用于递送活性剂的苯氧基胺化合物和组合物 本申请要求2001年11月13日提交的美国临时申请60/350,488和2002年2月15日提交的美国临时申请60/357,288的利益，在此引入此二者作为参考。
【发明领域】
本发明涉及用于将活性剂、例如生物或化学活性剂递送至目标的苯氧基胺化合物。这些化合物非常适于与活性剂形成非共价混合物，用于对动物进行口、结肠内、肺和其它途径的给药。还公开了这种组合物的制备和给药方法。
【发明背景】
用于递送活性剂的常规方法通常严格地受生物、化学和物理屏障限制。典型地，这些屏障是由发生递送的环境、递送目标的环境和/或目标本身施加的。生物和化学活性剂尤其易受这些屏障的损害。
在给动物递送生物活性和化学活性药理和治疗试剂时，身体施加了屏障。物理屏障的实例是皮肤、脂质双层和多种相对不能渗透某些活性剂但在到达目标前必须穿过的器官膜，例如循环系统。化学屏障包括但不限于胃肠(GI)道中的pH改变和酶降解。
这些屏障在口递送系统的设计中特别重要。如果不是因为生物、化学和物理屏障，许多生物或化学活性剂的口递送将是动物给药的选择途径。许多典型地不适于口服的试剂是生物或化学活性肽，例如降钙素和胰岛素；多糖，特别是粘多糖，包括但不限于肝素；类肝素；抗生素；和其它有机物质。这些试剂可以在胃肠道中通过酸水解、酶等迅速变得无效或破坏。此外，大分子药物的尺寸和结构可以抑制吸收。
易受损害的药理学试剂的早期口服方法依赖同时施用助剂(例如间苯二酚和非离子表面活性剂如聚氧化乙烯油基醚和正十六基聚乙烯醚)以人为增加肠壁的渗透性，以及同时施用酶抑制剂(例如胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸酯(DFF)和抑肽酶)以抑制酶促降解。脂质体也被描述为胰岛素和肝素的药物递送系统。但是，这些药物递送系统的广谱使用预先被排除，因为：(1)系统要求毒性剂量的助剂或抑制剂：(2)不能获得适宜地低分子量物质，即活性剂；(3)系统表现不良的稳定性和不足的保存期；(4)系统难以制备；(5)系统难以保护活性剂(物质)；(6)系统不利地改变活性剂；或者(7)系统不允许或难以促进活性剂的吸收。
类蛋白质微球体已用于递送药物，例如参见美国专利5,401,516、5,443,841和Re.35,862。此外，某些改性的氨基酸已用于递送药物，例如参见美国专利5,629,020、5,643,957、5,766,633、5,776,888和5,866,536。
更近期地，已通过连接基将聚合物与改性的氨基酸或它的衍生物偶合以提供聚合物递送试剂。这种修饰的聚合物可以是任何聚合物，但优选的聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)及其衍生物。例如参见国际专利公开WO 00/40203。
国际专利公开WO01/32130和WO01/32596公开用于递送活性剂的具体的苯基胺羧酸化合物和苯氧基羧酸化合物。国际专利公开WO00/50386还公开了胺递送试剂。
但是，仍需要容易制备的并可以通过多种途径递送宽范围的活性剂的简单、价廉的递送系统。
发明概述
本发明提供有利于活性剂递送的化合物和组合物。本发明的递送试剂化合物包括具有以下通式的化合物：
化合物A
或它的盐
其中
(a)R1、R2、R3和R4独立地为H、-OH、卤素、C1-C4烷基、C1-C4链烯基、C1-C4烷氧基、-C(O)R8、-NO2、-NR9R10或-N+R9R10R11(Y-)；
R8为氢，-OH，C1-C6烷基，被卤素或-OH取代的C1-C4烷基，未被取代或者被卤素或-OH取代的C2-C4链烯基，或者-NR14R15；
R9、R10和R11独立地为氢、氧、未被取代或者被卤素或-OH取代的C1-C4烷基、未被取代或者被卤素或-OH取代的C2-C4链烯基；
Y为卤化物、氢氧化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、烷氧基、高氯酸盐、四氟硼酸盐、羧酸盐、甲磺酸盐、富马酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、乙酸盐、葡糖酸盐、马来酸盐；
R5为H、-OH、-NO2、卤素、CF3、-NR14R15、-N+R14R15R16(Y-)、酰胺、C1-C12烷氧基、C1-C12烷基、C2-C12链烯基、氨基甲酸酯、碳酸酯、脲或-C(O)R22；R5任选被卤素、-OH、-SH或-COOH取代；R5任选被O、N、S或-C(O)-间隔；
R14、R15和R16独立地为H或C1-C10烷基；
R22为H，C1-C6烷基、-OH、-NR14R15；
R6为取代或未取代的C1-C16亚烷基、C2-C16亚链烯基、C2-C16亚炔基、C5-C16亚芳基、(C1-C16烷基)亚芳基或芳基(C1-C16亚烷基)；R6任选被C1-C7烷基或C1-C7环烷基取代；
R7为-NR18R19或-NR18R19R20Y-；
R18和R19独立地为氢、氧、羟基、取代或未取代的C1-C16烷基、取代或未取代的C2-C16链烯基、取代或未取代的C2-C16炔基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基羰基(例如取代或未取代的(C1-6烷基)羰基)、取代或未取代的芳基羰基、取代或未取代的烷烃亚磺酰基(例如取代或未取代的(C1-6烷烃)亚磺酰基)、取代或未取代的芳基亚磺酰基、取代或未取代的烷烃磺酰基(例如取代或未取代的(C1-6烷烃)磺酰基)、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷氧基羰基(例如取代或未取代的(C1-6烷氧基)羰基)或者取代或未取代的芳氧基羰基或取代或未取代的C5-C7杂环(即5、6或7-元杂环)，其中取代基可以是卤素或-OH；和
R20独立地为氢、取代或未取代的C1-C16烷基、取代或未取代的C2-C16链烯基、取代或未取代的C2-C16炔基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基羰基(例如取代或未取代的(C1-6烷基)羰基)、取代或未取代的芳基羰基、取代或未取代的烷烃亚磺酰基(例如取代或未取代的(C1-6烷烃)亚磺酰基)、取代或未取代的芳基亚磺酰基、取代或未取代的烷烃磺酰基(例如取代或未取代的(C1-6烷烃)磺酰基)、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷氧基羰基(例如取代或未取代的(C1-6烷氧基)羰基)或者取代或未取代的芳氧基羰基；
或者
(b)R1-R16和R20如以上定义；而R18和R19结合形成任选被氧基团间隔并且未被取代或被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、芳基、芳氧基或碳环取代的5、6或7-元杂环。
根据一个优选的实施方案，R7为吗啉基、吗啉鎓盐或二乙醇氨基。
根据另一个优选的实施方案，R6为C1-C16亚烷基，而R7为吗啉代或吗啉鎓盐。
优选地，R6为C4-C12亚烷基，例如未取代的C4-C12亚烷基。更优选，R6为C4-C10、C4-C8或C6-C8亚烷基如未取代的C4-C10、C4-C8或C6-C8亚烷基。根据一个实施方案，R1-R5之一为羟基，例如R1可以为羟基。
根据一个实施方案，当R6为C1-C10亚烷基时，R2和R4中至多一个为卤素。根据另一个实施方案，R6为C8-C16、C8-C16、C10-C16或C11-C16亚烷基。例如，R6可以为C8、C8、C10、C11或C12亚烷基(例如正C8-C12亚烷基)。根据进一步的另一个实施方案，R1和R5中至多一个为烷基。
在一个优选的实施方案中，R2＝-OH，而R2＝R3＝R4＝R5＝H或卤素。
在另一个优选的实施方案中，R2＝-OH，而R1＝R3＝R4＝R5＝H或卤素。
在另一个优选的实施方案中，R3＝-OH，而R1＝R2＝R4＝R5＝H或卤素。
在另一个优选的实施方案中，卤素为F、Cl或Br，更优选F或Cl，并更优选Cl。
在另一个优选的实施方案中，R6＝C1-C16亚烷基、(C1-C16烷基)亚芳基或芳基(C1-C16亚烷基)。更优选R6为C1-C12亚烷基，更优选C3-C10亚烷基，更优选C4-C10或C4-C8亚烷基，更优选C6-C8亚烷基，更优选R6未被取代。
在另一个优选的实施方案中，R7＝-NR18R19，而R18和R19独立地为被-OH取代的C1-C4烷基(例如甲基、乙基、丙基或丁基)。在另一个优选的实施方案中，R7＝-NR18R19，而R18和R19结合形成被氧基团取代的六元杂环。
根据一个优选的实施方案，R1为氢；R2、R3和R4独立地为氢、卤素、-OH或-OCH3；R5为氢、-OH或-C(O)CH3；R6为C1-C12亚烷基，而R7为NR18R19，其中R18和R19结合形成5、6或7元杂环。
根据另一个优选的实施方案，R3、R4和R5之一为羟基而其它基团独立地为卤素或氢；R1和R2独立地为卤素或氢；R6为C1-C16亚烷基；而R7为NR18R19，其中R18和R19结合形成5、6或7元杂环。R6优选为C6-C16、C6-C10、C8-C16、C10-C16或C4-C8亚烷基，例如未被取代的C6-C16、C6-C10、C8-C16、C10-C16或C4-C8亚烷基。优选R18和R19形成吗啉代基或咪唑。
在另一个优选的实施方案中，R1为氢；R2、R3和R4独立地为氢、卤素、-OH或-OCH3；R5为氢、-OH或-C(O)CH3；R6为C1-C12亚烷基；而R7为N+R18R19R20(Y-)，其中R18和R19为羟基取代的C1-C16烷基而R20为H。
在另一个优选的实施方案中、R1为氢；R2、R3和R4独立地为氢、卤素、-OH或-OCH3；R5为氢、-OH或-C(O)CH3；R6为C1-C12亚烷基；而R7为N+R18R19R20(Y-)，其中R18和R19为羟基取代的C1-C16烷基而R20为H。
在另一个优选的实施方案中，R1、R2、R4、R5独立地为卤素或氢；R3为-OH或-OCH3；而R7为N+R18R19R20(Y-)，其中R18和R19为羟基取代的C1-C16烷基而R20为H。
根据一个优选的实施方案，R1为氢；R2、R3和R4独立地为氢、卤素、-OH或-OCH3；R5为氢、-OH或-C(O)CH3；R6为C1-C6亚烷基或芳基取代的C1-C12烷基；而R7为-NR18R19，其中R18和R19结合形成5、6或7元杂环或者N+R18R19R20(Y-)，其中R18和R19为羟基取代的C1-C16烷基，而R20为H。
在另一个优选的实施方案中，使用化合物的柠檬酸盐。
优选的递送试剂化合物包括但不限于具有以下通式的化合物及其盐：
(4-(8-(2-羟基苯氧基)辛基)吗啉)
化合物1
8-(2-羟基苯氧基)辛基二乙醇胺)
化合物2
7-(4-(2-羟基苯氧基)庚基吗啉
化合物3
4-(6-(4-羟基苯氧基)己基)吗啉)
化合物4
4-(6-(2-羟基苯氧基)己基)吗啉
化合物5
8-(4-羟基苯氧基)-辛胺
化合物6
4-(4-(2-羟基苯氧基)丁基)吗啉
化合物7
6-(2-乙酰基苯氧基)-1-二甲基氨基己烷
化合物8
7-(2-羟基苯氧基)-庚基-2-异丙基咪唑
化合物9
6-(2-羟基苯氧基)-己基-2-甲基咪唑
化合物10
5-氯-4-甲基-2-(8-吗啉-4-基辛氧基)苯乙酮
化合物11
优选的化合物为化合物1的甲磺酸盐。
还可以使用这些递送试剂化合物的混合物。本发明的吗啉递送试剂可以由本领域中已知的方法转化成同样作为递送试剂的吗啉鎓盐。
本发明还提供一种包含至少一种上式的递送试剂化合物和至少一种活性剂的组合物。与不含递送试剂化合物的活性剂的给药相比，这些组合物以增加或改进的活性剂生物利用度将活性剂递送至选择的生物系统。
还提供包含组合物的剂量单位形式。此剂量单位可以是液体或固体的形式，例如片剂、胶囊或颗粒剂，包括粉末剂或小袋。
另一个实施方案是通过给动物施用包含至少一种上式的递送试剂化合物和活性剂的组合物而对动物，特别是需要活性剂的动物进行活性剂给药的方法。优选的给药途径包括口和结肠内途径。
另一个实施方案是一种通过施用本发明的组合物而治疗动物疾病或获得目标生理作用的方法。
另一个实施方案是通过将至少一种上述通式的递送试剂化合物和至少一种活性剂混合而制备本发明的组合物的方法。
发明详述
递送试剂化合物
这里所用的术语“烷基”、“链烯基”和“炔基”分别包括直链和支链烷基、链烯基和炔基取代基。
递送试剂化合物可以是游离碱或其盐形式。适宜的盐包括但不限于有机和无机盐，例如铵、乙酸盐、柠檬酸盐、卤化物(优选盐酸盐)、氢氧化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、烷氧基、高氯酸盐、四氟硼酸盐、羧酸盐、甲磺酸盐、富马酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、乙酸盐、葡萄糖酸盐和马来酸盐。优选的盐包括但不限于柠檬酸盐和甲磺酸盐。这些盐还可以是溶剂化物，包括乙醇溶剂化物和水合物。
本发明的递送试剂化合物的盐可以通过本领域中已知的方法制备。例如可以在乙醇、甲苯和柠檬酸中制备柠檬酸盐和甲磺酸盐。
一般地，本发明的胺化合物，即其中R7为-NR18R19的胺化合物可以通过以下方法制备：将适宜的酚与以下物质反应：(1)适宜的二卤代烷基链，或者(2)适宜的卤代烷基醇，其然后可以转化成适宜的离去基团，例如甲磺酸酯(例如通过与甲磺酰氯反应)，形成含活性离去基团的醚化合物，然后在碱如三乙基胺存在下与适宜的胺反应。为得到对应的盐，将胺化合物与适宜的酸反应，即为制备柠檬酸盐，将胺与柠檬酸，优选与过量的柠檬酸反应。为得到其中R7为-NR18R19R20(其中R18、R19、R20不为氢)的对应的季铵盐，通过本领域中已知的方法将胺化合物的胺部分烷基化。
可以通过在一种或多种单独或前后连接的固体色谱载体上进行重结晶或分馏而纯化递送试剂化合物。适宜的重结晶溶剂系统包括但不限于乙醇、水、庚烷、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、甲醇和四氢呋喃(THF)和它们的混合物。分馏可以在适宜的色谱载体如氧化铝上进行，使用甲醇/正丙醇混合物作为流动相；反相色谱法，使用三氟乙酸/乙腈混合物作为流动相；和离子交换色谱法，使用水或适宜的缓冲液作为流动相。当进行阴离子交换色谱法时，优选使用0-500mM氯化钠梯度。
递送试剂可以包含通过连接基团与选自以下基团偶合的聚合物：-NHC(O)NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)、-OOC-、-COO-、-NHC(O)O-、-OC(O)NH-、-CH2NH-NHCH2-、-CH2NHC(O)O-、-OC(O)NHCH2-、-CH2NHCOCH2O-、-OCH2C(O)NHCH2-、-NHC(O)CH2O-、-OCH2C(O)NH-、-NH-、-O-和碳-碳键，条件是聚合递送试剂不为多肽或多氨基酸。聚合物可以是任何聚合物，包括但不限于交替共聚物、嵌段共聚物和无规共聚物，它们的使用对哺乳动物是安全的。
优选的聚合物包括但不限于聚乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(氧乙烯)、聚(丙烯)、聚丙二醇、聚乙二醇(PEG)和它们的衍生物以及它们的组合。聚合物分子量的通常范围为大约100至大约200,000道尔顿。聚合物分子量的优选范围为大约200至大约10,000道尔顿。在一个实施方案中，聚合物分子量的范围为大约200至大约600道尔顿，更优选范围为大约300至大约550道尔顿。
活性剂
适用于本发明的活性剂包括生物活性剂和化学活性剂，包括但不限于杀虫剂、药理学试剂和治疗剂。适宜的活性剂包括在胃肠道中通过酸水解、酶等而变得效果较差、无效或被破坏的试剂。适宜的活性剂还包括大分子试剂，它们的生理化学特征如尺寸、结构或电荷抑制或阻止其口服吸收。
例如，适用于本发明的生物或化学活性剂包括但不限于蛋白质、多肽、肽、激素、多糖，特别是粘多糖、糖类、脂质的混合物；小极性有机分子(即分子量为500道尔顿或更小的极性有机分子)；有其它有机化合物；特别是本身不通过(或仅通过部分给药剂量)胃肠粘膜和/或易于在胃肠道中发生酸和酸化学裂解的化合物；或者它们的任意组合。
进一步的实例包括但不限于以下，包括它们的合成、天然或重组来源：生长激素，包括人生长激素(hGH)、重组人生长激素(rhGH)、牛生长激素和猪生长激素；生长激素释放激素；生长激素释放因子，干扰素，包括α(例如干扰素alfacon-1(购自InterMune，Inc.ofBrisbane，CA的干扰素))、β和γ；和白细胞介素-1；白细胞介素-2；胰岛素，包括猪、牛、人和人重组胰岛素，任选具有反离子，包括锌、钠、钙和铵；胰岛素样生长因子，包括IGF-1；肝素，包括未分级肝素、类肝素、皮肤素、软骨素、低分子量肝素、极低分子量肝素和超低分子量肝素；降钙素，包括鲑鱼、鳗鱼、猪和人降钙素；红细胞生成素；心钠素(atrial naturetic factor)；抗原；单克隆抗体；促生长素抑制素；蛋白酶抑制剂；促肾上腺皮质激素，促性腺激素释放激素；催产素；促黄体生成激素释放激素(leutinizing-hormone-releasing-hormone)；卵泡刺激激素；葡糖脑苷脂酶；血小板生成素；非格司亭；前列腺素；环孢菌素；加压素；色甘酸钠(cromolyn sodium)(sodium或色甘酸二钠)；万古霉素；去铁胺(DFO)；二膦酸盐，包括阿仑膦酸盐、替鲁膦酸盐、羟乙膦酸盐、氯屈膦酸盐、帕米膦酸盐、奥帕膦酸盐和因卡膦酸盐；甲状旁腺素(PTH)，包括它的片段；抗偏头痛试剂如BIBN-4096BS和其它降钙素基因相关的蛋白质拮抗剂；高血糖素样肽1(GLP-1)；抗菌剂，包括抗生素、抗菌剂和抗真菌剂；维生素；这些化合物的类似物、片段、模拟物或聚乙二醇(PEG)修饰的衍生物；或者它们的任意组合。抗生素的非限制性实例包括革兰氏阳性作用杀菌、脂肽和环肽抗生素，例如达托霉素及其类似物。
递送系统
本发明的组合物包含一种或多种本发明的递送试剂化合物和一种或多种活性剂。在一个实施方案中，可以通过在给药前与活性剂混合形成给药组合物而将一种或多种递送试剂化合物或者这些化合物盐，或者多氨基酸或肽用作递送试剂，其中这些化合物或盐形成一个或多个它的单元。
给药组合物可以为液体形式。溶液介质可以是水(例如对于鲑鱼降钙素、甲状旁腺素和红细胞生成素而言)、25％丙二醇水溶液(例如对于肝素而言)和磷酸盐缓冲液(例如对于rhGH而言)。其它给药载体包括聚乙二醇。给药溶液可以通过仅在给药前将递送试剂化合物与活性剂的溶液混合而制备。可选择地，可以将递送试剂化合物(或者活性剂)的溶液与活性剂(如者递送试剂化合物)的固体形式混合。递送试剂化合物和活性剂也可以混合成为干燥粉末。递送试剂化合物和活性剂也可以在制备过程中混合。
给药溶液可以任选包含添加剂如磷酸盐缓冲剂盐、柠檬酸、乙二醇或其它分散剂。可以将稳定添加剂加到溶液，优选其浓度范围为大约0.1-20％(w/v)。
给药组合物可以选择为固体的形式，例如片剂、胶囊或颗粒剂如散剂或小袋。固体剂型可以通过将固体形式的化合物与固体形式的活性剂混合而制备。可选择地，固体可以由化合物和活性剂的溶液，通过本领域中已知的方法，例如冷冻干燥(冻干)、沉淀、结晶和固体分散而获得。
本发明的给药组合物还包括一种或多种酶抑制剂。这些酶抑制剂包括但不限于化合物如actinonin或epiactinonin和它们的衍生物。其它酶抑制剂包括但不限于抑肽酶(Trasylol)和Bowman-Birk抑制剂。
用于本发明的给药组合物的活性剂的数量是有效地达到特定活性剂对目标适应症的目的的数量。组合物中活性剂的数量通常为药理学、生理学、治疗学或化学有效量。但是，其在用于剂量单位形式时用量可以小于这些数量，因为剂量单位形式可能包含多种递送试剂化合物/活性剂组合物，或者可能包含分开的药理学、生理学、治疗学或化学有效量。然后可以在总共包含有效量的活性剂的累积单元中施用总有效量。
待使用的活性剂的总量可以由本领域技术人员已知的方法确定。但是，由于本发明的组合物可以比仅包含活性剂的组合物更有效地递送活性剂，因此可以给受试者施用比用于先前的剂量单位形式或递送系统的较少数量的生物或化学活性剂，同时仍获得相同的血液水平和/或治疗效果。
本发明公开的递送试剂化合物促进递送生物和化学活性剂，特别是口服、鼻内、舌下、十二指肠内、皮下、颊、结肠内、直肠、阴道、粘膜、肺、透皮、真皮内、肠胃外、静脉内、肌内和眼系统中的生物和化学活性剂，并穿透血脑屏障。
剂量单位形式还可以包括赋形剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、增塑剂、着色剂、调味剂、味道掩蔽剂、糖、增甜剂、盐和给药载体，包括但不限于水、1，2-丙二醇、乙醇、橄榄油或它们的任意组合。
本发明的化合物和组合物用于将生物或化学活性剂施用于任何动物，包括但不限于鸟类如鸡，哺乳动物如啮齿动物、牛、猪、狗、猫、灵长目，特别是人和昆虫。
此系统特别有利于递送在活性剂到达其目标区域(即递送组合物中的活性剂释放的区域)之前并在给药的动物体内所遇的条件导致其被破坏和效果变差的化学或生物活性剂。具体而言，本发明的化合物和组合物用于口服活性剂，特别是通常不口服递送的活性剂或要求改进递送的活性剂。
包含化合物和活性剂的组合物用于将活性剂递送至选择的生物系统，且与不含递送试剂的活性剂的给药相比增加或改善了活性剂的生物利用度。递送可以通过在一定的时间内递送更多的活性剂，或者在特定的时期内递送活性剂(例如进行更迅速或更延迟的递送)，或者在特定的时间或者经过一定时间(例如延时递送)递送活性剂而得到改善。
本发明的另一个实施方案是一种通过施用本发明的组合物而治疗或预防动物疾病或者实现目标生理作用，例如下表所列的疾病和生理作用的方法。优选，施用有效量的用于治疗或预防目标疾病或用于实现目标生理作用的组合物。活性剂的特定适应症可以见于Physicians′Desk Reference(54th Ed.，2000，Medical EconomicsCompany.Inc.，Montvale，NJ)，在此引用作为参考。下表中的活性剂包括它们的类似物、片段、模拟物和聚乙二醇修饰的衍生物。活性剂疾病和生理作用生长激素(包括人重组生长激素和生长激素释放因子以及它的类似物)生长疾病干扰素，包括α、β和γ病毒感染，包括慢性癌症和多发性硬化白细胞介素-1；白细胞介素-2病毒感染；癌症胰岛素；胰岛素样生长因子IGF-1糖尿病肝素血栓形成；预防凝血降钙素骨质疏松症；骨疾病红细胞生成素贫血心钠素血管舒张抗原感染单克隆抗体预防移植排斥；癌症促生长素抑制素出血性溃疡；侵蚀性胃炎蛋白酶抑制剂AIDS促肾上腺皮质激素高胆固醇(降低胆固醇)促性腺激素释放激素排卵功能异常(刺激排卵)催产素分娩功能异常(刺激收缩)促黄体生成激素释放激素；卵泡刺激激素调节生殖功能葡糖脑苷脂酶高歇氏病(代谢脂蛋白)血小板生成素血小板减少症非格司亭减少化疗患者感染前列腺素高血压环孢菌素移植排斥加压素遗尿症；抗利尿色甘酸钠；万古霉素哮喘；变应性去铁胺(DFO)铁超载甲状旁腺激素(PTH)，包括它的片段骨质疏松症；骨疾病抗菌剂感染，包括革兰氏阳性菌感染维生素维生素缺乏二膦酸盐骨质疏松症；佩吉特氏病；抑制破骨细胞BIBN4096BS-(1-哌啶甲酰胺.N-[2-[[5-氨基-1-[[4-(4-吡啶基)-1-哌嗪基)羰基]戊基]氨基]-1-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)甲基]-2-氧代乙基]-4(1，4-二氢-2-氧代-3(2HO-喹唑啉基)-.[R-(R*，S*)]-)抗偏头痛；降钙素基因相关的肽拮抗剂
例如，本发明的一个实施方案是一种通过施用胰岛素和至少一种本发明的递送试剂化合物治疗患有或易患有糖尿病的患者的方法。
在给药之后，组合物或剂量单位形式中的本发明的活性剂被吸收进入循环。可以通过测定血液中已知药理学活性，例如由肝素导致的凝血时间增加，或者由降钙素导致的循环钙水平降低而容易地评价试剂的生物利用度。可选择地，活性剂本身的循环水平可以直接测定。
优选实施方案的描述
以下实施例以限制性地例示本发明。除非另外指出，所有的份按重量计。
除非另外指出，在300MHz Bruker光谱仪上，使用二甲亚砜(DMSO-d6)作为溶剂对下列化合物进行质子核磁共振(1H NMR)分析。
用具有以下参数的Agilent Technologies，LC/MSD 1100(singlequad)进行液相色谱/质谱(LC-MS)分析：
流动相A：50∶950∶5乙腈∶水∶乙酸(v/v/v)
流动相B：950∶50∶5乙腈∶水∶乙酸(v/v/v)
梯度洗脱：4分钟线性梯度0-100％B；每次注射总时间为11分钟
注射溶积：5μL
柱：ZORBAX Rapid Resolution Cartridge，SB-C18，2.1×30mm，3.5μm
粒径，目录号；873700-902
柱温：40℃
在244nm下进行UV检测
MSD参数：
来源：API-ES，正极性
扫描参数：
质量范围：125.00-600.00
片断器(Fragmentor)：60V
增量：1.0EMV
阈值：150
喷雾室：
气体温度350deg.D
干燥气体：12.01/分
嘴压；40psig
VCap 4000V正/负
实施例1：制备化合物
la：制备化合物1的柠檬酸盐：
(4-(8-(2-羟基苯氧基)辛基)吗啉)柠檬酸盐
用23.18克(168mmol)碳酸钾处理27.5ml(31.4克，157mmol)2-苄氧基酚、80.0ml(118.82克，434mmol)1，8-二溴辛烷和100ml乙醇的溶液，并加热回流5.5小时。将冷却的反应混合物在25℃下搅拌20小时，过滤并浓缩。残余物用100ml 2∶1己烷/乙酸乙酯稀释，并用炭脱色。将溶液浓缩。在98℃和0.5mm压力下进行Kugelrohr蒸馏纯化残余物以除去过量的二溴化物。
将59.0克(151mmol)以上分离的溴化物溶于100ml四氢呋喃，并用28.0ml(28.0g，321mmol)吗啉处理。将溶液加热回流4.5小时。将所得的浆冷却至25℃，在25℃下搅拌20小时，并与80ml 2N氢氧化钠水溶液处理。用80ml 2∶1己烷/乙酸乙酯稀释混合物。进行分层。用水(3×30ml)和盐水(1×30ml)洗涤有机相，用硫酸钠干燥，用炭脱色并浓缩。
将59.9克以上分离的苄基醚溶于80ml乙醇和20ml乙酸乙酯，用0.55克10％担载在炭上的钯处理，并置于Parr震动器中58psig氢气氛下。在20小时内使用至完大约20psig氢。用C盐滤垫过滤除去催化剂。将滤液浓缩并在真空下放置20小时。
将以上分离的4-8-(2-羟基苯氧基)辛基吗啉(37.63克，122.4mmol，NMR测定为大约80％纯)溶于50ml甲苯，并加到21.17g柠檬酸和乙醇的温溶液。加入另一份30ml甲苯。将溶液置于-4℃冰箱内。过滤分离形成的固体得到42.9g 4-8-(2-羟基苯氧基)辛基吗啉鎓柠檬酸盐，mp84-6℃。
Karl Fisher：0.55％水；燃烧分析(用水)：％C：57.39(计算值)，57.63(实测值)；％H：7.49(计算值)，7.55(实测值)；％N：2.79(计算值)，2.64(实测值)；1H NMR分析：(d6-DMSO)：δ8.4，bs，5H；66.9，dd，1H；δ6.7，m，3H；δ3.9，t，2H；δ3.7，t，4H；δ2.8，bt，4H；δ2.7，t，2H；δ2.6，q，4H；δ1.7，p，2H；δ1.5，p，2H；δ1.4，p，2H；δ1.3，m，6H。
1b：制备化合物1的甲磺酸盐：
(4-(8-(2-羟基苯氧基)辛基)吗啉)甲磺酸盐
将以上分离的N-8-(2-羟基苯氧基)辛基吗啉(13.3g，43.3mmol，NMR确定大约80％)溶于40ml四氢呋喃，并用2.30ml(3.41g，35.4mmol)甲磺酸处理。立即形成固体，过滤分离得到8.02g化合物1，为甲磺酸盐，mp137-9℃。燃烧分析：％C：56.55(计算值)，56.50(实测值)；％H：8.24(计算值)，8.23(实测值)；％N：3.47(计算值)，3.39(实测值)；％S：7.94(计算值)，7.79(实测值)；1H NMR分析：(d6-DMSO)：δ9.6，bs，1H；δ8.8，bs，1H；δ6.9，dd，1H；δ6.7，m，3H；δ3.9，t，4H；δ3.7，t，2H；δ3.4，t，2H；δ3.0，bt，4H；δ2.4，s，3H；δ1.7，m，4H；δ1.4，p，2H；δ1.3，m，6H。
1c.制备化合物3：
7-(4-(2羟基苯氧基)庚基吗啉鎓柠檬酸盐：
可以与化合物1相的方式，使用1，7-二溴己烷作为烷基化试剂制备。分离2.25g化合物3，mp 120-3℃。燃烧分析：％C：56.90(计算值)，56.92(实测值)；％H：7.27(计算值)，7.24(实测值)；％N：2.88(计算值)，2.61(实测值)；1H NMR分析：(d6-DMSO)：δ8.6，bs，5H；δ6.9，dd，1H；δ6.7，m，3H；δ3.9，t，2H；δ3.7，t，4H；δ2.8，bt，4H；δ2.7，t，2H；δ2.6，q，4H；δ1.7，p，2H；δ1.5，p，2H；δ1.2-1.4，m，6H。
ld：制备化合物2的柠檬酸盐：
8-(2-羟基苯氧基)辛基二乙醇胺)柠檬酸盐
用23.18g(168mmol)碳酸钾处理27.5ml(31.4g，157mmol)2-苄氧基酚、80.0ml(118.82g，434mmol)1，8-二溴辛烷和100ml乙醇的溶液，并加热回流5.5小时。将冷却的反应混合物于25℃下搅拌20小时，过滤并浓缩。用100ml 2∶1己烷/乙酸乙酯稀释残余物，并用炭脱色。将溶液浓缩。在98℃和0.5mm压力下进行Kugelrohr蒸馏纯化残余物以除去过量的二溴化物。
将以上分离的溴化物(4.32g，11.0mmol)和2.80ml(3.07g，29.2mmol)二乙醇胺溶于30ml四氢呋喃，并用5ml三乙胺处理。将此溶液加热回流3天。将所得的浆冷却25℃，在25℃下搅拌20小时并用20ml 2N氢氧化钠水溶液处理。用20ml乙酸乙酯稀释混合物。进行分层。用水(3×30ml)和盐水(1×30ml)洗涤有机相，用硫酸钠干燥并浓缩。
将3.98g以上分离的苄基醚溶于20ml乙醇和20ml乙酸乙酯，用0.22g 10％担载在炭上的钯处理，并放置在Parr震动器中的58psig氢气氛下。在20小时内用完大约20psig氢。用C盐滤垫过滤除去催化剂。将滤液浓缩并在真空下放置20小时。
将以上分离的8-(2-羟基苯氧基)辛基二乙醇胺(3.06g，9.40mmol)溶于10ml甲基叔丁基醚和2ml乙醇。将此溶液加到1.82g柠檬酸和8ml乙醇的混合物。加入另外5ml甲基叔丁基醚。将溶液置于-4℃冰箱中。过滤分离形成的固体得到2.16g 8-(2-羟基苯氧基)辛基二乙醇柠檬酸铵，mp＜25℃。Karl Fisher：0.1.71％水；燃烧分析(用水)：％C：54.74(计算值)，55.28(实测值)；％H：7.66(计算值)，8.16(实测值)；％N：2.66(计算值)，2.54(实测值)。
1e：制备化合物4的柠檬酸盐：
4-(6-(4-羟基苯氧基)己基)吗啉)柠檬酸盐
用7.67g(55.5mmol)碳酸钾处理9.97g(49.8mmol)4-苄氧基酚，22.2ml(34.9g，143mmol)1，6-二溴己烷和100ml乙醇的溶液，并加热回流5.5小时。将反应混合物冷却至25℃。在25℃下用乙酸乙酯和乙醇稀释凝固的反应混合物，过滤并用大量乙酸乙酯冲洗。收集滤液并浓缩以形成一种固体。过滤分离固体。
将4.20g(11.6mmol)以上分离的溴化物溶于30ml四氢呋喃，并用2.20ml(2.20g，25.3mmol)吗啉处理。将此溶液加热回流4.5小时。将所得的浆冷却至25℃，在25℃下搅拌20小时，并用20ml 2N氢氧化钠水溶液处理。用20ml 2∶1己烷/乙酸乙酯稀释此混合物。进行分层。用水(3×30ml)和盐水(1×30ml)洗涤有机层，用硫酸钠干燥，用碳脱色并浓缩。
将4.27g以上分离的苄基醚溶于25ml乙醇和20ml乙酸乙酯，用0.32g 10％担载在炭上的钯处理，并放置在Parr震动器中的58psig的氢气氛下。在20小时内用完大约20psig氢。用C盐滤垫过滤除去催化剂。将滤液浓缩并在真空下放置20小时。
将以上分离的4-6-(4-羟基苯氧基)己基吗啉(3.05g，10.9mmol)溶于60ml乙醇、20ml乙酸乙酯和20ml丙酮并加热。将此溶液加到2.10g柠檬酸和乙醇的温溶液。用50ml甲基叔丁基醚稀释混合物，并将其置于-4℃冰箱。过滤分离形成的固体得到2.16g 4-6-(4-羟基苯氧基)己基吗啉鎓柠檬酸盐，mp125-7℃。Karl Fisher：0.45％水；燃烧分析(用水)：％C：55.79(计算值)，55.47(实测值)；％H：7.07(计算值)，7.03(实测值)；％N：2.96(计算值)，2.92(实测值)。
lf.制备化合物5的柠檬酸盐：
4-(6-(2-羟基苯氧基)己基)吗啉鎓柠檬酸盐
制备与化合物1柠檬酸盐相同，除了将1，6-二溴己烷用作烷基化剂。分离10.11g化合物5，mp 76-80℃。燃烧分析：％C：55.70(计算值)，56.11(实测值)；％H：7.08(计算值)，7.22(实测值)；％N：2.95(计算值)，2.86(实测值)；1H NMR分析：(d6-DMSO)：δ8.6，bs，5H；δ6.9，dd，1H；δ6.7，m，3H；δ3.9，t，2H；b 3.7，t，4H；δ2.8，bt，4H；δ2.7，t，2H；b 2.6，q，4H；δ1.7，p，2H；δ1.5，p，2H；δ1.4，p，2H；δ1.3，p，2H。
1g.制备化合物6：
8-(4-羟基苯氧基)辛胺
用13.8克碳酸钾(100mmol)处理在200ml 2-丁酮中的4-苄氧基酚(10.23克，51.2mmol)和8-溴辛酸乙酯(12.80克，51.0mmol)的混合物并加热回流16小时。过滤冷却的反应混合物。将滤液与100ml乙酸乙酯合并，并连续地用2N NaOH、水、1N HCl和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。用旋转蒸发仪除去溶剂得到白色固体作为产物。
将18.53克(50.1mmol)以上得到的酯溶于200ml无水四氢呋喃。通过粉末漏斗缓慢加入氢化锂铝(1.9克，50mmol)。将此混合物于室温下搅拌2小时，然后用冰浴冷却。缓慢加入水(2ml)，然后加入6ml 15％NaOH，接着加入另外2ml水。将混合物搅拌过夜，然后过滤。将滤液浓缩得以16.3克产物。
将16.3克(49.7mmol)以上得到的醇溶于200ml二氯甲烷和10mlN，N-二甲基乙酰胺的混合物。加入三乙基胺(7.30克，72.3mmol)。将所得的混合物在冰浴中冷却，然后加入甲磺酰氯(7.39克，64.5mmol)。然后将混合物加热至室温，并搅拌20小时。连续用水、1N HCl、水、饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤混合物，用硫酸钠干燥。蒸发溶剂得到21.25克产物。
将以上得到的甲磺酸盐(20.50克，50.5mmol)溶于100ml N，N-二甲基乙酰胺并用叠氮化钠(5.01克，77.1mmol)处理。将混合物于120℃下加热三小时，然后冷却至室温。然后将混合物倾入200ml水，并通过真空过滤收集大量的形成的固体(17.25克)。
将以上得到的叠氮化物(16.64克，47.1mmol)溶于200异丙醇，并用甲酸铵(11.87克，188.4mmol)处理。将混合物加热至60℃，然后通过粉末漏斗缓慢地加入担载在碳上的钯(10％重量，1.0克)。在60℃下将反应物搅拌1小时，然后冷却至室温。通过旋转蒸发除去溶剂以得到13.09克固体。用乙醇水将固体再结晶得到8.90克纯产物8-(4-羟基苯氧基)辛胺，mp115-7℃。％C：70.85(计算值)，70.53(实测值)；％H：9.77(计算值)，9.92(实测值)；％N：5.90(计算值)，5.67(实测值)；1HNMR分析：(d6-DMSO)：δ6.7，AB，4H；δ3.8，t，2H；δ3.5，bt，3H；δ2.5，t，2H；δ1.6，p，2H；δ1.3，br，10H。
lh.制备化合物7的柠檬酸盐：
4-(4-(2-羟基苯氧基)丁基)吗啉鎓柠檬酸盐：
制备与化合物1柠檬酸盐相同，除了使用1，4-二溴丁烷作为烷基化剂。分离6.32g化合物7，mp 97-9℃。燃烧分析：％C：54.17(计算值)，54.11(实测值)；％H：6.59(计算值)，6.61(实测值)；％N：3.16(计算值)，3.08(实测值)；1H NMR分析：(d6-DMSO)：δ6.9，dd，1H；δ6.7，m，3H；δ4.0，t，2H；δ3.7，t，4H；δ2.8，bt，4H；δ2.7，t，2H；δ2.6，q，4H；δ1.7，m，4H。
li：制备化合物8的盐酸盐：
6-(2-乙酰基苯氧基)-1-二甲基氨基己烷盐酸盐
制备在70ml四氢呋喃(THF)中的9.32g(68.5mmol)2-羟基苯乙酮、11.3mL(9.94g，68.5mmol)6-二甲基氨基-1-己醇和18.00g(68.6mmol)三苯基膦的溶液。在大约30分钟内将在30ml THF中的13.5mL(13.86g，68.6mmol)二异丙基偶氮二甲酸盐(DIAD)加到以上溶液。将反应混合物于室温下搅拌20小时，用100ml乙酸乙酯稀释，并用5份50mL1％的盐酸水溶液和2份30mL10％盐酸水溶液萃取。通过加入10N氢氧化钠而使合并的水提取物变为pH＝9.5，用三份50mL乙酸乙酯萃取。用硫酸钠干燥合并的有机层并真空浓缩。用10ml乙酸乙酯稀释所得的浆，并通过玻璃羊毛过滤除去固体。真空浓缩有机相并冷冻。用大约40ml 10％盐酸水溶液稀释所得的固体，并过滤除去不溶部分。用氢氧化钠使溶液变为pH＝9，用四份30ml乙酸乙酯和一份30mL水洗涤，用硫酸钠干燥，真空浓缩，并在-5℃保存。将所得的固体在己烷中搅拌，过滤除去不溶部分。使气体盐酸冒泡通过滤液。从己烷中倾析出所得的固体，并将固体在乙酸乙酯中搅拌大约20小时。过滤收集这些固体得到5.77g(28.1％)6-(2-乙酰基苯氧基)-l二甲基氨基己烷盐酸盐，为一种灰黄色粉末。
熔点：138-141℃。燃烧分析：％C：64.09(计算值)，63.80(实测值)；％H：8.74(计算值)，8.60(实测值)；％N：4.67(计算值)，4.76(实测值)；％Cl：11.82(计算值)，11.63(实测值).1H NMR分析(d6-DMSO)：δ10.8，bs，1H；δ7.6，dd，1H；δ7.5，dt，1H；δ7.1，d，1H；δ7.0，dt，1H；δ4.1，t，2H；δ3.0，m，2H；δ2.7，d，6H；δ2.5，s，3H；δ1.8，m，2H；δ1.7，m，2H；δ1.5，m，2H，δ1.4，m，2H。
li.制备化合物9
以与以上相同的方式由2-苄氧基酚和1，7二溴庚烷制备7-溴庚基2-苄氧基苯基醚。将16.49g(149.7mmol)2-异丙基咪唑、28.80g(76.33mmol)7-溴庚基2-苄氧基苯基、11.2ml三乙基胺和150ml二噁烷的悬浮液加热至80℃，导致所有固体变成溶液。搅拌5小时后，将反应混合物冷却至25℃，用50n ml甲基叔丁基醚稀释并过滤。用2∶1甲基叔丁基醚和己烷稀释滤液，并用水(3×60mL)和盐水(1×40mL)洗涤。用硫酸钠干燥有机相(上层相)并浓缩。
将粗品31.0g以下分离的苄基醚溶于乙醇并冷却至-4℃。分离形成的固体并弃去。将滤液浓缩至一半体积(150mL)用0.50g 10％担载在炭上的钯处理，并置于Parr震动器中的53psig氢气氛下。在40小时内用完大约4psig氢。用C盐滤垫过滤除去催化剂。将滤液浓缩。2天后形成固体，回收于甲苯，滤掉并用乙醇/甲苯重结晶。在66℃和0.1mm下对固体进行Kugelrohr蒸馏以除去2-异丙基咪唑杂质。冷却时分离5.89g(2-羟基苯氧基)-庚基-2-异丙基咪唑，mp93-4℃。KarlFisher：1.66％水；燃烧分析(用水)：％C：70.92(计算值)，70.20(实测值)；％H：8.96(计算值)，8.80(实测值)；％N：8.71(计算值)，8.52(实测值)；MS(M+1)317；1H NMR分析：(d6-DMSO)：δ8.8，bs，1H；δ7.05，d，1H；δ6.9，dd，1H；δ6.8，d，1H；δ6.7，m，3H；δ3.9，m，4H；δ3.05，hept，1H；δ1.7，m，4H；δ1.3-1.5，m，6H；δ1.2，d，6H。
lk.制备化合物10
以与化合物9相同的方法，使用1，6-二溴己烷作为烷基化剂和2-甲基-咪唑制备此化合物。分离总共2.11g化合物10，mp 103-4℃。燃烧分析：％C：70.04(计算值)，70.24(实测值)；％H：8.08(计算值)，8.29(实测值)；％N：10.21(计算值)，9.97(实测值)；1H NMR分析：(d6-DMSO)：δ8.8，bs，1H；δ7.0，d，1H；δ6.9，dd，1H；δ6.8，m，3H；δ6.7，d，1H；δ3.9，t，2H；δ3.85，t，2H；δ1.7，m，4H；δ1.45，p，2H；δ1.3，p，2H。
1l.制备化合物11
将10.0g(47.8mmol)8-溴-1-辛醇、10.41g(120mmol)吗啉和四氢呋喃的溶液加热回流3小时。用饱和碳酸氢钠水溶液处理冷却的反应混合物，并用乙酸乙酯萃取。用盐水洗涤有机相，用硫酸镁干燥并浓缩得到10.50g 4-(8-羟基辛基)吗啉。
将粗品4-(8-羟基辛基)-吗啉(2.0g，9.3mmol)溶于二氯甲烷，并用10ml三乙基胺(7.3g，72mmol)处理。在冰浴中冷却后，用1.28g(11.2mmol)甲磺酰氯处理混合物，搅拌1小时，然后加热至25℃。搅拌2小时后，用碳酸氢钠水溶液稀释反应混合物，并用乙酸乙酯萃取。用盐水洗涤有机相，用硫酸镁干燥，并浓缩得到2.4g粗甲磺酸盐。
用2.26g(16.4mmol)碳酸钾和0.62g(4.1mmol)碘化钠处理2.40g(8.2mmol)粗品8-吗啉基辛基甲磺酸酯、1.82g(9.8mmol)2-羟基-5-氯-4-甲基苯乙酮和30ml二甲基甲酰胺的溶液。加热反应混合物。回收并用1.0M在乙醚中的氯化氢处理后，分离2.67g 5-氯-4-甲基-2-(8-吗啉-4-基辛氧基)苯乙酮盐酸盐，mp75-6℃。Karl Fisher：4.89％水；燃烧分析：％C：57.34(计算值)，56.42(实测值)；％H：8.11(计算值)，8.3(实测值)；％N：3.18(计算值)，3.81(实测值)；％Cl：16.12(计算值)，16.72(实测值)；1H NMR分析：(d6-DMSO)：δ11.0，bs，1H；δ7.55，s，1H；δ7.2，s，1H；δ4.1，t，2H；δ3.9，m，2H；δ3.8，t，2H；δ3.0，m，4H；δ2.5，s，3H；δ2.5，m，2H；δ2.4，s，3H；δ1.8，p，2H；δ1.7，m，2H；δ1.45，m，2H；δ1.3，m，6H。
实施例2
2A：胰岛素-口服递送
在去离子水中制备递送试剂化合物和人锌胰岛素(最少26IU/mg，购自Calbiochem-Novabiochem Corp，La Jolla，CA)的口服(PO)组合物。一般地，将500 mg递送试剂化合物加到1.5ml水。搅拌溶液，然后加热(大约37℃)并进行超声波(sonicator)处理。用NaOH或HCl调节pH至大约7-8.5。如果需要的话，再加入NaOH以得到均一的溶解度，将pH再调节至大约7-8.5。然后加入水以使总体积为大约2.4ml并搅拌。将来自胰岛素储备溶液(15mg/ml，由0.5409g胰岛素和18ml去离子水制备，用HCl和NaOH调节至pH8.15并用40ml浓HCl、25ml 10N NaOH和50ml 1N NaOH得到澄清溶液)的大约1.25mg胰岛素加到溶液并进行颠倒混合。溶液可以用于立即用于给药方案，或者可选择将溶液在37℃水浴中放置1小时，然后给药。最终递送试剂化合物剂、胰岛素剂量和剂量体积数如以下表1所列。
典型的给药和取样方案如下。将重量为大约200-250g的雄性Sprague-Dawley大鼠禁食24小时，在给药前15分钟施用氯胺酮(44mg/kg)和氯丙嗪(1.5mg/kg)，并再次按需保持麻醉。给5只动物的剂量组施用一种给药溶液。对于口服给药，用11cm Rusch 8 French导管装配1ml带移液管末端的注射器。管通过导管抽吸溶液而使注射器充满给药溶液，然后将其擦干。将导管顺食道放置，在门牙后留出1cm管道。通过冲压注射器活塞施用给药溶液。
通常在时间＝15、30、60、120和180分钟连续地从尾动脉收集血样。表1报道基于基线的葡萄糖水平的变化百分率。
表1.胰岛素-口服递送递送试剂化合物递送试剂化合物剂量(mg/kg) 胰岛素剂量 (mg/kg) 体积剂量 (ml/kg) 血清中的葡萄糖水平(％基于基线的变化±SD) 1 200 0.5 2 0.3±8.2 1 200 0.5 2 -5.9±4.6 2 200 0.5 2 -10.8±6.8 3 200 0.5 2 -9.8±4 4 200 0.5 2 -2.3±10.6 6 200 0.5 2 6.4±17.1 7 200 0.5 2 -11.7±3.4 8 200 0.5 2 -8.2±9.5
重复上述方法并进行以下修改：
使用重量为250-300g而不是200-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠。所有动物保存在金属笼中。将所有动物放置在室内，其中在实验之前30分钟进行实验。避免所有的大声的噪音和声音以减少动物压力。
用于测定血样中葡萄糖水平的试验条仅按需要与光接触。所有试验条除了在使用期间单独保存在密封瓶中。
当操作对照组时，剧烈振荡对照溶液，弃去第一滴，用kim擦擦去瓶端，并将一滴应用于试验条。
在t＝0、15、30、45和60分钟通过Farmer′s Wife技术取血样。在末端切割每只大鼠尾巴(大约2mm尾巴)。来自动物尾巴的第一滴血不用于进行血液葡萄糖读数。将来自每只大鼠尾巴的新鲜血滴置于试验条的末端。
在基线之后，动物口服给药并完全清醒。没有进行麻醉。
2B.生物素基化核糖核酸酶A(bRNase A)口递送
通过混合制备在去离子水中的递送试剂化合物和bRNaseA(Sigma(Milwaukee，WI)：来自牛胰腺的核糖核酸酶A型XII-A)的口管饲法(PO)给药溶液。制备递送试剂化合物的溶液。在磷酸盐缓冲液中制备递送试剂化合物溶液并搅拌。如果需要通过加入等分试样的适宜当量浓度的NaOH来上调混合物的pH直至递送试剂化合物完全溶解。溶解的递送试剂化合物的最终pH为7.5和9.5。通过将9体积的递送试剂化合物溶液与1体积的bRNase A储备溶液(20mg bRNase A，在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中)混合而制备最终的给药溶液。最终浓度为150mg/ml递送试剂化合物和2mg/ml bRNase A。
给药和取样方案如下。将重量为200-250g的雄性Sprague-Dawley大鼠禁食24小时，并在给药前15分钟施用氯胺酮(44mg/kg)和氯丙嗪(1.5mg/kg)，并再次按需要保持麻醉。以以下方式给5只动物的给药组施用一种给药溶液。用11cm Rusch 8 French导管装配1ml带移液管末端的注射器。管通过导管抽吸溶液而使注射器充满给药溶液，然后将其擦干。将导管顺食道放置，在门牙后留出1cm管道。通过冲压注射器活塞施用给药溶液。通常在时间＝15、30、60和90分钟连续地从尾动脉收集血样。通过如下述修改的免疫试验对血清bRNase A浓度进行定量。
核糖核酸酶A的生物素基化
为了用生物素分子标记每一个RNase A分子，使活化生物素的比率保持为3摩尔生物素/1摩尔RNase A。在各生物素基化反应中，将500mg RNase A溶于20ml 50mM NaHCO3，pH 7.6。将57.08mg EZ-连接磺基-NHS-LC-LC生物素(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)加到溶液，溶解并在冰上静置2小时。
然后在4℃下将反应混合物针对4升PBS进行透析(10,000MW截止透析膜(Pierce，Rockford，Illinois))过夜。将反应混合物置于4升新鲜的PBS中并再透析4小时。从透析膜中除去透析的bRNase A，用PBS将其稀释至25ml最终体积(最终bRNaseA浓度＝20mg/ml)，并在4℃下保存。
口服bRNase A的血清水平分析
一般地，将在100μl不同时间点收集的大鼠血清的等分试样置于96孔Reacti-Bind链霉亲和素包被的聚苯乙烯平板(Pierce)的适宜的孔中。2小时的培养时间之后，洗涤平板，然后与多克隆兔抗RNaseA(Chemicon，Pittsburgh，PA)一起温育。洗涤后，将平板与偶合到碱性磷酸酶上的多克隆山羊抗兔IgG(Chemicon，Pittsburgh，PA)一起温育2小时。温育后洗涤平板，并通过加入对硝基苯基磷酸酯(一种碱性磷酸酶的底物)(Pierce，Rockford，Illinois)检测最初捕获的bRNase A的数量。通过bRNAse A标准曲线比较对最初大鼠血清中循环的bRNaseA进行定量，所述标准曲线的范围为1000-0.1ng/mL的15份2倍稀释液。最大标准偏差如下表2给出。
表2-口递送RNAase递送试剂化合物递送试剂化合物剂量 (mg/kg) bRNAase剂量 (mg/kg) 体积剂量 (ml/kg)平均峰值血清 ng/ml
2c：口服递送BIBN4096BS
制备在水中的递送试剂化合物和降钙素基因相关的肽拮抗剂，1-哌啶甲酰胺，N-[2-[[5-氨基-1-[[4-(4-吡啶基)-1-哌嗪基)羰基]戊基]氨基]-1-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)甲基]-2-氧代乙基]-4(1，4-二氢-2-氧代-3(2H0-喹唑啉基)-.[R-(R*，S*)]-(BIBN4096BS)口管饲法(PO)给药溶液。通常在水制备递送试剂化合物的溶液并搅拌。通过将递送试剂化合物与BIBN4096BS储备溶液混合并稀释至目标体积(通常1.0mL)而制备最终的给药溶液。如果需要的话，通过加入等分试样的适宜当量浓度的盐酸水溶液调节混合物的pH，直至溶解的递送试剂化合物的最终pH低于7.0。每次给药最终化合物数量是在总体积1mL/kg中有25mg/kg BIBN4096BS和200mg/kg递送试剂化合物。
典型的给药和取样方案如下。将重量为大约200-250g的雄性Sprague-Dawley大鼠禁食24小时，在给药前15分钟施用氯胺酮(44mg/kg)和氯丙嗪(1.5mg/kg)。给5只动物的剂量组施用一种给药溶液。对于口管饲法(PO)给药，用11cm Rusch 8 French导管装配1ml带移液管末端的注射器。管通过导管抽吸溶液而使注射器充满给药溶液，然后将其擦干。将导管顺食道放置，在门牙后留出1cm管道。通过冲压注射器活塞施用给药溶液。对于口服，通常在时间＝0、15、30、45和60分钟连续地从尾动脉收集血样。通过使用液相色谱法/质谱法/使用UV检测的质谱分析法对血浆BIBN4096BS浓度进行定量。试验的标准范围为5-2,000ng/mL。前面的研究表明基线值为大约10ng/mL。最大值如下表3报道。
表3.BIBN4096BS口服递送 递送试剂化 合物递送试剂化合物 剂量(mg/kg)BIBN4096BS剂量 (mg/kg) 体积剂量 (ml/kg) 平均峰值血清 ±sd ng/ml 1(柠檬酸盐) 200 25 1 540±521 1(柠檬酸盐) 200 25 1 148±119 1(柠檬酸盐) 200 25 1 117±76 1(柠檬酸盐) 200 25 1 277±332 1(柠檬酸盐) 200 25 1 66±7 1(柠檬酸盐) 200 25 1 153±158 1(甲磺酸盐) 200 25 1 408±340 1(甲磺酸盐) 200 25 1 608±552 2 200 25 1 428±340 2 200 25 1 352±248 2 200 25 1 416±438 2 200 25 1 756±381 3 200 25 1 166±159 3 200 25 1 451±156 3 200 25 1 139±150 3 200 25 1 131±114 4 200 25 1 70±39 4 200 25 1 59±26 6 200 25 1 35±32 6 200 25 1 77±35 6 200 25 1 69±61 7 200 25 1 48±49 7 200 25 1 12±10 8 200 25 1 59±35 8 200 25 1 115±110 8 200 25 1 93±105 8 200 25 1 79±32
2d.口服递送达托霉素
2d.达托霉素-口服/结肠内递送
在0.9％生理盐水中制备含有递送试剂化合物和达托霉素(CubistPharmaceuticals，Cambridge，MA)的给药溶液。通过使用化合物的钠盐或通过将游离酸转化为钠盐而制备化合物的溶液。用一当量的氢氧化钠将递送试剂化合物的游离酸转化成钠盐。搅拌此混合物并将其置于超声波处理器(大约37℃)。用HCl或NaOH溶液调节pH至大约7.0-7.5。如果需要的话再加入NaOH以获得均一的溶解度，并再调节pH。将混合物搅拌产生均一溶液，如果需要还使用超声波处理。将递送试剂化合物溶液与来自储备溶液(200mg达托霉素/mL的0.9％生理盐水中，如果需要用NaOH或HCl调节pH至6.0-7.0)的达托霉素混合。将储备溶液包装在箔中冷冻(-20℃)保存，然后在使用前融解并逐渐加热至大约25℃。以低速搅拌递送试剂达托霉素混合物以产生均一溶液。用NaOH水溶液调节pH至大约7.0-7.5。然后0.9％生理盐将溶液稀释至目标体积(通常2.0ml)，并浓缩和在用前包在箔中保存。最终递送试剂化合物和达托霉素剂量和剂量体积如在下表4中列出。
典型的给药和取样方案如下。将重量为大约200-250g的雄性Sprague-Dawley大鼠禁食24小时，在给药前15分钟施用氯胺酮(44mg/kg)和氯丙嗪(1.5mg/kg)并再次按需要保持麻醉。给5只动物的剂量组施用一种给药溶液。对于口管饲法(PO)给药，用11cm Rusch 8French导管装配1ml带移液管末端的注射器。管通过导管抽吸溶液而使注射器充满给药溶液，然后将其擦干。将导管顺食道放置，在门牙后留出1cm管道。通过冲压注射器活塞施用给药溶液。对于结肠内(IC)给药，用7.5cm，8 fr Rusch导管装配1ml带移液管末端的注射器。将给药导管通过肛门插入结肠直至管子不再可见。通过冲压注射器活塞将给药溶液缓慢压进结肠。
通常在给药后0.25、0.5、0.75、1.0、2.0和4.0小时从腹侧尾动脉收集肝素化大鼠血样，并在冰上保存。然后在4℃下以11,500rpm将血样旋转(离心)4分钟得到血浆(上清液)，将其于-70℃下保存。通过等度反相HPLC测定血浆达托霉素浓度，分析期间保持4℃。空白血浆研究表示基线值零。
计算各时间点每组动物结果的平均值，并在表4中报道这些平均值中的最高值(即平均峰值达托霉素浓度，Cmax)。
表4.达托霉素-口服/结肠内递送 递送试剂 化合物给药途径递送试剂化合物剂量(mg/kg)达托霉素剂量 (mg/kg)体积剂量(ml/kg)平均血浆Cmax(达托霉素)±SD，μg/ml 1 口服 200 50 2 13.7±5.6 2 口服 200 50 2 15.3±9 3 口服 200 50 2 11.1±5.9 5 口服 200 50 2 15.76±3.4 5 口服 200 50 2 5.9±1.9 5 口服 200 50 2 13.6±7.54
*AUC＝总AUCH
**AUC＝AUC0→4小时
2e.口服递送人生长激素释放因子类似物(反式3-henxenoyl hGRFNH2)
在去离子水中制备递送试剂化合物和GRF类似物g(购自Theratechnologies，Quebec Canada美国专利5,861,379和美国专利6,020,311)的口服(PO)组合物。典型地，将500mg递送试剂化合物加到1.5ml水。通过以下方法将递送试剂化合物的游离碱转化成盐：将搅拌所得的溶液，并加入一当量的氯化氢。搅拌溶液，然后加热(在大约37℃下)并进行超声处理。用NaOH或HCl将pH调节至大约7至8.5。如果需要再加入NaOH或HCl以获得均一的溶解度，并将pH再调节至大约7至8.5。然后加入水以使总体积为大约2.4ml并搅拌。将大约25mg GRF-类似物储备溶液(50mg/ml，由100mg GRF-类似物和2ml去离子水制备，用HCl调节至pH4.0)加到溶液并通过颠倒进行混合。将溶液立即用于给药方案，或者可选择将溶液在37℃水浴中放置1小时，然后给药。
典型的给药和取样方案如下。将重量为大约200-250g的雄性Sprague-Dawley大鼠禁食24小时，在给药前15分钟施用氯胺酮(44mg/kg)和氯丙嗪(1.5mg/kg)并再次按需要保持麻醉。给5只动物的剂量组施用一种给药溶液。对于口管饲法(PO)给药，用11cm Rusch 8French导管装配1ml带移液管末端的注射器。管通过导管抽吸溶液而使注射器充满给药溶液，然后将其擦干。将导管顺食道放置，在门牙后留出1cm管道。通过冲压注射器活塞施用给药溶液。
通常在给药后0、15、30、60和120分连续地从尾动脉收集血样。通过RIA(第一抗体Peninsula Labs，RIN 8061；第二抗体LincoResearch Labs，5060-10)测定血浆GRF-类似物水平。测定每个时间点各给药组的5只动物中每只动物的血浆GRF-类似物浓度(pg/ml)。计算各时间点5个数值的平均值，并将结果绘制成血浆GRF类似物浓度对时间的图。最大值(峰值)在以下表5中报道。
表5.人生长激素释放因子类似物(反式3-henenoyl hGRF NH2)递送 递送试剂化 合物给药途径递送试剂化合物剂量(mg/kg) hGRF剂量 (mg/kg) 体积剂量 (ml/kg) 平均血浆Cmax(达托 霉素)±SD，μg/ml 1(柠檬酸盐) 口服 200 10 2 194±388 1(甲磺酸盐) 口服 200 10 2 1.21×105±1.45×105 1(甲磺酸盐) 口服 200 10 2 1.84×104±4544 1(甲磺酸盐) 口服 200 10 2 1.39×104±5237 1(甲磺酸盐) 口服 200 10 2 2.69×105±1.19×104 2 口服 200 10 2 1.57×105±1.37×105 2 口服 200 10 2 1.92×105±1.66×105 2 口服 200 10 2 1.46×105±1.26×105 3 口服 200 10 2 781±1469 3 口服 200 10 2 1.43×105±1.19×105 3 口服 200 10 2 2.28×105±1.09×105 3 口服 200 10 2 2.10×104±1.53×104 5 口服 200 10 2 22,709±13,067 5 口服 200 10 2 1.78×104±3.20×104 5 口服 200 10 2 4911±3250 5 口服 200 10 2 1.43×104±1.39×104 5 口服 200 10 2 8.12×104±1.63×105 10 口服 200 10 2 3848±995
2f.干扰素-口递送
在去离子水中制备递送试剂化合物和干扰素alfacon-1(IFN)(购自InterMune，Inc.of Brisbane，CA的Infergan)的给药溶液。用一当量的氢氧化钠将递送试剂化合物的游离酸转化成钠盐。通常在水中制备递送试剂化合物溶液，并搅拌，制备钠盐时加入一当量氢氧化钠(1.0N)。搅拌此混合物，并将其置于超声波处理器(大约37℃)。用NaOH水溶液调节pH至大约7.0-8.5。搅拌混合物产生均一的悬浮液或溶液，如果需要还可使用超声波处理和热。如果需要再加入NaOH以得到均的一溶解度，并将pH再调节至大约7.0-8.5。将递送试剂化合物溶液与IFN储备溶液(大约22.0-27.5mg/ml，在磷酸盐缓冲盐水中)混合，并稀释至目标体积(通常3.0ml)。最终递送试剂化合物和IFN剂量以有剂量体积如下表6所示。
典型的给药和取样方案如下。将重量为大约200-250g的雄性Sprague-Dawley大鼠禁食24小时，在给药前15分钟施用氯胺酮(44mg/kg)和氯丙嗪(1.5mg/kg)并再次按需要保持麻醉。给5只动物的剂量组施用一种给药溶液。对于口管饲法(PO)给药，用11cm Rusch 8French导管装配1ml带移液管末端的注射器。管通过导管抽吸溶液而使注射器充满给药溶液，然后将其擦干。将导管顺食道放置，在门牙后留出1cm管道。通过冲压注射器活塞施用给药溶液。
通常在给药后0、15、30、45、60和90分连续地从尾动脉收集血样。使用用于人IFN-alpha的Cytoscreen免疫分析试剂盒(目录号#KHC4012，购自Biosource International，Camarillo，CA)对血清IFN浓度进行定量。前面的研究表明基线值为大约0。在每个时间点计算各组动物结果的平均值。将这些平均值的最大值(即平均峰值血清IFN浓度)在以下表6中报道。
表6.干扰素-口服递送递送试剂 化合物递送试剂化合物剂量 (mg/kg) IFN剂量 (mg/kg) 体积剂量 (ml/kg) 平均峰值[IFN](血清ng/ml)±SD 8 200 1 1 0±0
借此全部引入上述专利、申请、试验方法和出版物作为参考。
根据以上详细描述，将启发本领域技术人员本发明的许多改型。所有这些显而易见的改型在所附权利要求书的充分预期的保护范围之内。