一种新型乳腺癌基因治疗药物HDM2－SIRNA.pdf

本发明涉及一种新型乳腺癌基因治疗药物hdm2－siRNA的设计、合成、细胞毒作用检测、靶mRNA和靶蛋白水平的沉默作用检测、诱导细胞凋亡和周期阻滞作用的检测以及体内抗肿瘤作用的检测等，针对hdm2基因设计的短干扰RNA(siRNA)转染细胞后可以抑制MCF－7细胞的生长，特异性降低hdm2基因的mRNA水平和HDM2蛋白表达水平，同时诱导MCF－7细胞发生凋亡和G1期阻滞，hdm2－siRNA对裸鼠体内移植肿瘤MCF－7的抑制率达60％，与丝裂霉素联合用药对该肿瘤生长的抑制率可达88％，且对动物的毒副作用较小，因此，hdm2－siRNA有望发展成为一种治疗乳腺癌等肿瘤的新型高效基因治疗药物。

1.  一种新型乳腺癌基因治疗药物hdm2-siRNA，其特征是所说的siRNA序列具有21-nt的双链RNA复合体，每一链3’端有两个脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂状态，正义链与反义链有19个碱基互补配对。

2.  如权利要求1所述的hdm2-siRNA，其特征是hdm2-siRNA的靶mRNA序列为：
5'-AAG CUU CGGAACAAGAGACCC-3’(SEQ ID No1)
寡核苷酸序列为：
5'-G CUU CGG AAC AAG AGA CCCdTdT-3’(SEQ ID No2)
3'-dTdTC GAA GCC UUG UUC UCU GGG-5’(SEQ ID No3)

3.  hdm2-siRNA在制备抗乳腺癌肿瘤基因治疗药物中的应用。

一种新型乳腺癌基因治疗药物hdm2-siRNA
技术领域：
本发明涉及一种短干扰核糖核酸(short interfering RNA，siRNA)药物的设计、合成及其对生长抑制作用、凋亡诱导作用、周期阻滞作用和体内抗肿瘤作用的检测等。
背景技术：
随着环境污染的日益严重和其它生存条件的变化，近年来乳腺癌病人的死亡率逐渐升高，全球每年有50-100万人死于乳腺癌。美国2003年乳腺癌死亡率在女性恶性肿瘤中仅次于皮肤癌(CA Cancer J Clin.2003，53(1)：5-26)，而在北京地区其死亡率已成为女性恶性肿瘤之首。因此，对乳腺癌进行基因治疗方面的研究具有一定的实际意义。
乳腺癌是受多个基因的网络调控作用，hdm2基因是1987年Cahilly等从转化小鼠细胞系的双微染色体上克隆成功的癌基因，在鼠和人的很多组织中都有表达，人hdm2基因定位于12号染色体长臂12q13-14，且有不同的mRNA剪接形式。人体许多器官都有hdm2 mRNA(5.5kb)的存在，以骨骼肌最高。1992年Oliner等首次报道hdm2基因在人体的一些软组织和骨肉瘤中有扩增，Sheikh等发现在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系中hdm2 mRNA水平是雌激素受体阴性的乳腺癌细胞系的30倍，5％-10％的人类肿瘤中虽无基因扩增但有hdm2过度表达，hdm2的基因扩增也与细胞的成瘤性及肿瘤的转移密切相关(Cancer Research.1993，53(4)：3226-3228)。HDM2的一个重要功能是抑制野生型p53的转录激活功能及抗肿瘤活性。由于野生型p53具有抑制肿瘤生长的作用，已成为肿瘤基因治疗的一个重要靶标。当细胞受到某种刺激而使p53升高时，它可以激活hdm2基因转录，增加HDM2的胞内蛋白水平，而HDM2蛋白N端又可以与p53的N端转录激活功能区相结合，抑制其激活转录功能，同时促进p53蛋白经泛素化途径降解，使之失活，将p53的生长抑制活性限制在一种相对平衡的水平上，使细胞能够继续增殖。因此，从理论上讲，若能降低HDM2基因的表达水平，即可以解除HDM2与p53的相互作用，恢复野生型p53介导周期阻滞和细胞凋亡的功能，从而抑制肿瘤的发生和发展。
以干扰HDM2-p53的相互作用为靶点而设计或得到的药物目前主要有人工合成多肽、微生物代谢产物、及非肽类的小分子化合物等，它们主要是通过阻止HDM2与p53的相互结合来发挥作用。通过降低HDM2的表达水平来发挥作用的反义核酸也是干扰HDM2-p53相互作用的一类主要药物。有报道表明，针对HDM2基因的反义核酸在体内和体外实验中均有一定的抗肿瘤作用。但是，由于反义核酸本身具有一定的局限性，其特异性不够强及给药剂量偏高等问题使其进一步的应用研究进展缓慢。而1998年发现的RNA干扰(RNAi)现象，是从低等生物到高等生物都普遍存在的一种防御外源性核酸侵扰的生理机制，它是由siRNA介导的高度特异的转录后基因沉默效应(Nature.1998，391：806-811)。通过siRNA发挥导向作用来激活RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex，RISC)，由其中的RNase III来高度特异地切割靶mRNA。RNA干扰技术已发展成为抑制靶基因表达的一个有效工具。
虽然RNAi的研究尚处于不完善阶段，但它已被认为是一种生物体固有的基因组“免疫系统”，使得它具有许多反义核酸不可比的优势。siRNA与反义核酸相比具有如下一些特点：前者是由双链RNA分子在细胞内发挥作用，由于细胞内可能存在某种稳定机制，使得siRNA的稳定性较高；siRNA的正义链和反义链在反应过程中都是必需的，而不是仅由一条反义链来发挥作用；siRNA本身没有催化活性，要求有许多辅助因子形成复合体才能发挥作用；在某些生物体内发现RNAi还具有遗传性，扩增性和可传递性。正是由于这些特点，使RNAi与传统的反义技术相比具有高效性，高特异性的特点(Lancet.2001，358(9282)：489-497)。目前已有大量报道表明，向哺乳动物和人类的细胞中导入siRNA可以引起靶mRNA分子高效特异的降解。
因此，以这种生物体本身存在的RNA干扰机制为基础，人工设计并合成针对hdm2基因的特异siRNA作为诱发RNA干扰的前体，高效特异地降解hdm2基因的mRNA，降低HDM2蛋白水平，诱导肿瘤细胞发生凋亡和周期阻滞，杀死肿瘤细胞，可以为乳腺癌等肿瘤的基因治疗提供更为有效的药物。
本发明目的在于以RNA干扰技术为基础，设计针对hdm2基因的siRNA药物，阐明hdm2-siRNA对人乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制作用、对细胞凋亡和周期阻滞的诱导作用，及其对体内移植肿瘤的生长抑制作用，为hdm2-siRNA在乳腺癌基因治疗中的应用提供一定的理论依据。
发明内容：
本发明以RNA干扰技术为基础，从GenBank中获得hdm2基因的cDNA序列，根据siRNA靶序列选择的基本原则，针对hdm2基因设计了长度为21个核苷酸的siRNA，siRNA地3’端有两个脱氧核糖核苷酸(dTdT)呈单链悬挂状态，以此增强siRNA在体内和体外对核酸酶(RNase)的耐受性。本发明中所使用的siRNA系由本发明人自行设计、委托美国Dharmacon公司通过化学法合成的。本发明涉及利用MTT法检测siRNA对肿瘤细胞的细胞毒作用，以不同浓度的siRNA进行转染，用MTT法检测转染后活细胞生存率，根据剂量反应曲线计算出siRNA对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)。结果表明，不对任何基因产生沉默作用的mock-siRNA对MCF-7细胞的IC₅₀为2416nM，hdm2-siRNA对MCF-7细胞的IC₅₀为137nM，hdm2-siRNA对MCF-7细胞的生长抑制作用强于已公开专利(申请号：02159031.1)报道的mdm2-siRNA(其IC₅₀为173nM)。本发明还涉及采用RT-PCR法检测hdm2-siRNA对靶mRNA的影响。细胞经100nMhdm2-siRNA处理24h后，进行一步法RT-PCR反应。结果显示，经hdm2-siRNA处理后细胞hdm2基因的mRNA水平明显下降，而经mock-siRNA处理后细胞hdm2基因的mRNA水平没有变化。本发明同时涉及用Western Blotting法检测hdm2-siRNA的沉默作用。采用100nM hdm2-siRNA分别处理细胞6，12，24，36，48h，和分别采用5nM，50nM，100nM，500nM的hdm2-siRNA处理细胞36 h，Western Blotting结果显示，hdm2-siRNA对HDM2蛋白水平的影响呈现明显的时间和剂量依赖效应，100nM和500nM siRNAs分别在48h和36h对HDM2水平产生明显的抑制作用，而mock-siRNA对HDM2蛋白水平没有影响。本发明还涉及用TUNEL标记法检测hdm2-siRNA的凋亡诱导作用。结果显示，细胞经300nM hdm2-siRNA处理36h后，细胞发生明显的DNA断裂，提示hdm2-siRNA能够诱导MCF-7细胞发生凋亡。本发明还涉及用流式细胞法检测hdm2-siRNA对细胞周期的影响。结果显示，以300nM hdm2-siRNA处理后，细胞发生明显的G1期阻滞，G1期细胞的百分比由49.8％增加到83.2％。本发明还涉及hdm2-siRNA体内抗肿瘤作用的检测，采用MCF-7肿瘤细胞裸鼠体内移植模型来检测hdm2-siRNA的体内抑制肿瘤增殖作用。hdm2-siRNA的给药剂量为0.5mg/kg，每隔一天给药，共给药8次。结果显示，hdm2-siRNA在体内能够有效地抑制肿瘤的生长。在第29天，hdm2-siRNA对肿瘤的抑制率为60％。实验中发现，mock-siRNA也对肿瘤生长有一定的抑制作用。hdm2-siRNA还可能增强DNA损伤类药物的抗肿瘤活性。将hdm2-siRNA与丝裂霉素C联合用药，丝裂霉素C的给药剂量是0.5mg/kg，在第5，8，13，21天共给药4次，hdm2-siRNA的给药剂量同前。结果显示，hdm2-siRNA能够协同增强丝裂霉素C的抗肿瘤作用，在第23天，联合用药组肿瘤生长抑制率是88.8％，hdm2-siRNA和丝裂霉素C单独给药组的抑制率分别是67.8％和46.8％，在停药后仍旧能够观察到这种协同作用。实验中对照组和给药组裸鼠的体重接近，且各组均无动物死亡。
综上所述，本发明提出了获取靶基因序列并设计特异siRNA的方法，建立了检测siRNA细胞毒作用、基因沉默作用、凋亡和周期阻滞诱导作用及体内抗肿瘤作用的一系列方法。所有结果表明，hdm2-siRNA可能成为一种新型的乳腺癌基因治疗药物。
发明效果：
本发明以RNA干扰为技术平台，提出了一种全新的乳腺癌基因治疗药物hdm2-siRNA的一系列研究方法，包括siRNA设计、体外生长抑制作用检测、mRNA和蛋白水平沉默效果检测、诱导细胞凋亡和周期阻滞作用检测、体内抗肿瘤作用检测等。合成的hdm2-siRNA能够高效特异地降低靶mRNA和靶蛋白水平，诱导细胞凋亡和周期阻滞的发生，对MCF-7细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)为137nM，其生长抑制作用强于已公开专利报道的mdm2-siRNA(其IC₅₀为173nM)。与丝裂霉素联合用药对体内移植肿瘤的生长抑制率达88％。因此，hdm2-siRNA对乳腺癌等肿瘤的基因治疗有着广泛的应用前景。
附图说明：
图1.hdm2-siRNA对MCF-7细胞的剂量-反应曲线，其中：
■-hdm2-siRNA
○-转染mock-siRNA组
图2.hdm2-siRNA降低靶mRNA水平。其中：
Marker泳道-DNA分子量标准
Control泳道-未转染任何siRNA组
Mock泳道-转染mock-siRNA组
siRNA泳道-转染hdm2-siRNA组
图3.hdm2-siRNA降低靶蛋白水平。其中：
Control泳道-未转染任何siRNA组
Mock泳道-转染mock-siRNA组
siRNA泳道-转染hdm2-siRNA组
图4.hdm2-siRNA诱导MCF-7细胞DNA断裂。其中：
Control泳道-未转染任何siRNA组
Mock泳道-转染mock-siRNA组
hdm2-siRNA泳道-转染hdm2-siRNA组
图5.hdm2-siRNA的体内抗肿瘤作用。其中：
○-以生理盐水作为对照组
□-瘤内注射mock-siRNA组
●-瘤内注射hdm2-siRNA组
■-瘤内注射丝裂霉素组
△-瘤内注射丝裂霉素和hdm2-siRNA组
以下实施例是为所属领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：
siRNA靶序列的选择
首先，从特定基因完整cDNA序列起始密码子下游的50个核苷酸以后和终止密码子前100个核苷酸之间的序列中选择21个核苷酸靶区域可能更为有效(Genes and Development 2001，15：188-200)。由于5’或3’的非翻译区及起始密码子附近调节蛋白结合位点较多，所以一般不选择这些部位。非翻译区的结合蛋白和翻译起始复合物可能会对短干扰核糖核蛋白(short interferingRibonucleoprotein，siRNP)和RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex，RISC)与靶mRNA的结合有影响。所用的序列一般是前两个为AA后两个为TT且G/C含量在30％-50％的21核苷酸序列。如果cDNA中不含有这样的序列，也可采用仅前两个核苷酸为AA的21核苷酸序列。这种情况下，在合成siRNA时需将其正义链3’端后两个核苷酸变为TT。如果靶mRNA上没有前两个为AA的21核苷酸序列，那就采用仅第二个核苷酸为A的21核苷酸序列，或者不选择有A开头的序列。此外RNaseIII能够较为高效地在GG，GA或AU间快速切断其间的共价键，而高度保守的CGG序列可能是一个甲基化酶作用中心，若能够在siRNA的正义链序列中尽量含有2-3个酶切序列即GG，GA或AU和一个CGG序列，形成一个酶切中心CGGG(A)N(N为A，U，C)，使它们中的第二个G位于siRNA中第十或第十一位，则可能有利于提高siRNA对靶mRNA的切割效率。此外，还要考虑设计的siRNA所在靶序列位置是否存在单核苷酸多态性(SNP)，及siRNA的正义链和反义链的能量值等项指标，这些都有利于得到更有效的siRNA。
选定靶序列后要对其同源性进行检索，使该靶序列与其它基因不具有较高的同源性，同时尽量选择针对靶基因或者其整个基因家族中高保守序列位置的siRNA序列进行合成。合成出的siRNA双链是由21个核苷酸的正义链和反义链组成，每条链的3’端都悬挂突出两个核苷酸dTdT，中间19个核苷酸配对，正义链和反义链3’端的悬挂突出序列dTdT是对称的。siRNA正义链悬挂突出部分的修饰不会影响其对靶mRNA的识别，而反义链该部分的修饰则可引导其对靶mRNA的识别。悬挂突出的两个脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸同样有效，但前者合成更便宜，而且可耐受更多的核酸酶，同时3’悬挂突出部分用dTdT的方式也可提醒合成者采用正确的合成方向(Nature 2001，411：494-498)。所以本发明选择悬挂突出为dTdT的siRNA序列(PNAS 2001，98：14428-14433)。本发明所使用的siRNA双链复合体纯度＞97％。用水溶解RNA双链后，可直接用于转染。这种方式可保证双链复合体以适当形式存在并易于转染。
综合以上多方面因素，本发明设计了实验中所需要的hdm2-siRNA序列，经后续的实验证明所设计的siRNA序列能够有效抑制靶基因的表达。
本发明从GenBank中获得了hdm2基因序列，它在GenBank中的登录号以及对应的siRNA序列相对于起始密码子的位置如下：
hdm-2(Acc.No.NM_002392)   61-79
hdm2-siRNA的靶mRNA序列及siRNA寡核苷酸序列如下：
mRNA Target(AA-N19)
5’-AAG CUUC AAG AGA CCC-3’(SEQ ID No1)
寡核苷酸序列为：
5’-G CUU CGG AAC AAG AGA CCCdTdT-3’(SEQ ID No2)
3’-dTdTC GAA GCC UUG UUC UCU GGG-5’(SEQ ID No3)
在上面的hdm2-siRNA靶序列中含有一个CGGAA酶切中心，与已公开专利(申请号：02159031.1)的mdm2-siRNA靶序列完全不同。
实验中采用的mock-siRNA序列为：
mRNA Target(AA-N19)
5’-AAAAUAGUGUAUACGGCAUGC-3’.
寡核苷酸序列为：
5’-AAU AGU GUA UAC GGC AUG CdTdT-3’
3’-dTdTU UAU CAC AUA UGC CGU ACG-5’
实施例2：
siRNA的传染
本发明使用LipofectAMINE^TM2000脂质体(Life Technologies，产品货号：11668-027)进行转染，转染后18-45小时进行沉默效果测定。将合成的siRNA粉末用水溶解，配成4000nM的储备溶液。实验细胞是在转染前18-20小时用200μl含10％胎牛血清的无抗生素DMEM组织培养液以6000-8000个/孔接种到96孔板中。将4000nM的siRNA用无抗生素无血清的Opti-MEM培养液分别稀释至120nM、400nM、1200nM、2000nM、4000nM各75μl，在另外一个Eppendorf管中，向370μl Opti-MEM培养液中加入5μl脂质体，孵育5分钟后，向各浓度的siRNA溶液中分别加入75μl脂质体稀释液并轻轻混匀。siRNA与脂质体复合物于室温静置20分钟后，把50μl siRNA-脂质体复合物加到细胞培养板(细胞生长覆盖率为80％-90％)中。细胞在给药前用无抗生素无血清的DMEM培养液洗一遍后，再加入新的50μl无抗生素无血清Opti-MEM培养液。这样，转染后每孔溶液终体积为100μl。各孔中siRNA的给药浓度分别为30nM、100nM、300nM、500nM、1000nM，每个浓度同时作三个平行孔，每次实验至少重复三次。转染后五小时，每孔中补加100μl Opti-MEM培养液。第一次转染后每间隔15小时，同样方法进行第二次、第三次转染。本发明所采用的乳腺癌MCF-7细胞来源于美国经典细胞库(ATCC HTB22)，由本室自行冻存。转染后用MTT法测定细胞存活率，计算IC₅₀值。
实施例3：
用MTT法检测siRNA对肿瘤细胞的生长抑制作用
按实施例2方法转染的细胞在37℃，含5％CO₂空气及100％湿度的温箱中孵育45小时左右。MTT用PBS缓冲液配成2mg/ml溶液，每孔加50μl，37℃温育4小时，使MTT还原为Formazan。吸出上清液，加入150μl DMSO(二甲基亚砜)使Formazan溶解。用酶标仪(Mode13550，Bio-Rad)在570nm处测定每个孔的光密度OD₅₇₀。将各测试孔的OD值减去本底OD值(完全培养基加MTT，无细胞)或空白药物孔OD值(完全培养基加受试药物的不同稀释度加MTT，无细胞)，各重复孔的OD值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C％表示，T为加药细胞的OD值，C为对照细胞的OD值。细胞存活率％＝(加药细胞OD/对照细胞OD)×100，求出T/C＝50％时的药物浓度即IC₅₀，同时绘出hdm2-siRNA对MCF-7细胞的剂量反应曲线(图1)，mock-siRNA对MCF-7细胞的IC50为2416nM，hdm2-siRNA对MCF-7细胞的IC₅₀为137.7nM，而去年公开专利(申请号：02159031.1)的mdm2-siRNA对MCF-7细胞的IC50为173nM。因此，hdm2-siRNA较mdm2-siRNA有更强的生长抑制作用。
实施例4：
RT-PCR检测siRNA的基因沉默效果
细胞经100nM siRNA处理24小时后，倒掉培养液加入TRIzol(Ivitrogen，产品货号：15596-026)，每平方厘米加1ml TRIzol试剂，提取总RNA，并用紫外分光光度计(BECKMAN DU800)测定RNA的浓度和质量。采用RT-PCR试剂盒(Invitrogen，Cat.No.10928-34)进行对mRNA水平的检测，反应时加入每种总RNA1μg作为模板，10μM的β-actin对照引物各加0.5μl，10μM的hdm2引物各加1μl，反应体系为25μl，反应条件如下：50℃×30min反转录，之后94℃×1min打开双螺旋，94℃×15sec，57℃×30sec，72℃×40sec，反应进行30循环，最后延伸反应72℃×10min。RT-PCR反应完成后将产物进行琼脂糖电泳，EB染色后用凝胶成像仪照相并分析结果。结果表明hdm2-siRNA能够有效降低hdm2基因mRNA的水平，而mock-siRNA对hdm2基因mRNA的水平没有影响(图2)。
实施例5：
Western Blotting检测siRNA对靶蛋白水平的影响
用2ml含10％胎牛血清的DMEM(Gibco公司产品)培养液在35mm细胞培养皿中于5％二氧化碳100％湿度培养箱中培养MCF-7细胞，覆盖率达到80％-90％时，按照LipofectAMINE^TM2000脂质体操作方案转染100nM siRNA于细胞中，分别在6，12，24，36，48小时后，将细胞用预冷的1×PBS(本实施例中各种试剂和常规操作方法按照《分子克隆实验指南》第二版中相关说明部分配制)洗两遍，加入120μl新鲜配制的细胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH7.5；1％NP-40；150mM NaCl；1mM PMSF，1mM EGTA，0.1mg/ml aprotinin；1mg/mlleupeptin；1mM Na₃VO₄；1mM NaF)，立即用细胞刮刀刮下细胞使其与裂解液充分混合，冰浴30分钟至1小时。4℃、13,000g离心15分钟，收集上清至新的EP管中，用标准Bradford法测定蛋白含量。取各样品等量总蛋白(20-50μg)分别加入等体积的2倍上样缓冲液，沸水煮沸变性5分钟后于7.5％-12％的SDS-PAGE凝胶电泳分离各蛋白，按照《分子克隆实验指南》第二版中相关部分说明转印蛋白到PVDF膜上。转完的膜浸于含5％(w/v)脱脂奶粉TBS溶液中后室温振摇封闭过夜，TBS(10mM Tris HCl，pH7.5，150mM NaCl)室温润洗5次，每次5分钟，装入杂交袋，用含1％BSA的TBS溶液稀释第一抗体，室温振摇孵育3小时，TBS室温润洗5次，每次5分钟。装入新的杂交袋内，用二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗)室温孵育3小时，TBS室温润洗5次，每次5分钟。膜上滴加化学发光增强剂(Santa Cruz Biotechnology公司产品)，按照试剂说明进行操作，通过化学发光成像系统ChemiImager5500(Alpha Innotech.)捕获图像。抗体的稀释比例如下，小鼠单克隆HDM2抗体(Santa Cruz产品，sc-5304)1/150稀释，小鼠单克隆PCNA抗体(Oncogene Product，NA-03)1/200稀释，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体(ZB-2305)1/3000稀释。同样方法分别用5，50，100，500nM的siRNA转染细胞36小时后，检测HDM2蛋白表达情况。结果表明hdm2-siRNA能抑制MCF-7细胞中相应蛋白的表达，并呈现出时间和剂量依赖性，100nM和500nM siRNA分别在48h和36h对HDM2水平产生明显的抑制作用，而经mock-siRNA对HDM2蛋白水平没有影响(图3)。同时检测PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)蛋白表达量，作为上样对照，以保证各组样品总蛋白上样量的一致。
实施例6：
TUNEL标记法检测细胞凋亡
细胞接种于含有经100μg/ml多聚赖氨酸处理过的盖玻片的培养瓶中，放入CO₂孵箱培养18-20小时，使细胞覆盖80％-90％瓶底面积，转染300nMhdm2-siRNA，处理36小时，取出长有细胞的盖玻片，用PBS洗3次。按照试剂盒说明书进行TUNEL标记法(Promega公司产品)检测DNA断裂情况。用Leica显微成像系统(Leica Q500IW)拍摄图像。结果显示hdm2-siRNA可以使细胞发生DNA断裂，表明hdm2-siRNA可诱导细胞凋亡，在图像中呈现棕褐色斑点，而mock-siRNA对DNA断裂的影响很小(图4)。
实施例7：
流式细胞法检测细胞周期变化
按照LipofectAMINE^TM2000脂质体操作方案转染300nM hdm2-siRNA于细胞中，分别在0，12，24，36小时后，将细胞用胰蛋白酶消化，离心收集处理过的细胞，用冰冷的PBS缓冲液洗两遍后，离心倒掉上清保留少许液体，加-20℃预冷的酒精至70％浓度，-20℃固定过夜，磷酸缓冲液洗3次后，经0.5mg/mlRNase A消化30min，用终浓度65μg/ml的碘化丙锭(propidium iodide，PI)染色1h后，FACS 420型流式细胞仪测定凋亡细胞百分率和细胞周期分布。结果表明hdm2-siRNA能够使细胞发生G1期阻滞，G1期细胞所占百分比升高，而mock-siRNA对细胞周期的影响较小(表1)。
表1 siRNA对细胞周期分布比例的影响
组别    时间(小时)    G1期比例(％)    S期比例(％)    G2期比例(％)
             0           49.8            39.8            10.4
             12          70.3            22.5            7.2
hdm2-siRNA
             24          77.6            12.9            9.5
             36          83.2            12.0            4.9
             0           68.7            25.6            5.8
Mock-siRNA
             36          68.9            27.8            3.3
实施例8：
体内抗肿瘤作用检测
采用MCF-7细胞裸鼠体内移植模型来检测siRNA在体内的抗肿瘤作用。选择5-6周龄雌性BALB/c裸鼠，于无菌条件中饲养，将MCF-7细胞300-1000万消化成单细胞后用无血清培养液洗一次，用不大于0.4ml的培养液悬浮细胞，用一次性注射器将细胞悬液注射至裸鼠右侧腋窝。待瘤块长至足够大时，将其在生理盐水中剪成2×2mm大小的小块。用套管针将瘤块移植到裸鼠右侧腋窝，用火棉胶将切口粘住。待瘤块长至大约4×4mm大小时，将裸鼠按瘤块大小分组，使每组动物的瘤块大小平均值约为4×4mm，同时考虑动物的体重，使各组动物体重的平均值接近。分组后进行给药，siRNA采用瘤内注射，剂量为0.5mg/kg，每隔一天给药一次。siRNA与脂质体的比例为1∶5，将siRNA与脂质体混合后静置20分钟，再加入30μl的Opti-MEM培养液，采用微量注射器注射，注射后用火棉胶粘住皮肤上的针孔。注射时要分几次向瘤块的不同方向推进药液，注意不能堵住注射器的针孔，注射器用乙醇消毒。用游标卡尺测量瘤块的大小，每隔一天或两天测量一次，根据公式ab²/2计算瘤块的体积，a为长径，b为短径。计算每组动物的瘤块体积平均值和S值。据此计算每组实验中药物对肿瘤生长的抑制率。同是观察动物的体重变化和死亡情况。联合用药丝裂霉素C时，采用腹腔注射，0.5mg/kg，在第5，8，13，21天给药。实验设生理盐水对照组，单独siRNA组，单独丝裂霉素组，mock-siRNA组，siRNA与丝裂霉素联合用药组。动物给药并观察一定天数后，将动物处死，取出瘤块于液氮中保存，用来作免疫组化或RT-PCR等实验。结果表明hdm2-siRNA在体内能够有效地抑制肿瘤的生长。在第29天，hdm2-siRNA对肿瘤的抑制率为60％。hdm2-siRNA还可能增强DNA损伤类药物的抗肿瘤活性。将hdm2-siRNA与丝裂霉素C联合用药，丝裂霉素C的给药剂量是0.5mg/kg，在第5，8，13，21天共给药4次，hdm2-siRNA的给药剂量同前。结果显示，hdm2-siRNA能够协同增强丝裂霉素C的抗肿瘤作用，在第23天，联合用药组肿瘤生长抑制率是88.8％，hdm2-siRNA和丝裂霉素C单独给药组的抑制率分别是67.8％和46.8％，在停药后仍旧能够观察到这种协同作用(图5)。
                           序列表
<110>中国医学科学院医药生物技术研究所
<120>一种新型乳腺癌基因治疗药物hdm2-siRNA
<160>1
<210>1
<211>1476
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<222>(61-79)
<400>1
   1 atgtgcaata ccaacatgtc tgtacctact gatggtgctg taaccacctc acagattcca61t ggttagacca aagccattgc ttttgaagtt attaaagtct
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