自肿瘤位置及正常组织的活组织待检品中99mTc的量。以免疫组织化学技术检查肿瘤位置及肿瘤浸润结节是否有CD44v6抗原的存在。前三位病人给药2毫克hMAb BIWA 4，其标记有20毫居里99mTc，并混合以23毫克未标记的hMAb BIWA 4。第二组三个可评估的病人给药2毫克hMAb BIWA 4，标记以20毫居里99mTc并混合以48毫克未标记的hMAb BIWA 4，而第三组给药2毫克标记的抗体，混合以98毫克未标记的抗体。
在特示的时间点上进行药物动力学评估。
3.1.2.B部分：
此临床试验部分是一个开放式未受控的剂量阶梯式扩大研究。其经设计可评估186Re-标记的hMAb BIWA 4的安全性及耐受力，以决定静脉内给药186Re-标记的hMAb BIWA 4的最大耐受剂量(MTD)，并可决定186Re-标记的hMAb BIWA4在头及颈部癌病人中的初步治疗作用，而此病人无治愈选择可采用。此外，也评估186Re-标记的hMAb BIWA 4的药物动力学概况。
进入此试验部分的所有病人均接受hMAb BIWA 4，其剂量的选用以A部分的结果为依据。hMAb BIWA 4标记以阶梯式扩大剂量的186Re。在较低剂量水平下(所观察到的毒性不超过第1级)二位病人进入过剂量组(per dosegroup)，而在较高水平时(≥2级毒性)最少三位病人进入过剂量组。所有病人均评估以决定所给药的hMAb BIWA 4的安全性。
病人由耳鼻喉科医师例常地检查，以决定肿瘤程度。此包括身体检查及肿瘤位置处的CT或MRI扫描。
186Re-标记的抗体以阶梯扩大方式的放射剂量注入：在第一剂量组的病人接受20毫居里/米2的照射剂量，而后在接下来的剂量组病人，以10毫居里/米2的放大比例扩大，直到达到MTD为止。观察病人是否发生不良作用。进行放射免疫闪烁照相扫描。
3.1.3在各次访视时的研究步骤
3.1.3.1.访视程序
a)筛选式访视
在进入研究前，各病人依适任而筛选。记录人口统计学及医学相关病史，也记录伴随的治疗，并进行一般身体检查，也测量体重。决定出Karnofsky性能分数。必需取得书面通知同意书。对有可能怀孕妇女需作怀孕测试。进行12-导联心电图(ECG)，也进行血液及尿液安全性实验室评估。也采取HAHA-测试的血样。进行胸部X-射线照射，及完全疾病评估(CT/MRI，耳鼻喉[ENT]检查)。
在此访视结束时，评估所需检查的结果，进行纳入及排除标准的证实及手术的安排(仅A部分)。
b)访视2：研究天数1-7
A部分及B部分
在第一天研究时，此不超过筛选访视后3周，病人要住院。在筛选访视时未做的所有必要的基础实验室评估均要做，并在输注前予以评估，且要符合适任条件。测量体重。所有伴随的治疗必需记录。在书面通知同意书签名后，每一个不良作用必需记录在病人档案及病例病历报告表(CRF)中。
在治疗当日，给药抗体前先采血样以记录药物动力学(包括可溶性CD44v6的评估)及生命体征。在第一个24小时间，收集0-4小时，4-8小时，8-12小时及12-24小时的尿液，再以24小时为间隔直到输注后48及96小时收集尿液，分别用于A及B部分。
抗体在核子医学部或医院的指定病房中给药。抗体的给药尽可能接近周边上肢末稍静脉。在所有例子中，输注历5分钟，在10毫升盐水的冲洗后，经由自由流通的管线。为了取得可再现的药物动力学结果，必需使用注射泵。因此以0.9％NaCl稀释体积至20毫升是必要的。此抗体输注后继以10毫升盐水的冲洗。任何疑似的溢出均记录在CRT中，且病人要照相。
备好有复苏设备，抗组织胺，皮质类固醇及肾上腺素的急救物品以对抗可能的过敏性反应。每天要记录不良作用及伴随治疗的变化。
A部分：
在p.i.10，60及120分钟时记录生命体征。输注后21，48及144小时，收集血样以分析安全性及可溶性CD44v6。
在输注结束时及在输注结束后5，10，30分钟，及1，2，4，16，21，48，72小时，及第7天(144小时p.i.，包括血清样品用于HAHA及可溶性CD44v6的评估)采血以行药物动力学评估。
行药物动力学研究的尿液，在第一个24小时中的0-4小时，4-8小时，8-12小时及12-24小时，及24小时直到48小时p.i.时收集。
在输注后直接及在之后21小时，进行全身闪烁照相显影。输注后21小时，除了全身显影，也做头及颈部区域的单一光子发射计算机断层照相(SPECT)及全面显影。
病人在p.i.48小时时手术，并留院做术后照料。
在第7天(144小时p.i.)收集安全性尿液样品。
每天记录不良反应及伴随治疗的改变。
B部分：
在输注后10，60，120及240分钟记录生命体征。在输注后21，48及144小时收集血样以行安全性及可溶性CD44v6分析。收集输注后144小时的血样进行HAHA评估。在144小时p.i.也收集尿液以用于安全性分析。
在输注结束及输注结束后5及30分钟及1，2，4，16，21，48及72小时，及第7天(144小时p.i.)采血以行药物动力学分析。原先在10分钟时计划的样品省略为修正案1。
在第一个24小时的0-4小时，4-8小时，8-12小时及12-24小时及在24小时直到96小时p.i.，收集尿液行药物动力学分析。
在21、48、72及144小时p.i.直接进行全身闪烁照相显影，可任选在输注后二周进行，此若考虑统计学许可时而言。
在21、48(视所需地)、72及144小时p.i.，及视所需二周p.i.进行头及颈部区域的平面显影，此若考虑统计学许可时而言。
只在输注后72小时进行SPECT显影。
每天记录不良反应及伴随治疗的改变。
三天后允许病人离院。
c)访视3：追踪访视
A部分：
输注后六周，病人看门诊。进行身体检查，收集安全性血液及尿液样品，测量体重及生命体征，并记录不良作用。也得进行药物动力学，HAHA评估及可溶性CD44v6分析的血样。对可能怀孕妇女需做怀孕测试。记录不良作用的随防结果。也记录伴随治疗的任何变化。
B部分：
病人到门诊每周一次至少六周，以记录不良作用并收集安全性血样。在输注后240小时及336小时采血分析药物动力学。原先计划在p.i.六周的血样省略为修正案1。也记录在伴随治疗中的任何变化。输注后基础的疾病评估要重复进行六周，之后若有指示才进行。(评估在六周后进行而非策略中曾提及的四周)。输注后六周采血分析安全性，HAHA评估及可溶性CD44v6，记录生命体征并测量体重。在此访视中进行身体检查。收集安全性尿液。对有怀孕可能妇女进行验孕。
d)访视4及5：第二次处理(B部分)
如先前策略中所列的第二次处理并不进行，因试验提前结束之故，因联系变化之故。反之，对第一剂186Re-BIWA 4有反应的病人适合第二次给药。其如同第一次给药般进行相同的访视程序。
3.2研究设计的讨论，包括对照组的选用
本研究的目的是评估99mTc-经标记BIWA 4在肿瘤中差别累积(A部分)，以及评估186Re-BIWA4的最大耐受剂量(B部分)，以及在有进展的头及颈部癌症病人中BIWA 4的药物动力学研究(A及B部分)。
如同在肿瘤学这些类型的I期试验型式中的一般实践般，使用开放式设计。在较低放射剂量效价至少有二位病人，而在较高放射剂量效价有三位病人纳入试验的B部分。而发生与药物有关的一般毒性标准(CTC)4级血液学及3级非血液学毒性例子中，此三位病人进一步以个别剂量效价处理(至于进一步给药详情见3.4.4.及3.4.5.段落)。
所给药的BIWA 4剂量依mMAb BIWA 1的先前结果为据，显示出50毫克的剂量在肿瘤组织有高且具选择性的摄取，而非肿瘤组织是低的摄取，及来自试验A部分的结果(也见3.4.4.1.段落)。
所选用的放射活性开始剂量水平，以先前数据为准，可推知20毫居里/米2的剂量是个安全剂量(也见3.4.4.2.)。
所反应的效力标准以及评估耐受力的标准，已针对此病人群体充分建立，且也可在开放设计中评估。
3.3研究群体的选择
3.3.1纳入准则
-组织学证实有头及颈部鳞状细胞癌的病人。
-计划以颈部解剖方法手术的病人(A部分)或：
-有局部和/或区域复发疾病的病人，且无可运用的治疗选择，或远端的转移。肿瘤沉积物必需以临床方式检测，或利用一种或一种以上的放射科技术(CT，MRI，骨骼闪烁照相法)。在较小的肿瘤沉积中已预测RIT更有效，以在最大尺寸中测得的伤处＜3公分的病人为较佳(B部分)。
-病人超过18岁。
-病人小于80岁。
-病人有书面通知同意书。
-病人寿命至少3个月。
-有良好状况的病人：Karnofsky＞60。
3.3.2排除准则
-致命性感染，过敏性体质，器官衰竭(胆红素＞30微摩尔/升和/或肌酸酐＞150微摩尔/升)或根据ECG有近来心肌梗塞的证据或不稳定心绞痛。
-停经前妇女(最后一次月经≤1年，指开始研究前)：
·无手术绝育(子宫切除术，结扎输卵管)及
·无实行生育控制可接受方法(或在研究中未计划要继续者)。生育控制的可接受方法包括口服，植入或注射避孕药。
-在基线上有血清怀孕检测阳性的妇女。
-在纳入研究前4周内进行化学治疗或放射治疗。
-白细胞数目＜3000/毫米3，粒细胞数目＜1500/毫米3或血小板数目＜100,000/毫米3。
-血液学失调症，充血性心力衰竭，支气管哮喘，食物性或接触性过敏，严重的特应性或过敏。
3.3.3从治疗或评估中受试者的排除
3.3.3.1停止受试者处理的准则
若病人发生心博过速(脉博每分钟大于120次)，低血压(血压的收缩压低于100毫米汞柱)，呼吸窘迫，胸痛，或病人无法忍受的任何症状，均要立即停止输注。
3.3.3.2中途退出及取消
受试者在此研究的任何时间时，均可自由地中止其参与。
若病人因为自动消取而自研究中提早离开，则放射性标记的hMAbBIWA4的评估不被视为是可行的。若无法取得适当的追踪资料，此病例被视为非可评估的。任何无法取得适当的追踪资料，此病例被视为非可评估的。任何无法评估的病人均计划要被取代。
若病人自研究早期即中止，则理由应记录在CRF中。若病人无法回来进行输注后采血以决定HAHA或药物动力学，理由也要记录。若病人发生严重的不良反应，则依严重的不良作用(SAE)而定，尽可能接近地追踪研究程序。
3.4处理
3.4.1给药处理
在A部分的病人给药放射活性剂量为20毫居里的99mTc-BIWA 4。对三位病人，各自给药的BIWA 4剂量为25毫克，50毫克或100毫克。药物以单一剂量静脉内给药。
在B部分的病人接受50毫克标记以铼186的BIWA 4。最低放射活性剂量为20毫居里/米2，以10毫居里/米2的剂量效价增加。试验药物以单一剂量于静脉内给药。
3.4.2研究产品的本质
A部分：
物质(INN)： BIWA 4(bivatuzumab)
药学型式： 注射用溶液
Chiffre号码： BIWA4 LOI 99 1D 1A
批号： B981101
来源： Boehringer Ingelheim Pharma KG
单位强度： 5毫克/毫升
每天剂量： 25毫克
使用期： 单一剂
给药路径： 静脉内
剂量学： 输注历5分钟
物质(INN)： BIWA 4(bivatuzumab)
药学型式： 注射用溶液剂
Chiffre号码： BIWA4 LOI 99 1D 1A
批号： B981101
来源： Boehringer Ingelheim Pharma KG
单位强度： 5毫克/毫升
每天剂量： 50毫克
使用期： 单一剂
给药路径： 静脉内
剂量学： 输注历5分钟
物质(INN)： BIWA 4(bivatuzumab)
药学型式： 注射用溶液剂
Chiffre号码： BIWA4 LOI 99 1D 1A
批号： B981101
来源： Boehringer Ingelheim Pharma KG
单位强度： 5毫克/毫升
每天剂量： 100毫克
使用期： 单一剂
给药路径： 静脉内
剂量学： 输注历5分钟
BIWA 4以与99mTc连接的放射性偶联物型式给药。连接分子是MAG3。MAG3购自Mallinckrodt，Petten，The Netherlands。
99mTc经由实验室地方性订货，在此制备放射免疫偶联物(Prof.Dr.vanDongen的实验室，Section Tumor Biology，Department ofOtorhinolaryngology/Head and Neck Surgery，Vrije Universiteit UniversityMedical Center，De Boelelaan 1117，1081 HV Amsterdam，The Netherlands)。
B部分：
物质(INN)： BIWA 4(bivatuzumab)
药学型式： 注射用溶液剂
Chiffre号码： BIWA4 LOI 99 1D 1A
批号： B981101
来源： Boehringer Ingelheim Pharma KG
单位强度： 5毫克/毫升
每天剂量： 50毫克
使用期： 单一剂
给药路径： 静脉内
剂量学： 输注历5分钟
BIWA 4以与186Re连接的放射性偶联物型式给药。连接分子是MAG3。MAG3购自Mallinckrodt，Petten，The Netherlands。
186Re经由实验室地方性订货，在此制备放射免疫偶联物(Prof.Dr.vanDongen的实验室，Section Tumor Biology，Department ofOtorhinolaryngology/Head and Neck Surgery，Vrije Universiteit UniversityMedical Center，De Boelelaan 1117，1081 HV Amsterdam，The Netherlands)。
3.4.2.1试验药物的特性及质量
抗体特性
由hMAb BIWA 4所确认的抗体是一种位于细胞外表面的穿膜糖蛋白，且仅少部分是内化的(＜20％)。进一步分析显示，hMAb BIWA 4可识别由CD44变体外显子v6所编码的表位。已显示该抗原为所有原发性头及颈部肿瘤(n＝54)及为这些肿瘤内的大部分细胞所表达。由颈部解剖待检品来的68个肿瘤浸润的淋巴结中可观察到可比较的表达(R97-2054)。hMAb BIWA 4在人类正常组织中的反应性类型，示于策略的附录III中。发现hMAb BIWA4的反应性基本上限于鳞状上皮。如先前以小鼠单克隆抗体(mMAb)BIWA 1的RIS研究中所证明的，与正常鳞状上皮的反应性并非在肿瘤靶向利用上的一个限制因素，此就肿瘤的摄入而言。
经99mTc或186Re-标记的hMAb BIWA 4的质量控制
抗体依Fritzberg et al.所述的方法(R96-2106：见策略附录IV)标记以99mTc或186Re，其并依Visser et al.(R96-2094)及Van Gog et al.(R96-2111)而修饰之。
以99mTc及186Re放射标记hMAb BIWA 4的步骤，已就所制成偶联物的最终质量而进行了保证。在五个独立的标记实验中，依策略附录IV所述步骤进行，发现与抗体结合的标记物的百分率为96-99％。
在此临床研究中，以薄层层析(TLC)或高性能液相层析(HPLC)评估所制备的各经99mTc或186Re-标记的抗体批次的放射化学纯度，并通过PD-10凝胶管柱，且必须在90％以上才可给药至病人。
在给药后利用有公信的方法检查各经99mTc/186Re标记的抗体批次的免疫反应性部分，且必需在60％以上。简言之，分析基本上依Lindmo et al.(R96-2104)所述的步骤进行。含有CD44v6抗原的UM-SCC 11B细胞(人类喉癌)固定在0.1％戊二醛。六个稀释度，由每管5×106细胞至每管3.1×105细胞，以1％牛血清白蛋白(BSA)在磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中制成。
在管中加入80,000cpm的99mTc-或10,000的186Re-标记的hMAb BIWA4，并在室温下温育一夜。
在最后的样品中，加入过量的未标记的hMAb BIWA4以测定非特异的结合。细胞离心，利用γ计数器测定在团块及在上清液中的放射活性，并计算出结合的及游离态放射标记MAb的百分率(LKB-Wallac 1218CompuGamma)。
数据在经修饰的Lineweaver Burk图中图解分析，再以线性外推至代表无限抗原过量的条件下而确定免疫反应性部分。
若在此结合分析中未达到60％的排除水平，则供输注的制剂应在第二结合分析中再行评估。针对此目的，抗体制剂标以131I。在第二分析中至少一者的免疫反应性部分必须大于60％，使可供评估及可供研究并以下一位病人继续进行。
抗体安全性
在此研究中，以99mTc及186Re放射标记的BIWA 4是一种已十分确定特性的单克隆抗体产品，其由中国仓鼠卵巢(CHO)-细胞培养发酵而产生。并在Good Manufacturing Practice(GMP)条件下确立主细胞图，并针对微生物状况(细菌，真菌，霉浆菌)以及病毒状况(腺病毒，反转录病毒)充分检查。除了内源性反转录病毒为例外(已知其存在于大多数CHO细胞中)，未测及污染物。
依据FDA 1994年“Points to Consider”文件，关于在癌症病人临床I期研究所用的MAb，一种标准化的下游纯化过程，被公认可有效地移去病毒，可应用至BIWA 4的纯化上。在此公认中包括有四种典型病毒(MuLV，PsRV，REO-3，SV 40)。检查浓缩的大团回收物中的反转录病毒效价，以确保接下来的下游纯化过程可适度地移除反转录病毒。移去内毒素的数据是在可接受限度内(≤0.01 EU/毫克)且可运用于大团产物。再者，依据欧洲药典准则的热原性试验已成功地进行。
更详尽地分析用于进一步放射标记的最终hMAb BIWA 4，且证明有高纯度(SDS Page，等电焦距法)，为含最低内毒素水平的无菌溶液(≤0.01 EU/毫克)。对于热原性的试验结果应顺应欧洲药典标准。用于临床前及临床上供应的由制造商来的BIWA4产品质量，由分析结果证明。
以99mTc或186Re放射标记hMAb BIWA 4是由以下部门进行：Otolaryngology and Head & Neck Surgery of the Vrije Universiteit UniversityMedical Center，依据标准操作步骤(SOPs)进行。可保证最终产品的无菌性。在保证流程中测试内毒素的不存在。在University Hospital Nijmegen，对病人给药药物时经放射标记的hMAb BIWA 4以适量在制备后直接于特殊容器中运送至在Nijmegen的研究中心。在化合物标记及给药至病人之间，24小时是许可的。
也见附录16.1.6关于分派各批次至病人。
3.4.2.2包装，标记及供应
BIWA 4由Boehringer Ingelheim The Netherlands供应。其由BoehringerIngelheim，Germany利用GMP制造法制备，纯化过程，且以无菌，无热原溶液(其中含有25毫克hMAb BIWA 4于5毫升等张的PBS，pH 7.2中)型式充填在小瓶内。天然的小瓶标记物的实例以及经标记的抗体均包括在临床试验手册中。
制备一批次共27克hMAb BIWA 4，并充填至小瓶内。在B级证明的Vrije Universiteit University Medical Center，Amsterdam的核子实验室中进行99mTc或186Re的hMAb BIWA4标记。
3.4.2.3贮存条件
未标记的hMAb BIWA 4必须贮于医院药局的有限接近区内以供研究，且在监视温度+2℃和+8℃之间。
3.4.3分配受试者至处理组别的方法
使用非任意方式。病人是依据纳入序列分配至不同的剂量组别。
3.4.4研究中剂量的选择
3.4.4.1 BIWA 4剂量的选择
A部分：
由于hMAb BIWA4之前未曾给药至病人，因此在开始RIT试验前基本上要告知有关其安全性及生物分布。其生物分布可能与用于靶向肿瘤的MAb的剂量非常有关，因此需小心地考虑。在以低亲和力抗-CD44v6 mMAbU36及高亲和力抗CD44v6 mMAb BIWA 1进行的MAb蛋白质剂量阶梯式扩大研究基础上，可预期到最适宜剂量是在25-100毫克范围内，以50毫克对mMAb U36而言是最适宜的。
为了证实此剂量对于hMAb BIWA 4的中等亲和力也是适当的，以及为了在肿瘤摄入的差异性上获得最初资讯，在25，50及100毫克总hMAb BIWA4时评估生物分布，并在这些剂量水平各自处理三位可评估病人。
所有可评估病人接受2毫克hMAb BIWA 4标以20毫居里99mTc的单一静脉内输注，在给药前以放射校正系统检测。计划接受25毫克，50毫克或100毫克的病人，分别接受23毫克，48毫克或98毫克未标记的hMAb BIWA4，加上此2毫克hMAb BIWA4，其标以20毫居里99mTc。
B部分中BIWA4剂量的选择
在理论基础上50毫克的hMAb BIWA 4经估计是最适于发展的。进行此研究的A部分，以证实在三个受试的试量水平下(25毫克，50毫克及100毫克)肿瘤对hMAb BIWA 4的差别性摄入。可预期，肿瘤的摄入(以每公斤注入剂量的百分率表示，％ID/公斤)，且对这三个剂量而言，肿瘤对非肿瘤的摄入比率不会有大的差异。若是如此，用于研究B部分中的hMAb BIWA4剂量为50毫克。然而，若在这些剂量水平间有临床上相关的差异，即其较偏爱这一水平甚于其它水平，则应选择有最佳生物分布型式的这一剂量水平。
在此例中，临床上相关的差异可定义为肿瘤(肿瘤摄入的平均值)对骨髓摄入比例(骨髓摄入平均值＝细胞部分及上清液)超过50％的差异。
最后依据A部分的结果，所选择的剂量为50毫克hMAb BIWA4。
3.4.4.2照射起始剂量的选择
B部分：
在研究A部分中的选择的hMAb BIWA 4剂量，标记以阶梯式扩大的186Re剂量。
有报告指出186Re-经标记的小鼠类MAb NR-LU-10的最大耐受剂量为90毫居里/米2，此对厉害地预处理病人而言，而剂量-限制的骨髓遏止作用可在120毫居里/米2观察到。对嵌合型MAb NR-LU-13而言，而识别相同的抗原为NR-LU-10，可逆的骨髓遏止作用发生在60毫居里/米2。在以cMAb U36进行的研究中，在Vrije Universiteit University Medical Center中进行，剂量-限制的骨髓遏止作用可在41毫居里/米2时观察到。
基于上述结果，以186Re-标记的hMAb BIWA 4型式给药20毫居里/米2的放射剂量，可视为是安全的起始剂量。
剂量以10毫居里/米2的增加幅度阶梯式扩大。在较低剂量水平时纳入二个可评估病人。当依CTC可观察到2级以上的药物相关毒性时，每个剂量水平处理最少三位病人。
在使病人进入下一个较高剂量水平前必需要确定的是在进行的剂量水平时不会经历到剂量限制毒性(DLT)，定义为：药物-相关的CTC 3级非血液学毒性，或药物-相关的CTC 4级血液学毒性，排除无适度止吐剂治疗的恶心及呕吐。就此目的而言，在此进行的剂量水平时对所有病人应有足够长时间的观察，以确定有可能诱生的毒性是可逆的。
当在进行的剂量水平有一位病人经历到DLT时，则在该剂量水平时治疗的病人数目要增加至总数最多共6位病人。当6人中有1人经历到DLT时，则剂量阶梯式扩大至下一水平。当二位或二位以上病人经历到DLT时，则下一较低的剂量水平扩大(若先前未做)至所有6位病人以确立MTD，及用于II期的安全建议剂量。
原先已有计划，即在该剂量水平有可接受毒性时(不到二位病人有DLT)，可加入额外的病人不但接受此剂量，还有阶梯式的较低的第二剂量。因为连接子的改变，此计划没有继续进行。MAG3将由MAG2GABA-TFP替代，此为可比得上的连接子，但有更方便的连接步骤。以MAG3进行的本发展计划已完成。
另外对186Re-BIWA4第一次给药有反应且可耐受的病人，是适合50毫居里/米2 186Re-BIWA4的第二剂给药的。
3.4.5各受试者剂量的选择及时机
3.4.5.1剂量及处理程序
研究者被许可可在任何时间给药试验药物。然而，放射标记及给药间的经过时间应不超过24小时。
3.4.6盲试验(blinding)
此为一种开放式不受控的试验。未进行盲试验。
3.4.7先前及伴随的治疗或步骤
3.4.7.1救援药物及额外的处理
过敏性反应被视为是最严重的潜在副作用，且可要求抗体输注立即停止，且开始适合的救援检测。应注意的是：在触及处应有救援设备；抗组织胺，皮质类固醇及肾上腺素。经历到此型不良反应的任何病人均不可接受额外的单克隆抗体。
许可病人接受其他的处理，或为研究指示或为不相关的疾病，只要符合纳入及排除准则。所有伴随的治疗均必需记录在CRF中。
在严重的血液学毒性情况下(CTC 4级)，为缓解骨髓毒性细胞因子的介入或其他方法是许可的。
3.4.7.2限制
额外的化疗或放射治疗是不许可的，且在纳入研究前4周以上，最后的化疗或放射治疗应已停止。所有先前的化疗及放射治疗要记录在CRF上。
3.4.8治疗顺应性
研究药物以单一静脉内输注型式给予。以药物动力学评估及放射免疫闪烁照相显影确认顺应性。
3.5效力/临床药理学及安全性参数
3.5.1效力/药效学以及安全性检测评估及流程图
流程图：
A部分
此研究在A部分时进行，且个别的时间详述于下示的流程中。研究说明示于下段落：
表3.5.1：1流程图：A部分：以99mTc-标记的hMAb BIWA4
进行生物分布研究访视1 访视2访视3 筛选 访视* 第1天*第2天第3天第4天第7天追踪6周注射前注射后签字通知同意书 x人口统计学浓度，治疗病史身体检查 x x x x x x x x x x x xECG胸部X光血液安全性分析尿液安全性分析妊娠试验 x x x1 x x x1 x1 x1 x1 x x1 x xHAHA评估 x2 x2 x2ENT检查CT或MRI x x纳入/排除准则 x不良作用生命体征体重 x3 x x x3 x x x3 x x x x X x3 x免疫闪烁照相术：-全身扫描-平面扫描-SPECT扫描 x4 x4 x5 x5药物代谢动力学：血样品尿液收集血清可溶性CD44v6 x6 x6 x7 x6 x6 x6 x6 x7 x6 x6 x7 x6 x6 x7 6 6 手术 x
*：预输注的评估应在确实输注前不超过3周进行。
x1：血样是测试下列：葡萄糖，钠，钾，钙，氯化物，肌酸酐，总蛋白质，白蛋白，血清谷草转氨酶(sGOT)，血清谷丙转氨酶(sGPT)，碱性磷酸酶，γ谷胺酰基转肽酶(GGT)，胆红素，尿素，尿酸，甲状腺刺激激素(TSH)，血红素(Hb)，血细胞比容(Ht)，平均红细胞体积(MCV)，网织红血球，白细胞，嗜中性粒细胞，谱带(bands)，淋巴细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，单核细胞及血小板，在筛选访视或在输注前1天，于21，48及144hrs p.i.及输注后六周。
x2：HAHA在血清样品中评估，所述血清样品得自筛选访视，于1周(144hrs)及六周p.i.后。
x3：生命体征的评估，在筛选访视，输注前，输注后10，60及120分钟及6周后。
x4：全身扫描在输注后及21hrs p.i.立即进行。
x5：SPECT扫描及平面扫描在21hrs p.i.时进行一次。
x6：进行药物代谢动力学的血样得自输注前，输注结束时，在5，10，30分钟1，2，4，16，21，48，72及144hrs输注结束后及六周p.i.，抽出血样进行酶联免疫吸附分析(ELISA)及检测放射活性(详情见9.5.4.1)。尿液收集在第一个24小时中的0-4小时，4-8小时，8-12小时及12-24小时，及在24小时中的血样，而余下时间宜到48小时p.i.。
x7：可溶性CD44v6测自血清样品，其得自输注前，在21，48及144hrs p.i.，及六周p.i.。
6：六周。
B部分
进行研究且个别时间示于下流程图中。个别的检查在以下段落有更详述。
表3.5.1：2流程图B部分：以186Re-标记的hMAb BIWA4
进行剂量阶梯式扩大研究访视1 访视2访视3 筛选 访视* 第1天*第2天第3天第4天第7天 追踪的周数注射前注射后签字通知同意书 x人口统计学浓度，治疗病史身体检查 x x x x x x x x x x 2，3，4，5，6 6ECG胸部X光血液安全性分析尿液安全性分析孕验HAHA评估 x x x1 x x x2 x1 x1 x1 x1 x x2 2，3，4，5，6 6 6 6ENT检查CT或MRI胸CT x x x8 6x8 6x8 纳入/排除标准 x不良作用生命体征体重 x3 x x x3 x x x3 x x x x 2，3，4，5，6 6 6免疫闪烁照相术：-全身扫描-平面扫描-SPECT扫描 x4 x4 x5 x4 (x5) x4 x5 x5 x4 x5 药物代谢动力学：血样尿液收集血清可溶性CD44v6 x6 x6 x7 x6 x6 x6 x6 x7 x6 x6 x7 x6 x6 x6 x7 6 6
*：输注前评估在确实输注前不超过3周进行。
x1：血样用于测试：葡萄糖，钠，钾，钙，氯化物，肌酸酐，总蛋白质，白蛋白，sGOT，sGPT，碱性磷酸酶，GGT，胆红素，尿素，尿酸，TSH，Hb，Ht，MCV，网织红细胞，白细胞，嗜中性粒细胞，谱带(bands)，淋巴细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，单核细胞及血小板，在筛选访视时或在输注前1天，于21hrs p.i，48hrs p.i.，及144hrs p.i.，于2-6周p.i.，至少每周获取安全性血样样品。
x3：评估血清样品中的HAHA，所述血样品得自筛选访视时，在输注后144hrs及六周。
x3：生命体征评估在筛选访视时一次，输注前，在输注后10，60，120及240分钟及6周后。
x4：全身扫描在p.i.立即进行，于21，48，72，144hrs p.i.，及视所需在二周p.i.进行。
x5：平面扫描在21、48(视所需)、72、144hrs p.i.进行及视所需在二周p.i.进行。SPECT扫描在72小时p.i.进行。
x6：行药物代谢动力学的血液样品得自输注前，在输注结束时，在输注结束后5，30分钟；1，2，4，16，21，48，72，144，240及336hrs。抽出血样以行ELISA，并可检测放射活性。尿液收集于前24小时期间自0-4小时，4-8小时，8-12小时及12-24小时收集，而其余时间直到96hrs p.i.收集24小时的样品。
x7：检测自血清样品的可溶性CD44v6，所述血清样品得自输注前，在21，48及144hrs p.i.及六周p.i.。
x8：疾病评估每6周重复直到疾病进展(progression)或无法追踪。做基线水平的胸CT，且在追踪时若有异常时可重复之。
3.5.1.1放射免疫闪烁照相法及剂量学
得自放射免疫闪烁照相(RIS)的数据，于A及B部分定性呈现(即在肿瘤，骨髓，肝，肺，肠，肾及另外的器官中的摄入，以低、中或高表示)及于B部分定量表示。
于定性评估时，评定的等级转成数字(0为无摄入，1为低摄入，2为中度且3为高度摄入)。平均数值计算出来并示出。
于B部分，RIS结果的定量表示是采用剂量学估算，如策略5.1.4段落中所列，并包括有以下参数：
·在特定时间点时的确实器官活性，以MBq表示。
·在器官中放射活性的滞留时间，以小时表示。
·吸收的(放射)剂量，以mGy/MBq表示。
·有效(放射)剂量，以mSv表示。
关于剂量学分析的详述可见于剂量学报告(2001年11月21日)。
e)放射免疫闪烁照相步骤
用于A及B部分的方法说明，且时间点示于下段中：
A部分
利用大视野，双头γ照相机，其配备有低能量视准仪，可在输注后立刻，以及在21hrs p.i.取得数据化的全身影像(前后(s.p.)及后前(p.a.))。取得头及颈部于21hrs p.i.的平面及SPECT影像。也取得校准源。贮存以上数据以供定量分析。
B部分
以大视野，配备有低能量视准仪的双头γ照相机，于给药于放射性免疫偶联物后立刻，以及在21，48，72及144小时后取得数据化全身影像(a.p.及p.a.)。另外头及颈部的平面影像可在21，48(视所需)，72及144hrs p.i.取得。视所需另外的影像(全身及平面)可在p.i.二周后进行。校准源(即一份有注射剂量已知部分的溶液，并置于10毫升小瓶内)嵌入一个Adams幻象内，其在全身扫描时需置于病人双下肢下方之间。校准源的最初活性必须是100-200Mbq186Re，且此源头在所有全身显像研究中均要采用。也要报告能量-窗及高峰设定，扫描速度，扫描长度，扫描日期，扫描开始的时间及期间。也要测量出颈及腹的前至后厚度，而病人在扫描台上呈仰卧位置。
在各显像期间，必须取得前方及平面静态影像，且就在此影像之前或之后，必须在Adams-幻象中的校准源取选一个静态影像。
在72hrs p.i.必须进行颈部的SPECT研究。也必须报告用于重构的方法，以及有切断频率的滤镜功能。
单一光子发射电脑化断层法(SPECT)
利用配备有低能量视准仪的双头旋转式γ照相机，可取得SPCET影像。探测需至少30分钟。20％的对称窗集中在137keV光子峰处。
平面及SPECT数据探测参数
平面显像包括以下的最低要求：矩阵128×128(详细的)或256×256(全身)及最少400000计数，最大的探测时间为10分钟以求详细，及60分钟应用于全身。
SPECT显像包括以下的最低要求：64个影像，矩阵尺寸64×64，360度环绕轨道，每个角度60秒探测。
数据的分析
在21hr p.i.前方全身影像，重点的直角区域(ROI′s)必须围绕着全身描出，并围绕着校准源。同样的不规则的ROI′s围绕着累积着186Re的器官(如肝，脾及左肾)，且围绕着肿瘤也必须描出来。必须描出一个或一个以上具代表性的背景区域。这些区域要反映出后方影像。原先是要描出在后方影像中围绕着骶骨的ROI。但在此试验中并未进行此计划。所有区域必须保存在电脑内，以在其他时间点上于影像上投影出这些ROI′s。也要报告像素数目，以及在各区域中每个像素的计数，所有影像时间点时，各区的计数量，必须以数据化方式报告在试算表(spreadsheet)中。
器官中吸收剂量的计算
由前及后影像ROI′s中的几何平均计数中，估算出器官，肿瘤及整体的活性量。当有指示时，要应用背景及衰减校正。如原先所计划的，在尿液中的活性并不用来估计在膀胱中的吸收剂量。反之，要使用动态膀胱模型。在器官内及在体内其他部位的滞留时间均要估算，且输入在MIRDOSE3程序中。
必要的品质控制试验
平面显像
每周在核子医学部门进行例常的品质控制：
1)100M冷光表(flood table)。
2)外来的57Co灌满低能量视准仪，每周要进行。
SPECT显像
SPECT显像系的品质控制需包括旋转决定中心。
断层照相处理
针对断层照相重构，使用斜波滤镜于滤过的反向投影演算中。
数据贮存
所有的平面影像及断层照相数据必须永久保存在磁片或光碟内。于断层照相研究中，原先投影的影像及重构的研究均要记在一个后援录影带内。影像及报告的拷贝
对所有病人，均需所有相关影像，病理学及手术报告的备份。也需要MRI及CT报告的拷贝备份。
3.5.1.2 99mTc-标记的hMAb BIWA4的活组织检查生物分布(A部分)
进入研究A部分的病人，在输注入经放射标记的hMAb BIWA 4后48小时进行手术。取出手术待检品中来自肿瘤位置及来自正常组织的活检样品。之后进行全身麻醉并取出骨骼活组织待检品及骨髓吸出物。离心骨髓吸出物以评估在上清液(血浆)及沉积物(细胞部分)的放射活性。所有的活组织待检品均称重，再测出99mTc的量。将％ID/公斤肿瘤与％ID/公斤正常组织比较，以评估出放射活性至肿瘤的特异摄入。
CD44v6抗原表达以免疫组织化学评估，利用恒冷箱的切片，其先与mMAb BIWA1共温育，再与抗-小鼠免疫球蛋白G(IgG)第二试剂温育。手术待检品及活组织检品再以组织学/细胞病理学方式检查。
手术待检品及生物分布的评估
在接到手术待检品后，以下列次序处理：
1.对待检品照相。Polaroid由前方而幻灯片由前及后。
2.评估手术待检品的大小。
3.取出原发性肿瘤，疑似淋巴结的进行活组织检查，且若有可能取出手术待检品中的正常组织，如正常粘膜，正常淋巴结，脂质及肌肉。所有的活组织均称重，且测出99mTc的量。所有数据转化成注射剂量百分率/公斤组织。将％ID/公斤肿瘤与％ID/公斤正常组织比较，以评估放射活性至肿瘤的特异摄入。
4.接下来待检品移至一块板上，并以甲醛4％固定至少36小时。
5.在切下胸锁乳突肌(有高放射密度的结构)后，制作待检品放射图以示出所涉及的淋巴结的实际大小及所在。此放射图在制作同时，将待检品浸入96％乙醇中，其有如同脂质的相同X-光吸收作用。
6.以X-射线观察到的所有结节，均示出在Polaroid上及待检品放射图上。
7.由手术待检品的检查及由X-光所见的所有结节均自待检品中切下。
8.所有在肉眼下呈阴性的结节完全处理以进行显微镜检，并评估单一切片。而所有肉眼下呈阳性结节，则制作二个以上的薄片。记录肿瘤坏死存在或不存在的肉眼下证据。
9.再者，记录所包围的结节数，及含有肿瘤结节的数目，位置及淋巴结水平(依Memorial Sloan Dettering癌症中心的分类)。
3.5.1.3肿瘤反应(B部分)
对于放射免疫治疗的效力参数是肿瘤反应。肿瘤反应以肿瘤检测评估，如临床上所评估和/或可利用CT，MRI或骨骼闪烁照相检查。评估依据WHO的反应标准而行。见策略中附录VI(R96-0941)。
3.5.1.4身体检查
在进行研究之前，各病人的疾病状态以ENT检查评估(包括触诊)且肿瘤位置利用CT或MRI检查。
每个颈部侧均描述所有头及颈部的损伤。
触诊
所有病人在基础时由耳鼻喉科医师/头及颈部外科医师检查。此临床检查可评估在头及颈部区域所有触及淋巴结的数目，大小，位置及移动性。淋巴结的特性描述如下：未被怀疑的，被怀疑的或有肿瘤浸润。颈部淋巴结的状态，在诊断时依Union Intemationale Contre le Cancer(UICC)对分阶段肿瘤(TNM)的肿瘤结节转移系统来分类。
放射学检查
依肿瘤位置之所有，需下列一种以上的检查：CT、MRI、骨骼闪烁照相术。肿瘤侵入头和颈部区域时MRI通常是优选的。在有骨骼伤害的例子中，以CT为较佳。于B部分，在基础时所得的所有放射学疾病评估参数，在输注后六周重复，且每六周重复直到进展或失去追踪为止。对于进入研究B部分的病人，在基线取得胸部CT，且若在胸部有肿瘤损伤时则在追踪时重复。超声波也可作为肿瘤显影的另一技术。对检查而设的准则如下：
原发肿瘤/局部-区域性复发
对于加入研究A部分的病人，以及有局部-区域性复发的病人(B部分)，必须进行头及颈部区域的CT扫描和/或MRI。
电脑断层照相法
头及颈部区域的电脑断层照相法：动态式CT优于涡状CT。然而，对于无法合作的病人，涡状CT可能有助。
病人必须以仰卧位置检查，颈部略过度伸展，头固定且肩膀放松并向下推。病人要安静地呼吸，使用腹部而非胸部肌肉。欲扫描的区域由侧面投影所做的最初概观决定。扫描平面需要与声带平行。例常使用连续的三个毫米切片。显影必须由颅骨基部(skull base)至上纵隔。
磁共振影像
待检测的病患仰卧，将头部轻微地过延展并固定头部，在检测期间需轻声呼吸并运用腹肌而非胸肌。得至适当显现颈部剖面并评估主要损害程度及扩张的淋巴结的影像。需得到自颅骨基部至上纵隔的影像。
远处转移
对于参加研究B部分的所有病人，进行基线胸部的CT扫描。视所需进行额外的检查以观察转移，如骨骼闪烁照相法或腹部CT。
胸部CT
可得涡状CT-扫描。病人以仰卧位置检查，且手臂抬高过头。要安静地呼吸，使用腹部而非胸部肌肉。病人扫描由肺正上方至肾上腺平面。必须在纵隔及肺定位中照相显影。
腹部CT
可得涡状扫描。病人以仰卧位置检查，且手臂抬高过头。病人必需安静地呼吸。所有病人使用口服造影剂。欲扫描区域由横隔膜上方至耻骨联合。影像必须在腹部及肝定位中照相。
骨骼闪烁照相法
在静脉内输注最大600MBq的99mTc标记的HDP/MDP后，要求病人消耗足够的流体及频繁的排泄。输注后3小时可得静态概况：一个全身的概况，且若必要时3个以上的详细概况。可疑的损伤处需以CT和/或MRI进行更近的分析。
计划依据分别的反应准则，进行骨转移反应报告。并未提供数据。
3.5.1.5可溶性CD44v6
必须在血清中检测可溶性CD44v6(sCD44v6)。利用可信的酶连接的免疫吸附分析法(ELISA)测定浓度，其以商品化试验套组为基础，并依Boehringer Ingelheim Department of Pharmacokinetics and Drug Metabolism，Biberach，Germany目前的国际化准则进行。在输注前，21，48及144小时p.i.及输注后六周各取5毫升血样(必须处理成血清)。令血样凝固，并离心制备血清。贮存及运送条件：用于ELISA检测的样品置于低温管内，小心地标记使能够唯一地被鉴定，贮存在-20℃下直到放射活性减低(186Re：4周，99mTc：3天)并送至BI Department of Pharmacokinetics and Drug Metabolism，Biberach，Germany，每四周以批次方式运送。血清样品在干冰中运送。
3.5.1.6安全性
受试者的保护
在给药放射标记的单克隆抗体期间及之后，小心地监测所有病人。基于此目的，至少一位检查者在场。
实验室评估
在以下时间点收集血样以分析：葡萄糖，钠，钾，钙，氯化物，肌酸酐，总蛋白质，白蛋白，血清谷草转氨酶(sGOT)，血清谷丙转氨酶(sGPT)，碱性磷酸酶(AP)，γ谷氨酰基转肽酶(GGT)，胆红素，尿素，尿酸，甲状腺刺激激素(TSH)，红血素(Hb)，血细胞比容(Ht)，平均红细胞容积(MCV)，网织红细胞，白细胞，嗜中性粒细胞，谱带，淋巴细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，单核细胞及血小板。所述时间点为：
·在筛选访视或在输注前1天，及
·在输注后21，48及144小时，
·于A部分，在输注后6周，于B部分：在研究的2，3，4，5及6周中，至少每周一次(若在毒性情况下则较频繁)。
在筛选访视或研究的第1天取得输注前基线实验室评估，限制条件为取得的样品是在经放射标记的hMAb BIWA 4输注前不到21天取得，且进行所有必要的评估。所有必要的实验室试验结果必须再总览一下，并在抗体输注前由负责医师检查是否适任。该做法同样可应用至B部分研究的第二次hMAb BIWA 4给药。
在以下时间点时收集尿液样品，以进行标准的医院筛选(蛋白质，血液及葡萄糖)：
·筛选访视
·输注后一周(144hrs p.i.)
·输注后六周
在筛选访视及在研究结束时，对有怀孕可能的妇女进行验孕。
人类-抗-人类-抗体评估
在血清样品中评估HAHA的存在和/或进展。因此在筛选访视时，抗体输注后一周(144hrs p.i.)及六周，采取5毫升血样(要处理成血样)。对于在B部分接受二次BIWA 4给药的病人，在第二次给药前要收集额外的HAHA待检品。血清水平以可靠的ELISA方法评估。
令样品凝固然后再离心制备血清。
贮存及运送条件：用于ELISA检测的样品置冷温管内，小心地标记使能够有唯一的鉴定，贮于-20℃直到测及放射活性降低为止(186Re：4周，99mTc：3天)且每四周以批次方式送至BI Department ofPharmacokinetics andDrug Metabolism，Biberach，Germany。血清样品必须以干冰方式运送。
人类抗人类抗体水平的任何提高，均逐病历小心地与病人可能的副作用相对比。收集此数据，并在研究过程中进行追溯性分析。
不良作用
所有的不良作用均报告在CRF中。所述作用依据US National CancerInstitute CTC(NCI-CTC)2.0版本分级(此文件版品下载自以下网址：http：//ctep.info.nih.gov/CTC3/ctc.htm.)所有的SAEs均需报告。
免疫原性及毒性
在进行此试验前，关于hMAb BIMA4安全性及免疫原性方面并无人体方面的数据资料。在先前以亲代小鼠抗体BIWA1进行的研究中，并未遇到临床上显著的毒性。而裸hMAb BIWA 4抗体单独地并未预期有毒性(于体外无抗体依赖的细胞-介导的胞毒性(ADCC)效应物功能；并未干扰预期的抗原-表达细胞的增殖作用)。有证明指出，hMAb BIWA 4可安全地给药至小鼠(异种移植研究)及猴子(毒性研究)。在三个局部毒性研究中可证明良好的局部耐受性。
小鼠及嵌合性MAb U36(抗-CD44v6-表位，有明确的重叠表位特异性)在HNSCC病人中目前十分安全；在以cMAb U36进行的I期剂量-阶梯式扩大RIT研究中可见除了骨髓毒性外(由186Re-标记所引起的)并无毒性。对放射标记的hMAb BIWA 4的过敏反应可能发生，此在理论上是可能的。单克隆抗体已给药至数百位病人中以供诊断应用。
虽然似乎不可能，对静脉内给药BIWA 4的可能反应可包括：低血压，暂时的发热及发冷，皮疹，呼吸困难，搔痒，恶心及过敏反应。
生命体征(血压，体温，脉博及呼吸速率)因此在筛选访视及下列时间点记录：输注前及输注后10，60，120分钟及6周后。对于仅参加B部分的病人，在输注后240分钟要记录额外的生命体征。
在此研究中使用放射性核素。与γ射线放射核素99mTc有关的放射作用负担(在目前的研究中为20毫居里)和许多例常的核子医学步骤所遇到的类似，且已知是小的。为了将对膀胱及肾的放射曝露减至最少，病人在前48小时内要充分喝水并被要求要经常排泄(在以186Re-标记的抗体输注后96小时)。
关于β-及γ-射线放射核素186Re，Breitz et al.(R98-2459)发现186Re-标记的MAb IgG在高度预处理病人中的最大耐受剂量为90毫居里/米2。此研究的目标之一是研究病人中186Re-经标记hMAb BIWA 4的毒性，所述病人有局部和/或区域性再复发疾病，且对此无可应用的治疗处理选择，所述病人或者有远处的转移。因为骨髓，甲状腺，肾及肝毒性可能会发生，所以要依3.5.1.6段落所述采血以进行器官功能测试。
为了监视体重减少或增加的发生，在输注前第1天及6周后及在筛选访视时记录体重。
监视病人局部毒性的发生。任何局部毒性迹象均记录成不良作用。
3.5.2检测的适宜性
所使用的测定对此类型试验是可充分接受的。
3.5.3主要的效力/药效学参数
3.5.3.1试验的A部分
在试验A部分中所测定的主要效力参数是活组织分布及放射免疫闪烁照相法。如何取得数据的方法描述，示于3.5.1.1及3.5.1.2中。
在正常组织及肿瘤中的摄入，于手术待检品的活组织中检测，且摄入以每公斤注射剂量的百分率(％ID/公斤)表示。评估在肿瘤及其他组织中摄入的时程，并与不同剂量的BIWA 4比较。
3.5.3.2试验的B部分
效力的主要参数是放射免疫闪烁照相法及剂量学的分析。
3.5.4药物浓度检测/药物代谢动力学
在试验的A部分及B部分中，均要测定经放射标记的BIWA 4的血液浓度。
3.5.4.1样品收集的方法及时机
收集病人血样并如下处理：在指定的时间点下，于输注位置相反的手臂周边静脉中抽取7毫升血液(3.5毫升于含有EDTA钾盐的管中，另3.5毫升在凝血管内；所要求的毫升量如修正案1所示)(即在给药抗体之前，及输注结束之时，及5，10，30分钟；1，2，4，16，21，48，72小时p.i.及7天p.i.(144小时)及6周p.i.)。输注结束视为t＝0。
于试验B部分省去在10分钟及6周p.i.时的血样。反之在240及366小时p.i.收集，如修正案1所示。
尿液的收集在48小时期间是在99mTc-标记的hMAb BIWA 4输注后，而在96小时期间是在186Re-标记的hMAb BIWA 4输注后。尿液收集在前24小时期间是由0-4小时，4-8小时，8-12小时及12-24小时，而其余时间是24小时的样品。计数尿液样品中的放射活性，以测定放射活性的排泄。
血样离心以制成血清。在处理前，测出全血中的放射活性。也测出血清中的放射活性。血样的冷藏贮存是必须的，然而样品勿需冷冻。利用由偶联制剂中保留的等份，将注入病人剂量的经称重稀释液制成标准品。依据局部SOPs进行病人样品及标准品的计数。结果记录在CRF适当的段落中。放射核素含量以注入剂量的百分率报告(以每斤血液或血清的％ID表示)。除了计数放射活性外，所有样品均利用HPLC分析来分析免疫复合物的存在。
所有样品试管均标记以下资料：试验编号，病人编号，样品本质(即血清，血浆或血液)，相对于输注的时间，实际时间，实际的日期及同位素(即99mTc或186Re)。检测各尿液样品的量，并记录且所有的尿液样品标记以下资料：试验编号，病人编号，总样品体积，收集间隔，实际的时间，日期及同位素(即99mTc或186Re)
所有药物代谢动力学样品的日期，次数及放射活性检测均记录在CRF中。
供ELISA检测的血浆样品转移至低温管内，小心地标记以便能唯一地鉴定，贮于-20℃下直到放射活性减低为止(186Re：4周，99mTc：3天)，并送至Boehringer Ingelheim Department of Pharmacolinetics and Drug Metabolism，Biberach，Germany每四周一批。血浆样品在干冰上运送。
3.5.4.2分析性测定
血浆样品以可靠的ELISA方法，在Boehringer Ingelheim Department ofPharmacokinetics and Drug Metabolism，Biberach，Germany检测。样品的放射活性计数在全血，血清及尿液中由研究者进行。
3.5.4.3参数及评估
以下的药物代谢动力学参数，利用WinNonlin 3.1 Professional(PharsightCorporation，Mountain View，CA)测定自全血，血浆，血清水平，影像资料如下述：
主要的药物代谢动力学参数为可观察到最大药物浓度的时间点(Tmax)，所观察到的最大药物浓度(Cmax)，在浓度-时间曲线下的面积(AUC)0→∞，最终消除半衰期(t1/2)，分布体积(末期及预测的稳态)，总体清除率(CL)，及平均滞留时间(MRT)0→∞。
药物代谢动力学分析的主要目的为：
在给药单一剂99mTc-标记的(A部分)及186Re-标记的hMAb(B部分)BIWA4后，比较及测定总放射活性及免疫反应性的hMAb BIWA4的特质。
从显像资料及血液处置(disposition)资料中，可估算出在研究中到达肝及脾的所注射放射活性的比例。为达到此目的，使用WinNonlin套装软件，在静脉内给药后，对免疫反应性hMAb BIWA 4及总血液放射活性水平的血浆浓度vs.时间图进行非-空间区分的药物代谢动力学分析，其为时间函数关系。
结果以总结性统计数值报告之。
3.5.5药物代谢动力学/药效学相互关系
最初意欲以空间区分的药物代谢动力学模式来说明人体内186Re-经标记BIWA 4的分布及代谢。意欲组合来自下列的数据资料：BIWA 4血浆水平，全血及血清放射活性检测，来自全身影像及重点特殊区域的放射活性，所给药的186Re-经标记BIWA 4剂量，未经标记的BIWA 4的剂量，可溶性CD44v6水平，及在输注前经放射标记抗体的评估。
结果以总结性统计数值报告之。然而，因变异性太高以致无法成为合理的模式。
3.5.6主要的安全性参数
最大可耐受剂量的决定及安全性评估，是试验的B部分主要终点。所做的测定述于3.5.1.6。
3.5.6.1毒性限制剂量及最大耐受剂量
将DLT定义为与药物有关的CTC 3级非血液学毒性，或与药物有关的CCT 4级血液学毒性，排除在无适度止吐剂处理下的恶心及呕吐。
MTD定义为六位病人中不到二人发展成药物-相关DLT的剂量水平。
3.6数据品质保证
此试验大体上依据良好临床实务原则进行，如在适合的调控及在公司标准操作步骤(反映这些调控)中所特示的。
在整个研究过程中，来自Boehringer Ingelheim The Netherlands的代表接触和/或访问研究地点以追踪研究的进展。就数据审核目的，研究者与访视者有频繁的接触，包括来源文件与病例报告的比较，及药物计量查核。研究者或其设计者在这些访视期间必须是对Boehringer Ingelheim TheNetherlands代表而言是可接触到的。
充分填写的CRFs有规律地来收集。数据以重复-数据方式输入内部。进行数据的总览，且难以采用的可对研究者执疑。
严重的不良作用，依据在策略中及CRF中的准则，以及依据BoehringerIngelheim SOPs进行报告。
3.7在策略中所计划的统计方法及样品大小的确定
3.7.1统计及分析计划
3.7.1.1统计设计/模式
用于此试验的设计是常用于I期肿瘤学试验的。
A部分
此I期试验的A部分是一个未受控制，依序提高测量的团体研究，可在有头及颈部进展的鳞状细胞癌病人中测定单一输注99mTc-标记的hMAbBIWA4后的安全性，耐受性，生物分布及药物代谢动力学。
在此研究部分，使用三个hMAb BIWA 4剂量水平，且计划在各剂量水平采用三位病人。所有病人有已证实的头及颈部肿瘤，且预定要手术。
B部分
此I期试验的B部分为一个开放式未受控的剂量阶梯式放大研究，以在有头及颈部进展的鳞状细胞癌病人中测定186Re-标记的hMab BIWA 4单一输注后的安全性，耐受力，MTD，药物代谢动力学及初步治疗作用，且此病是无可采用的可治愈的处理选择。
在此研究部分，放射剂量是阶梯式扩大的。二位病人以剂量水平处理，其中所见的毒性＜2级CTC毒性。若可见≥2级毒性，则每个剂量组处理的病人至少有三位。
安全性及耐受力评估(A+B部分)
就实验室参数，生命体征，HAHA的发展及不良经历的发生率，来评估此研究的安全性及耐受力。结果就个别的各剂量水平，以及就整体平均值报告之。
生命分布评估(A部分)
在固体组织中的99mTc-标记的hMAb BIWA 4分布，以放射免疫闪烁照相法(见3.5.1.1)及经由活组织待检品放射活性的检测(见3.5.1.1及3.5.1.2)可评估。由于每个剂量水平最多仅3位病人加入，因此仅可能有说明式统计。
免疫闪烁照相显影评估(A+B部分)
在给药经放射标记的抗体后，于特定时间点时可取得免疫闪烁照相显影(见9.5.1.1)。同样的仅有说明式统计学可被应用。
药物代谢动力学评估(A+B部分)
以下的药物代谢动力学参数，自血浆或血清，尿液水平及影像资料中决定，如下文所述：
主要的参数(非-空间区分的)
Tmax，Cmax，AUC(0-无限大时间)，最终消除的半衰期，分布体积(末期Vz及预测的稳态Vss)，CL及MRT(0-无限大时间)。放射活性随时间的累积尿液排泄率可由总尿液排出量决定。
次要的参数(空间区分的)
计划发展空间区分的药物代谢动力学模式，以定义出人体人186Re-标记的hMAb BIWA 4的分布及代谢。此模式可比较来自血清及尿液放射活性检测而来的数据，来自全身影像及重点特异区域的放射活性，所给药的186Re-标记的hMAb BIWA 4的剂量，hMAb BIWA 4的稳定一负荷(cold-loading)剂量，可溶性CD44v6水平，及输注前经放射标记的抗体的评估。
结果经计划定在各剂量水平下分别报告，且利用总结性统计学。
治疗效力评估(B部分)
肿瘤反应是治疗效力的参数。肿瘤反应依据WHO准则来评估。所有测及肿瘤损伤最大垂直直径的产物的总和，是肿瘤反应的主要参数。对于骨胳损伤反应的评估，此中有不同的准则。
3.7.1.2无束缚力的及不同的假说
在此试验中所有的分析本质上均是描述及探究性的。任何统计上的试验，其进行只为提供一个统计框架，由此可观察结果并对计划进一步的研究提供帮助。并不预知任何正式的统计推论，且因此并未进行统计学检验。
3.7.1.3计划中的分析
区别二个群体：
·意欲治疗的亚群(subset)包括所有病人，这些病人接受了经放射标记的hMAb BIWA 4的输注，且在基线后的数据可供使用。
·完全策略(per-protocol)的亚群包括可评估的病人。若以下准则符合时，则此病人可谓可评估的：
A部分：
1.符合意欲治疗亚群的准则。
2.就不良作用，生命体征及安全性血液及尿液样品而言，其追踪是适当的。
3.在二种所进行的分析中，有至少一者的免疫反应性部分大于60％。
4.适当的活组织检测及闪烁照相影像可运用以评估生物分布。
B部分：
1.符合意欲治疗亚群的准则。
2.就不良作用，生命体征及安全性血液及尿液样品而言，其追踪是适当的。
3.在二种所进行的分析中，有至少一者的免疫反应性部分大于60％。
4.反应：若在基线上可得适当的肿瘤测定值，及若病人被追踪达至少六周，
则对反应而言病人是可评估的。若在此六周期间内可观察到疾病的进行，则病人对反应而言也是可评估的。
主要的分析
就完全策略亚群进行主要的分析。
无一可评估病人被替代。对A部分而言，因此计划可评估的亚群含有9位病人，且意图治疗的亚群由至少9位病人组成。对B部分而言，病人数目依所遇到的毒性而定。对于毒性可被评估但对反应则不能被评估的病人并不被替换。
药物代谢动力学数据：
药物代谢动力学数据的分析由Dr.Thomas R MacGregor，BoehringerIngelheim Pharmaceuticals Inc.Ridgefield CT，USA进行。
药物代谢动力学分析的主要目的有：
1.为了测定及比较在给药单一剂99mTc-标记的hMAb BIWA 4及186Re-标记的hMAb BIWA 4后，总放射活性及免疫反应性hMAb BIWA 4的特性。
2.为了鉴定hMAb BIWA 4适合的稳定-负荷(cold-loading)剂量。
3.为了评估186Re-标记的hMAb BIWA4第二剂的性质。
4.自影像资料及血液所得资料中，可估计出在研究中间到达肝及脾的注入放射活性的比例。为达成此目的，使用WinNonLin套装软件，在静脉内给药后，在血浆浓度对免疫反应性hMAb BIWA 4及总血液放射活性水平的时间概况(呈时间的函数关系)中，进行非空间区分的药物代谢动力学分析。涉及放射活性的所有测定均校正至放射标记部分，其在输注前是与蛋白质结合的且具免疫反应性。所产生的特异药物代谢动力学参数包括：Tmax，Cmax，AUC(0-无限大时间)，最终消除半衰期，分布体积(最终期及预定的稳态)，总体清除率，及平均滞留时间(0-无限大时间)。也自总尿液输出量中测定出随时间的放射活性累积的尿排泄率。
药物代谢动力学分析的第二个目的是发展出可描述人体内186Re-标记的hMAb BIWA 4的分布及代谢的药物代谢动力学模式，但其之所以未达成乃因数据的高变异性之故(尤其是放射闪烁照相资料)。
其次的分析
其次的分析仅对参与研究B部分的病人意图治疗亚群而进行。
次要分析限于关键性终点：如反应速率，反应作用期，进展时间。
暂时分析
并未进行暂时性分析。
3.7.1.4遗漏资料的处理
在此I期研究中可预期到大多数的资料均可用于分析。若有遗漏数据，最有可能是遗漏原因不与结果有关。并无遗漏资料可归罪。
3.7.2样品大小的确定
在A部分中，每个剂量水平的三位病人，对于hMAb BIWA4的安全性及对50毫克未标记hMAb BIWA4预期的正确剂量上都可提供某些资讯。
在B部分中，六位病人被视为足以决定DLT。表3.7.2：1，在所有病人群体中，针对DLT某些推测的基础速率，此表呈现出6位病人中有2位或2位以上有PLT被察知的可能性。
表3.7.2：1DLT推测的群体比例 0.40 0.42 0.45在6位病人中2位或2位以上可观察到DLT的可能性 0.77 0.80 0.84
来源：可能性估算自二项分布的累积分布函数，n＝6且有变化的p′s。
由本试验中阶梯式扩大计划，二位或二位以上病人呈现DLT的可能性为至少80％，此若对病人达到DLT的潜在个别可能性为42％或42％以上时而言。
3.8研究进行中或计划分析中的变化
以下策略中的变化，经由修正案来实施。
经由1999年9月1日的No1修正案的实施，可调整血样收集的时间点。在试验中的B部分，输注后10分钟及6周的样品被漏掉，但在输注结束后240及336小时再收集额外的样品。结果是原先的采血程式无法充分适当地涵盖在试验A部分中所观察到的50小时的推测半衰期。共3.5毫升的血液收集在EDTA钾盐管中，另3.5毫升在凝固管中。
策略中提及病人在已测定MTD之后，可再给药第二剂的186Re-BIWA 4。此步骤由修正案2修饰。当病人对186Re-BIWA 4的第一次给药产生反应，在此其并无副作用或已从副作用中恢复且无HAHA抗体，则病人可视为适于第二处理循环。反应定义为疾病稳定(即无变化)，部分缓解或完全缓解。所给药的第二剂始终是50毫居里/米2。由于连接子的改变，试验可在以策略中所述的剂量疗程下于进行第二剂检视前先得出结论。为使有反应的病人无论如何均可被治疗，于是公布修正案2。
在达到MTD后，由于连接子的改变，试验已完成及终止。在BIWA 4计划的进一步发展中，MAG3可以MAG2GABA-TFP取代。
对于非原先所计划的更多时间点，样品可用于sCD44v6的测定。
在评估资料及已与试验团队讨论后，可进行以下的改变。
由于结果的变异性，仅对骨髓进行％ID/公斤肿瘤对％ID/公斤非肿瘤组织的比例分析。
对肿瘤大小的评估亦然。测定是不完全的，因此危害到合理的评估。
因此未进行正式分析。
4研究主题
4.1受试者的特性(disposition)
在33位受筛选病人中，三位病人因为给药试验药物前的不良作用而中止试验(表6.1：1)。此三位病人并不包括在分析中。共有30位病人进入并在此试验中接受治疗。
A部分
30位病人中有10位包括在A部分中，分别接受25毫克及100毫克99mTc-BIWA4的各有3人，而4人接受50毫克99mTc-BIWA4。在A部分中的所有病人均完成了试验。
B部分
在B部分中接受治疗的20位病人中有2位因不良作用而中止(二位病人死亡)。三位病人给药第二剂的50毫居里/米2。
表6.1：1病人的特性
A部分 B部分 总和
99mTc-BIWA4 99mTc-BIWA4[毫居里/米2]
2.5毫克 50毫克 100克 20 30 40 50 60
BIWA4 BIWA4 BIWA4
受筛选的 33
进入的 3 4 3 2 4 3 6 5 30
治疗的 3 4 3 2 4 3 6 5 30
完成的 3 4 3 2 3 2 6 5 28
中断的 0 0 0 0 1 1 0 0 2
由于AE 0 0 0 0 1 1 0 0 2
由于无效 0 0 0 0 0 0 0 0 0
由于其他理由 0 0 0 0 0 0 0 0 0
来源 附录16.1.9.2表1.1
4.2方法误差
大部分的策略违反状况是偏离策略中所提出的血液和/或尿液取样的时间窗(＞±10％)。受影响的病人并不排除在分析之外，但于测定血液、血浆、血清及尿清及尿液浓度时仍采用收集血液或尿液的确实时间。
5.效力/临床药理学评估
由A部分的结果可证实，50毫克BIWA4的剂量是用于治疗的最适当剂量。由B部分的数据显示，在使用比可观察到DLT的剂量还低的放射剂量时，病人在临床上可由186Re-BIWA4治疗中受益。
所测及的BIWA4浓度是与剂量成比例的，而所给药剂量的适度量由肾脏排泄。
5.1数据组分析
至少接受一剂试验药物的所有病人，均包括在意欲治疗分析中。来自A部分的7位病人包括在完全策略分析中。而B部分中未进行完全策略分析。
5.2人口统计学和其他基础特性
所有纳入的病人平均龄为56岁(由37至78)。有19位男性及11位女性(表5.2：1)。
A部分中受治疗的三位病人不曾吸烟，而7位为现行吸烟者(19-47)。在8位病人中有报告指出爱喝酒，而2位不饮酒。(表5.2：1)。
B部分中所有病人或为以前吸烟者或现行吸烟者(表5.2：1)平均35(由10至86)。六位不饮酒，而其余病人爱喝酒(表5.2：1)。
A部分中包括的所有病人，其疾病阶段是可局部手术的，而来自B部分的病人有复发疾病(15位病人)和/或已转移(3位病人)。1位病人有局部无法手术的疾病。有1位病人的资料被遗失。
在28位病人中有伴随的疾病或相关的病史报告。(表5.2：1)。所有病人均需要伴随的治疗。最常用的药物有：镇痛剂、镇静剂、乳果糖、H2-阻断剂、止吐剂及抗微生物剂。
表5.2：1人口统计学及基础特性。示出的是年龄平均值。
其他数字均表示病人数目
A部分 B部分 总和
99mTc-BIWA4 186Re-BIWA4[毫居里/米2]
2.5毫克 50毫克 100毫克 20 30 40 50 60
BIWA4 BIWA4 BIWA4
n 3 4 3 2 4 3 6 5 30
年龄[平均] 45.7 58.5 58.7 57.0 61.0 53.0 57.0 60.4 56.4
男性/女性 2/1 2/2 1/2 1/1 3/1 2/1 5/1 3/2 19/11
伴随疾病 3 3 2 2 4 3 6 5 28
伴随治疗 3 4 3 2 4 3 6 5 30
吸烟者 2 4 1 0 1 0 3 1 12
以前-吸烟者 0 0 0 2 3 3 3 4 15
饮酒者 3 3 2 0 3 3 6 2 22
纳入A部分的病人在纳入前约1个月即已知疾病的最初诊断，而包括于B部分的病人平均2年前即生病(由0.1至17.5年；表5.2：2)。A部分病人的Karnofsky分数由70至100。而B部分的病人有70-90的Karnofsky分数(表5.2：2)。
试验B部分中有1位病人据报告诊断出转移。
B部分中所有病人均进行先前的放射-和/或化学治疗，而在A部分的病人据报告既无先前的化学-也无放射治疗(表5.2：2)。顺铂、氨甲喋呤及氟尿嘧啶为最常用的全身性抗癌药)。
在自先前手术的13位B部分病人中。有11位先前的手术是根治性的。而A部分中仅一位病人已经历过先前的手术(表5.2：2)。
肿瘤的损伤大小(包括转移)为14毫米2至10304毫米2。原发的肿瘤位置在大多数病人中可被适度地区分出来。在13位病人中，其淋巴结已受感染(表5.2：2)。
表5.2：2人口统计学及基础特性。示出已知疾病的
平均年限及Karnofsky分数。所有其他数字
表示病人的数目
A部分 B部分
99mTc-BIWA4 186Re-BIWA4[毫居里/米2]
2.5毫克 50毫克 100毫克 20 30 40 50 60
BIWA4 BIWA4 BIWA4
n 3 4 3 2 4 3 6 5
已知疾病年限 0.11 0.08 0.07 9.30 2.13 1.17 0.80 1.16
Kamofsky分数 90 90 100 80 75 76.7 85 80
根治性的手术 0 0 0 2 2 1 2 4
受感染的淋巴结 2 2 0 2 3 2 1 1
先前的化疗 0 0 0 1 3 1 4 1
先前的放射治疗 0 0 0 2 4 3 6 5
5.3治疗顺应性的测定
所有药物的给予均在研究者或代表的监督下。收集血液以测定BIWA4的药物代谢动力学。所有病人均有可测及的BIWA4血中水平。
5.4效力/临床药理学结果
六位病人中有三位在50毫居里/米2的最大耐受剂量下疾病稳定。在试验A部分中已证实50毫克BIWA4剂量，就血液浓度及选择性肿瘤摄入而言是最适宜的剂量。BIWA4的血浆浓度在A部分中，于25毫克至100毫克BIWA4范围中是与剂量成比例的，且高峰在0.9小时，最终消除半衰期是54-74小时于A部分，94小时于B部分。
5.4.1效力的分析/药效学
5.4.1.1主要的终点(endpoint)
效力的主要终点是99mTc-BIWA4于A部分的生物分布。进一步的主要终点于试验的A部分及B部分，分别是放射免疫闪烁照相显影及药物代谢动力学(述于5.4.2)。剂量学仅在B部分进行。
A部分中99mTc-BIWA4的生物分布
在手术中可得到组织样品，99mTc-BIWA 4的摄入以％注射剂量(ID)/公斤组织表示。
意欲治疗(ITT)亚群：在所有三个剂量组中，于瘤中99mTc-BIWA4的相对生物分析最高，除了病人1(25毫克BIWA4)，病人5(50毫克BIWA4，无肿瘤细胞)及病人9(100毫克BIWA4)。肿瘤中的摄入，于25毫克，50毫克及100毫克剂量组中分别范围由6至17％ID/公斤，5至28％ID/公斤及13至17％ID/公斤。肿瘤摄入的经估算平均比率对骨髓中的摄入，于25毫克，50毫克及100毫克剂量组分别为1.7，2.6及2。(表7.2：1及7.2：2)。
完全一策略(per-protocol)(PP)亚群：在所有三个剂量组中，99mTc-BIWA4的相对生物分布在肿瘤中最高，除了病人1(25毫克BIWA4)外。肿瘤中的摄入，于25毫克，50毫克及100毫克剂量组分别为6至17％ID/公斤，23至28％ID/公斤及16％ID/公斤。肿瘤摄入的经估计平均比率对在骨髓中的摄入，于25毫克，50毫克及100毫克剂量组中分别为1.7，3.2及2.5(表7.2：1及7.2：3)。
较小的肿瘤大小有更大的摄入倾向，似乎存在于25毫克BIWA4剂量组。而在50毫克及100毫克BIWA4剂量组因为有限的病人数目因此类似的评估似乎不可能(表7.2：4)。
在骨髓上清液(高达17％ID/公斤)及血浆或血液(高达13％ID/公斤)中可观察到高的％ID/公斤摄入，其始终低于完全策略群体中肿瘤的摄入，除了病人1(25毫克BIWA4)外。在皮肤及粘膜中的摄入在完全策略亚群中，始终低于在原发性肿瘤中的摄入。
A部分中99mTc-BIWA4的放射免疫闪烁照相显像
虽然输注是在肿瘤中直接地并未见放射活性的摄入，在21小时后可记录1.9的中度摄入。放射免疫偶联物的摄入，于输注后立即及于21小时后，在骨髓及肾中似乎都低。在肺中的摄入为低度至中度，而肝则有较高的摄入。
于完全策略群体中可观察到类似的型式。唯一的差异似乎是在肾中有较高的摄入，而在肺中为较低，此乃与意欲治疗群体比较而言。
B部分中186Re-BIWA4的放射免疫闪烁照相显影
在输注后立即，及21，48，72，144及336小时后进行放射免疫闪烁照相检查。在输注后立即几乎观察不到肿瘤中有任何摄入。在肿瘤中的相对摄入似乎是和剂量有关的，且随时间增加于72至144小时后到达中度及高度摄入，但在336小时后下降。
于放射活性的生物分布，在骨髓、肺、肝、肾及肠中是类似的，且未显示出相同的剂量依赖作用(除了肠)。再者，放射活性的相对摄入似乎是恒定的或随时间适度下降，且在所有放射活性剂量下是类似的。对大多数治疗组而言，骨髓中的摄入是最低的。
5.4.1.2第二次终点
效力的第二次终点分别为对B部分治疗的肿瘤反应，及A部分中CD44v6在肿瘤中的表达水平。试验的A及B部分中均测定可溶性CD44v6的表达。
A部分中肿瘤的CD44v6表达
CD44v6抗原表达的测定数据可应用于七位病人。CD44v6抗原表达，在5及2位病人中分别在超过90％及80％肿瘤细胞中可观察到，而CD44v6抗原表达在4位病人中于超过90％淋巴结转移的细胞中可测及，其中淋巴结可供评估。在所有病人的粘膜中可观察到均质的CD44v6抗原表达。B部分中的肿瘤反应
以高达40毫居里/米2 186Re-BIWA4剂量治疗的病人，并未经历到临床的肿瘤反应。所有病人经历到进行性的(progressive)疾病。有一位病人由于并发的死亡致使无法评估。
六位以50毫居里/米2 186Re-BIWA4治疗的病人中有三位发展为稳定的疾病，或在第一次循环后无变化。此三位病人中有二人以50毫居里/米2186Re-BIWA4另一循环治疗，而在第二循环后有进行性的疾病。在试验药物第一次给药后，分别在148天(病人109)及127天(病人116)后可观察到进行性的疾病。
有一位以60毫居里/米2 186Re-BIWA4治疗的病人在第一次循环后经历了稳定的疾病。此病人在50毫居里/米2 186Re-BIWA4的第二循环后进入进行性疾病(在受试药物的第一次给药后173天)。
对于对治疗无反应的病人，其进行的整体时间范围由0至55天，平均为约5至6周，和治疗组无关。
在A及B部分中可溶性CD44v6
在本试验中测定以BIWA4治疗的所有病人的可溶性CD44v6。
对于以186Re-BIWA4治疗的病人，在B部分的试验中可溶性CD44v6检测量趋向增加(表7.2：6)，而对于A部分以99mTc治疗的病人，则并未观察到此种倾向。
5.4.2药物剂量，药物浓度，及与反应的相互关系
BIWA4的药物代谢动力学，于A及B部分中将分别地呈现，因为放射标记不同之故(A部分：99mTc；B部分；186Re)。
5.4.2.1关于BIWA4，HAHAs及CD44v6的分析性能
利用可靠的分析法分析血浆样品。品质控制样品的分析可产生有高度正确性及精确度的样品。
关于样品γ计数的分析性能
闪烁晶体在γ计数器中的讯号线性并未测试。其可依据仪器类型来推测，至少在目前研究中所用的能量范围。校正样品显示出每分钟典型的40000-200000计数，相对于背景样品中每分钟少于50-100的计数。每一校正标准品七次测定的精确性完全在2％内。在该精确度下测定血液，血清及尿液，各平行三份检测。血液及血清样品可显示每分钟2000及100000计数间的典型活性。
对于放射活性计数，在此并无品质控制样品。校正标准品及由本研究中衍生的样品，其经重复测定的精确性显示出三次测定的精确性至少优于2％。
5.4.2.1药物代谢动力学
A部分
A部分包括有10位病人，其接受由25至100毫克的单一剂BIWA4，并有20毫居里99mTc的固定放射标记剂量。经过短期静脉内输注后，以ELISA检测的BIWA4的血浆内药物代谢动力参数示于表5.4.2.2：1。
表5.4.2.2：1研究A部分中，BIWA4
血浆中的药物代谢动力学参数
病人 BIWA4 tmax Cmax 半衰期 AUCinf Vz CL MRT
剂 (分) (ng (小时) (微克·小 (升) (毫升/分) (小时)
(毫克) /ml) 时/毫升)
1 25 0 6634 44.1 387.4 4.1 1.076 58.0
2 25 30 6640 67.0 534.7 4.5 0.779 94.8
3 25 10 9590 53.3 542.9 3.5 0.768 71.0
4 50 29 14900 64.9 1112.3 4.2 0.749 84.8
5 50 121 15500 102.8 1580.2 4.7 0.527 135.2
8 50 5 13900 53.0 831.0 4.6 1.003 71.7
10 50 41 16700 83.8 1461.6 4.1 0.570 110.0
6 100 4 30500 85.0 2548.9 4.8 0.654 112.0
7 100 17 30600 76.0 2709.6 4.0 0.615 110.4
9 100 30 24500 44.6 1708.1 3.8 0.976 61.1
几何平均值
25毫克 7503 54.0 482.7 4.0 0.863 73.1
50毫克 29 15216 73.8 1208.8 4.4 0.689 97.5
100毫克 13 28383 66.0 2276.4 4.2 0.732 91.1
可观察到CmaxBIWA4血浆浓度的增加，且曲线下的面积与给药的剂量成比例(图4及5)。
也测定放射标记物(99mTc)的血清浓度，且药物代谢动力学参数示于表5.4.2.2.：2。
表5.4.2.2：2研究A部分中血清的99mTc-BIWA4的药物代谢动力学参数
病人 99mTc- Tmax Cmax 半衰期 AUCinf Vz CL MRT
BIWA4 (分) (％ID/ (小时) (％ID·小 (公斤) (公斤/分) (小时)
剂量 公斤) 时/公斤)
(毫居里)
1 19.0毫居里 117 52.66 44.6 3376.9 1.9 0.030 63.8
2 20.0毫居里 10 28.08 55.6 2151.7 3.7 0.048 79.1
3 21.4毫居里 10 39.11 27.5 1445.3 2.7 0.072 41.5
4 19.5毫居里 29 31.84 31.3 1432.8 3.2 0.072 43.8
5 19.1毫居里 121 32.29 39.6 1934.8 3.0 0.054 56.3
8 18.8毫居里 114 28.41 42.8 1620.1 3.8 0.060 60.8
10 19.3毫居里 41 40.31 43.1 2247.1 2.8 0.042 62.3
6 19.3毫居里 120 30.45 45.3 1946.5 3.4 0.054 65.2
7 19.8毫居里 77 35.79 36.0 1628.6 3.2 0.060 51.1
9 18.3毫居里 238 31.94 35.5 1805.6 2.8 0.054 50.6
调和平均值 38.7
几何平均值 57.9 34.5 39.4 1898.0 3.0 0.053 56.5
在A部分研究的三个治疗组中，于静脉内输注后以ELIS测血浆中BIWA4的几何平均半衰期，范围由54至73.8小时。相同样品，99mTc-放射标记的BIWA4几何平均半衰期，于血清中为较短的39.4小时，而于血液中为46.4小时。在二个平均估计值间的差异可归因于因放射活性分析限制所致的BIWA4可能的较长取样时间。
放射活性排泄至尿液中，其所收集的量示于表5.4.2.2：3。由于在48小时期间不完全的收集(即因为不同的收集时段，所累积的数据将无法始终是可比较的)，所以对此尿液排泄数据并无进一步的评估。对于有完全的48小时收集的六位病人而言，所收集的放射活性平均量为最初剂量的10％。
5.4.2.2：3 A部分中排泄至尿液(以最初剂量的百分率
表示)的放射活性量(99mTc)
收集间隔(小时)
病人 0-4 4-8 8-12 12-24 24-48 累积量
(％ID)
1 2.80 10.13 5.08 n.a. n.a. 18.01
2 1.94 0.97 0.52 3.09 3.23 9.75
3 0.29 1.44 1.19 n.a. n.a. 2.92
4 1.68 1.42 1.95 1.14 2.21 8.40
5 2.20 1.60 1.02 3.96 3.98 12.76
8 1.29 2.45 0.88 3.67 3.00 11.29
10 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
6 2.55 1.59 1.80 1.89 2.00 9.83
7 n.a. 3.14 n.a. 1.79 3.13 8.06
9 1.54 3.34 0.00 1.05 2.31 8.24
n.a.＝无可应用的，无数据可采用
B部分
B部分包括有20位病人，接受50毫克BIWA4，具有不同的186Re-BIWA4放射标记剂量，由20-60毫居里/米2。三位病人接受二次静脉内输注，而另17位病人只接受单一治疗疗程。
用图表说明，各位病人及在二次接受186Re-BIWA4的三位病人中，血浆BIWA4浓度及血清放射活性浓度间是一致的。此由图解观察到的一致性，当数据作图时(非空间区分地评估)与放射活性较长半衰期的理解相反。186Re-BIWA4放射活性部分122小时的几何平均半衰期，较由ELISA所测定的BIWA血浆半衰期-94小时还长。
通过将所给药的放射活性合计而对药物代谢动力学参数进行的分类(表5.4.2.2：6及5.4.2.2：7)显示，在给药放射活性增加时有曝露时间延长的某些倾向，但由于各剂量组的受试者数目太小以致无法有任何一致的结论。
表5.4.2.2：6将所给的放射活性合计而进行分类，求血浆
BIWA4药物代谢动力学参数的几何平均值
186Re剂量 n Cmax 半衰期 AUCinf Vz CL MRT
(毫居里/米2) (ng (小时) (微克·小时 (升) (毫升 (小时)
/ml) /毫升) /小时)
20 2 12160 106.5 1217 6.3 41.1 130.3
30 4 15239 86.2 1399 4.4 35.7 116.2
40 3 11121 90.6 1201 5.4 41.7 125.1
50 9* 12982 92.4 1055 6.3 47.4 117.4
60 5 11927 99.8 939 7.7 53.2 115.9
*包括接受二剂50毫居里/米2的病人
表5.4.2.2：7将所给的放射活性合计而进行分类，求血清
186Re-BIWA4药物代谢动力学参数的几何平均值
186Re剂量 n Cmax 半衰期 AUCinf Vz CL MRT
(毫居里/米2) (％ID/ (小时) (％ID·小 (公斤) (公斤/ (小时)
公斤) 时/公斤) 小时)
20 2 30.88 114.4 3296 5.01 0.030 154.6
30 4 40.09 98.8 4365 3.27 0.023 134.5
40 3 28.82 126.4 3856 4.73 0.026 172.4
50 9* 40.22 123.3 4182 4.25 0.024 162.5
60 4 32.10 145.2 3493 6.00 0.029 185.5
*包括接受二剂50毫居里/米2的病人
5.4.2.2药物代谢动力学/药效学分析
并未进行药物代谢动力学/药效学分析。
5.4.3统计/分析
如原先所计划的进行分析。详情述于3.7.1.3。
5.4.3.1初次终点(primary endpoint)无可应用的。
5.4.3.2二次终点(secondary endpoint)无可应用的。
5.4.4药物-药物及药物-疾病之间的相互作用并未进行关于药物-药物或药物-疾病交互作用的试验。
5.4.5副主题的呈现
详见6.4.2.2及6.4.2.3段落。
5.5效力/临床药理学结论
A：部分
由A部分的结果，以血液浓度及组织摄入水平为基础，可证实50毫克BIWA4的剂量是治疗最适宜剂量。由放射闪烁照相法及活组织检测所评估的分布，可知在几乎所有的例子中，和其他组织比较下肿瘤中是最高分布的。在肿瘤中放射活性的摄入随时间而增加。CD44v6分别在原发性肿瘤及淋巴结转移肿瘤的超过80％及90％的细胞表达，且在所有获得的粘膜待检品中表达。
在99mTc-BIWA4给药前及之后，可溶性CD44v6的量似乎是恒定的。
所测得的BIWA4浓度，在25毫克至100毫克BIWA4范围中是与剂量成比例的。所给药剂量的中等量经由肾脏排泄。对所有给药组而言，在尿中排泄的％ID是类似的。
B部分：
由B部分得来的数据显示，在MTD时病人可由186Re-BIWA4的治疗中受益。五位以60毫居里/米2治疗的病人中有一位有稳定的疾病。六位病人中三位在50毫居里/米2的最大耐受剂量时疾病稳定。而接受第二剂50毫居里/米2的这些病人中直到127至173天之间才有进展(progression)。放射免疫闪烁照相可显示出肿瘤组织内放射活性的摄入。在不考虑剂量的情况下，生物分布在其他组织中是相当的。在肿瘤以外的组织中，剂量学分析未显示出令人意外的高吸收剂量，但睾丸除外。然而，所观察到的睾丸剂量对于破坏生育力的相关性目前是未知的。
对于以186Re-BIWA4治疗的病人，所测及的可溶性CD44v6含量有增加的倾向。
BIWA4的血浆浓度在0.92小时时为高峰，且由ELIS测定得知，对BIWA4而言，抗体以94小时的几何平均半衰期消去。对于50毫克BIWA4剂量组而言，Cmax及AUC数值(ELISA测定)和在试验A部分中所得的类似。
6安全性评估
剂量限制毒性发生在60毫居里/米2的剂量时，而50毫居里/米2186Re-BIWA4的剂量转变成本试验中的最大的耐受剂量。剂量限制毒性为来自骨髓的不良作用，即血小板减少症及白细胞减少症。
6.1曝露程度
在A部分治疗的十位病人，均给药单一剂99mTc-BIWA4。BIWA4的剂量为25毫克，50毫克或100毫克，而99mTc为20毫居里。
在B部分，病人共20位给药单一剂的186Re-BIWA4。三位接受第二剂的50毫居里/米2，因疾病稳定之故(无变化)。BIWA4的剂量保持稳定在50毫克，而186Re的放射活性以10毫居里/米2体表面积的比例增加。依据体表面积估计剂量(表6.1：1)
表6.1：1所给药的放射活性平均剂量 A部分 99mTc-BIWA4 B部分 186Re-BIWA4[毫居里/米2] 25毫克 BIWA 50毫克 BIWA4 100毫克 BIWA4 2030 40 50 60NmCi99mTcmCi186Re 3 20.1±1.2 n.a. 4 19.2±0.3 n.a. 3 19.1±0.8 n.a. 2 n.a. 33.1±1.74n.a.52.4±5.6 3 n.a. 70.6±5.2 6 n.a. 87.2±8.5 5 n.a. 97.2±8.3
n.a.＝无可应用的。表中显示平均值及标准差
药物的放射化学纯度超过95％，且免疫反应性部分高于80％。
观察期为给药试验药物后至少6周。
6.2不良作用(AEs)
在所有接受治疗的病人中均要报告不良作用。二位病人在B部分中因为AE而中止观察期。并不因试验药物而采取行动，因为治疗已完成。
6.2.1不良作用的简要要点
A部分：
在A部分的大多数病人经验到不良作用，由身体为一整体(50％)，其也可能是由于基础手术及相关的疼痛之故。并无特殊的不良作用型式被报告，且病人中无一者发展成CTC准则3或4级，此被判断为是与药物有关的(表6.2.2：1及2)。
三位病人经历严重的副作用，其在6.3.1.章节描述。
B部分：
全身器官类型(SOC)的不良作用，身体为一整体，在病人中有65％有报告，继之为来自全身器官类型的不良作用，血小板，流血及凝血失调，(病人中占60％)，及白细胞和网状内皮系统失调症，(病人中占50％)。药物-相关的血小板减少症及白细胞减少症发生在11位(55％)及10位(50％)病人身上，在开始放射免疫治疗后平均21天时发生，且通常在6周后是可逆的。
在这些事件中均可观察到剂量-反应(表6.2.2：3)。
将血液学剂量-限制的毒性定义为与药物有关的CTC第4级，在三位病人中有报告。
非血液学剂量-限制的毒性定义为与药物有关的CTC第3或4级非血液学毒性，发生在4位病人(在30毫居里/米2时有一病人经历皮疹及Quincke′s水肿，二位病人在60毫居里/米2时经历发热，而一位病人以60毫居里/米2治疗时感觉到疲劳。
九位经历严重不良作用的病人中有六位死亡。死亡及严重的不良作用述于12.3.1章节中。
6.2.2不良作用的呈现
A部分：
以下不良作用由SOC，优选术语来分类，且在A部分中超过一位病人有三种BIWA4剂量组的报告(表6.2.2：1)。详情及优选术语可见于7.3.1中。
表6.2.2：1在A部分中有不良作用的病人(以单一剂20
毫居里99mTc-BIWA4在手术前处理)
99mTc-BIWA4
25毫克 50毫克 100毫克 总和
BIWA4 BIWA4 BIWA4
病人数目(受治疗病人％) 3(100) 4(100) 3(100) 10(100)
有任何不良作用的病人数目 3(100) 4(100) 3(100) 10(100)
应用部位的失调症 2(66.7) 0(0) 0(0) 2(20.0)
全身为一整体 2(66.7) 2(50.0) 1(33.3) 5(50.0)
疼痛 1(33.3) 1(25.0) 1(33.3) 3(30.0)
中枢及周边神经失调症 1(33.3) 1(25.0) 0(0) 2(20.0)
代谢及营养失调症 1(33.3) 2(50.0) 1(33.3) 4(40.0)
体重减轻 1(33.3) 1(25.0) 0(0) 2(20.0)
低抗(resistance)机制失调症 0(0) 4(100) 0(0) 4(40.0)
感染 0(0) 3(75.0) 0(0) 3(30.0)
血管失调症 1(33.3) 1(25.0) 1(33.3) 3(30.0)
出血(未特示) 1(33.3) 1(25.0) 0(0) 2(20.0)
若其在一位病人以上中报告，则以SOCs及优选术语来表示；括号内的数字表示接受治疗病人的百分率。
由研究者依据CTC准则分级而视为与药物有关的作用，列于表6.2.2：2中。依据CTC，这些作用定为1级。
表6.2.2：2在A部分中所报告的依据CTC准则，与药物-有关
(由研究者判定)的不良作用的严重程度(在手术前以
单一剂的20毫居里99mTc-BIWA4治疗)
99mTc-BIWA4
25毫克 50毫克 100毫克 总和
BIWA4 BIWA4 BIWA4
病人数目 3 4 3 10
被视为与药物相关 0 2 0 2
的不良作用次数
肝胆系统的失调症 0 2 0 2
sGOT增加 0 1 0 1
sGPT增加 0 1 0 1
sGOT＝血清谷草转氨酶；sGPT＝血清谷丙转氨酶
B部分：
表6.2.2：3示出由SOC，优选术语所分类的不良作用病人数目，及186Re-BIWA4的放射剂量组。
表6.2.2：3发生在B部分的不良作用的病人(先以
186Re-BIWA4处理，再考虑第二剂)
186Re-BIWA4[毫居里/米2]
20 30 40 50 60 总和
接受治疗的病人数目 2(100) 4(100) 3(100) 6(100) 5(100) 20(100)
有不良作用的病人数目 2(100) 4(100) 3(100) 6(100) 5(100) 20(100)
全身为一整体 2(100) 3(75.0) 2(66.7) 2(33.3) 4(80.0) 13(65.0)
过敏反应 0(0) 1(25.0) 0(0) 0(0) 1(20.0) 2(10.0)
疲劳 0(0) 0(0) 0(0) 1(16.7) 1(20.0) 2(10.0)
发烧 0(0) 0(0) 2(66.7) 0(0) 2(40.0) 4(20.0)
嘴部水肿 1(50.0) 0(0) 0(0) 1(16.7) 0(0) 2(10.0)
疼痛 0(0) 2(50.0) 0(0) 1(16.7) 1(20.0) 4(20.0)
中枢及周边神经学失调症 0(0) 1(25.0) 2(66.7) 1(16.7) 0(0) 4(20.0)
胃肠道系统失调症 0(0) 1(25.0) 1(33.3) 2(33.3) 3(60.0) 7(35.0)
粘膜炎 0(0) 0(0) 0(0) 1(16.7) 3(60.0) 4(20.0)
胃炎 0(0) 0(0) 0(0) 1(16.7) 1(20.0) 2(10.0)
肝胆系统失调症 1(50.0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(20.0) 2(10.0)
sGPT增加 1(50.0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(20.0) 2(10.0)
代谢及营养失调症 1(50.0) 0(0) 1(33.3) 1(16.7) 1(20.0) 4(20.0)
肿瘤 0(0) 0(0) 2(66.7) 0(0) 2(40.0) 4(20.0)
恶性肿瘤加重 0(0) 0(0) 1(33.3) 0(0) 2(40.0) 3(15.0)
血小板，出血及凝血失调症 0(0) 1(25.0) 1(33.3) 5(83.3) 5(100) 12(60.0)
血小板减少症 0(0) 1(25.0) 1(33.3) 4(66.7) 5(100) 11(55.0)
红细胞失调症 0(0) 0(0) 0(0) 2(33.3) 3(60.0) 5(25.0)
贫血 0(0) 0(0) 0(0) 2(33.3) 3(60.0) 5(25.0)
呼吸系统失调症 0(0) 1(25.0) 1(33.3) 0(0) 2(40.0) 4(20.0)
支气管炎 0(0) 1(25.0) 0(0) 0(0) 1(20.0) 2(10.0)
呼吸困难 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 2(40.0) 2(10.0)
鼻炎 0(0) 0(0) 1(33.3) 0(0) 1(20.0) 2(10.0)
皮肤及附属器失调症 1(50.0) 1(25.0) 1(33.3) 0(0) 1(20.0) 4(20.0)
皮疹 0(0) 1(25.0) 0(0) 0(0) 1(20.0) 2(10.0)
白细胞及RES失调症 0(0) 0(0) 1(33.3) 4(66.7) 5(100) 10(50.0)
粒细胞减少症 0(0) 0(0) 0(0) 1(16.7) 2(40.0) 3(15.0)
白细胞减少症 0(0) 0(0) 1(33.3) 4(66.7) 5(100) 10(50.0)
若其在一位病人以上中被报告，以SOCs及优选术语示出；sGPT＝血清谷丙转氨酶；RES＝网状内皮系统，在括号内的数字表示接受治疗病人的百分率。
在75％病人中有药物-相关的不良作用被告。药物相关的白细胞减少症及血小板减少症在病人中分别有50％及55％.
视为与药物相关的不良作用示于表6.2.2：4中，依CTC而分级。
表6.2.2：4在B部分所报告的依CTC准则的与药物-相关
(由研究者判定)的不良作用(考虑第一及第二剂)
不良作用 186Re-BIWA4[毫居里/米2]
20 30 40 50 60 总和
CTC第1级 1 0 2 6 5 14
脸部水肿 1 n.a 0 0 0 1
白细胞减少症 0 n.a. 1 2 0 3
念球菌病 0 n.a 0 0 1 1
粘膜炎 0 n.a. 0 0 1 1
血小板异常 0 n.a 0 1 0 1
紫癜 0 n.a. 0 0 1 1
胃炎 0 n.a. 0 1 0 1
血小板减少症 0 n.a. 1 2 2 5
CTC第2级 0 1 0 7 7 15
贫血 n.a. 0 n.a. 1 1 2
痛风 n.a. 0 n.a. 1 0 1
白细胞减少症 n.a. 0 n.a. 1 2 3
粘膜炎 n.a. 0 n.a. 2 3 5
胃炎 n.a. 0 n.a. 0 1 1
味觉丧失 n.a. 0 n.a. 1 0 1
血小板减少症 n.a. 1 n.a. 1 0 2
CTC第3级 0 2 0 2 8 12
过敏反应 n.a. 1 n.a. 0 0 1
疲劳 n.a. 0 n.a. 0 1 1
发烧 n.a. 0 n.a. 0 2 2
白细胞减少症 n a. 0 n.a. 1 1 2
皮疹 n.a. 1 n.a. 0 0 1
血小板减少症 n.a. 0 n.a. 1 4 5
CTC第4级 0 0 0 3 5 8
贫 n.a. n.a. n.a. 0 1 1
粒细胞减少症 n.a. n.a. n.a. 1 2 3
白细胞减少症 n.a. n.a. n.a. 1 2 3
血小板减少症 n.a. n.a. n.a. 1 0 1
示出的是不良作用的次数；n.a.＝无可应用的。
6.2.3不良作用的分析
A部分：
发生在试验A部分的不良作用无一者被视为是与药物有关的，除了有一位病人经历轻微且可逆的CTC1级AST及ALT的升高。
当与不同的BIWA4剂量比较时，在AE方面上并未观察到有何差异。
B部分：
血小板减少症及白细胞减少症是与剂量有关的(表6.2.2：3及6.2.2：4)且是剂量-限制的。时程示于6.4.2.1中。
随着放射剂量的增加常有报告称粘膜炎高达CTC2级，但没引起剂量-限制毒性(表6.2.2：3及6.2.2：4)。
在二位病人中有过敏反应的报告，一人经历与药物有关的Quincke′s水肿及皮疹(30毫居里/米2)，且有一人(60毫居里/米2)在血小板浓缩液输血后有过敏反应，其亦不认为和药物有关。有一病人(20毫居里/米2)有风疹，其也被认为非药物-相关的，而一病人(20毫居里/米2)经历与药物-有关的脸部水肿。
可在二病人中测及HAHAs(见12.4.3)。
二病人因不良作用致使研究中断。二病人均死亡。
在17位病人中因不良作用需开始伴随的治疗。这些病人旋即描述于6.3.1中。
6.3死亡，其他严重的不良作用，及其他重大的不良作用
可在12位病人中见到严重不良作用的报告。其中六人在试验或追踪过程中死亡。所有死亡的病人均曾接受试验B部分的治疗。在A部分治疗的病人无一人死亡。所有死亡均因疾病的进展。
B部分中有二位病人提早中止试验乃因不良作用之故(病人112及105均死亡)。
需要治疗的不良作用最常见的是血小板减少症，白细胞减少症和发热。
7.本文参照但不包括的表，数字及图
7.1人口统计学数据
不包括人口统计学详述。
7.2效力/药物代谢动力学数据
表7.2：1肿瘤对骨髓的摄入比例-试验的A部分
表7.2：2肿瘤对骨髓的摄入比例(ITT亚群)-试验的A部分
表7.2：3肿瘤对骨髓的摄入比例(PP亚群)-试验的A部分
表7.2：4肿瘤大小及抗体的摄入％-试验的A部分(完全策略群体)
表7.2：5在肿瘤及其他组织中CD44v6抗原的表达-试验的A部分
表7.2：6血清中的可溶性CD44v6。平均值以ng/ml表示。
表7.2：1肿瘤对骨髓的摄入比例-试验的A部分
A部分
99mTc-BIWA4
病人 肿瘤摄入 骨髓摄入 肿瘤/骨髓比
数目 (％ID/公斤；估计值) (％ID/公斤；估计值) 值(估计值)
25毫克BIWA4 1* 6.14 5.58 1.10
2* 15.78 7.49 2.11
3* 16.78 8.63 1.95
50毫克BIWA4 4* 28.10 6.98 4.03
8* 27.76 7.57 3.67
10* 22.63 11.54 1.96
100毫克BIWA4 6* 15.89 6.47 2.46
7 16.99 7.70 2.21
9 13.31 10.11 1.32
No＝数目，*＝包括在完全策略分析中；％ID＝注入剂量％；估计值的运算是将样品不同的重量考虑在内。
表7.2：2肿瘤对骨髓摄入比例(ITT亚群)-试验的A部分
A部分
99mTc-BIWA4
肿瘤/骨髓比例
(估计值)
25毫克BIWA4 1.72
50毫克BIWA4 2.57
100毫克BIWA4 1.99
表中数据以平均值表示；ITT＝意欲治疗；估计值的运算是将样品不同重量考虑在内。
表7.2：3肿瘤对骨髓摄入比例(PP亚群)-试验A部分
A部分
99mTc-BIWA4
肿瘤/骨髓比例
(估计值)
25毫克BIWA4 1.72
50毫克BIWA4 3.22
100毫克BIWA4 2.46
表中数据以平均值表示；PP＝完全策略；估计值的运算是将样品不同重量考虑在内。
表7.2：4肿瘤大小及抗体的摄入％-试验的A部分(完全策略群体)
A部分
99mTc-BIWA4
病人数目 肿瘤大小[毫米2] 肿瘤摄入
(％ID/公斤；估计值)
25毫克BIWA4 1 1350 6.14
2 900 15.78
3 225 16.78
50毫克BIWA4 4 n.a. 28.10
8 1504 27.76
10 1400 22.63
100毫克BIWA4 6 800 15.89
No＝病人数目，n.a.＝无可应用的，仅给出长或宽，不是长和宽都给出，估计值的运算是将不同样品重量考虑在内。
表7.2：5在肿瘤及其他组织中CD44v6抗原的表达-试验的A部分
A部分
99mTc-BIWA4
病人数目 CD44v6抗原 CD44v6表达 CD44v6表达在
表达在肿瘤 在粘膜 淋巴结转移
25毫克BIWA4 1* n.a. n.a. n.a.
2* ++/+++；＞80％ +++ ++/+++；＞90％
3* +++；＞90％ +++ +++；＞90％
50毫克BIWA4 4* +++；＞90％ +++ +++；＞90％
8* n.a. n.a. n.a.
10* ++；＞90％ +++ +++；＞90％
100毫克BIWA4 6* +++；＞80％ +++ n.a.
7 +++；＞90％ +++ n.a.
9 +++；＞90％ +++ n.a.
No＝数目，*＝包括在完全策略分析中；n.a.＝无可应用的
表7.2：6在血清中的可溶性CD44v6。以平均值表示(ng/ml)
A部分 B部分
99mTc-BIWA4 186Re-BIWA4[毫居里/米2]
25毫克 50毫克 100毫克
20 30 40 50 60
BIWA4 BIWA4 BIWA4
N 3 4 3 2 4 3 6 5
预先给药 203 337 174 408 262 346 171 160
21小时 223 301 179 396 177 403 199 170
48小时 200 275 157 384 198 423 199 174
72小时 140 386 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
144小时 188 282 182 444 284 516 233 195
240/336小时 n.a. n.a. n.a. 445 337 n.a. n.a. n.a.
第6周 203 310 210 289 220 487 226 162
n.a.＝无可应用的，数据包括第二次给药
要点-结论：效力结果：A部分： 由A部分的结果证实，依据血液浓度及组织摄入水平，可 证实50毫克BIWA4是治疗的最适宜剂量。以放射闪烁照相法 及活组织检测对分布进行评估，发现几乎在所有的情况下，与 其它组织比较，肿瘤中的分布最高。在肿瘤中放射活性摄入随 时间而增加。在原发肿瘤及淋巴结转移肿瘤中，分别有超过80 ％及90％的细胞表达CD44v6，且还在所有获得的粘膜待检品 中表达。 在50毫克BIWA4剂量组中，肿瘤大小与放射活性的摄入 之间并未观察到相关性。在给药99mTc-BIWA4之前及之后，可 溶性CD44v6的量似乎是恒定的。 所测得的BIWA4浓度，在25毫克至100毫克BIWA4范 围内是与剂量成比例的。所给药剂量的中度量经由肾脏排泄。 在尿中排出的注入剂量百分率(％ID)于所有剂量组中是类似的。 B部分： 由B部分的数据显示，病人在最大耐受剂量下(MTD)可临 床受益自186Re-BIWA4治疗。以60毫居里/米2治疗的5位病人 中有1位疾病稳定。六位中有三位在50毫居里/米2的最大耐受 剂量下疾病稳定。在接受第二剂50毫居里/米2的这些病人中， 直到127及173天之间才有进展。放射免疫闪烁照相术显示肿 瘤组织中有放射活性摄入。不考虑剂量，在其他组织中的生物 分布是相当的。剂量学分析并未显示在肿瘤以外的组织中有非 预期的高吸收剂量，睾丸除外。所测及的可溶性CD44v6含量 对186Re-BIWA4治疗病人而言倾向增加。 BIWA4的血浆浓度的高峰在0.92小时，且对BIWA4而言， 由ELISA测定可知抗体以94小时的几何平均半衰期消去。对 50毫克BIWA4剂量组而言，Cmax及AUC数值(ELISA)和在A 部分所得的相似。安全性结果：A部分： 对单一剂BIWA4偶联低放射剂量的锝-99的耐受性是可 接受的。三个严重不良作用中的二个可归因于手术造成的并发 症。 B部分： 最大耐受剂量(MTD)为50毫居里/米2 186Re-BIWA4。剂 量-限制的不良作用是与剂量有关的，先是血小板及白细胞可 逆地减少，接下来是个别病人的发烧。血小板减少症的临床症 状是轻微的瘀斑。 在以较高放射剂量处理的病人中可观察到粘膜炎，但非 剂量-限制的。 在试验过程中并未观察到在甲状腺刺激激素(TSH)数值 上有何相关的变化。 有12位病人经历严重的不良作用。其中，六位病人在试 验B部分的过程中死亡，主要是由于基础疾病的进展。 过敏反应罕见，有一人是严重的药物-相关的Quincke′s 肿。在输注药物期间或之后短时间，并无过敏反应发生。 有二位病人发生HAHAs。重复的给药并不会诱使HAHA 的发生。结论：结果显示肿瘤组织中有186Re-BIWA4的摄入，且对于有 头及颈部晚期鳞状细胞癌病人有临床益处。安全性概况似乎是 可接受的。BIWA4显示出与剂量成比例的药物代谢动力学， 且在50毫克和100毫克BIWA4剂量之间，肿瘤的摄入不会 有关联性的改变。
实施例4
引言。有晚期头及颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的病人，发展成局部区域性复发肿瘤和/或远端转移的危险性增加。对这些病人而言，有效辅助性全身治疗法的发展是有必要的。已知HNSCC确实是放射敏感的，利用单克隆抗体将放射核素选择性的靶向HNSCC的放射免疫治疗型式，将是较有效的治疗法。
目的。为了确定以铼-186(186Re)-标记的人源化单克隆抗体BIWA4在HNSCC病人的放射免疫疗法的安全性，最大耐受剂量(MTD)，免疫原性及效力。
病人及方法。在HNSCC病人中进行I期剂量阶梯式扩大研究，而这些病人并无治愈的治疗选择可采用。在共20位病人中，经186Re-标记的BIWA4以20，30，40，50或60毫居里/米2的剂量于静脉内给药。有三位病人，在50或60毫居里/米2剂量后至少3个月，接受第二剂50毫居里/米2。
结果。所有单一剂以及重复给药均可良好耐受，且并未观察到急性不良作用的迹象。在较高剂量下仅有明显的毒性，表现为口腔粘膜炎和剂量-限制的骨髓毒性包括血小板减少症及白细胞减少症。MTD确定在50毫居里/米2。一病人在给药单一剂后发生人-抗-人应答。在以最高剂量水平治疗的5位病人中可观察到稳定的疾病，持续4至19周。
结论。HNSCC病人中经186Re-标记的BIWA4的放射免疫疗法似乎是安全的，且可达到杀灭肿瘤的剂量。再者，由于低的免疫原性，因此重复给药似乎是可能的。此I期研究的结果，鼓励了以铼-186(186Re)-标记的人源化单克隆抗体BIWA4放射免疫治疗朝向对头及颈部癌症病人的辅助性治疗的进一步发展。
【序列表】
<110>贝林格尔.英格海姆国际有限公司(Boehringer Ingelheim International GmbH)
<120>CD44v6特异性的抗体
<130>1-1212 PCT
<140>待定
<141>2002-05-16
<150>EP 01112237.1
<151>2001-05-18
<150>US 60/325147
<151>2001-09-26
<160>18
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>114
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人源化抗体序列
<400>1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Ile
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210>2
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人源化抗体序列
<400>2
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Ile
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>3
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人源化抗体序列
<400>3
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Ile
20 25 30
Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ile Leu Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>4
<211>342
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人源化抗体序列
<400>4
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctaagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgaca tgtcttgggt tcgccaggct 120
ccggggaagg ggctggagtg ggtctcaacc attagtagtg gtggtagtta cacctactat 180
ctagacagta taaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtac 240
ctgcaaatga acagtctgag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagacagggg 300
ttggactact ggggtcgagg aaccttagtc accgtctcct ca 342
<210>5
<211>318
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人源化抗体序列
<400>5
gaaattgttc tcacccagtc tccagcaacc ctgtctctgt ctccagggga gagggccacc 60
ctgtcctgca gtgccagctc aagtataaat tacatatact ggtaccagca gaagccagga 120
caggctccta gactcttgat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgcgcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg aaccgacttc actctcacaa tcagcagcct ggagcctgaa 240
gattttgccg tttattactg cctgcagtgg agtagtaacc cgctcacatt cggtggtggg 300
accaaggtgg agattaaa 318
<210>6
<211>318
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人源化抗体序列
<400>6
gaaattgttc tcacccagtc tccagcaacc ctgtctctgt ctccagggga gagggccacc 60
ctgtcctgca gtgccagctc aagtataaat tacatatact ggctccagca gaagccagga 120
caggctccta gaatcttgat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgcgcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg aaccgacttc actctcacaa tcagcagcct ggagcctgaa 240
gattttgccg tttattactg cctgcagtgg agtagtaacc cgctcacatt cggtggtggg 300
accaaggtgg agattaaa 318
<210>7
<211>444
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人源化抗体序列
<400>7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Ile
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Ly s
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
340 345 350
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210>8
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人源化抗体序列
<400>8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Ile
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>9
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人源化抗体序列
<400>9
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Ile
20 25 30
Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ile Leu Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>10
<211>2135
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人源化抗体序列
<400>10
aagctttgac agacgcacaa ccctggactc ccaagtcttt ctcttcagtg acaaacacag 60
acataggata tcacatttgc ttctgacaca actgtgttca ctagcagcct caaacagaca 120
ccatgaactt tgggctcagc ttgattttcc ttgtcctaat tttaaaaggt gtccagtgtg 180
aagtgcagct ggtggagtct gggggaggct tagtgaagcc tggagggtcc ctaagactct 240
cctgtgcagc ctctggattc actttcagta gctatgacat gtcttgggtt cgccaggctc 300
cggggaaggg gctggagtgg gtctcaacca ttagtagtgg tggtagttac acctactatc 360
tagacagtat aaagggccga ttcaccatct ccagagacaa tgccaagaac tccctgtacc 420
tgcaaatgaa cagtctgagg gctgaggaca cggccgtgta ttactgtgca agacaggggt 480
tggactactg gggtcgagga accttagtca ccgtctcctc agctagcacc aagggcccat 540
cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct 600
gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga 660
ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca 720
gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc 780
acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttggtga gaggccagca cagggaggga 840
gggtgtctgc tggaagcagg ctcagcgctc ctgcctggac gcatcccggc tatgcagccc 900
cagtccaggg cagcaaggca ggccccgtct gcctcttcac ccggagcctc tgcccgcccc 960
actcatgctc agggagaggg tcttctggct ttttcccagg ctctgggcag gcacaggcta 1020
ggtgccccta acccaggccc tgcacacaaa ggggcaggtg ctgggctcag acctgccaag 1080
agccatatcc gggaggaccc tgcccctgac ctaagcccac cccaaaggcc aaactctcca 1140
ctccctcagc tcggacacct tctctcctcc cagattccag taactcccaa tcttctctct 1200
gcagagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagg taagccagcc 1260
caggcctcgc cctccagctc aaggcgggac aggtgcccta gagtagcctg catccaggga 1320
caggccccag ccgggtgctg acacgtccac ctccatctct tcctcagcac ctgaactcct 1380
ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg 1440
gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt 1500
caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca 1560
gtacaacagc acgtaccggg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa 1620
tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac 1680
catctccaaa gccaaaggtg ggacccgtgg ggtgcgaggg ccacatggac agaggccggc 1740
tcggcccacc ctctgccctg agagtgaccg ctgtaccaac ctctgtccta cagggcagcc 1800
ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt 1860
cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag 1920
caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc 1980
cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt 2040
ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct 2100
gtctccgggt aaatgagtgc gacggccgcg aattc 2135
<210>11
<211>785
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人源化抗体序列
<400>11
aagcttgatc ttcaggatat cacatttgct tctgacacaa ctgtgttcac tagcaacctc 60
aaacagacac catggatttt caggtgcaga ttttcagctt cctgctaatg agtgcctcag 120
tcataatgtc caggggagaa attgttctca cccagtctcc agcaaccctg tctctgtctc 180
caggggagag ggccaccctg tcctgcagtg ccagctcaag tataaattac atatactggt 240
accagcagaa gccaggacag gctcctagac tcttgattta tctcacatcc aacctggctt 300
ctggagtccc tgcgcgcttc agtggcagtg ggtctggaac cgacttcact ctcacaatca 360
gcagcctgga gcctgaagat tttgccgttt attactgcct gcagtggagt agtaacccgc 420
tcacattcgg tggtgggacc aaggtggaga ttaaacggac tgtggctgca ccatctgtct 480
tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgctagcgtt gtgtgcctgc 540
tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat 600
cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca 660
gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag 720
tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttagg 780
aattc 785
<210>12
<211>785
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人源化抗体序列
<400>12
aagcttgatc ttcaggatat cacatttgct tctgacacaa ctgtgttcac tagcaacctc 60
aaacagacac catggatttt caggtgcaga ttttcagctt cctgctaatg agtgcctcag 120
tcataatgtc caggggagaa attgttctca cccagtctcc agcaaccctg tctctgtctc 180
caggggagag ggccaccctg tcctgcagtg ccagctcaag tataaattac atatactggc 240
tccagcagaa gccaggacag gctcctagaa tcttgattta tctcacatcc aacctggctt 300
ctggagtccc tgcgcgcttc agtggcagtg ggtctggaac cgacttcact ctcacaatca 360
gcagcctgga gcctgaagat tttgccgttt attactgcct gcagtggagt agtaacccgc 420
tcacattcgg tggtgggacc aaggtggaga ttaaacggac tgtggctgca ccatctgtct 480
tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgctagcgtt gtgtgcctgc 540
tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat 600
cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca 660
gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag 720
tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttagg 780
aattc 785
<210>13
<211>1392
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人源化抗体序列
<400>13
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct aagactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatgacatgt cttgggttcg ccaggctccg 180
gggaaggggc tggagtgggt ctcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactatcta 240
gacagtataa agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cctgtacctg 300
caaatgaaca gtctgagggc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaag acaggggttg 360
gactactggg gtcgaggaac cttagtcacc gtctcctcag ctagcaccaa gggcccatcg 420
gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480
ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540
agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 720
acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 780
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1140
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1260
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380
ccgggtaaat ga 1392
<210>14
<211>702
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人源化抗体序列
<400>14
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctgctct ggctcccaga taccaccgga 60
gaaattgttc tcacccagtc tccagcaacc ctgtctctgt ctccagggga gagggccacc 120
ctgtcctgca gtgccagctc aagtataaat tacatatact ggtaccagca gaagccagga 180
caggctccta gactcttgat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgcgcgc 240
ttcagtggca gtgggtctgg aaccgacttc actctcacaa tcagcagcct ggagcctgaa 300
gattttgccg tttattactg cctgcagtgg agtagtaacc cgctcacatt cggtggtggg 360
accaaggtgg agattaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ga 702
<210>15
<211>702
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人源化抗体序列
<400>15
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctgctct ggctcccaga taccaccgga 60
gaaattgttc tcacccagtc tccagcaacc ctgtctctgt ctccagggga gagggccacc 120
ctgtcctgca gtgccagctc aagtataaat tacatatact ggctccagca gaagccagga 180
caggctccta gaatcttgat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgcgcgc 240
ttcagtggca gtgggtctgg aaccgacttc actctcacaa tcagcagcct ggagcctgaa 300
gattttgccg tttattactg cctgcagtgg agtagtaacc cgctcacatt cggtggtggg 360
accaaggtgg agattaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ga 702
<210>16
<211>9568
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人源化抗体序列
<400>16
ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 60
ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 120
ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 180
ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtaggg 240
tcgcgacgta ccgggccccc cctcgattaa ttaatcgagc tactagcttt gcttctcaat 300
ttcttatttg cataatgaga aaaaaaggaa aattaatttt aacaccaatt cagtagttga 360
ttgagcaaat gcgttgccaa aaaggatgct ttagagacag tgttctctgc acagataagg 420
acaaacatta ttcagaggga gtacccagag ctgagactcc taagccagtg agtggcacag 480
cattctaggg agaaatatgc ttgtcatcac cgaagcctga ttccgtagag ccacaccttg 540
gtaagggcca atctgctcac acaggataga gagggcagga gccagggcag agcatataag 600
gtgaggtagg atcagttgct cctcacattt gcttctgaca tagttgtgcc agcatggagg 660
aatcgatcct ccatgcttga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg 720
gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg 780
ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc 840
ctgaatgaac tgcaggtaag tgcggccgct ctaggcctcc aaaaaagcct cctcactact 900
tctggaatag ctcagaggcc gaggcggcct cggcctctgc ataaataaaa aaaattagtc 960
agccatgcat ggggcggaga atgggcggaa ctgggcggag ttaggggcgg gatgggcgga 1020
gttaggggcg ggactatggt tgctgactaa ttgagatgca tgctttgcat acttctgcct 1080
gctggggagc ctggggactt tccacacctg gttgctgact aattgagatg catgctttgc 1140
atacttctgc ctgctgggga gcctggggac tttccacacc ctaactgaca cacattccac 1200
agaattaatt cccctagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca 1260
tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac 1320
gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact 1380
ttccattgac gtcaatgggt ggactattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa 1440
gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg 1500
cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta 1560
gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg 1620
tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg 1680
caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg 1740
ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctgggtacgt gaaccgtcag 1800
atcgcctgga gacgccatca cagatctctc accatggaag ccccagctca gcttctcttc 1860
ctcctgctgc tctggctccc agataccacc ggagaaattg ttctcaccca gtctccagca 1920
accctgtctc tgtctccagg ggagagggcc accctgtcct gcagtgccag ctcaagtata 1980
aattacatat actggtacca gcagaagcca ggacaggctc ctagactctt gatttatctc 2040
acatccaacc tggcttctgg agtccctgcg cgcttcagtg gcagtgggtc tggaaccgac 2100
ttcactctca caatcagcag cctggagcct gaagattttg ccgtttatta ctgcctgcag 2160
tggagtagta acccgctcac attcggtggt gggaccaagg tggagattaa acgtacggtg 2220
gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 2280
tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 2340
gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac 2400
agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa 2460
gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 2520
aggggagagt gttgaattca gatccgttaa cggttaccaa ctacctagac tggattcgtg 2580
acaacatgcg gccgtgatat ctacgtatga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag 2640
ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact 2700
gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt 2760
ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat 2820
gctggggatg cggtgggctc tatggaacca gctgggacta gtagctttgc ttctcaattt 2880
cttatttgca taatgagaaa aaaaggaaaa ttaattttaa caccaattca gtagttgatt 2940
gagcaaatgc gttgccaaaa aggatgcttt agagacagtg ttctctgcac agataaggac 3000
aaacattatt cagagggagt acccagagct gagactccta agccagtgag tggcacagca 3060
ttctagggag aaatatgctt gtcatcaccg aagcctgatt ccgtagagcc acaccttggt 3120
aagggccaat ctgctcacac aggatagaga gggcaggagc cagggcagag catataaggt 3180
gaggtaggat cagttgctcc tcacatttgc ttctgacata gttgtgttgg gagcttggat 3240
agcttggaca gctcagggct gcgatttcgc gccaaacttg acggcaatcc tagcgtgaag 3300
gctggtagga ttttatcccc gctgccatca tggttcgacc attgaactgc atcgtcgccg 3360
tgtcccaaaa tatggggatt ggcaagaacg gagacctacc ctggcctccg ctcaggaacg 3420
agttcaagta cttccaaaga atgaccacaa cctcttcagt ggaaggtaaa cagaatctgg 3480
tgattatggg taggaaaacc tggttctcca ttcctgagaa gaatcgacct ttaaaggaca 3540
gaattaatat agttctcagt agagaactca aagaaccacc acgaggagct cattttcttg 3600
ccaaaagttt ggatgatgcc ttaagactta ttgaacaacc ggaattggca agtaaagtag 3660
acatggtttg gatagtcgga ggcagttctg tttaccagga agccatgaat caaccaggcc 3720
accttagact ctttgtgaca aggatcatgc aggaatttga aagtgacacg tttttcccag 3780
aaattgattt ggggaaatat aaacttctcc cagaataccc aggcgtcctc tctgaggtcc 3840
aggaggaaaa aggcatcaag tataagtttg aagtctacga gaagaaagac taacaggaag 3900
atgctttcaa gttctctgct cccctcctaa agctatgcat ttttataaga ccatgggact 3960
tttgctggct ttagatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc 4020
ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 4080
aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg 4140
gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg 4200
ggctctatgg aaccagctgg ggctcgaagc ggccgctccg gatatgccaa gtacgccccc 4260
tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg 4320
ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg 4380
gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct 4440
ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa 4500
atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt 4560
ctatataagc agagctgggt acgtcctcac attcagtgat cagcactgaa cacagacccg 4620
tcgacatgga gtttgggctg agctggcttt ttcttgtggc tattttaaaa ggtgtccagt 4680
gtgaagtgca gctggtggag tctgggggag gcttagtgaa gcctggaggg tccctaagac 4740
tctcctgtgc agcctctgga ttcactttca gtagctatga catgtcttgg gttcgccagg 4800
ctccggggaa ggggctggag tgggtctcaa ccattagtag tggtggtagt tacacctact 4860
atctagacag tataaagggc cgattcacca tctccagaga caatgccaag aactccctgt 4920
acctgcaaat gaacagtctg agggctgagg acacggccgt gtattactgt gcaagacagg 4980
ggttggacta ctggggtcga ggaaccttag tcaccgtctc ctcagctagc accaagggcc 5040
catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg 5100
gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc 5160
tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca 5220
gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga 5280
atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct tgtgacaaaa 5340
ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct 5400
tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg 5460
tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg 5520
aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg 5580
tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg 5640
tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc 5700
cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg 5760
tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga 5820
gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct 5880
ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct 5940
tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc 6000
tgtctccggg taaatgagga tccgttaacg gttaccaact acctagactg gattcgtgac 6060
aacatgcggc cgtgatatct acgtatgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc 6120
atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 6180
cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 6240
ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 6300
tggggatgcg gtgggctcta tggaaccagc tggggctcga cagcgctgcg atcgcctcga 6360
ggccgctact aactctctcc tccctccttt ttcctgcagg acgaggcagc gcggctatcg 6420
tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga 6480
agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct 6540
cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg 6600
gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg 6660
gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc 6720
gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat 6780
ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 6840
tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 6900
gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct 6960
cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc 7020
tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca 7080
ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga 7140
tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccaacttg tttattgcag 7200
cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 7260
cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatct atcttatcat gtctggatcg 7320
cggccggccg caccgcggtg gagctttaat taaggcgcgc cagctccagc ttttgttccc 7380
tttagtgagg gttaatttcg agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa 7440
attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct 7500
ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 7560
agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 7620
gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 7680
ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 7740
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 7800
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 7860
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 7920
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 7980
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 8040
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 8100
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 8160
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 8220
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ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 8340
ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 8400
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cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 8520
attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 8580
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ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 8880
ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 8940
gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 9000
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tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 9180
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cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccaca 9568
<210>17
<211>6414
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：质粒
<400>17
tcgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 60
cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 120
caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 180
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ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca 540
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cttctgcagg tcgacatcga tggatccggt acctcgagcg cgaattctct agaggatctt 720
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ttgctttgct atttacacca caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga 1140
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aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga 1260
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cccagaaatt gatttggaga aatataaact tctcccagag tacccagggg tcctttctga 3120
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tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga 4680
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<210>18
<211>6062
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：质粒
<400>18
tcgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 60
cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 120
caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 180
gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 240
tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 300
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cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt 3720
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ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca 4980
acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata 5040
gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc 5100
tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca 5160
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actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg 5280
taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa 5340
tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt 5400
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gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga 5580
gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac 5640
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gaactgagat acctacagcg tgagcattga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag 5880
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