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冻干水痘减毒活疫苗的生产方法及产品
技术领域：
本发明涉及一种水痘减毒活疫苗及产品，特别是公开了一种冻干水痘减毒活疫苗的生产方法，利用水痘病毒减毒株(Oka株)感染人胚肺二倍体细胞(2BS)采用旋转培养制备水痘减毒活疫苗的方法，属于疫苗生产制备工艺技术领域。
技术背景：
病毒疫苗的生产通常利用鸡胚细胞、幼鼠的脑细胞和哺乳动物的二倍体细胞作为宿主细胞。但由于病毒的低敏感性，复杂的纯化过程和由于存在外源蛋白污染引起的副作用，它们不具备优势。相反，使用起源于人的正常二倍体细胞能减少外源蛋白引起的副作用，所以，制备病毒疫苗时它们更优选。代表性的二倍体细胞包括MRC-5细胞株，WI-38细胞，HEL299细胞，和LBHEL细胞株。美国专利3,985,615中公开了通过由豚鼠初级胚胎细胞(GPEC)中多次减毒OKa病毒生产VZV疫苗；美国专利4,000.256叙述了将含有VZV病毒的人胚成纤维细胞WI-38株传代培养10-80次来生产VZV疫苗；美国专利5,360,736公开了MRC-5细胞株中生产VZV疫苗的改进方法，WO97.30147专利公开了利用LBHEL细胞培养VZV疫苗的生产方法。然而，GPEC细胞中VZV的产量是非常低的。WI-38和MRC-5细胞株有高的传代数，从而减低了它们生产VZV的能力。另外，以上专利中细胞及病毒繁殖过程中采用静止培养法，所以，上述方法限制了水痘疫苗的规模化生产。
发明内容：
本发明提供一种冻干水痘减毒活疫苗的生产方法及产品，适合于水痘疫苗的规模化生产。
本发明以水痘减毒株OKa株为毒株，以人二倍体细胞2BS为培养基质生产的冻干水痘减毒活疫苗，包括以下主要步骤：
首先取人胚肺二倍体细胞2BS按1∶2-1∶4的比例扩增传代(43代以内)。其中细胞扩增所用培养基是添加10-15％小牛血清的MEM，pH7.2-7.6。将细胞培养瓶置37℃下旋转培养3-5天(转速15-30转/小时)，形成均匀、致密的细胞单层，然后弃去生长液。在培养瓶内按毒种与细胞1∶60～120比例加入毒种，对细胞进行感染，并于35-36℃旋转培养(转速15-30转/小时)，培养时间为2-4天。当2BS细胞上出现75％以上典型病变时，倒去原维持液，用原维持液量二倍以上的Earle’s液冲洗细胞表面，洗去牛血清，加入含有疫苗稳定剂的疫苗液收获。其中，
疫苗液中各成份质量比为：蔗糖1.5-2.5％、明胶2-5％、谷氨酸钠0.5％、尿素0.1-0.25％、精氨酸0.1％、山梨醇0.3-0.6％、人血白蛋白0.5-1％，余量为水。将收获的疫苗液经-70℃冻融，20KHz超声破碎细胞，4℃下1000rpm离心30分钟去除细胞碎片，经滤过澄清，上清液合并后即为半成品。
检定合格的半成品疫苗，置冰水浴中保冷分装，采用适宜的冻干曲线进行冻干。即制备出冻干剂型的水痘减毒活疫苗成品。
与已有技术相比，本发明的积极效果在于：(1)在病毒宿主细胞增殖阶段，以旋转培养法代替静止培养法，如此可显著地扩大细胞培养面积，使细胞增殖率提高5倍以上，且可以比较容易地除去或减少牛血清残余量，减小疫苗制品的不良反应。(2)根据水痘VZV病毒的生物学特性，用Earle’s液冲洗细胞表面，可更加有利于病毒的吸附感染。(3)将含有稳定剂的疫苗液直接加入培养瓶内，可减小病毒的损失，提高疫苗的产率和滴度，并可改善病毒的稳定性。
通过使用本发明，水痘减毒活疫苗完成了几百万人的人体接种观察，在安全性及免疫原性方面进行了多指标详细考核，结果表明该疫苗是安全和有效的，阳转率为98.89％，GMT36.83。
2BS细胞株用于水痘减毒活疫苗的研究
1.染色体异常试验
对2BS细胞株(43代)进行染色体异常试验包括染色体多倍体试验、二倍体试验，形状异常试验，核型分析试验。
                    表1

异常    检查细胞数    500结构异常    8染色单体和染色体断裂    2超二倍体    4亚二倍体    70多倍体    3
上述表1结果符合2000年版《中国生物制品规程》《生物制品生产用人二倍体细胞株》染色体检查标准的要求。
 2.致肿瘤性检查
将2BS细胞株和He P₂-C细胞株各5×10⁶个细胞颈后皮下注射到每组10只经抗胸腺血清处理(ATS)的乳鼠中。
结果：动物观察14天，2BS组小鼠全部健存，活泼喜食。He P₂-C组毛色无光泽，颈部可见大小不等的肿瘤结节。试验组进行病理检查，无移植瘤形成。
3.VZV在细胞株中的繁殖
                 表2细胞株(传代数)活性(PFU/ml)2BS(27)182702BS(32)210002BS(40)19000MRC-5(8)2234MRC-5(11)1895MRC-5(12)2250
如表2所示，在本发明的2BS株中VZV的活性高于常规细胞株MRC-5的活性。
通过染色体异常试验、致肿瘤试验证明本发明的2BS细胞株是正常的二倍体细胞株并且在动物试验中它不会导致肿瘤。另外，它比常规细胞株如MRC-5生长得更快并对各种病毒具有增强的敏感性。甚至在43代传代培养后它仍保持同样的生长速度。此外，对2BS株进行了外源因子检查、细菌、真菌、支原体等项检查，结果均符合2000年版《中国生物制品规程》中《生物制品生产用动物细胞制备及检定规程》要求。该细胞同样也适用于甲肝疫苗、脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗等病毒疫苗的生产。
按本发明方法制备的水痘疫苗(旋转培养)与采用克氏瓶(静止培养)制备疫苗的比较
1、疫苗成品滴度的比较
使用同一代次细胞、同一批毒种，分别用两种方法制备疫苗，成品滴度见表1
            表4两种瓶型制备冻干水痘减毒活疫苗成品病毒滴度
       克氏瓶(LgPFU/ml)                 转瓶(LgPFU/ml)
编号      产品滴度    37℃7天    编号.    产品滴度    37℃7天
980336    4.0         3.6        1        4.0         3.7
980337    4.1         3.6        2        4.0         3.5
980338    4.3         3.6        3        4.0         3.6
980339    4.0         3.5        4        4.1         3.5
980340    3.9         3.3        5        3.9         3.5
平均      4.1         3.5        平均     4.0         3.6
表4中，旋转培养和静止培养两种方法制备的疫苗，冻干后病毒滴度和37℃7d病毒滴度经统计学处理，均无显著性差异。(具体结果：干后病毒滴度，t＝1.348，p＞0.05，差别无显著的统计学意义；37℃7d病毒滴度t＝1.414，p＞0.05，差别无显著的统计学意义。)
2、残余牛血清蛋白含量
克氏瓶及转瓶均使用相同量的洗涤液，其残余牛血清蛋白含量见表2。
           表5不同瓶型残余牛血清蛋白含量比较
     克氏瓶子(ng/ml)             转瓶(ng/ml)
编号      残余牛血清含量    编号.    残余牛血清含量
980336    48                1        36
980337    47                2        25
980338    49                3        32
980309    45                4        38
980440    46                5        29
平均      47                平均     32
表5中两种瓶型制备的疫苗中残余牛血清蛋白含量经统计学处理，结果是：t＝6.124，p＜0.001，差别有极显著的统计学意义。表明，应用旋转培养，可降低疫苗中的牛血清蛋白残留量。
3、疫苗的单瓶产量
设定克氏瓶单瓶产量为1(原倍)，转瓶按克氏瓶的原倍至10倍量加疫苗液。结果显示，1～2倍加液量病毒滴度最好，但牛血清蛋白含量偏高。其他倍数加液量，随着疫苗液的增加，牛血清蛋白含量的降低，37℃7d热稳定性也呈递减趋势。故而，将转瓶疫苗加液量定为克氏瓶的3倍。(见图1、图2)
冻干水痘减毒活疫苗应用转瓶生产工艺，与传统的克氏瓶相比，不但疫苗病毒滴度稳定，而且疫苗的单瓶产量较静止培养显著提高了。解决了静止培养工艺中产量低，生产占地大，牛血清蛋白残存量偏高及劳动强度大等弊端。应用旋转培养技术，降低了生产成本，能使更多的易感人群应用水痘疫苗，从而使该病的发病率降至最低点，采用转瓶生产工艺生产的水痘疫苗各项指标均符合《WHO水痘活疫苗规程》及《冻干水痘减毒活疫苗制造及检定规程》的要求。
附图说明：
图1为加液量与病毒滴度的关系图。
图2为加液量与残余牛血清蛋白含量关系图。
具体实施方式：
实施例1
取人胚肺二倍体细胞2BS(32代)单层后按1∶4传代，转瓶机转速调至30转/小时，置37℃培养5天，长成致密单层后，在培养瓶内按毒种与细胞1∶60比例加入毒种，对细胞进行感染，(转速25转/小时)35℃培养3天至细胞病变达75％以上时，用原维持液量三倍的Earle’s液冲洗细胞表面，洗去牛血清，加入含有疫苗稳定剂地疫苗液收获。其中疫苗液中各成份质量比为：蔗糖2.5％、明胶2％、谷氨酸钠0.5％、尿素0.1％、精氨酸0.1％、山梨醇0.3-％、人血白蛋白1％。将收获的疫苗液经-70℃冻融，20KHz超声破碎细胞，4℃下1000rpm离心30分钟去除细胞碎片，经滤过澄清，上清液合并后即为半成品。检定合格的半成品疫苗，置冰水浴中保冷分装，冻干。即制备出冻干剂型的水痘减毒活疫苗成品。
实施例2
首先取人胚肺二倍体细胞2BS(31代)按1∶2传代。其中细胞扩增所用培养基是添加10％小牛血清的MEM，pH7.2。将细胞培养瓶置37。下旋转培养3天(转速20转/小时)，形成均匀、致密的细胞单层，然后弃去生长液。在培养瓶内按毒种与细胞1∶80比例加入毒种进行感染，并于35℃旋转培养(转速20转/小时)，培养4天。当2BS细胞上出现75％以上典型病变时，倒去原维持液，用原维持液量四倍的Earle’s液冲洗细胞表面，洗去牛血清，加入含有疫苗稳定剂的疫苗液收获。其中疫苗液中各成份质量比为：蔗糖2.5％、明胶2％、谷氨酸钠0.5％、尿素0.1％、精氨酸0.1％、山梨醇0.3-0.6％、人血白蛋白0.5％。将收获的疫苗液经-70℃冻融，20KHz超声破碎细胞，4℃下1000rpm离心30分钟去除细胞碎片，经滤过澄清，上清液合并后即为半成品。检定合格的半成品疫苗，置冰水浴中保冷分装，冻干。即制备出冻干剂型的水痘减毒活疫苗成品。
实施例3
首先取人胚肺二倍体细胞2BS(38代)按1∶2传代。其中细胞扩增所用培养基是添加12％小牛血清的MEM，pH7.2。将细胞培养瓶置37℃下旋转培养4天(转速25转/小时)，形成均匀、致密的细胞单层，然后弃去生长液。在培养瓶内按毒种与细胞1∶90比例加入毒种进行感染，并于35℃旋转培养(转速15转/小时)，培养4天。当2BS细胞上出现75％以上典型病变时，倒去原维持液，用原维持液量三倍的Earle’s液冲洗细胞表面，洗去牛血清，加入含有疫苗稳定剂的疫苗液收获。其中疫苗液中各成份质量比为：蔗糖1.5％、明胶4％、谷氨酸钠0.5％、尿素0.2％、精氨酸0.1％、山梨醇0.4％、人血白蛋白0.5％。将收获的疫苗液经-70℃冻融，20KHz超声破碎细胞，4℃离心去除细胞碎片，经滤过澄清，上清液合并后即为半成品。检定合格的半成品疫苗，置冰水浴中保冷分装，冻干。即制备出冻干剂型的水痘减毒活疫苗成品。
实施例4
首先取人胚肺二倍体细胞2BS(40代)按1∶4传代。其中细胞扩增所用培养基是添加15％小牛血清的MEM，pH7.2。将细胞培养瓶置37℃下旋转培养5天(转速15转/小时)，形成均匀、致密的细胞单层，然后弃去生长液。在培养瓶内按毒种与细胞1∶100比例加入毒种进行感染，并于35℃旋转培养(转速25转/小时)，培养4天。当2BS细胞上出现75％以上典型病变时，倒去原维持液，用原维持液量三倍的Earle’s液冲洗细胞表面，洗去牛血清，加入含有疫苗稳定剂的疫苗液收获。其中疫苗液中各成份质量比为：蔗糖2.5％、明胶2％、谷氨酸钠0.5％、尿素0.14-％、精氨酸0.1％、山梨醇0.5％、人血白蛋白1％。将收获的疫苗液经-70℃冻融，20KHz超声破碎细胞，4℃离心去除细胞碎片，经滤过澄清，上清液合并后即为半成品。检定合格的半成品疫苗，置冰水浴中保冷分装，冻干。即制备出冻干剂型的水痘减毒活疫苗成品。
实施例5
首先取人胚肺二倍体细胞2BS(43代)按1∶4传代。其中细胞扩增所用培养基是添加15％小牛血清的MEM，pH7.2。将细胞培养瓶置37℃下旋转培养5天(转速25转/小时)，形成均匀、致密的细胞单层，然后弃去生长液。在培养瓶内按毒种与细胞1∶70比例加入毒种进行感染，并于35℃旋转培养(转速30转/小时)，培养3天。当2BS细胞上出现75％以上典型病变时，倒去原维持液，用原维持液量三倍的Earle’s液冲洗细胞表面，洗去牛血清，加入含有疫苗稳定剂的疫苗液收获。其中疫苗液中各成份质量比为：蔗糖2％、明胶3％、谷氨酸钠0.5％、尿素0.2％、精氨酸0.1％、山梨醇0.6％、人血白蛋白0.5％。将收获的疫苗液经-70℃冻融，20KHz超声破碎细胞，4℃离心去除细胞碎片，经滤过澄清，上清液合并后即为半成品。检定合格的半成品疫苗，置冰水浴中保冷分装，冻干。即制备出冻干剂型的水痘减毒活疫苗成品。
        表6按实施例1-5生产的冻干水痘减毒活疫苗的各项检定结果实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5病毒滴定(PFU/ml)3166635666396663600035333热稳定性试验(PFU/nl)700010000628065008000牛血清蛋白残余量(ng/ml)3126362821水分(％)1.72.01.82.01.6外观合格合格合格合格合格鉴别试验确认为VZV确认为VZV确认为VZV确认为VZV确认为VZV无菌试验合格合格合格合格合格
上述结果表明，按本发明方法制备的冻干水痘减毒活疫苗病毒滴定高、热稳定性好，各项检测指标均符合2000年版《中国生物制品规程》及《冻干水痘减毒活疫苗制造及检定规程》要求。