在含水介质中在酸存在下从谷蛋白 制备富麦醇溶蛋白和富麦 谷蛋白级分的方法 本发明涉及在含水介质中在酸存在下从谷蛋白制备富麦醇溶蛋白和富麦谷蛋白的方法。
在专利文献及科学文献中，已描述了分离小麦的谷蛋白为富麦醇溶蛋白和富麦谷蛋白级分的若干方法。这些级分的用途也已是众多专利出版物及科学出版物的主题。
已研究了实验室规模的采用不同溶剂和别的条件分离这两种级分的技术。在图书“Proteines vegetales”(1985)，p.161-210中，Popineau报导了对这些技术的详细评论，但在大多数情况下，这些技术不能被推断为是工业规模的，因为这些技术通常使用了食品制备中不许使用的溶剂，而且这些技术包括例如制备色谱的步骤，而这一步骤虽然适用于药物用途，但是太昂贵了因而不适用于食品工业。
在允许用于制备食品组分的溶剂中，以实验室规模检验了水-乙醇混合物和乙酸溶液用于分离蛋白质级分的能力。
在EP685164中描述了一种萃取方法，在这一方法中，利用了浓度为30-70％体积的乙醇水溶液、浓度为10-20％体积的异丙醇或正丙醇水溶液，或浓度为20-50％体积的丙酮水溶液来制备麦醇溶蛋白浓度高达80％或大于80％的级分。此萃取也可利用浓度为5-30％体积及pH为3.5～5.5的乙醇的酸性水溶液来进行，得到浓度为50％或更大的麦醇溶蛋白级分。在这些能用的酸中，有乙酸、柠檬酸、马来酸、乳酸、己二酸、富马酸、酒石酸、葡糖酸、磷酸及肌醇六磷酸。
因为使用可燃性溶剂需要额外的安全措施，所以人们认为获得不需要这些溶剂的方法是有利的。这种方法描述在C.de Meester所著的“IndustriesAlimentaires et Agricoles”(1974)之中，在这种方法中用0.01-0.1M乙酸溶液从有生命的小麦地谷蛋白中萃取蛋白质。在萃取1～8小时后，最终产率为20～55％。在中性pH用沉淀法回收富麦醇溶蛋白这一可溶级分。因为不溶的麦醇溶蛋白是很粘的，所以这种技术不很适于工业应用，而且在回收过程中必须避免蛋白质沉淀阶段。这一方法在实验室规模已精心运作，但在工业规模并不可行。
在WO9710260中描述了另一种无溶剂方法。此专利申请描述了一种将小麦的谷蛋白分离的方法。根据这一方法，首先将小麦的谷蛋白在还原剂的存在下分散在处于第一酸性pH的含水酸性介质中，以还原在谷蛋白中的二硫键。然后将分散液的pH升到高于该第一pH的第二水平，使麦谷蛋白沉淀，而同时留下悬浮于分散液中的麦醇溶蛋白，最终将麦醇溶蛋白和麦谷蛋白分离为各自的级分。
EP992193也提及一种含水萃取法，此法使用其pH小于或等于4.5的含有0.1～10％重量/体积至少一种有机酸的水溶液。在这些可选择的有机酸中，记述了柠檬酸、乳酸、马来酸、乙酸，但也可使用磷酸及其盐。此申请在含水萃取如何进行方面没有提供更详细情况。
在Berot等人的“Intern.Jonrnal of Food Science & Technology”(1994)，p.489-502中，描述了用酸性含水溶液分离谷蛋白的中试规模方法。根据这一出版物，将小麦的谷蛋白和稀酸溶液在高速剪切混合机中混合2分钟，并继续搅拌30分钟。含水溶剂与谷蛋白的比例在7∶1至16∶1(v/w)之间。用Westfalia水平离心倾析器将可溶的富麦醇溶蛋白级分分离，然后将残留物再与水或稀酸混合，并进行第二次离心分离。获得不溶的富麦谷蛋白级分和中间级分。此中间级分的全部特征与小麦的谷蛋白相差不多。
虽然这一方法提供了富麦醇溶蛋白，但是因为以副产物获得中间级分，所以不大具有吸引力。考虑到产率，这一副产物被认为是一大缺点。
此外，此加工装置是很复杂的，值得简化，优选已分离物不要失去官能性。
Berot方法除了其复杂性之外，人们尚观察到中间体级分不需通过与新鲜谷蛋白回混而再加工。确实观察到中间产物的再循环能导致级分的纯度和质量降低。
本发明的目的是提供一种在含水介质中和在酸存在下从谷蛋白制备富麦醇溶蛋白及富麦谷蛋白级分的方法，这一方法不显示上述缺点。
这一目的通过提供一种在含水介质中和在酸存在下从谷蛋白制备富麦醇溶蛋白和富麦谷蛋白的方法而达到了。但在该方法中将谷蛋白连续或不连续分散于水中直至干物质在5～30％之间为止，其中
*分散液的pH控制在4.4与4.8之间，及
*将谷蛋白-水混合物进行剪切处理，
通过处理，此分散液能被连续或不连续地分离为富麦醇溶蛋白和富麦谷蛋白级分，由此获得麦醇溶蛋白/麦谷蛋白比值至少为2.5的单一富麦醇溶蛋白级分，也获得麦醇溶蛋白/麦谷蛋白比值小于0.8的单一富麦谷蛋白级分。
在根据本发明的一种优选方法中，将谷蛋白—水混合物进行剪切处理，在这一方法中，分离后谷蛋白分散液的沉降物体积按“旋转检验”测得为在15与35％之间。
更优选的是，在根据本发明的一种方法中，该沉降物体积在20与30％之间。
在根据本发明的另一优选方法中，该沉降物含有的在谷蛋白分散液中存在的干物质在48与58％之间。
更优选的是，在根据本发明的方法中，该沉降物含有的在谷蛋白分散液中存在的干物质在50与55％之间。
在根据本发明的另一优选方法中，分散液的pH被控制在4.5与4.7之间。
优选的是，在根据本发明的方法中，可以通过在少于60分钟的时间内使用混合手段，以500至3000rpm的转速将谷蛋白与水混合，而将谷蛋白分散。
更优选的是，在根据本发明的方法中，混合在小于30分钟的时间内进行。
在根据本发明的优选方法中，分散液的分离以离心方式进行，例如采用自动自排渣离心机的方式或倾析器离心的方式。
在根据本发明的另一优选方法中，分散液的干物质含量在10至15％之间。
在根据本发明又一别的优选方法中，磷酸被用作为酸。
现在将对本发明作更详细描述。详细描述的目的是为了给予本发明更清晰的认识，和指出本发明的别的优点和详情。此外，将采用阐述性实施例。这种详细描述和这些阐述性实施例决不能解释为对本发明的应用领域或如在权利要求中所要求的专利权的限制。
在这一详细描述中将参考附图，其中：
-图1是根据本发明的典型分离方法的示意图。
-图2是分离麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、清蛋白和球蛋白的萃取方法的示意图。
可以用有机酸或无机酸进行酸化。可以采用的典型酸类是(虽然它们并不限于此)例如乙酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、酒石酸、富马酸、盐酸、硫酸和磷酸。优选使用磷酸。分散液的pH优选控制在4.5与4.7之间。更优选是约4.6。
在分散液中的谷蛋白浓度在5-30％w/v之间，在10与15％w/v之间的浓度是优选的。可通过采用例如带刀或带有别的结构的混合叶片，在500-3000rpm下旋转，小麦的谷蛋白与水混合足以获得能分离成为本发明级分的分散液的时间，而将麦谷蛋白分散。典型的混合时间是小于1小时，优选小于30分钟。
必须如此选择机械输入和混合条件：所得的分散液能分离成其麦醇溶蛋白/麦谷蛋白比例至少为2.5的富麦醇溶蛋白级分和其显示的麦醇溶蛋白/麦谷蛋白比例小于0.8的富麦谷蛋白级分。在标准谷蛋白组成中，麦醇溶蛋白/麦谷蛋白的比例典型地在1与1.3之间。这些不同小麦的蛋白质类别用这里公开的分析方法来测定。
此方法利用在不同溶剂中小麦的蛋白质类别的不同溶解度特点来分离麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、清蛋白和球蛋白。蛋白质在不同溶剂中的分布用克耶达分析法来定量。
-设备
·40ml聚丙烯离心管
·离心机(可以在15000g下旋转)
·分析天平
·0.5M NaCl
·1.5％SDS溶液
·95％乙醇
·10℃下的培养室
·克耶达设备
·克耶达小片
-方法(如图2所示)
全部萃取均是在室温下进行30分钟。
·在±40ml PP-离心管中称取样品。对麦粉来说称2g，对谷蛋白来说称200mg，对被加工样品来说称的数量相当于蛋白质±150-160mg。
·加入20ml 0.5M NaCl。在室温(RT)下搅拌30分钟。萃取之后，在RT下于500g之下离心15分钟。小心地倾析上层清液入清洁的PP管中。往残留物(沉淀A)中加入另外20ml 0.5M NaCl，重复萃取和离心。将第2份上层清液与第1份合并，然后在RT下于15000g之下离心15分钟。该上层清液含清蛋白和球蛋白。
·往残留物(沉淀B)中加入6ml 1.5％SDS溶液。将此混合物均匀化，并与沉淀A混合。在RT下萃取30分钟。随后逐滴加入14ml无水乙醇，混合物在RT下再搅拌30分钟。在室温下于500g之下离心15分钟后，得到沉淀及上层清液3。对于所得沉淀重复全过程，产生沉淀C及上层清液4。
·在小烧杯中将上层清液3和4合并，并在10℃培养室中放置60分钟。产生细的沉淀，然后将此混合物倒入装有沉淀C的离心管中。马上将此混合物转移至离心机中，并在10℃下于15000g下旋转15分钟。产生含麦醇溶蛋白的上层清液及含麦谷蛋白的沉淀。
-克耶达测定
将此含清蛋白/球蛋白及麦醇溶蛋白的溶液(±40ml)定量转移至裂构烧瓶(750ml)中。加入小片、14ml浓硫酸和3滴辛醇(除泡剂)，并将此样品(约15ml)转移至克耶达管中，用标准克耶达法测定氮。
将麦谷蛋白级分冷冻干燥，以干燥产物测定其氮含量。
以在不同类别中发现的蛋白质数量来报导所得结果，并以回收的蛋白质的百分数表示。
人们业已发现，当机械能的输入导致分散液如用“旋转检验”测出的，显示特别的沉降物体积值时，则在离心之后能获得上述富麦醇溶蛋白和富麦谷蛋白级分。
这种“旋转检验”使用标准的实验室离心机，及15ml离心管(带0.1ml分刻度)。然后将10ml谷蛋白分散液灌入这些管中。在1800g下将这些管离心10分钟。随后测定沉降物的体积，它以％体积表示，它是沉淀物的ml值与离心管体积的ml值的比值乘以100。
然后将合适的分散液以其在20与35％之间、优选在20至30％之间的沉降物体积进行表征。因此沉降物含有在48至58％之间、更优选在50至55％之间的存在于谷蛋白分散液中的干物质。分散液的干物质可以在5至30％干物质之间、优选在10至15％干物质之间。如果剪切强度和/或混合时间不适合，则不可能获得相应于上述数值的级分。
分散液的分离以离心手段例如自除渣离心或倾析器离心来实现。离心设备在优化分离条件下使用。
根据本发明的典型分离方法典型地在10至40℃之间的温度下进行。根据如图1所示的图解，在混合罐中酸性溶液与干的小麦的谷蛋白混合，在此期间用pH计连续监控pH。然后将如此得到的谷蛋白分散液进行离心分离，由此得到富麦醇溶蛋白级分及富麦谷蛋白级分。此富麦醇溶蛋白级分在干燥之前能以超滤浓缩方式进行浓缩。然后此富麦醇溶蛋白级分能用任何已知方法进行干燥，喷雾干燥是优选的。透过物可以再循环并用于混合步骤。也将富麦谷蛋白干燥。
实施例：
实施例1：
间歇制备：
工业级干的小麦的谷蛋白被用作原料。在装有2251自来水和450g磷酸(75％)的容器中，用一个螺旋输送器(Katrion)通过一个管子将25kg工业级小麦的谷蛋白直接加到被搅拌的分散剂的旋涡中。用pH计连续地监控pH，并维持pH＝4.6。在10分钟的时间内，将谷蛋白分散，继续混合直到获得在其分散相中含有45至50％物质的分散液为止。这相应于“旋转检验”值为27％。
用高剪切混合器进行混合。用倾析器离心机(Westfalia CA150)将如此获得的分散液进行分离，调整离心机的设置以获得在倾析器的上层清液中所含的干物质约为45％。
然后将富麦醇溶蛋白级分进行喷雾干燥。此级分的蛋白质含量为80％。麦醇溶蛋白含量为蛋白总含量的68％，与之相比，天然的谷蛋白则为45～48％。麦醇溶蛋白/麦谷蛋白的比值为3.1。
在表1中，对由Berot法制得的谷蛋白级分样品(它们是收自Popineau etBerot的样品)与根据本发明方法制得的样品之间的组成作了比较。全部样品已用上述方法进行了分析。
根据Berot的方法 谷蛋白麦醇溶蛋 白 中间体麦谷蛋白 清蛋白/球蛋白 麦醇溶蛋白 麦谷蛋白 麦醇溶蛋白/麦谷蛋白比值 11,0-13,3 45,3-48,7 37,0-45,4 1,08-1,28 10,5 59,1 30,4 1,94 7,2 39,1 53,7 0,73 6,1 31 62,9 0,49
根据Amylum的方法 谷蛋白ABe麦醇溶蛋白ABe麦谷蛋白Afr麦醇溶蛋 白AFr麦谷蛋白 11,0-13,3 45,3-48,7 37,0-47,4 1,08-1,28 10,4 67,7 21,9 3,1 8,8 35,6 55,6 0,64 10,4 67,9 21,6 3,13 6,9 35,3 57,7 0,61
ABe：由在Amylum Belgium制的小麦的谷蛋白制得的样品
AFr：由在Amylum Prance制的小麦的谷蛋白制得的样品
表1：由按照Berot和按照Amylum方法制得的样品的组成，用上述方法(检验a)测出。数值以在样品中的全部蛋白质级分的％表示。
实施例2：
连续制备：
在装有2251自来水和450g磷酸(75％)的容器中，用一个螺旋输送器(Katrion)通过一个管子将25kg工业级小麦的谷蛋白直接加到被搅拌的分散剂的旋涡中。用pH计连续地监控pH，并维持pH＝4.6。在10分钟的时间内，将谷蛋白分散，继续混合直到获得其“旋转检验”值为25％的分散液为止。在谷蛋白被分散之后，提供必要的剪切以便在20分钟之内达到此检验值。
然后往此被搅拌分散液的涡旋中连续加入另外的水和谷蛋白，在此同时连续监控pH并通过加入磷酸维持pH在pH＝4.6。加入速度为每小时20kg谷蛋白和2001水。容器的溢流被引导到601的被搅动的缓冲容器中，此溢流用于连续地供应倾析器(Westfalia CA150)。所加入数量相应于通过倾析器而加工的数量(加入速度20l/小时；2500rpm；差异10-15)。如此获得的麦醇溶蛋白级分的干物质含量为6％，它被用超滤法进一步加工。透过的水在第一搅拌罐中被用于分散谷蛋白。干物质含量约为10％的保留物用喷雾干燥法干燥。
用碳酸钠将富麦谷蛋白中和至pH＝7，用水洗涤，然后在环状干燥器中干燥。