用免疫调节性非内源性促孕激素化合物预防流产 在所有可临床鉴别的妊娠中，15％会发生自发性流产(流产)。世界卫生组织(WHO，1977)对自发性流产的定义为“从母体娩出或取出重量等于或小于500g的胚胎或胎儿”。自发性流产是妊娠最常见的并发症。50-60％的自发妊娠失败可以用胎儿染色体异常、感染性病因或母体内分泌学或解剖学共发病来解释。但仍有40-50％的自发妊娠失败“原因不明”。
在原因不明的妊娠失败的病例中，最实用且最有疗效的治疗干预方法是施用去氢孕酮(Duphaston)。去氢孕酮是口服的活性孕酮(＝非内源性促孕激素化合物)。近年来，一些临床实验显示了去氢孕酮在治疗习惯性和先兆流产上的功效。目前已经在超过90个国家中使用Duphaston，并且已有超过2千6百万名患者年的累积暴露该药物。大约7百万经去氢孕酮治疗的患者很可能或已被证实在子宫内具有药物。
直至近年来，“原因不明的病例”的复发性妊娠失败仍被认为是一种由于非接受性、不协调性子宫内膜所致的植入失败。由于黄体生成孕酮的不足所导致的黄体期缺陷原先被认为是对其它原因不明的不孕病例的病因解释。去氢孕酮对自发或习惯性流产高风险女性的有益影响因此被认为是对内源性孕酮缺乏的简单代偿。因此，现在通常仅在妊娠得到医学鉴别后施用去氢孕酮和其它孕酮，即所述药物的施用通常仅开始于受精后三或四周。
近年来，不断积累的证据已经表明内源性孕酮可能在成功妊娠早期对建立有效免疫应答发挥重要作用。由于亲本遗传的因素，胎儿-胎盘部分相当于半同种异体移植物。妊娠的免疫识别和随后母体免疫系统的活化是成功妊娠所必需的。在足量孕酮作用下，例如胎盘细胞和脱落的CD56+细胞中的活化淋巴细胞能合成孕酮诱导地封闭因子(PIBF)，该因子是具有实质性抗流产活性的递质。PIBF改变了经活化的淋巴细胞的细胞因子分泌模式。非炎性、非细胞毒性白细胞介素(例如，IL-3，IL-4，IL-10)的生成增加，而前炎性、细胞毒性细胞因子(例如，IFN-γ、TNFα、IL-2)降低。PIBF能通过阻断自然杀伤细胞(natural killer(NK)cell)的脱粒和穿孔素释放而抑制自然杀伤细胞的细胞毒性。其还能抑制由IFN-γ、TNFα和IL-2介导的NK细胞转化为毒性淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。
已知T辅助细胞(Thelper cells)(＝Th细胞)作为人类细胞免疫系统的基本组成，还在免疫疾病状态中发挥极其重要作用。Th细胞可分化为两种诱导不同效应物应答类型的不同的极化形式，即Th1细胞和Th2细胞。Th细胞能生成并释放(分泌)细胞因子。免疫系统内的信息处理很大程度上要依赖于细胞因子的生成并释放。
细胞因子可根据其对免疫应答的影响而被分为两类。由Th1细胞分泌的Th1细胞因子(例如肿瘤坏死因子(＝TNF)α，干扰素-(＝IFN)γ，白细胞介素(＝IL)-2，IL-12，IL-18)，该因子诱导某些细胞介导的细胞毒性和炎性反应。因此细胞因子释放所构成的细胞毒性和炎性模式在Th1免疫应答模式中占主导地位。由Th2细胞分泌的Th2细胞因子(例如，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-13)，与B细胞抗体的生成有关。Th2细胞因子下调Th1型反应。因此细胞因子抗炎模式在Th2主导的免疫应答模式中占主导地位。
已知特定的免疫疾病状态与特定的病理免疫应答模式(一般指“Th1免疫应答模式”)相关。所述免疫疾病状态为，例如自身免疫病如类风湿性关节炎和多发性硬化症或组织和/或骨髓移植后的急性排斥反应状态。已知，胎盘中的活化淋巴细胞和外周血中的外周血单核细胞(＝PBMC)以免疫调节的，即抗流产的方式进行反应。非炎性、非细胞毒性白细胞介素(例如，IL-3，IL-4，IL-10；“Th2模式”)的生成增加，而前炎性、细胞毒性细胞因子(例如，IFN-γ，TNFα，IL-2，“Th1模式”)降低。例如，在成功的妊娠中，正常的模式为Th2-型免疫，而移向Th1-主导被认为与原因不明的习惯性流产有关。
已知孕酮能抑制复发性妊娠失败的女性滋养细胞的体外胚毒性Th1细胞因子的生成(参见B.C.Choi，K.Polgar，L.Xiao，J.A.Hill，Human Reproduction 15/1(2000)46-59)。因此孕酮量可能在体外诱导了从Th1免疫应答模式向Th2免疫应答模式的转移。
但是，孕酮并非高选择性内源性递质。例如孕酮，除结合人类孕酮受体外，还已知与糖皮质激素竞争糖皮质激素受体。此外，孕酮目前的代谢物(例如12α-羟基孕酮、雄甾烯二酮、睾酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮质醇、18-羟基皮质酮和醛甾酮)具有多种十分不同的活性。特别是，皮质类固醇代谢物对免疫系统具有很强的影响。这些皮质激素是一类能够影响糖类代谢(糖异生、肝糖原积累、血糖升高)的类固醇，其抑制促肾上腺皮质激素分泌且甚至具有可观的抗炎性活性。其还在脂肪和蛋白质代谢、保持动脉血压、结缔组织的改造以应答损伤、降低循环淋巴细胞数量、以及中枢神经系统功能中发挥作用。
令人惊奇地发现，去氢孕酮能够通过以下方式影响Th1主导的免疫应答模式，所述方式为Th2免疫应答以更强的影响而占优，并由此去氢孕酮显示出对于特征为Th1主导的免疫应答模式的免疫疾病状态具有有益的影响。
去氢孕酮是一种口服活性孕酮，其分子结构与内源性孕酮相似，但与孕酮不同的是，其可作为高选择性孕酮受体激动剂。此外，已知去氢孕酮的代谢物或者也是人类孕酮受体的选择性激动剂，或者不具备活性。因此可推出任何被去氢孕酮触发的生理效应通常借助孕酮受体介导。因此，去氢孕酮以其对于特征为Th1主导的免疫应答模式的免疫疾病状态具有有益效应作为人类孕酮受体激动剂的所有非内源性促孕激素化合物类的实例。由于根据本发明已经鉴定了所述非内源性促孕激素化合物在妊娠中所起的免疫作用，就非常需要不仅从医学鉴别出妊娠或甚至更迟的时日开始，还应早至从排卵时就开始将所述非内源促孕激素化合物施用给女性患者。对高风险地面临自发或习惯性流产的女性患者早期施用根据本发明的所述非内源性促孕激素化合物具有特别的好处。
因此本发明的目的是提供治疗或预防自发或习惯性流产的方法，所述方法包括从排卵时起，对需要所述治疗的女性患者施以有效量的至少一种非内源性促孕激素化合物。
在本发明的一个特定方面，还提供了通过鉴别以病理性Th1主导的免疫应答模式应答适宜刺激的女性个体而预选择合适的高风险地面临自发或习惯性流产的女性患者。所述适宜刺激优选为有丝分裂原诱导的刺激。
在本发明的另一个特定方面，鉴别所述女性个体的方法包括如下步骤：
a)从所述女性个体中获取外周血单核细胞(＝PBMC)，
b)用提取自滋养层的蛋白质培养所述PBMC，
c)测定所得PBMC培养物的上清液中Th1和Th2细胞因子的浓度和
d)计算各女性个体的Th1/Th2细胞因子比率。
适用的能作为人类孕酮受体激动剂的非内源性促孕激素化合物优选为非雄性激素的、非内源性促孕激素化合物，其典型实例选自如下化合物：去氧孕烯、二甲炔睾酮、去氢孕酮、炔诺醇或双醋炔诺醇、依托孕烯、孕二烯酮、羟基孕酮或己酸羟基孕酮、地索高诺酮、利奈孕酮、美屈孕酮、甲羟孕酮或醋酸甲羟孕酮、甲地孕酮或醋酸甲地孕酮、nestorone、诺美孕酮或醋酸诺美孕酮、诺孕酯、异炔诺酮、诺孕烯酮、普美孕酮、奎孕醇或醋酸奎孕醇和三甲孕酮。
去氢孕酮是针对人类孕酮受体的高选择性激动剂，而某些其它所引用的孕酮中表现至少部分副反应如雄激素/抗雄激素效应、雌激素/抗雌激素效应、糖皮质激素/抗糖皮质激素效应和/或盐皮质激素/抗盐皮质激素效应。另外，与大量其它合成孕酮不同，去氢孕酮在母体内的不会产生雄激素效应(例如，多毛、声音改变、痤疮等)，且不会产生使女性胎儿发生雄性化的效应。因此去氢孕酮优选作为非内源性促孕激素化合物。
女性根据已知方法可以确定其排卵期。从受精时起即按医嘱开始治疗也能产生良好的效果，但优选从排卵时即开始治疗。
下述药理学实验中显示了根据本发明的非内源性促孕激素化合物，特别是去氢孕酮，作用于Th1主导的免疫应答的效果。
药理学实验方法
建立起去氢孕酮作用于有丝分裂原刺激的外周血单核细胞(＝PBMC)所产生的Th1和Th2细胞因子模式的效果。在来自原因不明习惯性流产的女性的外周血淋巴细胞中检测去氢孕酮作用于Th1和Th2细胞因子生成的效果。于存在以及不存在去氢孕酮的情况下，用有丝分裂原(植物血凝素)体外刺激外周血单核细胞。培养96小时后测定分泌的细胞因子水平。去氢孕酮强烈抑制了Th1细胞因子IFN-γ的生成，而提高了IL-4和IL-6的水平。
针对妊娠期间女性中细胞因子模式的偏向已经进行了一些实验。通过在外周T细胞中的改变、通过由外周淋巴细胞生成的细胞因子和由细胞因子在母婴界面的改变表明妊娠与移向Th2的偏向相关。原因不明的复发性自发妊娠流产(URSA)看上去与向Th1细胞因子的强偏向有关。前期诊断为URSA的女性因此可被认为是预选择患者组，其通过显示Th1主导模式的免疫应答而典型地应答免疫刺激。因此采用合适的URSA组实施药理学实验，所述合适的URSA组包括被确认自发妊娠流产的女性(i)测试前至少发生2次不明原因流产的女性，(ii)正处在至少第三次流产中的女性和(iii)已经做过完整检查的女性。
测试了54名正常妊娠女性(之前至少3次正常妊娠)和23名原因不明习惯性流产史的女性(URSA组)中习惯性流产和细胞因子生成应答之间的关系。
外周血单核细胞(PBMC)的有丝分裂原诱导的刺激：
于流产日从流产组中采用静脉穿刺获得外周血。通过Ficoll-paque(Pharmacia Biotech，Sweden)密度梯度离心分离PBMC，在包含10％胎牛血清的RPMI培养基(＝″Roswell Park Memorial Institute″-培养基；获自GIBCO/BRL，USA)中形成悬液，等分加于96孔组织培养板上，细胞密度为100000细胞每孔，然后用浓度为5mg/ml的有丝分裂原-植物血凝素(＝PHA，Sigma Chemicals，USA)刺激96小时，和用自体同源胎盘抗原或用滋养细胞抗原。按下述不同的组合加入孕酮、去氢孕酮(Duphaston)和RU486(＝米非司酮)。以10-3ml/L、10-5ml/L和10-7ml/L的浓度测定孕酮。以等当量浓度测定RU486。于96小时收集培养基上清液，用以检测PBMC向上清液中分泌的细胞因子的水平。采用酶联免疫吸附试验(＝ELISA)测定上清液中的细胞因子水平。
实验样品的记录：
每一样品均按下述方法进行实验：
PBMC+有丝分裂原
PBMC+有丝分裂原+孕酮
PBMC+有丝分裂原+孕酮+RU486
PBMC+有丝分裂原+去氢孕酮
PBMC+有丝分裂原+去氢孕酮+RU486
PBMC+有丝分裂原+载体
PBMC+有丝分裂原+载体+RU486
采用ELISA测定细胞因子水平：
使用获自Immunotech SA，France的试剂盒实施ELISA来测定这些样品中的Th1细胞因子TNF-α和IFN-γ，以及Th2细胞因子IL-4、IL-6和IL-10。这包括“夹心ELISA(sandwich ELISA)”：简而言之，第一个步骤导致通过结合在微量滴定板的孔上的单克隆抗细胞因子抗体捕捉相关细胞因子。在第二个步骤中，加入第二种生物素化的单克隆抗体与链霉抗生物素-酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)缀合物。生物素化抗体与固相抗体-抗原复合物结合，并依次，结合缀合物。在诱导后，冲洗孔，并借助生物素结合链霉抗生物素-酶，然后加入显色底物。所产生的着色强度与样品中的细胞因子的浓度成正比。使用重组细胞因子作为参照，绘制每一细胞因子的标准曲线，然后从这些曲线中读取结果。每个实验的敏感性均为：5pg/ml TNF-a，0.08IU/ml IFN-γ，5pg/ml IL-4和5pg/ml IL-10。通过各个样品的T-检验分析结果。
细胞因子水平在正常妊娠妊娠女性和习惯性流产的女性之间具有显著性差异。正常妊娠女性显示出较高Th2偏向，而有习惯性流产史的女性显示出向Th1反应活性的偏向。根据上述药理学测试报道的离体实验的结果显示了对自发妊娠流产女性和习惯性流产的女性施用去氢孕酮(Duphaston)降低了淋巴细胞活性，导致Th1向Th2的偏向(IFN-γ的降低和白细胞介素4和6的显著增加可作为证据)，并且孕酮释放的增加诱导了阻遏因子(PIBF)(一种34kDA的蛋白质)。PIBF是随后的免疫应答中的分子递质。
上述药理学测试方法的结果也能在使用妊娠小鼠的体内实验模型中得以证实。在鼠紧张诱发流产模型中，显示了Th1向Th2细胞因子生成的迁移。对5日孕龄的妊娠小鼠施加超声。该紧张将这些小鼠的流产率从约12％增加至44％。用脱氢孕治疗后，以剂量相关性模式将流产降低至5％。所述治疗导致了IL-4水平的增加。
根据本发明的非内源性促孕激素化合物可以常规药物制剂进行施用。使用剂量可按个体而改变，并通常根据欲治疗的疾病类型以及所使用的活性物质的性质而改变。但是大体上，用于施用于人类和大型哺乳动物时的适用药物剂型为2，5～100mg/每个体每日，特别是在当由于去氢孕酮良好的耐受性和安全性而用作非内源性促孕激素化合物时。通常每日个体剂量含有非内源性促孕激素化合物5～60mg。
优选口服所述化合物，但也可以借助其它通常用于激素替代疗法中的传统途径进行给药，例如，阴道内的或经皮的途径。化合物可联合常规药物辅助剂和/或载体而被制成固体或液体的药物制剂。固体制剂的实例为能口服给药的制剂，如片剂、包衣片剂、胶囊、粉剂或粒剂、或可选择的栓剂。这些制剂可包含常规药物无机和/或有机载体，如滑石粉、乳糖或淀粉，还包含常规药物辅助剂，例如润滑剂或片剂崩解剂。液体制剂如所述活性物质的悬液或乳剂可包含常用的稀释剂，如水、油和/或悬浊剂如聚乙二醇等。也可以加入其它辅助剂，如防腐剂、调味剂等。
可按照已知的方法将所述活性物质与药物辅助剂和/或载体混合并进行配制。为制备固体药物剂型，例如可将所述活性物质与辅助剂和/或载体按常规方法混合，并可进行湿性或干燥颗粒化。颗粒或粉末可按照常规方法直接注入胶囊或压制入片剂核。如有需要，可按照已知方法对其包衣。
适用的药物制剂的其它实例为用于局部和/或经皮的递送药剂如凝胶剂、软膏或皮肤贴片剂和/或用于阴道内给药的制剂、用于鼻内给药的制剂如喷雾剂或适用于注射给药的制剂如长效注射剂或植入物。