5－甲基吗啉－3－氨基－2－恶唑烷酮的偶联物及其制备方法.pdf

本发明公开了一种通式(I)的5－甲基吗啉－3－氨基－2－恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物，由5－甲基吗啉－3－氨基－2－恶唑烷酮类半抗原与产生抗原性的载体物质优选牛血清蛋白偶联构成，其中n为与一个牛血清蛋白分子结合的AMOZ的分子数，n为整数1～20，BSA为牛血清蛋白，分子量范围是6.6KDa～6.9KDa。本发明还公开了所述的偶联物的制备方法，即将5－甲基吗啉－3－氨基－2－恶唑烷酮与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物。本发明具有方法简便，快速，特异，准确的特点，为用所述偶联物制备AMOZ的酶联免疫检测试剂提供了广阔的应用空间。

1.  一种5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物，由5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮类半抗原与产生免疫原性的载体物质偶联构成，所述载体物质为优选蛋白质，蛋白质片段，合成多肽或半合成多肽。

2.  如权利要求1所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物，其中所述的蛋白质是牛血清蛋白。

3.  如权利要求2所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物，其结构通式如(I)

其中：n：为与一个牛血清蛋白分子结合的AMOZ的分子数，n为整数1～20BSA为牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量范围是6.6KDa～6.9KDa上述偶联物显示出如下物化特征：
(1)外观：白色粉末固体
(2)紫外吸收光谱：265nm
(3)红外吸收光谱(cm^-1，KBr)：3407，2923，2871，1650，1540，1439，1398，1081，591，527，483。

4.  如权利要求3所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物，其中n为整数1～10，BSA分子量范围是6.7KDa～6.8KDa。

5.  权利要求1～4中任一项所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物的制备方法，其特征是，将5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物，并保持该偶联物的生物活性不变。

6.  如权利要求5所述5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物的制备方法，该方法步骤如下：
(1)将AMOZ与牛血清蛋白以15∶1～30∶1的摩尔比溶于设定体积的磷酸缓冲液中，反应4～6小时，制成溶液A；
(2)在25℃～30℃条件下，以溶液A体积75分之一的量加入戊二醛于溶液A中，同时不断搅拌，反应3～6小时，得到溶液B；
(3)将溶液B用磷酸缓冲液透析70～78小时，每10～12小时更换一次透析液；
(4)以20,000g，30分钟的条件，离心上述透析后的溶液B，取上清液；
(5)将制取的上清液冻干，得到5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物粗品；
(6)以磷酸缓冲溶液为洗脱液，用葡聚糖凝胶层析分离纯化上述粗品，制得AMOZ偶联物纯品，再经冻干得到白色固体粉末状的，具有诱发动物免疫系统产生抗体的AMOZ偶联物。

7.  如权利要求6所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物的制备方法，其中所述的AMOZ与牛血清蛋白的摩尔数比为20∶1。

8.  如权利要求6所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物的制备方法，其中所述的磷酸缓冲液pH为7.40，浓度为0.01M。

9.  如权利要求6所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物的制备方法，其中所述的戊二醛浓度是体积百分比为25％的水溶液。

10.  如权利要求6所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物的制备方法，其中所述的葡聚糖凝胶层析采用Sephadex-G75。

5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮的偶联物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种硝基呋喃类抗生素代谢物的偶联物及其制备方法，尤其涉及一种呋喃它酮(Furaltadone)代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(5-methylmorpholino-3-amino-2-oxazolidinone)的偶联物及其制备方法。
背景技术
本发明涉及的下列名称适用于整个说明书和权利要求书：
BSA＝牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，Sigma公司产品
PBS＝磷酸缓冲液(Phosphate Buffered Saline)(0.01M，pH＝7.40)
Sephadex-G75＝葡聚糖凝胶，Sigma公司产品
AMOZ＝5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(5-methylmorpholino-3-amino-2-oxazolidinone)，Sigma公司产品
Glutar＝(Glutaraldehyde)戊二醛，上海化学试剂公司产品
透析膜：美国联合炭化(United Carbide)公司产品
呋喃它酮是一种重要的硝基呋喃类抗感染药，而5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(5-methylmorpholino-3-amino-2-oxazolidinone)即AMOZ为呋喃它酮的代谢物。由于其优良的抗菌性能和动力学性质，呋喃类药物早已被广泛地应用于家畜，家禽和水产等养殖业的传染病预防与治疗，是一类广谱抗菌药。但长期的动物实验研究结果表明，硝基呋喃类药物及其代谢产物具有致癌和致突变的特性。动物长期或大剂量服用呋喃类药物能引起毒性反应，表现为兴奋，惊厥，瘫痪的急性神经症状以及全身出血和反刍兽消化障碍等慢性中毒反应。对于人体的不良反应主要是胃肠反应，溶血性贫血，血小板减少性紫癜，多发性神经炎，眼部损害，急性肝坏死和嗜酸性白细胞增多等过敏反应。
由于这些毒害作用，世界上很多国家都对硝基呋喃类药物的使用及其残留进行了严格的规定。美国和日本分别于1975和1977年禁止呋喃唑酮作为医药使用；澳大利亚于1992年禁止在养殖业中使用硝基呋喃类药物；美国1993年禁止呋喃唑酮作为兽药；欧盟在1995年6月开始禁止使用呋喃唑酮和呋喃西林，规定动物源食品中不得检出硝基呋喃(Commission Regulation 1442/95)；在我国，硝基呋喃药物是农业部严禁的抗菌素。尽管如此，硝基呋喃类药物由于药效显著，价格低廉，难以检测，在我国的畜禽水产养殖业中使用仍然非常普遍，这给人们的健康安全带来巨大的隐患。我国出口欧盟的鱼，虾，禽肉，兔肉，和肠衣均被检出过含有硝基呋喃类药物，尤其是兔肉和禽肉，常常因此导致出口食品被迫就地销毁。这已严重制约我国动物源食品的出口，对国际贸易带来极大的威胁。所以，关于硝基呋喃类药物残留的检测方法的开发研究已刻不容缓。
由于硝基呋喃类药物在动物体内代谢迅速，通过检测母体化合物并不能得知这类药物的滥用情况。因此检测硝基呋喃类药物残留以杜绝使用这种违禁药物的最佳方法是检测其代谢物而非母体化合物本身。检测硝基呋喃类药物的残留就变成了检测这些与蛋白组织结合在一起的代谢物的残留。
在抗生素药物残留的检测中，仪器法如液相色谱和质谱以及液相质谱联用是应用最广泛的方法。这些方法准确，稳定，可靠，可以作为标准方法。但仪器法价格昂贵，费时较长，需要大型仪器设备，需要专门的技术人员，所以难于用于现场操作。酶联免疫检测法(ELISA)提供了一种极好的扫描手段。该法具有快速，准确，简易，不需要专门人员操作等优点，这使得ELISA法成为一种理想的，可用于常规扫描的检测方法。酶联免疫检测法的核心是高质量的抗体。大多数抗生素包括硝基呋喃类药物都是小分子有机化合物，不具有免疫原性，称之为半抗原。所以，要实施酶联免疫检测法(ELISA)，达到快速，准确，简易的检测目的，必须把这些化合物转变成能引发动物免疫系统产生抗体的免疫原(又称之为完全抗原)。本发明涉及的5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮的偶联物就是用来引发动物免疫系统产生对AMOZ有特异反应的抗体的免疫原。经检索发现，至今尚未有关于AMOZ免疫原合成的相关文献或专利报道。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明要解决的问题是：提供一种能引发动物免疫系统产生针对AMOZ有特异反应的抗体的免疫原，即5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮的偶联物以及制备这种免疫原的方法。
本发明的5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物，由5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮半抗原与产生抗原性的载体物质偶联构成，所述载体物质为优选蛋白质，蛋白质片段，合成多肽或半合成多肽。
上述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物，其中所述的蛋白质优选是牛血清蛋白。
本发明所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物，其结构通式
如(I)

其中：n：为与一个牛血清蛋白分子结合的AMOZ的分子数，n为整数1～20
BSA为牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量范围是6.6KDa～6.9KDa
上述偶联物显示出如下物化特征：
(1)外观：白色粉末固体
(2)紫外吸收光谱：265nm
(3)红外吸收光谱(cm^-1，KBr)：3407，2923，2871，1650，1540，1439，1398，1081，591，527，483。
上述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物，其中优选n为整数1～10，BSA分子量范围是6.7KDa～6.8KDa。
上述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物的制备方法是：将5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物，并保持该偶联物的生物活性不变。
上述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物的制备方法具体步骤如下：
(1)将AMOZ与牛血清蛋白以15∶1～30∶1的摩尔比溶于设定体积的磷酸缓冲液中，反应4～6小时，制成溶液A；
(2)在25℃～30℃条件下，以溶液A体积75分之一的量加入戊二醛于溶液A中，同时不断搅拌，反应3～6小时，得到溶液B；
(3)将溶液B用磷酸缓冲液透析70～78小时，每10～12小时更换一次透析液；
(4)以20,000g，30分钟的条件，离心上述透析后的溶液B，取上清液；
(5)将制取的上清液冻干，得到5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)地偶联物粗品；
(6)以磷酸缓冲溶液为洗脱液，用葡聚糖凝胶层析分离纯化上述粗品，制得AMOZ偶联物纯品，再经冻干得到白色固体粉末状的，具有诱发动物免疫系统产生抗体的AMOZ偶联物。
在上述制备方法中，AMOZ与牛血清蛋白的摩尔数比优选为20∶1。
在上述制备方法中，所述的磷酸缓冲液优选pH为7.40，浓度为0.01M。
在上述制备方法中，所述的戊二醛浓度是体积百分比为25％的水溶液。
在上述制备方法中，所述的葡聚糖凝胶层析优选采用Sephadex-G75。
利用本发明的技术方案可以成功地把半抗原AMOZ与载体蛋白特别是牛血清白蛋白BSA偶联起来，从而合成了能够在动物体内引发免疫反应，产生抗体的完全免疫原。利用此免疫原免疫兔，鼠，鸡等动物可以得到对半抗原AMOZ有特异反应的抗体，这为该偶联物用于制备AMOZ的酶联免疫检测试剂提供了广阔的应用空间。把该抗体镀在微孔盘内，就可以用来检验动物源食品中呋喃它酮抗生素的残留。由于该方法具有简易，快速，特异，准确的特点，所以可以用于食品检验检疫中的初步扫描检测之用。这样不但可以节省大量的检验时间，还可以用于现场操作，从而弥补了仪器法费时较长，需要大型仪器设备支持，需要专门的技术人员操作，难于用于现场的不足。所以，半抗原AMOZ与载体蛋白特别是牛血清蛋白BSA偶联物的合成为这种快速检验法奠定了基础。
具体实施方式
实施例1
(1)溶液A的制备：在50ml圆形反应瓶内，搅拌中(120转/分钟)，加入AMOZ 10.00mg(0.050mmol)，牛血清蛋白BSA 171.00mg(0.0025mmol)(所用BSA分子量范围是6.7KDa～6.8KDa)，溶解于15ml PBS(pH＝7.40，0.01M)中，反应4小时，得到溶液A。
(2)溶液B的制备：在25℃条件下，搅拌中(120转/分钟)，向溶液A中加入0.20ml戊二醛(25％v/v水溶液)，反应4小时，得到淡黄色溶液B。
(3)制备AMOZ免疫原：将溶液B用PBS(pH＝7.40，0.01M)缓冲液透析72小时(透析膜：美国联合炭化(United Carbide)公司产品)，每12小时更换一次透析液。以20,000g，30分钟的条件，离心上述透析后的溶液B，取上清液。冻干上清液，得到140mg白色固体粉末，即为5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物粗品。用Sephadex-G75进行纯化分离，以PBS(pH＝7.40，0.01M)为洗脱液。收集AMOZ偶联物纯品。再经冻干得到AMOZ免疫原固体粉末。通过红外和紫外吸收光谱(吸收值)确定产物的偶联情况。本发明的5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物在265nm处有特征紫外吸收峰。红外吸收光谱(cm^-1，KBr)：3407，2923，2871，1650，1540，1439，1398，1081，591，527，483。
实施例2
(1)溶液A的制备：在50ml圆形反应瓶内，搅拌中(120转/分钟)，加入AMOZ 10.00mg(0.050mmol)，牛血清蛋白BSA 225.72mg(0.0033mmol)，溶解于15ml PBS(pH＝7.40，0.01M)中，反应5小时，得到溶液A。
(2)溶液B的制备：在28℃条件下，搅拌中(120转/分钟)，向溶液A中加入0.20ml戊二醛(25％v/v水溶液)，反应5.5小时，得到淡黄色溶液B。
(3)制备AMOZ免疫原：将溶液B用PBS(pH＝7.40，0.01M)缓冲液透析77小时，每11小时更换一次透析液。以20,000g，30分钟的条件，离心上述透析后的溶液B，取上清液。冻干上清液，得到162mg白色固体粉末，即为5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物粗品。用Sephadex-G75(Sigma)进行纯化分离，以PBS(pH＝7.40，0.01M)为洗脱液。收集AMOZ偶联物纯品。再经冻干得到AMOZ免疫原固体粉末。通过红外和紫外吸收光谱(吸收值)确定产物的偶联情况。本发明的免疫原在265nm处有特征紫外吸收峰。红外吸收光谱(cm^-1，KBr)：3407，2923，2871，1650，1540，1439，1398，1081，591，527，483。
实施例3
(1)溶液A的制备：在50ml圆形反应瓶内，搅拌中(120转/分钟)，加入AMOZ 10.00mg(0.050mmol)，牛血清蛋白BSA 114.00mg(0.0017mmol)，溶解于15ml PBS(pH＝7.40，0.01M)中，反应6小时，得到溶液A。
(2)溶液B的制备：在30℃条件下，搅拌中(120转/分钟)，向溶液A中加入0.20ml戊二醛(25％v/v水溶液)，反应5小时，得到淡黄色溶液B。
(3)制备AMOZ免疫原：将溶液B用PBS(pH＝7.40，0.01M)缓冲液透析72小时，每12小时更换一次透析液。以20,000g，30分钟的条件，离心上述透析后的溶液B，取上清液。冻干上清液，得到113mg白色固体粉末，即为5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的偶联物粗品。用Sephadex-G75(Sigma)进行纯化分离，以PBS(pH＝7.40，0.01M)为洗脱液。收集AMOZ偶联物纯品。再经冻干得到AMOZ免疫原固体粉末。通过红外和紫外吸收光谱(吸收值)确定产物的偶联情况。本发明的免疫原在265nm处有特征紫外吸收峰。红外吸收光谱(cm^-1，KBr)：3407，2923，2871，1650，1540，1439，1398，1081，591，527，483。