可注射型胶原基软组织填充材料及其制备方法.pdf

本发明公开了一种可注射型胶原基软组织填充材料及其制备方法。该填充材料主要由以下组分构成：胶原0.5～20％，肝素0.1～10％，细胞生长因子0～1％，缓冲液70～99.4％。制备上述填充材料的方法如下：从动物结缔组织中提取可溶性胶原，利用蛋白酶水解切除胶原分子中的抗原决定族，纯化处理后，采用安全无毒的交联剂交联，然后添加生物活性组分，将混合物反复揉捏成膏状，无菌条件下密封并低温储存。本发明所得的填充材料，安全无毒，可生物降解，容易为人体耐受。

1、  一种可注射型胶原基软组织填充材料，其特征在于主要由以下组分构成：胶原0.5～20％；肝素0.1～10％；细胞生长因子0～1％；pH值为6.8～7.2的缓冲液70～99.4％。

2、  根据权利要求1所述的填充材料，其特征在于主要由以下组分构成：
胶原2～10％；肝素0.5～5％；细胞生长因子0.0001％～0.001％；pH7.2的磷酸盐缓冲液85～97.1％；局部麻醉剂0.3％。

3、  根据权利要求2所述的填充材料，其特征在于：所述细胞生长因子是bFGF，所述局部麻醉剂是利多卡因。

4、  根据权利要求1、2或3所述填充材料的制备方法，从动物结缔组织中提取可溶性胶原，其特征在于：利用蛋白酶水解切除胶原分子中的抗原决定族，纯化处理后，采用安全无毒的交联剂交联，然后添加生物活性组分，将混合物反复揉捏成膏状，无菌条件下密封并低温储存。

5、  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述动物结缔组织包括来源于猪、牛或羊等的皮肤、软骨或肌腱组织。

6、  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶或菠萝蛋白酶。

7、  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述纯化处理是通过透析或超滤膜处理脱除其中的无机盐及小分子杂质。

8、  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述交联剂是碳化二亚胺或甲壳糖；采用碳化二亚胺时，碳化二亚胺的终浓度为0.5～5％；采用甲壳糖时，甲壳糖的终浓度为1％～20％。

9、  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述生物活性组分是细胞因子成分、肝素以及粘多糖类、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸或甲壳糖中的一种或一种以上。

10、  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述交联进行0.1～4小时后，在-80～0℃下冷冻干燥处理1～48小时，然后在真空条件下加热到100～120℃处理0～72小时进一步交联和灭菌。

可注射型胶原基软组织填充材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学材料及其制备方法，尤其是人体组织修复或填充材料及其制备方法。
背景技术
组织工程技术是在20世纪80年代提出并逐渐发展起来的一种生物技术。其基本含义是将细胞、合成材料或处理过的天然材料、组织与细胞因子和基因治疗结合起来，广泛地应用于体内的组织再生或体外的组织构建。因此，组织工程技术是整形和修复重建外科领域的一个重大革命。组织工程皮肤产品已经获得FDA的批准并在美国生产和销售。目前在国内外，组织工程制品的研究已经引起人们广泛的关注。
目前市场上的类似产品主要有三类。一是以美国巴菲特面部整容外科中心(Parfitt Facial Cosmetic Surgery Center)为代表的商品名为“Zyderm”和“Zyplast”的产品，是从牛皮提取纯化的纯胶原蛋白，经戊二醛化学交联而成。该产品主要存在几个方面的问题，包括疯牛病病毒的威胁，填充效果不佳，需连续多次注射，而且反弹率很高，残留的戊二醛具有细胞毒性，需要严格控制其残留量，目前尚未在国内销售；二、中国预防科学研究院刘秉慈研究开发的人胎盘胶原蛋白注射液。该产品虽然安全性较高，但同样存在免疫排斥反应，而且胎盘胶原降解快，需多次注射且修复皮肤效果差，生产成本相对较高；三、荷兰哈福生物科学公司(Hafod Bioscience B.V.)的商品名为“爱贝芙”(Artecoll)的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球和胶原的复合注射剂，该产品应用非降解性的合成高分子材料PMMA作为填充剂，材料长期存留在体内，对皮肤的正常代谢产生不良影响，而且有潜在的致使皮肤发生癌变的可能，不符合人们的消费心理。
发明内容
本发明的目的就是提供一种安全无毒，可生物降解，容易为人体耐受且具备诱导组织再生特性的可注射型胶原基软组织填充材料及其制备方法。
为达上述目的，本发明的胶原基软组织填充材料主要由以下组分构成：
胶原0.5～20％，肝素0.1～10％，细胞生长因子0～1％，pH值为6.8～7.2的缓冲液70～99.4％。
作为一个优选方案，胶原基软组织填充材料主要由以下组分构成：
胶原2～10％，肝素0.5～5％，细胞生长因子bFGF 0.0001％～0.001％，pH7.2的磷酸盐缓冲液85～97.1％，局部麻醉剂利多卡因0.3％。
制备上述填充材料的方法如下：从动物结缔组织中提取可溶性胶原，利用蛋白酶水解切除胶原分子中的抗原决定族，纯化处理后，采用安全无毒的交联剂交联，然后添加生物活性组分，将混合物反复揉捏成膏状，无菌条件下密封并低温储存。
所述动物结缔组织包括来源于猪、牛或羊等的皮肤、软骨或肌腱组织等。
蛋白酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶或菠萝蛋白酶等。
所述纯化处理是通过透析或超滤膜处理脱除其中的无机盐及小分子杂质。
所述交联剂是碳化二亚胺或甲壳糖。采用碳化二亚胺时，其加入的终浓度为0.5～5％；采用甲壳糖时，其加入的终浓度为1％～20％。
所述生物活性组分是细胞因子成分、肝素、粘多糖类、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸或甲壳糖中的一种或一种以上。
作为本发明的改进，上述方法中，交联进行0.1～4小时后，在-80～0℃下冷冻干燥处理1～48小时，然后在真空条件下100～120℃加热处理0～72小时进一步交联和灭菌。
采用本发明所制得的材料及其制备方法具有以下优点：
①以来源于动物结缔组织的天然蛋白质高分子作为基质材料，安全无毒，可生物降解，容易为人体耐受；
②材料经生物酶处理，切除分子中相应的抗原决定族，使材料的抗原性显著降低；
③材料的降解时间可方便地实现人为调节；
④材料的交联采用安全无毒容易去除的碳化二亚胺类交联剂取代戊二醛和甲醛，可在温和的条件下反应，交联效果好；
⑤材料复合细胞生长因子，可诱导人体皮肤中的细胞加速增殖并分泌相应的细胞外基质，实现自体修复；
⑥应用该材料可实现皮肤等软组织的永久修复，没有反弹。
本发明摒弃了现有皮肤修复用及其它医用组织填充材料的缺陷，根据组织工程技术的基本原理，结合新型的生物组织交联技术，制备出新型的医用填充材料。本发明所得的填充材料注射到人体皮肤真皮层，以填充真皮缺损并最终诱导真皮层的纤维母细胞加速分泌细胞外基质，实现引导组织再生的目的，以消除皮肤皱折和塌陷，使皮肤恢复饱满和弹性，完美修复皮肤缺损。该填充材料还可以用于作为组织填充材料治疗前列腺切除术后尿失禁等治疗用途。本发明工艺简单，生产成本低。
具体实施方式
实施例一：
制备本发明的填充材料的方法依次如下：
1)取新鲜屠宰的猪肌腱组织1kg，洗净，切碎，10升4.5mol/l NaCl溶液浸泡4小时，然后0.05mol/l的三羟甲基氨基甲烷—盐酸盐(Tris-HCl)(pH＝7.5)缓冲液10升浸泡4～6小时；
2)用终浓度为0.5mol/l的葡萄糖和终浓度为2mol/l的NaCl的混合液浸泡2～12小时；
3)用0.1mol/l的醋酸溶液浸泡4～6小时，组织捣碎机捣碎；
4)浆状物重新用5升Tris-HCl(pH＝7.5)缓冲液浸泡4～6小时；
5)离心处理，分离沉淀物，将沉淀物质按1∶50的质量比用蒸馏水稀释，搅拌分散，用纯醋酸调节体系pH值到3.0左右，同时加入占沉淀物质质量的3％的胃蛋白酶，10℃搅拌反应24小时；
6)往反应体系中加入乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)，使其浓度达到1000ppm，继续搅拌0.5小时；
7)将反应液在4～10℃冷冻离心处理，去掉沉淀物质，往清液中加入饱和氢氧化钠溶液中和至中性，然后再加入氯化钠，直至其浓度达到2mol/l；缓慢搅拌，然后静置盐析10～24h；
8)4～10℃冷冻离心收集沉淀，用蒸馏水透析24～48小时，每隔4小时换一次水，至硝酸银试剂检测不到Cl^-为止；
9)4～10℃冷冻离心处理后，沉淀物在-40～-10℃冷冻干燥成胶原海绵，约120g；
10)取约1g的胶原海绵浸泡于50ml含50mmol/l地2-吗啉代乙基磺酸(MES)的乙醇溶液中，pH为5.4，室温下浸泡30min；
11)加入N-(3-二甲胺基丙基)-N′-乙基碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，使EDC∶NHS∶Coll-COOH＝7.0∶2.8∶1，作为交联剂(Coll-COOH表示胶原分子中的羧基)，室温下交联1～4h；
12)用pH＝9.0的磷酸盐缓冲液冲洗后，再用2mol/l的NaCl溶液浸泡后，蒸馏水洗涤；
13)产品再次在-40～-10℃冷冻干燥，然后在真空条件下100～120℃加热处理1h进一步交联和灭菌；
14)无菌条件下将产品加入20ml pH＝7.2的无菌磷酸盐缓冲溶液，使其充分吸水溶胀，揉捏成膏状，然后加入0.5g肝素，0.1g硫酸皮肤素，0.3％的利多卡因，充分混合，无菌条件下将膏状物密封于一次性注射器中，每管封装1～2ml，10℃下保存。
所得填充材料的成份为：胶原2～10％，肝素0.5～5％，细胞生长因子bFGF0.0001％～0.001％，pH7.2的磷酸盐缓冲液85～97.1％，局部麻醉剂利多卡因0.3％。
实施例二：
制备本发明的填充材料的方法依次如下：
1)取新鲜屠宰的小牛皮肤组织1kg，洗净，切碎，10升10％(质量与体积比，g/ml)的碳酸钠溶液浸泡4小时后，4.5mol/l NaCl溶液浸泡4小时；
2)终浓度分别为0.5mol/l的葡萄糖溶液和2mol/lNaCl溶液浸泡过夜；
3)用0.1mol/l的醋酸溶液浸泡4～6小时，组织捣碎机捣碎；
4)浆状物分两次用5升Tris-HCl(pH＝7.5)缓冲液浸泡4～6小时；
5)离心处理，分离沉淀物，将沉淀物质按1∶50的质量比用蒸馏水稀释，搅拌分散，用纯醋酸调节体系pH值到3.0左右，同时加入占沉淀物质质量的3％的胃蛋白酶，10℃搅拌反应24小时；
6)反应体系中加入EDTA，使其浓度达到1000ppm，继续搅拌0.5小时；
7)反应液冷冻离心处理，去掉沉淀物质，往清液中加入饱和氢氧化钠溶液中和至中性；
8)然后再加入氯化钠，直至其浓度达到2mol/l；缓慢搅拌，然后静置盐析2～12小时；
9)冷冻离心收集沉淀，对蒸馏水透析48小时，每隔4小时换一次水；
10)冷冻离心处理后，沉淀物冷冻干燥成胶原海绵，约80g；
11)取0.5g胶原海绵溶解于pH＝3.0的蒸馏水中，加入0.1g甲壳糖作为交联剂，室温下搅拌交联1小时；
12)产品再次冷冻干燥，然后在真空条件下100～120℃加热处理1小时进一步交联和灭菌；
13)无菌条件下将产品加入20ml pH＝6.8的无菌磷酸盐缓冲溶液，使其充分吸水溶胀，揉捏成膏状，然后加入0.5g肝素，0.1g透明质酸，0.3％的利多卡因，充分混合，无菌条件下将膏状物密封于一次性注射器中，每管封装1～2ml，10℃以下保存。
实施例三：
制备本发明的填充材料的方法如下：
1)胶原的制备方法同实施例一或实施例二所述；
2)取0.5g胶原海绵溶解于pH＝3.0的蒸馏水中，加入0.1g甲壳糖作为交联剂，室温下搅拌交联1h；
3)产品再次冷冻干燥，然后在真空条件下100～120℃加热处理1小时进一步交联和灭菌；
4)无菌条件下将产品加入20ml pH＝6.8的无菌磷酸盐缓冲溶液，使其充分吸水溶胀，揉捏成膏状，然后加入0.3肝素，0.1g硫酸皮肤素，细胞因子bFGF冻干粉10μg，0.3％的利多卡因，充分混合，无菌条件下将膏状物密封于一次性注射器中，每管封装1～2ml，10℃以下保存。