人溶菌酶在制备治疗皮肤病的药物中的新用途.pdf

本发明涉及人溶菌酶在制药领域的新用途，涉及在制备治疗由细菌、真菌、病毒、变态反应、职业性、物理性、神经功能障碍性、免疫性引起的皮肤病变、感染、溃烂疾病的药物中的应用。本发明对基因重组人溶菌酶发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。安全无毒副作用，有很好的药用前景。并且基因重组人溶菌酶来源丰富，制备工艺简单，使用方便。

1、  人溶菌酶在制备治疗皮肤病的药物中的应用。

2、  人溶菌酶在制备治疗由单纯疱疹病毒和带状疱疹病毒引起的皮肤疾病的药物中的应用。

3、  人溶菌酶在制备治疗由细菌引起的皮肤脓疱病和新生儿皮肤脓疱病的药物中的应用。

4、  人溶菌酶在制备治疗由细菌引起的深脓疱病的药物中的应用。

5、  人溶菌酶在制备治疗由细菌引起的脓皮病的药物中的应用。

6、  人溶菌酶在制备治疗由变态反应引起接触性皮炎和荨麻疹的药物中的应用。

7、  人溶菌酶在制备治疗由神经功能障碍性引起的瘙痒症和结节性痒疹疾病的药物中的应用。

8、  人溶菌酶在制备治疗由机体免疫疾病引起的银屑、掌跎脓疱病和天疱疮的药物中的应用。

9、  根据权利要求1-8之一所述的人溶菌酶在制备治疗皮肤病的药物中的新用途，其特征是：药物为喷雾剂、滴剂、奶液、乳剂或膏、霜剂。

10、  根据权利要求1-8之一所述的人溶菌酶在制备治疗皮肤病的药物中的新用途，其特征是：人溶菌酶为基因工程表达的重组人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)₂或(谷氨酸-丙氨酸)₃修饰的人溶菌酶、基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。

人溶菌酶在制备治疗皮肤病的药物中的新用途
技术领域：
本发明涉及人溶菌酶的用途，特别是人溶菌酶在制药领域中的新用途。
背景技术：
皮肤病是由多种因素引起的，这些病的发生和发展与机体的内外因素、宿主的反应状况、遗传和个人素质等因素有关。皮肤病有时轻微极易被忽视，有时可累及内脏，如不早期诊断和早期治疗可导致严重后果。很多皮肤病是细菌引起的，抗生素有很好的疗效。抗生素创造了许多医学奇迹，使许多疾病消失无踪，如肺炎、脑膜炎、产褥热、败血症、结核等。但是21世纪的今天，抗生素的外用导致大量耐药菌产生，耐药菌的发展令人触目惊心。如耐青霉素的肺炎链球菌，过去对青霉素、红霉素、磺胺等药品都很敏感，现在几乎“刀枪不入”。肺炎克雷伯氏菌对西力欣、复达欣等16种高档抗生素的耐药性高达51.85％-100％。金黄色葡萄球菌(MRSA)除万古霉素外已经无药可治，而铜绿假单孢菌在临床上也基本无药可治。目前急需开发一种针对不同耐药菌株均有效的不产生耐药性的新型“超级抗生素”用于临床治疗。
发明内容：
本发明的目的是提供一种人溶菌酶在制备治疗皮肤病的药物中的新用途，有效针对由细菌、真菌、病毒、变态反应、职业性、化学性、物理性、神经功能障碍性、免疫性引起的皮肤病变、感染、溃烂疾病。
实际上，本发明涉及人溶菌酶在制备治疗皮肤病的药物中的应用。
涉及人溶菌酶在制备治疗由单纯疱疹病毒和带状疱疹病毒引起的皮肤疾病的药物中的应用。
涉及人溶菌酶在制备治疗由细菌引起的皮肤脓疱病和新生儿皮肤脓疱病的药物中的应用。
涉及人溶菌酶在制备治疗由细菌引起的深脓疱病的药物中的应用。
涉及人溶菌酶在制备治疗由细菌引起的脓皮病的药物中的应用。
涉及人溶菌酶在制备治疗由变态反应引起接触性皮炎和荨麻疹的药物中的应用。
涉及人溶菌酶在制备治疗由神经功能障碍性引起的瘙痒症和结节性痒疹疾病的药物中的应用。
涉及人溶菌酶在制备治疗由机体免疫疾病引起的银屑、掌跎脓疱病和天疱疮的药物中的应用。
所述人溶菌酶包括基因工程表达的重组人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)₂或(谷氨酸-丙氨酸)₃修饰的人溶菌酶、基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
重组人溶菌酶基因来源人的外周血。再通过DNA重组技术，将基因克隆于pUC19质粒载体中，克隆株通过核苷酸DNA序列分析，证实为重组人溶菌酶基因。它是一种有效的抗菌剂，全称为：1，4-β-N-溶菌酶，或者称：粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它能切断细菌细胞壁的肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键的联结，破坏肽聚糖支架，细菌在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。人和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用。溶菌酶除可以直接裂解细菌，还可以作为免疫调节剂调节中性粒细胞的作用，保护炎症部位正常组织，在调节炎症反应中起负反馈作用(Leo IG，et al.J.Clin.Invist.1979；64：222)。它可能通过与多形核粒细胞膜表面的多糖部分结合，抑制多形核粒细胞向炎症部位移动，并可衰减炎症部位由多形核粒细胞所产生的超氧化物的作用，保护机体在炎症反应时由于免疫应答过度而发生的组织损伤。
所述药物中含有活性300U～300万U/ml人溶菌酶。可以根据通用制剂方法制成喷雾剂、滴剂、奶液、乳剂、膏、霜剂等。
本发明对基因重组人溶菌酶发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。疗效显著且安全无毒副作用，有很好的药用前景。并且基因重组人溶菌酶来源丰富，制备工艺简单，使用方便。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用基因重组人溶菌酶的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
以配制200毫升培养基为基准，用H₃PO₄(磷酸)4-8毫升、MgSO₄(硫酸镁)1-5克，K₂SO₄(硫酸钾)2-6克，KOH(氢氧化钾)1-3克，CaSO₄2H₂O(硫酸钙)1-3.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。再进行种子罐培养，然后进行生产罐培养。将含有基因工程表达的人溶菌酶的毕赤酵母菌培养液过滤浓缩，冰冻干燥，测定蛋白量、纯度和溶菌酶活性(纯度99.8％活性8万单位/ml)保存。将合格的基因重组人溶菌酶冻干粉溶于水中制得喷雾剂、滴剂30000U/ml备用；制得膏(霜)剂30000U/g备用。
一、动物模型试验：
A、人溶菌酶对大鼠的镇痛作用(大鼠甩尾法)
选用120-150克SD健康大鼠50只，雌雄各半，动物自由饮水。试验室温度控制在22-28℃左右，动物喂饲大鼠标准饲料。在TF-光热测痛仪(光源为12V，50W)热照射下10秒钟内反应的大鼠，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。设空白对照组、人溶菌酶三个剂量组(120、60、30IU/只)、鸡溶菌酶(阳性对照)30IU/，均尾部涂药。涂药前和涂药后0.5-4小时测每只大鼠的疼痛反应(甩尾)时间，若痛阈升高到照射30秒钟不甩尾时即中断照射，以免损伤皮肤与起泡，并以30秒计算。试验重复一次。
试验结果见表17-21，结果表明，涂抹人溶菌酶30、60、120IU/只三小时内，其痛阈明显升高，具有镇痛作用。
表17-21(A)人溶菌酶外涂对大鼠的镇痛作用(甩尾法)
                   (第一次试验结果)
                                        疼痛反应时间(秒，X±SD)
组别    剂量      动物数
        (IU/只)   (只)     0        0.5       1         2         3        4(h)
空白    -         10       5.2      5.7       6.4       6.4       6.8      10.3
对照                       ±1.69   ±2.16    ±2.46    ±3.34    ±3.91   ±5.33
鸡溶    30        10       5.5      11.4^**   14.0^**   14.7^**   15.2^**  12.7^**
菌酶                       ±1.72   ±4.5     ±6.93    ±7.67    ±7.45   ±6.99
人溶    120       10       5.3      13.6^**   15.2^**   13.4^**   15.4^**  14.9
菌酶                       ±1.77   ±6.98    ±7.42    ±6.38    ±6.62   ±6.54
人溶    60        10       5.3      9.8^*     12.9^**   12.7^*    13.5^*   12.4
菌酶                       ±1.89   ±4.05    ±6.69    ±6.9     ±6.72   ±6.65
人溶    30        10       5.2      8.6^*     12.4^*    10.9      11.7     10.1
菌酶                       ±1.93   ±2.67    ±7.49    ±7.09    ±6.89   ±7.5
注：经统计学处理，与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表17-21(B)人溶菌酶外涂对大鼠的镇痛作用(甩尾法)
                        (第二次试验结果)
                                    疼痛反应时间(秒，X±SD)
组别    剂量       动物数
        (IU/只)    (只)    0       0.5       1       2        3         4(h)
空白    -          10      5.5     5.9       6.5     6.6      6.9       9.8
对照                       ±1.58  ±1.66    ±1.78  ±4.95   ±6.35    ±6.73
鸡溶    30         10      5.7     12.3**    15.0**  13.8*    13.6*     11.7
菌酶                       ±1.64  ±4.6     ±7.99  ±7.99   ±7.6     ±6.9
人溶    120        10      5.8     14.2**    15.7**  14.5**   14.3*     13.5
菌酶                       ±1.23  ±6.54    ±6.78  ±7.11   ±7.44    ±7.69
人溶    60         10      5.6     12.6**    14.3**  14.0*    13.8*     12.5
菌酶                       ±1.89  ±4.05    ±6.69  ±6.9    ±6.72    ±6.65
人溶    30         10      5.7     10.0*     12.0*   10.7     10.1      11.2
菌酶                       ±1.34  ±4.47    ±7.85  ±4.27   ±3.84    ±4.5
注：经统计学处理，与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
B、人溶菌酶对巴豆油诱发小鼠耳廓肿胀的影响
选用体重27-30克的健康雄性昆明小鼠50只，随机分成5组，每组10只。动物自由饮水。试验室温度控制在22-28℃左右。动物喂饲大鼠标准饲料。第一组为空白对照组；第二、三、四组为人溶菌酶，剂量分别为120、60、30IU/只；第五组为鸡溶菌酶(阳性对照)，30IU/只。首先，各组小鼠全部右耳内侧涂1％巴豆油30μL致炎，(巴豆油，浅棕色油状液体，药用级，批号000309，由江西吉水县华宝天然药用厂生产。临用前用乙醇∶水∶乙醚25∶5∶70混合溶媒配制成1％浓度备用。)半小时后分别用双蒸水20μl、人溶菌酶(6000IU/ML)20μl、人溶菌酶(3000IU/ML)20μl、人溶菌酶(1500IU/ML)20μl、鸡溶菌酶(1500IU/ML)20μl涂抹各组小鼠右耳内侧。致炎后4小时将小鼠脱颈椎致死，沿耳廓基线剪下左右两耳片，用8mm打孔器冲下两耳片，精确称重，左右耳片重量之差为肿胀度。经T检验，比较药物组与空白对照组的差异，并求出抑制率。试验重复一次。
试验结果见表17-22。小鼠经外涂人溶菌酶120、60、30IU/只，使小鼠由巴豆油诱发耳廓肿胀度明显减轻，经T检验，药物组与空白对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)。结果表明人溶菌酶具有抗炎作用。
表17-22  人溶菌酶对巴豆油诱发小鼠耳廓肿胀地影响
                            第1次试验                  第2次试验
组别        剂量
            (IU/只)         肿胀度         抑制率      肿胀度           抑制率
                            (mg，X±SD)    (％)        (mg，X±SD)      (％)
空白对照    -               20.3±3.40                 20.1±4.01
人溶菌酶    120             12.5±5.56**   38.42       13.6±3.78**     32.34
人溶菌酶    60     13.5±4.67**   33.50    15.1±2.42**   24.88
人溶菌酶    30     14.2±3.77**   30.05    15.4±4.22*    23.38
鸡溶菌酶    30     14.6±2.12**   28.08    15.1±2.51**   24.88
注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
C、基因重组人溶菌酶(HLZ)体内外抗菌作用评价
1体外抗菌作用
药品及试剂
1、人溶菌酶(Human Lysozyme HLZ)：活性单位：30000单位/mL，由大连奇龙生物技术研究所提供。
2、对照溶菌酶(contral Lysozyme，CLZ)：白色粉未，活性单位：50000单位/mg，美国SIGMA公司产品，批号：L6876。
3、克拉霉素：效价948μ/mg，中国药品生物制品检定所标准品，批号：
4、罗红霉素：效价878μ/mg，中国药品生物制品检定所标准品，批号：
5、注射用阿莫西林：哈尔滨制药厂产品，批号：010504。
6、琼脂糖(B10WEST AGAROSE)：
7、三羟甲基氨基甲烷(Tris)：成都化学试验厂，批号010211
试验菌株
所用菌株均为2001.4-2002.4月于四川、北京地区收集的临床分离致病菌。经本室用API方法重新鉴定后用于试验。
质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923
          大肠埃希菌ATCC25922
        铜绿假单孢菌ATCC27853
培养基：
1、Tris-HCl缓冲液：0.1M Tris 100ml，0.1M HCl 70ml，HighWater 800ml，测PH值，用HCl溶液调至PH7.2，加High Water至1000ml。
2、Tris-HCl琼脂培养基：在Tris-Cl缓冲液中加入琼脂糖116℃！灭菌后使用。
3、M-H培养基：中国药品生物制品检定所产品，M-H肉汤培养基：称取25g加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌，116℃20分钟。M-H固体培养基：称取36g，加1000ml蒸馏水，高压灭菌，116℃20分钟，用于革兰阳性、阴性需氧菌的药敏试验。
4、血培养基，即在M-H培养基中加5-10％脱纤维兔血配制而成，用于肠球菌、链球菌的药敏试验。
试验方法：
体外抗菌活性(MIC)测定：采用琼脂二倍稀释法测定受试药物对试验菌株的最低抑菌浓度(MIC)。将受试药物用灭菌蒸馏水溶解，适当稀释。分别取1ml药液加9ml融化的Tris-HCl琼脂糖固体培养基混匀，以二倍稀释，制备系列含药平皿。每皿所含药物终浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03……0.001mg/ml；用多点接种仪(Denley A400，England)将稀释至10⁵CFU/ml的试验菌液接种于各含药平皿表面，置于37℃培养8-10小时，取出分别吸取6ml融化的M-H培养基(50℃)覆盖上述系列平皿表面，再置于37℃培养10小时取出，观察结果，以无细菌生长平皿内所含最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度(MIC)。
2、体内抗菌作用评价
药品：人溶菌酶来源同前。
      克拉霉素来源同前。
      罗红霉素来源同前。
      阿莫西林来源同前。
细菌：金黄色葡球菌01193，金黄色葡球菌MRSA021923均为临床分离致病菌。
动物：昆明种小鼠，体重18-22克，由本所动物室提供。
试验方法：
(1)体内保护试验：挑取一定量的菌苔接种于2ml M-H液体培养基中，37℃培养6小时后，取出用灭菌干酵母液进行适当稀释(10^-1，10^-2，10^-3，10^-4)，再取昆明种小鼠，随机分组，每组5只鼠，分别腹腔感染不同菌量的受试菌液，测定引起小鼠100％死亡的最小致死菌量(MLD)。再按1∶0.5剂间距设置5个剂量组，每组10只鼠，每只小鼠腹腔感染1MLD菌量的菌液0.5ml，感染后即刻静脉注射受试药0.5ml，设感染对照组(不给药)，观察1周，记录小鼠死亡数。按Bliss法计算半数有效剂量ED₅₀及95％可信限。
(2)小鼠皮肤烧伤感染模型的疗效评价：昆明种小鼠26-30g，随机分组，每组5只鼠，分别皮肤烧伤感染模型喷涂金黄色葡萄球菌菌液100ml，菌量为10⁸CFU/ml，连续喷5次(间隔10分钟喷一次)，末次喷菌后6小时，分别用无菌棉签挑取皮肤烧伤感染模型涂于无药琼脂平板表面，37℃培养18小时，皮肤烧伤感染模型感染细菌数在＞10³CFU/ml，且经革兰氏染色、光镜检测为金黄色葡萄球菌的小鼠为感染模型成功。
选取皮肤烧伤感染模型感染成功小鼠随机分组，每组10只鼠，分别用喷雾器喷涂受试药物100μl/次，4次/日，连续5日，每日采用咽试子涂片法，于琼脂平板表面进行活菌计数，作统计学处理，与感染对照组和克拉霉素组、罗红霉素给药组作比较。
试验结果(1)人溶菌酶对临床分离菌株的体外抗菌活性见表1。(2)克拉霉素、罗红霉素、阿莫西林与人溶菌酶以1∶1联合用药的体外抗菌作用结果见表2。(3)人溶菌酶对379株临床分离致病菌的MIC50、MIC90见表3。
根据以上试验结果表明：人溶菌酶体外具有一定抗菌作用，体内对伤口感染溃烂的疗效较确切。对多数菌株的抗菌活性比不上克拉霉素、罗红霉素和阿莫西林。人溶菌酶与克拉霉素、罗红霉素联用(1∶1)，可使克拉霉素、罗红霉素对其耐药菌株的抗菌活性增效2-16倍以上，个别菌株增效倍数在1000倍。溶菌酶是一种小分子蛋白质，存在于机体的泪液、唾液、白细胞和血清中，对多种革兰氏阳性菌和少数革兰氏阴性菌有杀菌作用，由大连奇龙生物技术研究所研制的基因重组人溶菌酶(Human Lysozyme)也具有溶菌酶相同作用机制，主要切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1、4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，引起细菌裂解。
表1  人溶菌酶、鸡溶菌酶、克拉霉素和罗红霉素体内外抗菌活性
                                                       MIC
细菌                  HLZ                   CLZ                   CLA            ROX
                      mg/ml(万μ/ml)        mg/ml(万μ/ml)        mg/ml          mg/ml
金葡MRSA02-22         0.25(0.8)             0.008(0.04)           ＞1            ＞1
金葡MRSA02-23         0.25(0.8)             0.008(0.04)           ＞1            ＞1
金葡MRSA02-26         0.25(0.8)             0.004(0.02)           ＞1            ＞1
金葡MRSA02-28         0.5(1.5)              0.016(0.08)           ＞1            ＞1
金葡02-19-5           0.03(0.1)             ＜0.002(0.001)        ＞1            ＞1
表葡MssE25            0.016(0.05)           0.004(0.02)           ＜0.001        ＜0.001
表葡MRSE 02-29        0.063(0.2)            0.5(2.5)              0.03           0.5
表葡MRSE 02-5         ＜0.001(0.003)        ＜0.001(0.003)        ＜0.001        ＜0.001
表葡MRSE 02-6         ＜0.001(0.005)        ＜0.001(0.005)        ＜0.001        ＜0.001
表葡MRSE 02-20-2      ＜0.001(0.003)        ＜0.001(0.005)        ＞1            1
表葡MRSE 02-20-3      ＜0.001(0.003)        0.004(0.02)           ＞1            1
表葡MRSE 02-20-4      ＜0.001(0.003)        ＜0.001(0.005)        ＞1            ＞1
表葡MRSE 02-20-5      0.004(0.012)          ＜0.001(0.005)        ＞1            ＞1
表葡MRSE 02-20-6      0.004(0.012)          ＜0.001(0.005)        ＞1            ＞1
表葡MRSE 02-20-7      ＜0.001(0.003)        ＜0.001(0.005)        1              1
表葡MRSE 02-20-8      ＜0.001(0.003)        ＜0.001(0.005)        ＜0.001        ＜0.001
表葡MRSE 02-20-9      ＜0.001(0.003)        ＜0.001(0.005)        ＜0.001        ＜0.001
表葡MRSE 02-20-1      ＜0.001(0.003)        ＜0.001(0.005)        ＜0.001        ＜0.001
表葡MRSE 02-3         1(3)                  0.015(0.08)           ＞1            ＞1
表葡MRSE 02-4         0.004(0.012)          0.008(0.04)           0.5            ＞1
续表2
                                                            MIC
   细菌                   HLZ                    CLZ                 CLA            ROX
                       mg/ml(万μ/ml)         mg/ml(万μ/ml)      mg/ml          mg/ml
表葡MRSE 02-10         0.004(0.012)           0.25(1.25)          1              1
表葡MRSE 02-12         ＜0.001(0.003)         ＜0.001(0.005)      0.008          0.125
表葡MRSE 02-11         ＜0.001(0.003)         ＜0.001(0.005)      ＜0.001        ＜0.001
表葡MRSE 02-15         0.008(0.024)           0.002(0.01)         1              ＞1
表葡MRSE 02-17         0.004(0.012)           ＜0.001(0.005)      0.25           ＞1    表葡MRSE 02-18         ＜0.001(0.003)         ＜0.001(0.005)      ＜0.001        ＜0.001
表葡MRSE 02-20         0.008(0.024)           ＜0.001(0.005)      ＞1            ＞1
表葡MRSE 02-21         0.016(0.05)            0.25(1.25)          ＜0.001        ＜0.001
表葡MRSE 02-22         0.004(0.012)           ＜0.001(0.005)      ＜0.001        ＜0.001
表葡菌02-7-4           0.008(0.02)            4(20)               0.002          0.002
表葡菌02-7-5           0.008(0.02)            0.25(0.63)          ＜0.001        ＜0.001
金葡菌02-7-6           0.008(0.02)            0.063(0.31)         0.008          0.25
金葡菌02-7-9           0.063(0.2)             0.125(0.63)         0.008          0.016
金葡菌02-7-7           0.125(0.4)             0.016(0.08)         0.032          0.25
金葡菌01-2-22          0.032(0.1)             0.5(2.5)            1              1
金葡菌01-2-30          0.063(0.2)             4(10)               ＞1            ＞1
金葡菌01-2-32          0.016(0.05)            0.25(1.25)          0.008          0.5
金葡菌01-2-33          0.032(0.1)             2(10)               ＞1            ＞1
金葡菌01-2-36          0.063(0.2)             4(20)               0.25           0.5
金葡菌01-2-37          0.032(0.1)             ＞4(20)             ＞1            1
金葡菌01-2-39          0.032(0.1)             0.5(2.5)            0.5            1
续表3
                                                         MIC
细菌                      HLZ                 CLZ                 CLA          ROX
                          mg/ml(万μ/ml)      mg/ml(万μ/ml)      mg/ml        mg/ml
铜绿假单孢菌01-2-41       0.032(0.1)          0.5(2.5)            ＞1          ＞1
铜绿假单孢菌01-2-42       0.016(0.05)         0.5(2.5)            0.063        ＞1
铜绿假单孢菌01-2-43       ＜0.001(0.003)      ＞4(20)             0.016        0.25
铜绿假单孢菌01-2-45       0.032(0.1)          2(10)               0.25         0.5
铜绿假单孢菌01-2-51       0.032(0.1)          ＞4(20)             ＞1          ＞1
铜绿假单孢菌01-2-52       0.032(0.1)          ＞4(20)             ＞1          0.25
铜绿假单孢菌01-2-53       0.008(0.024)        4(20)               0.03         0.25
铜绿假单孢菌01-2-54       0.032(0.1)          1(5)                ＞1          1
金葡菌01-2-56             0.032(0.1)          ＞4(20)             0.016        0.25
金葡菌01-2-57             ＜0.001(0.003)      2(10)               0.032        0.25
大肠埃希菌01-2-58         ＜0.001(0.003)      4(20)               ＞1          0.5
大肠埃希菌01-2-59         0.032(0.1)          4(20)               0.125        0.25
沙雷氏菌2-31-8            0.008(0.02)         0.5(0.25)           0.008        0.016
沙雷氏菌2-31-8            0.008(0.02)         1(5)                0.008        0.016
金葡菌2-31-8              0.008(0.02)         0.125(0.63)         0.016        0.016
金葡菌02-6-14             0.25(0.8)           1(5)0.063           ＞1
金葡菌02-6-18             0.5(1.5)            ＞4(20)             0.5          1
注：HLZ指人溶菌酶，CLZ指对照溶菌酶(鸡溶菌酶)，CLA指克拉霉素，ROX指罗红素
D、重组人溶菌酶抑制豚鼠牛血清白蛋白过敏反应试验模型
选用体重250克左右的健康豚鼠20只，雄性，随机均分四组，每组5只，进行静脉注射牛血清白蛋白造模。将造模后的20只小鼠重新合并后再随机分成四组，分别设立三个给药组和一模型组。重组人溶菌酶临床气雾剂治疗时药液的浓度为15000u/ml，初步拟定剂量为15000u/次，每日3～5次，即0.5mg/次/日。(按体表面积推算至豚鼠剂量为1.3×10^-3mg/只(250g体重计)，由于人通气量9000ml/分相当于豚鼠通气量31ml/分的290倍，人用单次剂量0.5mg/70kg相当于小鼠剂量1.3×10^-3mg/250g的280倍，以上二者较为接近)。所以设定用临床人用浓度0.5mg/ml对小鼠进行雾化治疗，另考虑到临床人用气雾吸入重组人溶菌酶气体利用率较高，而小鼠在雾化缸内只能靠自身呼吸吸入含药气体，故只有延长吸入时间才能确保吸入药量，设定为一小时。在15000u/ml为低剂量浓度基础上再配制30000u/ml、60000u/ml二浓度作为中、高剂量组治疗时的药液浓度。在第二十一天给每只豚鼠静脉注射牛血清白蛋白前一个小时，将豚鼠置于玻璃干燥器后，用PAR1.BOY压缩喷雾器雾化不同浓度的重组人溶菌酶液对豚鼠进行雾化预防。然后给每只豚鼠静脉注射牛血清白蛋白1mg，肉眼观察豚鼠形态变化情况和死亡数量及时间。
实验结果豚鼠静脉注射牛血清白蛋白后10秒钟模型组出现咳嗽、气促和挠唇现象。30秒钟后模型组豚鼠全部死亡。给药重组人溶菌酶组30小时豚鼠仍然全部存活。给药重组人溶菌酶组和一模型组有明显区别。见表4、见表5。
表4  气雾治疗第1天
                动物数
组别                       用药后10秒         用药后30秒     用药后60秒
                (只)
模型对照组      5只        4只                0只            0只
模型高剂量组    5只        5只                5只            5只
模型中剂量组    5只        5只                5只            5只
模型低剂量组    5只        5只                5只            5只
表5  气雾治疗第二天
                动物数
组别                       用药后10小时       用药后20小时    用药后30小时
                (只)
模型对照组      0只        0只                0只             0只
模型高剂量组    5只        5只                5只             5只
模型中剂量组    5只        5只                5只             5只
模型低剂量组    5只        5只                5只             5只
综合以上实验结果表明，对豚鼠静脉注射牛血清白蛋白进行过敏反应试验重组人溶菌酶雾化保护，有很好的保护预防效果。其保护预防效果与使用剂量无明显量效关系。
E、重组人溶菌酶抗疱疹病毒抑制豚鼠角膜炎试验模型
选用体重250克左右健康豚鼠20只，雄性，将20只豚鼠随机均分四组，每组5只，进行滴眼液造模。首先用细针在豚鼠的眼角膜上轻微划出三道痕迹，然后用四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供I型疱疹病毒100～1000TCID₅₀感染豚鼠的眼角膜，每天三次。第三天豚鼠眼角膜出现轻微角膜炎，第四天豚鼠眼角膜出现红肿，角膜炎加重。将造模后的20只豚鼠重新合并后再随机分成四组，分别设立三个给药组和一模型组。
重组人溶菌酶滴眼液以15000u/ml(每滴1500U)为低剂量浓度基础上再配制30000u/ml(每滴3000U)、60000u/ml(每滴6000U)二浓度作为中、高剂量组治疗时的药液浓度。在第五天开始给豚鼠眼角膜用重组人溶菌酶滴眼液，每天三次，每次每只眼一滴，肉眼观察豚鼠形态变化情况及时间。
实验结果给药重组人溶菌酶滴眼液第二天，给药重组人溶菌酶滴眼液中、高剂量组治疗效果凸现，豚鼠角膜红肿减轻。给药重组人溶菌酶滴眼液第三天，给药重组人溶菌酶滴眼液低剂量组也出现好转治疗效果。给药重组人溶菌酶滴眼液第六天，给药模型低、中、高组豚鼠角膜炎和红肿全部消退好转。模型对照组豚鼠角膜红肿，角膜炎症加重并出现溃疡。给药重组人溶菌酶组和一模型组有明显区别。见表6、见表7。
表6
              动物数
组别                       用药第一天        用药第二天        用药第三天
              (只)
                           角膜红肿角膜
模型组对照    5只                            角膜红肿角膜炎    角膜红肿角膜炎
                           炎
                           角膜红肿角膜
模型高剂量组  5只                            红肿减轻          红肿减轻
                           炎
                           角膜红肿角膜
模型中剂量组  5只                            红肿减轻          红肿减轻
                           炎
                           角膜红肿角膜
模型低剂量组  5只                            角膜红肿角膜炎    红肿减轻
                           炎
表7
               动物数
组别                          用药第四天          用药第五天        用药第六天
               (只)
                                                  角膜红肿、角膜炎  角膜红肿、角膜炎
模型组对照      5只           角膜红肿角膜炎
                                                  角膜溃疡          角膜溃疡
                                                  角膜红肿角膜炎
模型高剂量组    5只           角膜炎症减轻                          恢复正常
                                                  消退
                                                  角膜红肿角膜炎
模型中剂量组    5只           角膜炎症减轻                          恢复正常
                                                  消退
                                                  角膜红肿角膜炎
模型低剂量组    5只           角膜炎症减轻                          恢复正常
                                                  消退
综合以上实验结果表明，试验重组人溶菌酶滴眼液对抗I型疱疹病毒100～1000TCID₅₀感染豚鼠的眼角膜炎，有很好的治疗效果。其治疗效果与使用剂量有明显量效关系。
六、用法与用量：
1、喷雾剂：直接喷雾作用于病灶局部给药，每日1～6次，每次1500u～30000u成人与小儿相同。
2、奶液、乳剂、滴剂：直接作用于病灶局部给药每日1～6次，每次1500u～30000u。
3、霜剂：直接作用于病灶局部给药1500u～30000u/g外用，每日2～3次，每次按病灶部位大小给药。
具体实施方式：
实施例1
将纯度85％-99％的基因重组人溶菌酶制得300U～300万U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、万分之五吐温80，在常温下混合均质，(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)制成喷雾剂。
实施例2
将纯度85％-99％的基因重组人溶菌酶制得、300U～300U万/ml、磷酸盐缓冲液10(pH6.0)80％、5～20％丙二醇、6％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、0.9％水溶性氮酮、万分之三吐温80的(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)滴剂、奶液、乳剂。
实施例3
将85％-99％的基因重组人溶菌酶制得、300U～300U万/ml/g、磷酸盐缓冲液20mM(pH7.0)85％、5～20％丙二醇、万分之三吐温80、卡波树脂1％、香精0.3％(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)霜剂。