酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂及其使用方法 【技术领域】
本发明是相关于抗菌化合物及其应用，尤其是相关于酰基氨基葡萄糖环肌六醇酰胺酶抑制剂及其在治疗细菌感染中的应用。
背景技术
真菌硫醇(MSH)是一种低分子量硫醇能够取代放线菌的谷胱甘肽(G.L.Newton et al.J.Bacteriol.(1996)178：1990)。与MCA(真菌硫醇自共轭酰胺酶)相结合，MSH能够起到一个重要作用，来保护放线菌不受烷化剂和其它毒素的侵蚀。(G.L.Newton，et al.Biochemistry(2000a)39：10739)。最近，另一种同源结核分支杆菌的酰胺酶，其可参与MSH的生化合成，也被描述和探讨。(G.L.Newton et al.J.Bacteriol.(2000)24：6958)。
好气菌要承受很多种氧化压力，包括大气氧化，基础新陈代谢，还有在病原生物中，寄主吞噬细胞为消灭入侵细菌而反应生成的毒性氧化剂。谷胱甘肽是真核细胞和格兰氏阴性细菌中主要的低分子量的硫醇，它能保护细胞抵御氧毒性和亲电毒性。(R.C.Fahey and A.R.Sundquist(1991)adv.Enzymol.64：1-53；Dolphin，et al，(1989)Glutathione：Chemical，Biochemical，and Medical Aspects pp 45-84，John Wiley&Sons，New York)。但是，放线菌包含链霉菌属和分支杆菌不产生谷胱甘肽而是产生毫摩尔单位的真菌硫醇(MSH，AcCys-GlcN-Ins)，一种不常见的氮基易咳净(N-acetylcysteine(AcCys))和1-D-Myo-inosityl-2-deoxy-α-D-glycopyranoside(GlcN-Ins)的共轭物。(G.L.Newton，et al(1996)J.Bacteriol.178：1990-1995；S.Sakuda，et al.，(1994)Biosci.Biotech.Biochem.58：1347-1348；H.S.C.spies and D.J.Streenkamp，(1994)Eur.J.Bichem.224：203-213；G.L.Newton，et al.(1995)Eur.J.Biochem.230：821-825)(图1A)。
病原菌的抗菌素抵抗力，包括病原放射菌，例如：结核分支杆菌的抗菌素抵抗力，是治疗细菌类疾病的一个广泛关注的难题。结核分支杆菌是结核病的病因，也是导致世界范围内大量患者死亡的元凶。(Zumla，A.et al.ClinicalReview：Tuberculosis.Br.Med.J.(1998)316：1962)。结核分支杆菌对一般性的抗结核药，例如雷米封(异烟肼)和利福平的高抗药性，以及在艾滋病人中的结核菌和鸟结核杆菌复合物的高发生率，重新唤起了人们对抗分支杆菌制剂的研发兴趣。
所以，医药界对一种能够减少对用于治疗人和动物细菌感染，象治疗细菌疾病结核等，对已知抗生素的抗药性新型化合物充满了期待。
【发明内容】
本发明通过提供一种化合物能够有效抑制分支杆菌酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶，例如真菌硫醇自共轭酰胺酶(MCA)，来接以上提及地和其它的一些业界难题。在第一实施例中，本发明酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂具有以下化学结构。
其中Z和其附加于上的碳可以构成单环，双元环，三元环，四元环，或五元环结构，其中每环包含5-7个结构成员，0-2个结构成员是独立从氧，硫和氮元素中选择，其余结构成员是碳，这里每环包含0-3个双键并且可以被最多四种取代物X1，X2，X3，X4取代。
这里，X1，X2，X3，和X4的可独立从-F，-Cl，-Br，-I，-OH，-OCH3，和-O(CH2)mQ选择，其中m是1到4之间的整数，并且Q可以从-NH2，-NH(CH2)SCH3，-N[(CH2)SCH3]2，-N+[(CH2)SCH3]3中选择，其中S等于从0到3的整数，N是从0到6的整数，R等于零或是从1到4之间的整数。
Y或是从“N取代2氨基咪唑酸”选择，
其中R1，R2，R4，R5和R6可以独立从-H，-CH3和-(CH2)PCH3中选择，P等于零或任何从1-3的整数，除去-CHR2和R3能结合形成-C＝CR7，产生咪唑环。同时R7是从下列中选择：H，
其中X5，X6和X7是从-H，-F，-Cl，-Br，-I，-OH，-OCH3，-NH2，-CONH2和-O(CH2)MQ中独立选择，M等于1-4之间的任何整数，Q是从-NH2，-NH(CH2)SCH3，-N[(CH2)SCH3]2，-N+[(CH2)SCH3]3中选择，S等于零或是任何1-3之间的整数，N是1-6之间的整数，R等于零或是1-4之间的整数。
或者，Y是-O-R8，其中R8是：
其中X8，X9是从-H，-F，-Cl，-Br，-I，-OH，-OCH3，-NH2，和-O(CH2)MQ中独立选择，M等于1-4之间的任何整数，Q是从-NH2，-NH(CH2)SCH3，
-N[(CH2)SCH3]2，-N+[(CH2)SCH3]3中选择，S等于零或是任何1-3之间的整数，N是1-6之间的整数，R等于零或是1-4之间的整数。
其中X10是从-H或-OH中选择，G是-H，-NH2，N+[(CH2)SCH3]3，-NHC(NH2)＝NH，或2-氨基咪唑酸，其中S等于0-3，R9是从-H，CH3，(CH2)SCH3中选择，S等于零或是任何1-3之间的整数。
在另一实施例中，本发明中的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂具有以下化学结构。
其中，M是1-6之间的整数，N是1-6之间的整数，O是1-6之间的整数，P是1-6之间的整数，Y1，Y2和Y3从-CH2-，-O-，-S-，-CO-，和-CH(CONHOH)-中独立选择，X1，X2是独立的-H或-OR，R是-H，葡萄糖，氨基葡萄糖，乙酰氨基葡萄糖，氨基葡萄糖纤维醇；R1和R2可独立从下列集合中选取，
其中R3，R4和R5可有选择的出现，并且当出现时，会独立从-H，-(CH2)mCH3中选取，m等于零或1-3之间的整数；
或者，R1和R2从以下集合中选取，
其中，R6是(CH2)qOCH3或(CH2)qCH3，其中q是1-11之间的整数，
其中，R7是(CH2)qOCH3或(CH2)qCH3，其中q是1-11之间的整数，
本发明的另一实施例提供了可以降低细菌抗生素抵抗力的方法，通过将酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂和病原酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶产生的细菌接触，从而有效地抑制了细菌的耐抗生素能力。分子内存在的抑制剂，可以减弱酰胺酶的活动，从而降低了真菌硫醇的含量，和原始细菌比较，耐抗生素能力大大降低。
本发明的另一实施例提供了可以降低抗生素抵抗力的方法，通过给药以一定剂量的本发明的抑制剂，来降低酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶产生的细菌的毒力。酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶产生的致病细菌的活动被充分抑制，细菌的生长率被降低，和原始细菌比较，其毒力大大降低。
对本发明的技术方案再详细叙述如下：
本发明一种化合物，其特征在于：其结构包含如下结构1和结构2：
其中Z和其附加于上的碳可以构成单环，双元环，三元环，四元环，或五元环结构，其中每环包含5-7个结构成员，0-2个结构成员是独立地从氧，硫和氮元素中选择，其余结构成员是碳，这里每环包含0-3个双键并且可以被最多四种取代物X1，X2，X3，和X4取代；
其中该X1，X2，X3，和X4可独立从-F，-Cl，-Br，-I，-OH，-OCH3，和-O(CH2)Mq选择，其中m是1到4之间的整数，并且Q可以从-NH2，-NH(CH2)SCH3，-N[(CH2)SCH3]2，-N+[(CH2)SCH3]3中选择，其中S等于从0到3的整数，N是从0到6的整数，R等于零或是从1到4之间的整数；
其中该Y是从“N取代2核苷酸”和”-O-R8”中选择，该“N取代2核苷酸”的结构是：
其中该R1，R2，R3，R4，R5和R6是独立从-H，-CH3和-(CH2)PCH3中选择，该P等于零或任何从1-3的整数，除去-CHR2和R3能结合形成-C＝CR7，产生咪唑环，同时R7是从下列中选择：H，
其中X5，X6和X7是从-H，-F，-Cl，-Br，-I，-OH，-OCH3，-NH2，-CONH2和-O(CH2)MQ中独立选择，M等于1-4之间的任何整数，Q是从-NH2，-NH(CH2)SCH3，-N[(CH2)SCH3]2，-N+[(CH2)SCH3]3中选择，S等于零或是任何1-3之间的整数，N是1-6之间的整数，R等于零或是1-4之间的整数；
另该Y的该-O-R8中，该R8是：
其中该X8，X9是从-H，-F，-Cl，-Br，-I，-OH，-OCH3，-NH2，和-O(CH2)MQ中独立选择，该M等于1-4之间的任何整数，该Q是从-NH2，-NH(CH2)SCH3，-N[(CH2)SCH3]2，-N+[(CH2)SCH3]3中选择，S等于零或1-3之间的整数，N是1-6之间的整数，R等于零或是1-4之间的整数；
其中该X10是从-H或-OH中选择，G是-H，-NH2，N+[(CH2)SCH3]3，-NHC(NH2)＝NH，或2-核苷酸，其中该S等于0-3，R9是从-H，CH3，(CH2)SCH3中选择，S等于零或是任何1-3之间的整数。
本发明一种化合物，其特征在于：其化学结构可以如该结构1所述，其中Z是可取代的或非取代的溴酪氨酸；或者如该结构2所述，Z是可取代的或非取代的溴酪氨酸衍生物：螺旋体异恶唑氨酸，其中n等于1或2具有结构1。
本发明一种化合物，其特征在于：其化学结构可以如该结构2，其中Y是：
本发明一种化合物，其特征在于：其化学结构可以如该结构2，其中Y是：
除去-CHR2和R3能结合形成-C＝CR7，产生咪唑环，同时R7是-H。
本发明一种化合物，其特征在于：其化学结构可以如该结构2，其中Z可以是7节环包含一个氧结构成员，W是-OH，N等于1或2。
其中，Y是-O-R8。
其中，Y是-O-R8，X8和X9是-Br，X10是-OH，n等于2，t等于0，同时G是NH2。
本发明一种化合物，其特征在于：其化学结构可以如该结构1，其中Z可以是6节环，X1和X3是-Br，X2是-O(CH2)mQ，m等于3，Q是-NH2，n等于1或2。
其中，Y是
除去-CHR2和R3能结合形成-C＝CR7，产生咪唑环，同时R7是-H。
其中，Y是
除去R4不存在，氮的正电荷也不存在。
本发明一种化合物，其特征在于：它具有如下化学结构：
本发明一种化合物，其特征在于：它具有如下化学结构：
本发明一组合物，其特征在于：它具有如下结构，
其中M是1-6之间的整数，N是1-6之间的整数，O是1-6之间的整数，P是1-6之间的整数，Y1，Y2和Y3从-CH2-，-O-，-S-，-CO-，和-CH(CONHOH)-中独立选择，X1，X2是独立的-H或-OR，R是-H，葡萄糖，氨基葡萄糖，乙酰氨基葡萄糖，氨基葡萄糖纤维醇；R1和R2可独立从下列集合中选取：
其中R3，R4和R5可有选择的出现，并且当出现时，会独立从-H，-(CH2)mCH3中选取，m等于零或1-3之间的整数；
或者，R1和R2从以下集合中选取，
其中，R6是(CH2)qOCH3或(CH2)qCH3，其中q是1-11之间的整数，
其中，R7是(CH2)qOCH3或(CH2)qCH3，其中q是1-11之间的整数，
其中Y1＝-CH2-，Y2＝-CO-，Y3＝-CH2-，m＝4，n＝4，o＝6，p＝5。
其中X1是-OR，R等于葡萄糖，X2＝-OR，R＝H，R2是：
R1是：
其中X1是-OR，R＝-H，X2＝-OR，R＝H，R2是：
R1是：
其中Y1，Y2，Y3是-CH2-，m＝n＝1，o等于任何从一到四的整数，p等于任何从一到四的整数，R2是：
其中，R7是(CH2)qOCH3或(CH2)qCH3，其中q是1-11之间的整数，R1是：
其中，R6是(CH2)qOCH3或(CH2)qCH3，其中q是1-11之间的整数。
本发明一种化合物，其特征在于：具有如下化学结构：
本发明一种化合物，其特征在于：它具有如下化学结构：
本发明一种化合物，其特征在于：它具有如下化学结构：
其中，该化合物为酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂。
其中，该化合物具有抗分支杆菌活性。
其中，该抗分支杆菌活性能够抗放线菌。
其中，该抗分支杆菌活性能够抗包皮垢分支杆菌。
其中，该抗分支杆菌活性能够抗结核分支杆菌。
本发明一种化合物，其特征在于：该化合物能够抑制抗生素产生杆菌的成长。
本发明一种能够减弱病原酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶产生的细菌的耐抗生素能力的方法，其特征在于：该方法包含：
将细菌引入本发明一种化合物，其中该化合物对酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶有抑制作用，而且，分子内存在的该化合物，和原始细菌相比较，能充分减弱细菌的耐抗生素能力。
其中，该方法的特征在于：其中该本发明一种化合物，其特征在于：其结构包含结构1和结构2：
其中，该方法的特征在于：其中该本发明一种该化合物有如下结构：
其中，该化合物具有如下结构：
其中，该化合物具有如下结构：
其中，该化合物具有如下结构：
其中，该化合物具有如下结构：
其中，该化合物具有如下结构：
其中，该方法的特征在于：其中该酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺是真菌硫醇衍生自共轭物，该酰胺酶是真菌硫醇自共轭酰胺酶。
其中，该方法的特征在于：其中该抑制剂抑制分子内产生的酰胺酶。
其中，该方法的特征在于：其中该抑制剂抑制分子内酰胺酶活性。
其中，该方法的特征在于：其中该细菌为放线菌。
其中，该方法的特征在于：其中该细菌为包皮垢分支杆菌。
其中，该方法的特征在于：其中该细菌为结核分支杆菌。
其中，该方法的特征在于：其中该酰胺酶为真菌硫醇自共轭酰胺酶。
其中，该方法的特征在于：其中该自共轭酰胺为真菌硫醇衍生自共轭酰胺。
本发明一种方法能够降低主体病原酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶产生的细菌，其特征在于：该方法包含：
对该主体给药以一定有效量的本发明之化合物，其中该化合物对酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶有抑制作用，其中对该主体给药的该抑制剂可以降低该主体的细菌成长率，从而和为给药的主体相比较降低该主体内细菌的毒性。
其中，该方法的特征在于：其中该所述之化合物，其结构包含结构1和结构2：
其中，该方法的特征在于：其中该化合物有如下结构：
其中，该方法的特征在于：其中该化合物有如下结构：
其中，该方法的特征在于：其中该化合物有如下结构：
其中，该方法的特征在于：其中该化合物有如下结构：
其中，该方法的特征在于：其中该化合物有如下结构：
其中，该方法的特征在于：其中该化合物有如下结构：
其中，该方法的特征在于：其中还包含对该主体给药以一定有效量的抗生素。
其中，该方法的特征在于：其中该抗生素包含可作为此用途的抗生素包括浅蓝霉素(cerulenin)，红霉素Erythromycin，exfoliamycin，石榴菌素(granaticin)，kinamycin，洁霉素，丝裂霉素mitomycin，石脑素naphthomycin，利福霉素rifamycin，链丝菌素streptothricin，和万古霉素vancomycin等抗生素。
其中，该方法的特征在于：其中该细菌为分支杆菌。
其中，该方法的特征在于：其中该细菌为结核分支杆菌。
其中，该方法的特征在于：其中该细菌为鸟结核杆菌。
其中，该方法的特征在于：其中该酰胺酶为真菌硫醇自共轭酰胺酶。
【附图说明】
图1A显示了真菌硫醇(AcCys-GlcN-Ins(MSH))的化学结构，其化学名称为1-D-myo-inosityl-2-(N-acetylcysteinyl)amino-2-deoxy-α-D-glucopyranoside。
图1B是反应图示，其中MSH先被烷基化为MSR(真菌硫醇的烷基化物)，再被真菌硫醇自共轭酰胺酶(MCA)分解后，形成1-D-myo-inosityl-2-amino-2-deoxy-α-D-glucopyranoside(GlcN-Ins)and a mercapturic acid(AcCysR)。
图1C的图示显示了通过单溴苹果酸氢盐(monobromobimane)产生的真菌硫醇烷化形成的苹果酸氢盐(酯)衍生物的水解物，其中单溴苹果酸氢盐可以裂解产生GlcN-Ins和AcCySmB(一种硫醚氨酸)。
图2编辑展示了了本发明酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂化合物1-14的化学结构。
图3A和图3B显示了利用超导核磁共振仪(Mercury300spectrometer)，CD3OD溶剂条件下，化合物1的1H和13C核磁共振光谱。
图4显示了在Jasco-700偏振频谱仪，CH3OH溶剂条件下，化合物1和化合物2的CD光谱图。
图5是原理图示，显示了化合物1中的2-氨基咪唑基和2-羟基喹啉断片之间的相关连接。
图6显示了3种被筛选作为本发明酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂化合物的化学结构和第二种实施方法的IC50s。
【具体实施方式】
根据本发明最佳实施例所得之酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂化合物，其中酰胺酶从分支杆菌中天然产生，并能够对包含葡萄糖环己六醇的基质产生酶化反应。
在一实施例中，本发明酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂具有以下化学结构1或者化学结构2。
其中Z和其附加于上的碳可以构成单环，双环，三环，四环，或五环结构，其中每环包含5-7个结构成员，0-2个结构成员是独立从氧，硫和氮元素中选择，其余结构成员是碳，这里每环包含0-3个双键并且可以被最多四种取代物X1，X2，X3，X4取代。
这里，X1，X2，X3，和X4的可独立从-F，-Cl，-Br，-I，-OH，-OCH3，和-O(CH2)Mq选择，其中m是1到4之间的整数，并且Q可以从-NH2，-NH(CH2)SCH3，-N[(CH2)SCH3]2，-N+[(CH2)SCH3]3中选择，其中S等于从0到3的整数，N是从0到6的整数，R等于零或是从1到4之间的整数。
Y或者具有如下结构。
其中R1，R2，R3，R4，R5和R6可以独立从-H，-CH3和-(CH2)PCH3中选择，P等于零或任何从1-3的整数，除去R4可以可有可无，及-CHR2和R3能结合形成-C＝CR7，产生咪唑环。同时R7是从下列结构中选择：H，
其中X5，X6和X7可以从-H，-F，-Cl，-Br，-I，-OH，-OCH3，-NH2，-CONH2和-O(CH2)MQ中独立选择，M等于1-4之间的任何整数，Q是从-NH2，-NH(CH2)SCH3，-N[(CH2)SCH3]2，-N+[(CH2)SCH3]3中选择，S等于零或是任何1-3之间的整数，N是1-6之间的整数，R等于零或是1-4之间的整数。
或者Y可以是-O-R8，其中R8是：
其中X8，X9可以从-H，-F，-Cl，-Br，-I，-OH，-OCH3，-NH2，和-O(CH2)MQ中独立选择，M等于1-4之间的任何整数，Q是从-NH2，-NH(CH2)SCH3，-N[(CH2)SCH3]2，-N+[(CH2)SCH3]3中选择，S等于零或为任何1-3之间的整数，N是1-6之间的整数，R等于零或是1-4之间的整数。
其中X10是从-H或-OH中选择，G是-H，-NH2，N+[(CH2)SCH3]3，-NHC(NH2)＝NH，或2-2氨基咪唑酸，其中S等于0-3，R9是从-H，CH3，(CH2)SCH3中选择，S等于零或是任何1-3之间的整数。
例如，本发明抑制剂的化学结构可以如以上结构1所述，其中Z是可取代的或非取代的溴酪氨酸；或者如结构2所述，Z是可取代的或非取代的溴酪氨酸衍生物：螺旋体异恶唑氨酸，其中n等于1或2。在另一例中，本发明抑制剂的化学结构可以如以上结构2所述，其中Y是：
或如结构2，Y是：
除去-CHR2和R3能结合形成-C＝CR7，产生咪唑环。同时R7是-H。
做为选择，本发明抑制剂可以如结构2，其中Z可以是7节环并包含一个氧结构成员，W是-OH，N等于1或2，包括一些化合物其中Y是-O-R8，X8和X9是-Br，X10是-OH，n等于2，t等于0，同时G是NH2。
本发明抑制剂也可以如结构1，其中Z可以是6节环，X1和X3是-Br，X2是-O(CH2)mQ，m等于3，Q是-NH2，n等于1或2，包括下列化合物其中Y是：
除去-CHR2和R3能结合形成-C＝CR7，产生咪唑环，同时R7是-H，或者下列化合物，其中Y是
除去R4不存在，氮的正电荷也不存在。
本发明抑制剂近期较佳的实施体具有如下化学结构：
本发明抑制剂近期另一较佳的实施体具有如下化学结构：
在本发明另一实施例中，酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂具有如下化学结构：
其中，M是1-6之间的整数，N是1-6之间的整数，O是1-6之间的整数，P是1-6之间的整数，Y1，Y2和Y3从-CH2-，-O-，-S-，-CO-，和-CH(CONHOH)-中独立选择，X1，X2是独立的-H或-OR，R是-H，葡萄糖，氨基葡萄糖，乙酰氨基葡萄糖，或氨基葡萄糖纤维醇；R1和R2可独立从下列集合中选取，
其中R3，R4和R5可有选择的出现，并且当出现时，会独立从-H，-(CH2)mCH3中选取，m等于零或1-3之间的整数；
或者，R1和R2独立地从以下集合中选取，
其中，R6是(CH2)qOCH3或(CH2)qCH3，其中q是1-11之间的整数，
其中，R7是(CH2)qOCH3或(CH2)qCH3，其中q是1-11之间的整数，
例如，本发明抑制剂，可以被有如结构III的化合物例证，其中Y1＝-CH2-，Y2＝-CO-，Y3＝-CH2-，m＝4，n＝4，o＝6，p＝5。
另外，本发明抑制剂，也可以如同结构III，其中X1是OR，R等于葡萄糖，X2＝-OR，R＝H，R2是：
及R1是：
在另一例中，本发明抑制剂，可以被有如结构III的化合物例证，其中X1＝-OR，R＝-H，X2＝-OR，R＝H，R2是：
及R1是：
另外，本发明抑制剂，也可以有如结构III，其中Y1，Y2，Y3是-CH2-，m＝n＝1，O等于任何从一到四的整数，p等于任何从一到四的整数，R2是：
其中，R7是(CH2)qOCH3或(CH2)qCH3，其中q是1-11之间的整数其中，R1是：
其中，R6是(CH2)qOCH3或(CH2)qCH3，其中q是1-11之间的整数。
本发明抑制剂有如结构III较佳的实施体具有如下化学结构：
和
本发明抑制剂作为化学化合物能够抑制酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶的酶化作用。这样，本发明抑制剂有抑制分支杆菌作用，特别能够抑制放线菌，如包皮垢分支杆菌和结核分枝杆菌。同时，本发明抑制剂还能抑制抗生素产生的细菌的生长。本发明抑制剂能够用这里描述的业界熟知的方法从自然生物纯化得到。另外，本发明抑制剂也可以用业界熟知的方法化学合成。
这里所用名称，“酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶”指氨基葡萄糖环己六醇基质里有酰胺酶酶性的多肽。
同时，酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶也意味着一种酰胺酶能够水解一种基质，此基质具有化学分子式R-CONH-GlcN-Ins，其中R＝CH3(CH2)n-，n＝0-6。在此基质组合中包括的是一种自然基质，acetyl-GlcN-Ins，其中n＝0。在此基质组合中的很多结构成员都是烷酸衍生物。同时，化合物具有化学结构，R-CONH-GlcN-Ins，其中R＝-aryl-(CH2)n-，n＝0-6被本发明名称包含。在此基质组合中的很多结构成员都是芳基烷酸衍生物如苯基-(CH2)nCOOH。
以上化学分子式中的酰基氨基葡萄糖环己六醇也可以从GlcN-Ins和商业用酰氯反应衍生所得，形成RCOCl，其中R是：o-tolyl-，4-ethylphenyl-，4-biphenyl-，3，4-dimethoxyphenyl-，3，4，5-trimethoxyphenyl-，2-furyl-，或其他。
以上化学分子式中的酰基氨基葡萄糖环己六醇也可以从氨基酸，或N-乙酰氨基酸衍生所得。较佳的氨基酸包括N-acetylcysteinyl-S-R’或者cysteinyl-S-R’，其中R’是附着在半胱氨酸硫上的有机团，半胱氨酸硫可以从工业用有硫醇标记的试剂中衍生，例如，2溴苯乙酮(2-bromoacetophenone)，单溴苹果酸氢盐(monobromobimane)，N-顺丁烯二酰亚胺(N-ethylmaleimide)，7-diethlamino-3-(4’-maleimidyl phenyl)-4-methyl coumarin(抗凝血剂)，3(N-maleimidopropionyl)biocytin，或从天然的抗生素中衍生，如蛋白酰化抑制剂cerulenin，石榴菌素granaticin A，naphthomycin A，naphthomycin H，和其他。
能被本发明抑制剂抑制的还包括酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶的子集，象例如真菌硫醇自共轭酰胺酶(MCA)，其基质为半胱氨酸酰胺自共轭物。这里，自共轭意指分子是硫醚或硫酯包含两个化学部分被硫键(-s-)连接。在最优实施例中，硫共轭分子是从真菌硫醇中反应衍化产生，如图1A，图2B所示，其中RX是亲电子试剂，R是烷基部分。但是，本发明酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶不需要包含硫元素的酰胺基质，相反地，却裂解了包含GlcN-Ins酰胺的基质。
这里，“包含GlcN-Ins酰胺的基质”和“包含氨基葡萄糖环己六醇酰胺的基质“两个名称是一致的，均可以表示酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶具有酶化作用的基质分子，该酶化作用可以裂解分子。同样地，酰胺自共轭物(amide-containing S-conjugate)和自共轭酰胺(S-conjugate-containingamide)两名称在本质上是一致的，均可以表示自共轭醇酰胺酶具有酶化作用的基质分子，该酶化作用可以裂解分子。如果一特定的酰胺酶为酰胺水解酶，裂解的基质分子会形成裂解产品，其中一产品为羧酸。比如，羧酸至少有一部分为硫基，而其它产品为一种胺(如GlcN-Ins)。如果基质是真菌硫醇衍生自共轭酰胺，如图1B所示，其一分解物为1-D-myo-inosityl-2-deoxy-α-D-glucopyranoside(GlcN-Ins)，而其他分解物为包含硫的羧酸。AcCys自共轭物可命名为硫醚氨酸，是哺乳动物解毒用谷胱甘肽经硫醚氨酸路径后，最后的排出物。(J.L.Stevens，et al.，(1989)in Glutathione：Chemical，Biochemical，andMedical Aspects-Part B(D.Dolphin，et al.)pp 45-84，John Wiley & Sons，etal.)。
众所周知，酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶在细菌的解毒路径上活动，特别是对于抗生素产生的细菌，并且细菌的解毒路径依靠体内细菌产生的蛋白质酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶。但是，当治疗病原的放线菌导致的疾病时，致病的放线菌(不产生抗菌素)包括基因编码生成的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶可在抗生素给药条件下活动。可编码成酰胺酶的基因为乃抗生素的基因家族中的一员。
而且，真菌硫醇(1-D-Myo-inosityl-2-(N-acetylcysteinyl)amido-2-deoxy-α-D-glycopyranoside(GlcN-Ins)(MSH)在各种放线菌中都存在，并且在细菌解毒路径内起很重要的作用。真菌硫醇包含N-易咳净酰胺(AcCys)和1-D-myo-inosityl-2-deoxy-α-D-glucopyranoside(GlcN-Ins)相连，并且是大多数放线菌产生的主要硫醇。在放线菌中依靠真菌硫醇解毒过程中，一烷基剂被转换成自共轭真菌硫醇，然后被裂解成硫醚氨酸并从细胞内排出。酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶的子集，这里指真菌硫醇自共轭酰胺酶(MCA)，其基质为酰胺自共轭物。这里，自共轭意指分子是硫醚或硫酯包含两个化学部分被硫键(-s-)连接。在本发明最优实施例中，硫共轭分子是从真菌硫醇中反应衍化产生，如图1，图2所示，其中RX是亲电子试剂，R是烷基部分。但是，本发明酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶不需要包含硫元素的酰胺基质，相反地，却裂开了包含GlcN-Ins酰胺的基质。
在真菌硫醇制造的细菌中用来裂解自共轭真菌硫醇的真菌硫醇自共轭酰胺酶是从包皮垢分支杆菌纯化得到，并被认定为和开放阅读框架Rv1082中的结核分支杆菌同源(ortholog)。桑格(Sanger)中心的注释把这种基因放置在结核分支杆菌染色体的1206520-1207383核酸剩余物中。它的蛋白质代码包含288种氨基酸，和构成结核分支杆菌N末端氨基酸的顺序完全一致。同源的酰胺在麻风分枝杆菌和鸟结核杆菌中也被确认。麻风分枝杆菌的同源体(ML2391)在桑格(Sanger)中心被编码为核酸剩余物2861602-2862474，同时被测定为86％和Rv1082相同，鸟结核杆菌的同源体在Sanger中心被编码为核酸剩余物1152499-1153362，同时被测定为84％和Rv1082相同(TIGR-The Institutefor Genomic Research)。另一种自共轭酰胺酶同源体也在牛棒状杆菌中被认定，同时被测定为99％和Rv1082相同。基因编码真菌硫醇自共轭酰胺酶在全部分支杆菌染色体中出现，其同源体也会在真菌硫醇放线菌中被发现。
另外，大多数同源非分支杆菌类蛋白质也在能产生真菌硫醇的放线菌中被发现。现在已经知道同源基因编码自共轭酰胺酶在抗生素合成操纵子中被发现，例如可用来合成抗生素的链霉菌(Streptomyces lincolnensis)，地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)，土壤丝菌属(amycolatopsis orientalis)，淡紫灰链霉菌(streptomyces lavendulae)，蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)，链霉菌(Streptomyces Rochei)，以及可用来制造多聚乙酰红霉素的Saccharopolyspora erythraea。两种其他细菌，白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)和恐兽球菌(Deinococcus radiodurans)也用同源酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶编码。四中这样的开放阅读框架(ORF)是广泛认知的放线菌蛋白质编码，分别为洁霉素(lincomycin)，红霉素(erythromycin)，丝裂霉素(mitomycin)，和利福霉素(rifamycin)抗菌素合成操纵子。
已知的细菌酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶同源体有至少4种高度保留的定义域，其中的3种包含组氨酸剩余物。3个保留的定义域被认为和酰胺的水解作用相关并和氨基葡萄糖环己六醇相结合。组氨酸剩余物被认为可以和锌金属离子(Zn2+)在酶中结合。酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶蛋白质家族成员也是高度保留的，并在氨基酸末端保持高度的一致。
这样一来，人们已经知道酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶作为解毒路径的一部分是在体内通过细菌形成，通常是由可用来制造抗生素的细菌形成，而且还经常是分子内部产生真菌硫醇的细菌形成。一个对此酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶酶活性的测定涉及了对酰胺酶在包含烷基剂(mBBr)条件下产生的杆菌治疗过程，其中细胞内真菌硫醇被转化成苹果酸氢盐衍生物(MSmB)(如图1C所示)。后者被很快裂解产生GlcN-Ins和苹果酸氢盐衍生物(AcCySmB)，一种硫醚氨酸并从细胞内排出。其他裂解产物，GlcN-Ins，被保留在细胞内并被利用真菌硫醇的再合成。
一个比较类似的体外测定，利用从真菌硫醇产生的杆菌，如包皮垢分支杆菌和结核分枝杆菌，经纯化后的到的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶，用来过滤化合物来测定酰胺酶的抑制力。在此测定中，真菌硫醇通过mBBr烷基化，产生稳定的，荧光的苹果酸氢盐衍生物(MSmB)，可以被已知的荧光探测HPLC方法量化测定，正如这里所举的例子一样。真菌硫醇可以轻易地从包皮垢分支杆菌分离，并可在很短时间内大量转化成MSmB(如第二例)。还有，重组的结核分枝杆菌MCA可以在寄主细胞，如大肠杆菌，内被充分表达，并被用作酶。一合成的的结核分枝杆菌MCA苹果酸氢盐衍生物可以在第二例中被作为描述的对象。当把纯的MSmB标本暴露于酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶后，可以得到产生大量裂解产品AcCySmB，表明MSmB可以被暴露于酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶裂解。当把纯的MSmB标本和酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶暴露于一生物体自由萃取细胞，会产生本发明酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂，但不会产生荧光真菌硫醇衍生物，表明天然获得的萃取物可以产生酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂。培养的混合物标本也可以被间断性地分析的到其他可能的MSmB裂解物，GlcN-Ins，或者MSmB，AcCySmB。在不存在抑制剂条件下，大于50％的转换率，大约1.0当量的MSmB(0.1nmol)可以产生1.00±0.02_当量的AcCySmB，和0.80±0.08当量的GlcN-Ins，并在60分钟内23摄氏度条件下一直延续到MSmB达到97％转化率。在此转化率下任何本质上的还原反应均表明天然产生的化合物的抑制作用。
业界熟知的荧光探测法可以探测AcCySmB的裂解产物。荧光探测HPLC测定法对MSmB的裂解物测定是广泛认知的。(G.L.Newton et al.，2000a supra)(同时，本案美国申请专利号09/733,569，送案日期12/7/2000，这里可以全案引证。对不含半胱氨酸的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶，荧光探测HPLC测定法对其MSmB的裂解物测定也是广泛认知的(G.L.Newton et al.，2000a supra)。
mBBr也可被认为能快速穿透细胞，并能转换分子内硫醇(如真菌硫醇)成苹果酸氢盐衍生物(G.L.Newton et al.，1995 supra)。细胞萃取的天然化合物的抑制作用的检验可通过体内测定来决定该化合物在体内作为酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂是否有效。通过将培养的活性的真菌硫醇产生的细菌细胞暴露于一纯净的受试化合物，可以测定抑制剂在真菌硫醇合成杆菌的过程中真菌硫醇的合成路径上的抑制活性。在真菌硫醇合成过程中对受试菌的干扰或间断可以造成抑制剂的生长或死亡。总体来说，用现存的受试化合物和抗生素基础上培养包含真菌硫醇的细菌做这样的测定比较容易。真菌硫醇合成路径上的分裂，和由于杆菌酰胺酶产生的抑制剂的作用导致的依赖真菌硫醇的细菌解毒路径上的分裂，会干扰对抗生素，其他烷基剂，由杆菌的真菌硫醇提供的类似物质的自然抵抗能力。可作为此用途的抗生素包括浅蓝霉素(cerulenin)，红霉素(Erythromycin)，增长激素(exfoliamycin)，石榴菌素(granaticin)，活激素(kinamycin)，洁霉素，丝裂霉素(mitomycin)，石脑素(naphthomycin)，利福霉素(rifamycin)，链丝菌素(streptothricin)，和万古霉素vancomycin等抗生素。
本发明中，生物的细胞萃取物以被以上描述的体外测定法筛选，并发现有小分子的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂存在。对Oceanapia sp.7的萃取物照射表明其对MCA有强烈的抑制力(G.L. Newton et al.2000，supra)。生物测定法引导的纯化的MeOH/10％H2O溶液反相光谱，然后通过LH20色谱法，产生已知的化合物伪神经酰胺(化合物2)和铀啶(Uranidine)及一定量的化合物1(2mg，0.11％)。化合物的具体成分如表1。
在这次测定中，化合物1，2，4，和6(如表1)分别抑制了50％的真菌硫醇自共轭酰胺酶在2，100，3，37μM等处，但是Uranidine无效果。其中化合物1对MCA体现了最强的抑制作用，但初期的建立构架努力被反相HPLC充分的分界作用影响。化合物1和6的结构注释在下面的第一例中会有说明。
根据对这些学习的分析，水生海面生物及陆生的真菌细胞萃取物被进一步测定来测试酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂和萃取细胞中相关的抑制及从而获取额外的化合物如表6所示。化合物1-14的化学结构如表2所示。
在另一实施例中，本发明提供了认定天然抑制剂的方法。此方法通过将生物的细胞提取物和酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶接触，或在适当条件下，和存在包含GlcN-Ins酰胺的多聚核苷酸编码的酰胺酶接触，来决定具有酰胺指示剂功能酰胺水解活动产生的裂解产品存在或不存在。本质上缺少酰胺水解活动可以表明生物体能够产生一种天然的化合物来抑制酰胺酶的活动。例如，如果酰胺酶是自共轭酰胺酶，裂解产品硫醚氨酸(AcCysR)或GlcN-Ins的缺失会表明该化合物可以抑制自共轭酰胺酶。这里所讲比较适合的条件为业界所熟知并在这里讨论。此方法可进一步包含利用细胞萃取物的抑制能力纯化天然化合物。在以下例子中会有进一步的讨论。
在对能产生天然的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶的病变细菌造成的感染中，可以将本发明抑制剂结合抗生素给药。本发明抑制剂的使用大大提高了抗生素的治疗效果，如降低了病原体的毒性和对抗生素的抵抗力。
理想地讲，酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂是一种化合物能够抑制的分子内产生的真菌硫醇。例如，在实施例中，提供的化合物抑制了酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶分子间的活动。
在本发明的另一实施例中，通过将本发明酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂引入可产生病变GlcN-Ins酰胺酶的细菌的方法来减弱其抗生素抵抗力。分子内存在的本发明抑制剂可以减弱酰胺酶的活性，进而降低了细菌的抵御抗生素的能力。本发明抑制剂可以抑制分子内酰胺酶的产生。比较理想地，本发明抑制剂可以和细菌一起培养已达到“接触”作用。
较佳地讲，以上所述的本发明实施方法中的被抑制的病变细菌指放线菌，例如包皮垢分支杆菌和结核分枝杆菌，麻风分枝杆菌，牛型放线菌，细胞内杆菌，非洲杆菌，M.marinarum杆菌，M.chelonai杆菌，白喉杆菌，以色列放线菌，和鸟结核杆菌等等。
测试本发明抑制剂效果的酰胺酶可以从多种方法得到。如以上所讲，本发明酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂可以从能天然产生酶的细菌中纯化得到，例如真菌硫醇自共轭酰胺酶，因为能够水解真菌硫醇自共轭物，其S-R基团可以是天然的烷基物。另外，酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂也可利用天然蛋白质基因重组的方式获取。同时，真菌硫醇自共轭酰胺酶和酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶利用本发明所述筛选法会包含一些天然酰胺酶中的保留的变异氨基酸。
在氨基酸顺序里的保守变异是指通过一个或多个保留的或非保留的氨基酸取代，删除，或插入，氨基酸顺序和它的引用顺序有所不同，特别是取代发生在分子的非活性地带，这样多肽会本质上保留了基本特性。保留的氨基酸取代物，例如，可以用同级氨基酸取代另一氨基酸。(如取代疏水氨基酸物，象异白氨酸(isoleucine)，缬氨酸(valine)，亮氨酸(leucine)，甲硫氨酸(methionine)，或者极性氨基酸取代物，如赖氨酸取代精氨酸，谷氨酰胺蒜取代氨基丁二酸，谷氨酰胺取代天门冬酰胺等等)。一个或多个氨基酸可以被删除，例如，不用改变其生化活性，从酰胺酶多肽可以对多肽的结构进行改变。碳基端氨基酸可以在不需要酰胺酶参与下删除。
利用在寄主细胞中可以表达或繁殖的具有生化功能的病毒和质粒DNA媒介来重组酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶，并用来筛选本发明酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂的方法已为业界共知。这些媒介可用来和DNA的顺序相结合。总体来说，表达媒介包含促进顺序，其能够更有效率的转录插入的可用于和寄主细胞相连的多肽的遗传序列。表达媒介一般具有一个复制源，一加速体，和一终结体，以及一些特别的能够提供转化细胞表型选择基因。
除业界熟知的表达媒介，如细菌，酵母，和哺乳动物表达系统外，杆状病毒媒介也可被作为表达媒介。在这种无脊椎的病毒媒介中表达外来基因的一个优点是能够表达高等级的重组蛋白质，在抗原和功能上与其天然对应物相似。杆状病毒媒介和一些昆虫本体细胞被用作表达媒介也被此行业中熟悉该项技术的人共知。
这里的名称重组的表达媒介是指质粒，病毒，或其它此技艺中的载体，被操作用来插入，或结合本发明酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶的基因顺序。表达媒介包含促进顺序，其能够更有效率的转录插入的寄主细胞的遗传序列。表达媒介一般具有一个复制源，一促进体，和一终结体，以及一些特别的能够提供转化细胞表型选择基因。适用于本发明不限制的包含基于T7的细菌的表达媒介，(Rosenberg，et al.，Gene，56：125，1987)，在哺乳动物细胞中的pMSXND表达媒介，和昆虫细胞中的杆菌病毒衍生细胞。DNA段在媒介中可以与调节元素相关联，如促进体。
该媒介也可以包括一表现型可选标识，能够确认包含表达媒介的寄主细胞。原核表达媒介比较常用的标识为氨基苄青霉素，四环素，和氯霉素的耐抗生素基因。哺乳动物表达媒介中常用的标识为腺甙脱氨酶(ADA)的基因，氨基糖苷类(neo，G418)的基因，二氢叶酸(DHFR)的基因，潮霉素(HPH)的基因，胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的基因，黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(XGPRT，gpt)的基因等等。
对寄主细胞表达的酰胺酶多肽的隔离和纯化可以是用传统方式，例如，制备色谱分离法，和免疫分离法来分离和单性系及多性系抗体相关的物质。
重组DNA对寄主细胞的转换可以通过传统技艺来实现。其中寄主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，或一些经指数增长或被CaCl2充分处理方法得到的能够摄取DNA的细胞。同理，MgCl2和RbCl也可被使用。
当寄主细胞是真核细胞时，不同的DNA转移方法也可以被使用。这包括通过磷酸沉淀物对DNA转染，传统的生物注入法，注入脂质体包围的质粒，或者用病毒媒介。真核细胞也可以用DNA顺序编码的本发明抑制剂的多肽转换，或用另一种外来的DNA分子编码成一种可选择的表型，如单纯性疱疹胸腺嘧啶核苷激酶基因。另一种方法是利用真核病毒传媒，如猿病毒40或牛乳头瘤病毒，来瞬时传染或转化真菌细胞以及表达蛋白质。(Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman ed.，1982)。哺乳动物寄主细胞包括COS，BHK，293，和CHO细胞。
真核细胞可以包括酵母。例如，DNA在酵母中可以通过插入适合的表达媒介并将产品已入寄主细胞的方式表达。在表达外来基因中，在酵母中不同的传播媒介已被报道(Heinemann，J.et al.，Nature，340：205，1989；Rose，M.et al.，Gene，60：237，1987)。
被作为筛选天然形成的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂的重组酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶多肽，可以包括溶解蛋白质，其进一步包含另一从和酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶无关的蛋白质来的氨基酸顺序多肽部分。此类溶解蛋白质再也接踵可被用来做异类测定。
本发明其他的一些特点和优点通过权力要求的要求会变得更加清楚。对本发明的实际应用会运用传统的细胞生物学，细胞培养学，分子生物学，转基因生物学，生物学，DNA重组，免疫学等方面的知识。这些科技在文字上都有详尽的论述，例如分子克隆试验手册，(by Sambrook，Fritsch andManiatis(Cold Spring Harbor Labortary Press：1989))；DNA克隆(D.N.Glover ed.，1985)，寡聚核苷酸合成(M.J.Gait ed.，1984)；Mulliset al. U.S.Pat. No.4,683,195；核酸杂化(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；动物细胞培养(R.L.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；固定化细胞和酶(IRL Press，1986)；分子克隆的论证(1984)；酶生物科技(Academic Press，Inc.，N.Y.)；哺乳动物细胞基因转换媒介(J.H.Millerand M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；酶学方法，分子和细胞生物学中的免疫化学(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；免疫学实验手册(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；操作鼠胚(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
这里，名称“核酸”是指多核甙酸例如脱氧核糖核酸(DNA)，或核糖核酸(RNA)。该名称也包括，或相当于，模拟物或从脱氧核糖核酸和核糖核酸得到的模拟物，以及实施体所述的单链或双链多核甙酸。
这里，名称“基因”“重组基因”和“基因组建”，是指核糖核酸包含一开放阅读框架编码的本发明酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂，其中包括外显子和内显子顺序。“内显子”是指在一酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶基因的DNA顺序不能被译成蛋白质并一般在内显子中被发现。
“同源体”是指两肽键之间或两核酸分子之间的顺序相似性。通过比较每个顺序的为比较而特意排列的位置，来决定同源性或同源体。当被比较的顺序的位置为同一基或氨基酸时，分子在这一位置为同源体。顺序间的同源程度是分享顺序的同源位置的作用。
名称“转染”，“转换”和类似名称，是指引入核酸，例如，表达媒介通过核算基因介导转移被引入接受细胞中。“转换过程”这里指细胞的基因型因细胞的外界的DNA和RNA的摄取被改变。
名称“细胞”“细胞培养”“重组寄主细胞”“寄主细胞”这里经常可以被替代使用。这些名称还包括直接主体细胞其能够表达本发明中的细胞循环调控蛋白质及其后代。这里因为变异的机会及环境的不同，所有后代细胞和其母体细胞并非为完全一致。但是，这些改变的后代也在以上这些名称涵盖范围内，毕竟这些后代也包含和原始的转化细胞相关联。在本发明中，这样的特征可以是产生重组酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶多肽。
这里，名称“媒介”是指能够运载另一和它相连的核酸的核酸分子。名称“表达媒介”包括质粒，粘尾质粒，和噬菌体，其能够合成被不同的媒介所携带的基因编码的主体酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶多肽。较优的媒介能够自动复制并表达和其相关联的核酸。本说明书中，质粒和媒介可以交互使用因为质粒是最常使用的媒介。而且，本发明还进一步包括其他一些能够起到相同功能的表达媒介。
在整个说明书中，名称“转录调节顺序”是一通用术语，特指DNA顺序，象早期信号，加强体，促进体，及一些聚腺苷酸活性点，其能够导致及控制与其结合的蛋白质编码的顺序转录。在最优实施例中，重组的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶基因的转录是在促进体或其他转录调节顺序控制下完成。该促进体或其他转炉调节顺序能够表达细胞的重组基因。另外也可以理解为重组基因能够被转录调节顺序控制，该转录调节顺序具有相同的或不同的顺序能够控制天然形成的调节蛋白质的转录。
这里，名称“转基因生物”可以指任何生物，最好是细菌其中一个或多个细胞含有人为引入的异源体核酸，这样的转基因引入技术为业界共知。核酸备用一些人为操纵手法，如生物注射或与重组病毒或媒介感染的方式被引入细胞中。这里所讲的基因操纵不包括传统的杂交，或体外受精，而是指直接引入重组DNA分子。此分子可以和染色体相结合，或染色体外复制DNA。在这里叙述的典型的转基因生物中，转基因能够使细胞表达主体酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶多肽。
名称“脱离”和“纯化”在被发明酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂中的使用指化合物被从天然生物提取后，或化学合成后，能够独立与细胞物质或培养物质。各种提取方式也为业界所共知。
由于基因编码的减并导致脱离的核酸和一般野生型核苷酸顺序不同的方法也在制作本发明酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂中得到应用。例如，一定数量的氨基酸被多个三位字节设定。设定同类氨基酸的密码子，或会导致净突变的同物异名(比如CAU和CAC为组氨酸的同物异名)，不会影响蛋白质的氨基酸顺序。然而，一般认为能够改变主体酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶多肽氨基酸的排列顺序DNA顺序的多型现象会存在于原核细胞中。此行业中有该项技术的人会体会这些在核酸中编码的一定数量的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶多肽中的一或多个核苷酸变化会会存在于一些给定的天然的等位基因变化中。其中一些或全部的核苷酸变化以及引发的氨基酸多型现象被包含在本发明中。
编码了生物活性部分主体酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶多肽的片段也可被用在测定中来筛选和发现本发明酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶的额外例。这样的片段编码了肽键能够保留至少一部分全长蛋白质的生物活性。
具有自共轭酰胺酶活性的一核酸编码的肽键能可从人和制作抗生素或病原细菌的mRNA和染色体组DNA中获取。例如业界共知的放线菌获取法。例如，cDNA编码的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶多肽可以通过隔离总mRNA的方法从细菌细胞中获得。双链cDNAs可以通过mRNA预制，然后被插入适合的质粒或细菌噬菌体媒介中。一基因编码的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶多肽也可以利用已建立的聚合酶链反应技术和本发明提供的核苷酸排列顺序信息克隆而得。
表达媒介可以包含核苷酸顺序编码的并至少与一调控顺序可操纵相关的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶多肽。可操纵相关进一步意味着核苷酸顺序和调控顺序相关来表达核苷酸顺序。调控顺序是业界熟悉的语言并被选择用来直接表达肽键具有酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶多肽的活性。同样地，调控顺序包括促进体，增强体，和其它一些控制表达元素。对于调控顺序的介绍可见与“基因表达科技”Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)。例如，一系列的当与操纵相关时能够控制DNA顺序表达的表达控制顺序可以用在媒介中来表达DNA编码的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶。这样的表达控制顺序包括SV40的早期和晚期促进体，腺病毒和巨细胞病毒的直接早期促进体，乳糖系统，和色氨酸系统，TAC或TRC系统，被T7 RNA聚合酶引导的T7促进体，噬菌体拉姆达的主要操作体和促进体，fd涂层蛋白质的控制区域，三磷酸甘油酸酯激酶的促进体及其他糖解酶促进体，酸性磷酸酶促进体，α交配的酵母促进体，杆状病毒系统的多面促进体，和控制基因原核和真核细胞表达的顺序的促进体，等等。可以理解，表达媒介的设计师依靠与一些因素，如寄主细胞的选择，和翔表达的蛋白质的种类等等。而且，媒介的复制数量，控制复制数量的能力，和媒介对编码蛋白质的表达，如对抗生素的标识，都应该被考虑。
很明显，这样的基因组建可用作在培养繁殖的细胞内表达主体酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶多肽来产生蛋白质或肽键，包括融化蛋白质及肽，也为测定中纯化和后续的使用来筛选酰胺酶抑制剂。
为发现酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶活性的而筛选的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶多肽可以通过寄主细胞和表达媒介转染来实现。表达媒介编码了一个主体酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶多肽并与一定条件下培养指导对肽的表达发生。肽可以通过包含肽的细胞和中介物质中获取。同理，肽也可以细胞质的保留，细胞被收集，或被赖氨酸化，并且蛋白质被隔离。细胞培养包括寄主细胞，介质，和其它副产品。有很多细胞培养介质为业界所共知。肽可以从细胞培养介质和寄主细胞中隔离出来，这些纯化蛋白质的方法科技，包括离子交换色谱法，胶过滤色谱法，超过滤法，电泳法，对主体酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶多肽表位特殊抗体免疫亲和性纯化法等等。
在下列例子中，本发明会被进一步描述。但是，本发明并不局限于以下例子。
第一例
一般过程
用一Beckman DU-600分光测光仪得到一UV光谱；在一Perkin Elmer偏光计CH3OH条件下得到旋光；用一Jasco-700分光测光仪利用0.2cm细胞得到CD光谱；用Bio-Rad-FTS-45 FT-IR分光测光仪得到IR光谱。然后用Jeol-SX102仪器得到一高分辨率快速原子轰击质量光谱。利用一GBC LC1150泵得到一反相(C-18)HPLC，其中GBC LC5100光电二极管数组探测器被应用，μBONDAPAKTMC18水柱(7.8×300mm)维持在3mL/min流速。
在Varian Mercury 300上记录1-D磁核共振(NMR)光谱，并在27℃条件下，用-Bruker DMX500测量2-D NMR光谱，并和残留溶解物(DMSOd6，δc39.5，δh2.50)相参考。质子从1H NMR或HSQC光谱中获取。
标本Oceanapia sp.7可以从NCI开放档案中提取。
初级筛选的提取物显示了对MCA强烈的抑制作用，这是排除了MCA/MSH裂解产品AcCysBm的情况下，用荧光检测器HPLC测定，并用50MM MSmB作为底物，并依据以前所述方法得到的。用反相(C-18)色谱从Oceanapia sp.7中提取生物测定纯化的MeOH/10％水溶液材料，接着用LH20色谱法获取已知的化合物伪神经酰胺(A.Benharref and M.Pais，J.Nat.Prod.(1996)59：177)(compound 2，24.7mg，1.4％)and uranidine(G.Cimino etal.Tetrahedron left.(1984)25：2925)(17.7mg，1.0％)and a small amount of compound1(2mg，0.11％)。
用以上描述方法进一步的测定化合物1，2，5，6的抑制效果，和真菌硫醇自共轭酰胺酶中uranidine的作用.在这次测定中，化合物1，2，4，和6(如表1)分别抑制了50％的真菌硫醇自共轭酰胺酶在2，100，3，37μM等处，但是Uranidine无效果。其中化合物1对MCA体现了最强的抑制作用，但初期的建立构架努力被反相HPLC和CH3CN/H2O(0.05％三氟乙酸)充分的分解作用影响。
用LH20色谱法对Oceanapia sp.7的提取物粗品的第二种MeOH/10％水溶液部分进行纯化也增加了混合物1的量(6.0mg 0.24％)。对此LH20柱上其他部分进行重复的反相(C-18)HPLC得到化合物6(2.0mg，0.11％)和化合物5(1.5mg，0.08％)。其中化合物1显示了同位素聚类在快原子轰击质谱(FABMS)中m/z为681，683和685条件下的同位素比为1∶2∶1。一分子式为C24H22O8N6Br2的化合物被高分辨率快速原子轰击质量光谱法测定。(HRFABMS)
对化合物1的1H和13C NMR光谱的初步比较显示了化合物1和化合物2及Uranidine的光谱有明显的相似性，同时也指出二溴化的螺旋体异恶唑氨酸(cyclohexadienol-spiro-isoxazoline)不受影响。这也被第二表中的异核单量子相干谱HSQC和异核多键相关谱HMBC二维核磁共振(2D NMR)试验中得到确认。C9到C11的自旋系统在HMBC上得到体现，其中亚甲基质子相关在δH(H10)和可交换质子在δH8.62(C9-NH)，和碳酰胺在C9(δC158.9)，以及TOCSY相关在质子和亚甲基质子之间，δH2.75(H11)。为阐明化合物的完整结构1，HMBC上的相关从δH2.75(H11)到两个芳香四元碳C12(δC120.4)和118.7(C13)，还有从可交换的质子δH11.95(12-NH)到碳峰在C12(δC120.4)和146.2(C14)的相关对分析是非常重要的。(如图1)。对于化合物1中的咪唑基2-羟基喹啉，其中除两个质子和碳以外的全部共振和URANIDINE报告相符合，并被HMBC异核多键相关谱上的相关性所支持。明显的区别包括在URANIDINE中对H6，H7共振的反应和在δH6.96处的单峰谱线的出现。这个单峰可以归功于化合物1中的H7’，在对HMBC谱的观察的基础下，相关于碳峰出现在δC128.9(8a’)，137.0(C8’)，149.3(C5’)，从而确认了C6’碳的取代。在变量下对HMBC光谱的解析保证了对相关物的发现，从氢键的羟基质子δH14.42(5’-OH)到三个芳香碳δC112.2，149.3，103.1，其分别代表C4a’，C5’，C6’。HMBC谱上的相关从H7’(δH6.96)到四院碳δC128.9(C13)给了最后的碳碳连接并和2-羟基喹啉和咪唑酸相连(如图1)。
将化合物1光谱数据和化合物2及其对应结构体进行比较得到绝对立体化学数据。化和物2的结构对应体已被描述，通过比较CD光谱和以前发布的数据可以决定绝对立体化学形态。(A.Benharref et al.TetrahedronLett.(1984)25：2925 and J.Kobayashi et al. Chem.Pharm.Bull.(1995)43：403)。基于这些研究，化合物2的CD光谱中的特殊的旋转性和负考顿效应保证了其可作为左旋的对应结构体，伪角质，并有绝对构型1-(S)，6-(R)。将化合物1和2中的H1，H7a，H7b的化学位移的1H NMR相比较，可以表明两者有相同的立体化学结构。当然化合物1的CD光谱中的负考顿效应也表明其有绝对构型1-(S)，6-(R)(Kobayashi et al.，supra)。
化合物5中的1H和13C的NMR数据和一切报告的化合物都共有一名称psammaplysin B(M Litaudon and M.Guyot Tetrahedron Lett.(1986)27：4455)。由HR-FABMS测定的化合物6的C17H26N6O3Br2的分子式如下所示。化合物5和6的1H NMR光谱的明显相似性表明芳族单峰的存在于δH3.82(H7)。相比较，化合物6的1H NMR光谱缺少相应的化合物5的亚甲基C10和C11，和δH6.51(H13)芳族信号。在化合物6的HMBC和同核相关谱(COSY)光谱上，四个亚甲基H10-H13(δH3.27，1.56(2CH2)和3.17)，以胍基团结尾(C14，δC156.8)很明显。这些质子和碳的共振与包括这部分的其他化合物的报告一致。
化合物1和化合物6是新颖的。化合物1包含一少见的例子，其氨基酸咪唑和另一芳族取代物相接。另一例证发生于二环的肽糖脂AC(aciculitins)histidino-酪氨酸桥上。(C.A.Bewley etal.，J.Am.Chem.Sac.(1996)118：4314)。除了这个例证外，溴化酪氨酸衍生物代谢一般被局限于order verongida的海绵体，或在海绵动物门中的化学分类中免去。然而取样标本和化合物1，2，5，6的海绵体相对应，使收集物中用可能出现海绵体。
化合物1，2，5，6是最早的天然产品可以抑制分支杆菌依赖真菌硫醇的解毒路径中心的酶。
化合物1
1NMR(CD3OD，300MHz)7.72(S，H2’)，6.90(s，H7’)，6.33(s，H5)，3.98(brs，H1)，3.70(s，H15)，3.64(d，J＝18.0Hz，H7b)，3.50(m，H10)，2.92(d，J＝17.7Hz，H7a)，2.91(m，H11)。
13C NMR(CD3OD，75MHz)，δC175.0(C4’)，161.7(C9)，155.0(C8)，151.5(C5’)，149.3(C3)，147.9(C14)，141.9，139.1，133.7，132.3(C5)，124.8(C2’)，122.9(C4)，121.9，121.5，114.9(C7’)，114.3，114.2，104.9(C6’)，92.4(C6)，75.5(C1)，60.5(C15)，40.0(C7)，39.6(C10)，25.7(C11)。
IR(ZnSe，film)3166(broad)，1715，1694，1679，1674，4653，1588，1557，1539，1438，1263，1219，1025，994cm-1。
表2归纳了化合物1中全部的NMR数据，包括从COSY，HMBC，ROESY光谱得到的数据。
表2
原子 δC δh， 同核相关谱 异核多键相关谱
Atom δC δH， COSY HMBC(20Hz) HMBC(13Hz) HMBC(8Hz) ROESY
multiplicity，
J(Hz)a
1 73.5 3.89，d，0.6 147.1，131.2， 147.1，131.2， 147.1，131.2， 6.42，
113.1，90.1 113.1，90.1 113.1，90.1 3.60
2 113.1
3 147.1
4 120.8
5 131.2 6.56，d，0.6 147.1，120.8， 147.1，120.8， 147.1，120.8， 3.12
73.5 113.1，73.5，39.4 113.1，90.1，
73.5，39.4
6 90.1
7a 39.4 3.12，d， 3.60 131.2 154.4，131.2， 131.2，90.1， 6.56
18.0 90.1，73.5 73.5
7b 3.60，- 3.12 -- 154.4，131.2， 73.5weak 8，62，
90.1，73.5 3.89
8 154.4
9 158.9
10 38.1 3.40，- 8.62， -- -- 120.4，158.9 8.62
2.75 (weak)
11 24.6 2.75，m 3.40 120.4，38.1 120.4 120.4，118.7 8.62，
6.96
12 120.4
13 118.7
14 146.2
15 59.6 3.69，s 147.1 147.1 147.1 --
2’ 124.2 7.70，s 173.2，128.9 173.2，128.9 173.2，128.9 11.81，
9.00
3’ 137.7
4’ 173.2
4a’ 112.2
5’ 149.3
6’ 103.1
7’ 113.8 6.96，s 149.3，128.9， 137.0 137.0 10.36，
118.7 8.62
8’ 137.0
8a’ 128.9
1-OH 6.42，br s -- 113.8 -- 3.89，
3.60
9-NH 8.62，br t， 3.40 158.9，38.1 158.9 158.9 2.75，
5.7 3.12，
6.96
12- 11.95，br s -- 146.2，120.4 -- 7.27
NH
14- 7.27，br s -- -- -- 11.95
NH2
1’- 9.00，br s -- -- -- 7.67
NH
3’- 11.81，br s -- 139.9，124.2， -- 7.67
OH 112.2
5’- 14.42，br s 149.3，112.2， 149.3，112.2 -- --
OH 103.1
8’- 10.36，br s -- 128.9 -- 6.96
OH
s＝单峰，d＝双峰，m＝多峰，br＝广，(--)＝重叠。
第二例
利用以上第一例所属的程序，另外测试一些从NCI集合的水生海绵体和陆生真菌中的提取的纯化组合物来获取酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂的活性。
为确保天然化合物纯化而得的抑制剂活性，本发明真菌硫醇自共轭酰胺酶的IC50值被用以下方法测定。应用荧光HPLC测定法并结合如以上描述的方法，并注入以下试剂。为测定包皮垢分支杆菌分支杆菌真菌硫醇自共轭物的IC50值，天然的真菌硫醇溴被用作基质，从培养的包皮垢分支杆菌分离出来的多种MCA被用来裂解MSmB。为决定包皮垢分支杆菌MCA的IC50值，合成的MSmB被培养正如已发表的描述。(G.M.Nicholas et al.J.Am.Chem.Soc.(2002))，这篇文章也被发表在www.pubs.acs.org网站上。基质和重组的结核分枝杆菌MCA可以被载寄主细胞，如大肠杆菌，内被充分表达，并被用作酶。重组的结核分支杆菌被从结核分支杆菌中分离出来的总基因DNA再克隆，并别插入一蛋白质G融化媒介，该媒介最初从Pet-11a媒介中建立。MtB-MCA编码质粒，这里指sb-G1082-Mtb，被用作获取重组的MtB-MCA。
抑制剂的贮备溶液，是不同的化合物，在浓度为1-20mM的MeOH下预制。关于每个抑制剂的一系列稀释液被制取，所以2μl的抑制剂被加入每个基质井中，以得到理想的抑制剂浓度。所有的测定均用30um天然或者合成的MSmB以及大约20um天然或者重组的MCA，在不同的抑制剂浓度条件下。裂解反应发生在31摄氏度条件下，20分钟，这样可以更好地结合酶的最初的线速度。酶的溶液可以用布雷德福方法或紫外光谱学量化。IC50值可以通过非线性最小二乘最佳拟合法，利用公式裂解＝S/(1+[I]/[IC50]其中S是在缺少抑制剂条件下，裂解的量，I是抑制剂浓度。
表1概括了这些测定的结果，还显示了试验于包皮垢分支杆菌和结核分支杆菌的酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶时化合物1-化合物14的IC50值。鉴于对包皮垢分支杆菌和结核分支杆菌的测试，抑制剂的活性有所不同，化合物10，11，13，14只对包皮垢分支杆菌酶做试验。在两种酰胺酶中，80％的氨基酸顺序是完全一致的，所以化合物10，11，13，14对结核分支杆菌酶试验的结果和化合物10，11，13，14对包皮垢分支杆菌酶试验结果相近。
第三例
为了阐明本发明酰基氨基葡萄糖环己六醇酰胺酶抑制剂的结构成分，像以上描述的自共轭酰胺酶，3种化合物被测定来筛选酰胺酶的抑制力，如同第一例和第二例所描述的一样。50uM MSmB被作为基质，第一种化合物，这里指C2385-2-2，一种二溴酚衍生物具有和化合物4相同的结构元素，但和化合物4比较，其基点向推接近酚环。其酰胺酶的抑制结果测定显示C2385-2-2作为酰胺酶抑制剂，效果不佳。其IC50值高于1mM(如图6)。
相比较，oceanapiside，这里指化合物7，和3-alkylpyridiniummacrocycles，这里指化合物9，本质上具有不同的结构及IC50值，分别为5UM和50ng/ml。
这种结构上的对照表明了化合物7，8，9共同的结构特性在正电荷的亮点存在，oceanapiside的两个胺基在生理PH下，被质子化，并和介入的长疏水链相连。
本发明通过一些实施例已被充分描述，但本发明精神涵盖下的一些改进应包括在以下申请权力中。