具有抗癌及抑制NO释放活性的新的螺环化合物BULBOPHYLLISPIRADIENONE及其衍生物.pdf

本发明涉及具有抑制肿瘤细胞活性及抑制巨噬细胞释放NO活性的新的螺环类化合物。本发明从兰科石豆兰属植物密花石豆兰Bulbophyllum odoratissimum Lindl.中分离得到1个新的螺环化合物bulbophyllispiradienone。该化合物在体外可以显著抑制巨噬细胞中NO的释放，同时对一些肿瘤细胞也有一定的抑制作用。本发明涉及的这些化合物可考虑用于防治肿瘤以及因NO在体内过度释放诱发的种种疾病。

1.  式I的化合物。

R₁，R₂，R₃，R₄，相互独立地代表氢、羟基、甲氧基，或者R₁和R₂，或R₂和R₃，或R₃和R₄被亚甲二氧基取代并和与其相连的碳原子形成五元环化合物。
R₅，R₆相互独立地代表氢、羟基、甲氧基。

2.  如权利要求1所述的化合物，其是：

4，  5-二羟基-2，3-二氢茚螺3′-甲氧基-4′，5′-亚甲二氧基-3′，5′-二烯-环己-2′-酮，俗名为bulbophyllispiradienone。

3.  权利要求1-2之一所述的新的螺环化合物对肿瘤细胞的抑制作用，以及作为癌症防治药物的应用。

4.  权利要求1-2之一所述的新的螺环化合物对巨噬细胞释放NO活性的抑制作用，以及它们用于因NO过度释放诱发的种种疾病的治疗药物。

5.  权利要求1-2之一所述的新的螺环化合物组成的药物制剂。

具有抗癌及抑制NO释放活性的新的螺环化合物bulbophyllispiradienone及其衍生物
技术领域
本发明涉及从兰科石豆兰属植物(Bulbophyllum)中提取分离的新化合物bulbophyllispiradienone及其衍生物，这些化合物在体外实验中对肿瘤细胞示有一定的抑制活性，对巨噬细胞释放NO也有明显的抑制活性，提示可能用于防治肿瘤以及防治因NO在体内过度释放诱发的种种疾病。
背景技术
生物体中NO由NO合成酶(NOS)调控产生。目前为止已经确定了三种同工酶：神经型NOS(又叫nNOS)，血管内皮型NOS(eNOS)和诱导型NOS(iNOS)。通常状态下，人体中nNOS和eNOS都在正常生理条件下通过调控NO的释放起到正常的生理作用。iNOS的表达与疾病，尤其是炎症和癌症有着密切的关联。由iNOS诱发的NO过多的释放，会非选择性地对细胞组织造成损伤，引发各种疾病。NO释放抑制剂可用于治疗细胞中由病理浓度的NO诱发或加重的各种疾病^[1]。
兰科石豆兰属植物(Bulbophyllum)主要分布于中国南方各省，到目前为止，尚未见到有关从石豆兰属植物中提取分离得到bulbophyllispiradienone这类骨架化合物的报道。
[1]谷口直之、铃木敬一朗，NOの生理作用と疾患，羊土社，2000。
发明内容
式I中的化合物：

R₁，R₂，R₃，R₄，相互独立地代表：
a)氢，
b)羟基，
c)甲氧基，
R₁和R₂，或R₂和R₃，或R₃和R₄被亚甲二氧基取代并和与其相联的碳原子形成五元环化合物。
R₅，R₆相互独立地代表：
a)氢，
b)羟基，
c)甲氧基。
本发明涉及4，5-二羟基-2，3-二氢茚螺3′-甲氧基-4′，5′-亚甲二氧基-3′，5′-二烯-环己-2′-酮，俗名为bulbophyllispiradienone及其取代基不同的新的螺环类化合物。本发明还涉及这些新的螺环类化合物对肿瘤细胞生长的抑制活性以及对巨噬细胞释放NO的抑制活性，以及它们在防治肿瘤及防治因体内NO过度释放诱发的神经性疾病，炎性疾病，自体免疫性疾病，心血管疾病等中的应用。
所述疾病可以是：脑缺血、缺氧和其他与炎症相关的神经性疾病。如多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏病、癫痫、精神分裂症，或者因心血管系统疾病以及自身免疫和/或炎症引起的疾病，如：高血压，脓毒症，类风湿性关节炎，骨关节炎，胰岛素依赖性糖尿病，骨盆/肠的炎性疾病，软膜蛛网膜炎，肾小球性肾炎，急性和慢性肝病，或炎性皮肤病如牛皮癣等。
具体实施方案
实施例1：新地螺环化合物Bulbophyllispiradienone的具体分离制备方法如下：
本发明原料来自于中国广西省，经香港嘉道理农场萧丽萍博士鉴定为兰科石豆兰属植物密花石豆兰(Bulbophyllum odoratissimum Lindl.)。
新鲜采集的原料室温干燥，粉碎，用10倍量的10％-100％乙醇回流提取2次，合并提取液，减压回收至干。该提取物用水分散后，用乙酸乙酯等剂量萃取3次，回收溶剂至干。将乙酸乙酯提取物进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(98∶2至97∶3)为洗脱剂，收集含石豆兰素G的馏分，重结晶即得，收率为十万分之三。
Bulbophyllispiradienone，白色柱状结晶(氯仿-甲醇)，mp.171-173℃，[α]_D³⁰+9.2°。ESI-MS(positive)给出m/z：325[M+Na]⁺和303[M+H]⁺。ESI-MS(negative)给出m/z：301[M-H]^-。通过ESI-MS图谱的综合分析，可以确定该化合物的分子量为302。HR-EI-MS给出m/z：[M]⁺302.078，计算值为302.0791，确定分子式为C₁₆H₁₄O₆。UV图谱(CH₃OH)λ_maxnm：239.2，272.0，333.2(logε3.82，3.75，2.72)]显示了典型苯的紫外吸收。IR中ν_max^KBrcm^-1 1670为羰基的吸收峰；1612，1488证明结构中有苯环存在。采用核磁共振仪(400MHz)测定了该化合物的¹H-NMR，¹³C-NMR，DEPT，HMQC，HMBC等，确定了该化合物的碳原子和氢原子归属。

Bulbophyllispiradienone的¹³C(100MHz)和¹H(400MHz)核磁共振数据(in MeOD)^*
No.                ¹³C                 ¹H
1(1’)             63.5s
2                  40.3t                2.50m，2.13m
3                  29.5t                3.16m，2.96m
3a                 132.4s
4                  142.9s
5                  146.0s
6                  115.2d               6.55d(8.0)
7                  115.0d               6.24d(8.0)
7a                 138.2s
2’                                   200.7s
3’                                   129.9s
4’                                   144.0s
5’                                   152.5s
6’                                   107.1d               5.41s
OCH₃              60.2q                3.75s
-O-CH₂-O-         103.9t               5.91d(12)
^*δin ppm，J(in parentheses)in Hz
具体实施例2：体外抗癌实验结果：
实验以体外培养的肝癌HepG2细胞为模型，以顺铂为阳性药，测定了bulbophyllispiradienone体外抗肿瘤的活性，其IC₅₀为31.6μM。
具体实施例3：体外抑制NO释放实验结果：
RAW264.7细胞(源于美国ATCC)，调整细胞浓度到1.2×10⁶/mL，以每孔200μL加入于96孔培养板中，5％CO₂，37℃，培养2小时。加入LPS(10μg/mL)2μL，IFN-γ(33ng/mL)2μL，样品DMSO溶液0.4μL，使LPS终浓度为100ng/mL，IFN-γ终浓度为100ng/mL，溶解样品的DMSO相对于培养基的含量为0.2％。培养16小时。随后取上清液100μL，加入事先调好的Griess试药，用酶联免疫检测仪在570nm(对照655nm)测定吸光度。由于文献报道quercetin有较好的NO产生抑制活性，因此选择quercetin为阳性对照药，其抑制NO释放的IC₅₀是26.8μM。

用此方法测定bulbophyllispiradienone抑制NO释放的IC₅₀为23μM。