产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母及其筛选方法 【技术领域】
本发明涉及产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株、筛选该酵母菌株的方法及利用该酵母菌株细胞的食品。从其中产生的γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸可用于食品领域中。
背景技术
半胱氨酸是为了增强食品的味道等目的而应用的。已知的半胱氨酸生产方法包括如蛋白质酶解方法和半合成的方法。目前应用的方法大体上是蛋白酶解方法和半合成的方法。尽管为了应用它们以增强食品味道的目的而需要具有高半胱氨酸含量的天然食品材料，但很少这种天然食品材料是已知的。另一方面，人们已报道对含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母提取物的热-或酶-处理可导致具有高半胱氨酸含量地食品材料(WO 00/30474)。
γ-谷氨酰半胱氨酸通过γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的功能从作为底物的半胱氨酸和谷氨酸合成。另一方面，谷胱甘肽通过谷胱甘肽合成酶的功能从作为底物的γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成。人们已报道谷胱甘肽合成酶基因被破坏的酵母可累积γ-谷氨酰半胱氨酸(Otake，Y.等人，Agric.Biol.Chem.，54(12)，3145-3150，1990)。
作为筛选已丧失谷胱甘肽合成酶活性的酵母的方法，应用甲基乙二醛敏感性作为表型的方法是已知的(Otake，Y.等人，Agric.Biol.Chem.，54(12)，3145-3150，1990)。根据该报道，从300个甲基乙二醛敏感性菌株中选择了12个不能产生谷胱甘肽的菌株。该报道进一步陈述进一步的分析显示8个菌株是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶突变型，而剩余的4个是谷胱甘肽合成酶突变型。在该筛选方法中，75个甲基乙二醛敏感性菌株中有1个菌株是谷胱甘肽合成酶活性的突变型。因此，粗略地看，该方法似乎是γ-谷氨酰半胱氨酸高累积性酵母的简单筛选方法。然而，由于对从中选择出上述300个甲基乙二醛敏感性酵母的菌株的数目未作描述，所以应用甲基乙二醛敏感性作为表型的筛选方法不能认为是含有高γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母的简单筛选方法。此外，在将甲基乙二醛敏感性用作表型的情形中，需要困难的复制操作。从此观点看，根本不能认为这是简单的筛选方法。
附带地，已知利用MNNG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)抗性的方法是筛选谷胱甘肽缺陷型菌株的方法(Kistler，M等人，MutationResearch，173(1986)117-120；Kistler，M等人，Mutagenesis，5(1)39-44，1990)。根据该方法，所有获得的酵母均丧失了γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性，但未获得具有降低的谷胱甘肽合成酶活性的菌株。已知利用硝普酸钠的方法是筛选谷胱甘肽缺陷型菌株的另一种方法。据报道同样在该情形中，获得的酵母均是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶突变型(Kistler，M等人，Mutagenesis，5(1)39-44，1990)。
发明公开
在上述技术背景中，本发明的一个目的是提供具有降低的谷胱甘肽合成酶活性并产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母，和这种酵母的简单筛选方法以及利用这种酵母菌株的含有γ-谷氨酰半胱氨酸的食品。
在这些情况下，本发明者已进行了大量研究，且作为结果，他们已发现对用作表型的一定浓度MNNG的抗性使得能够对具有降低的谷胱甘肽合成酶活性且具有γ-谷氨酰半胱氨酸生产力的菌株进行选择，因此实现了本发明。
即，本发明如下。
(1)一种对MNNG具有抗性且产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株。
(2)根据(1)的酵母菌株，其中该菌株具有如下面公式计算的0.03或更大的生长程度：
生长程度＝
当培养于含MNNG的培养基中时培养基的OD660/当培养于不含MNNG的培养基中时培养基的OD660
当收集在液体培养基中预先培养的酵母菌株并将其接种于含有30μg/ml MNNG的YPD培养基(含MNNG的培养基)和不含MNNG的YPD培养基(不含MNNG的培养基)中，使每一种培养基在660nm的吸收(OD660)为0.1，然后将该菌株在适当的温度进行固定培养(standing culture)的时候。
(3)一种根据(1)或(2)的酵母菌株，其中该菌株具有降低的谷胱甘肽合成酶活性。
(4)一种根据(1)～(3)中任何一项的酵母菌株，其中当培养于SD培养基中时，对数生长期中每个干细胞的γ-谷氨酰半胱氨酸含量按重量计算为1％或更多。
(5)一种根据(1)～(4)中任何一项的酵母菌株，其中该菌株具有二倍性或更多倍性。
(6)一种根据(1)～(5)中任何一项的酵母菌株，其中该菌株属于酵母属(Saccharomyces)。
(7)一种筛选具有对MNNG的抗性和γ-谷氨酰半胱氨酸生产力的酵母菌株的方法，该方法包括步骤：
(a)从大量酵母中选择对一定浓度范围的MNNG有抗性的酵母菌株；和
(b)从选择的菌株中筛选具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰半胱氨酸生产力的菌株。
(8)一种根据(7)的方法，其中在步骤(a)中，大量酵母是通过将亲代酵母菌株进行突变处理而制备的。
(9)一种根据(7)或(8)的方法，其中在步骤(a)中，对一定浓度范围的MNNG有抗性的酵母菌株是用琼脂培养基进行选择的，在该培养基上已形成了MNNG的浓度梯度。
(10)一种根据(7)～(9)中任何一项的方法，其中在步骤(a)中，提供了以前分离的具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰半胱氨酸生产力的酵母模型菌株，并选择了与模型菌株有相同水平的对MNNG的抗性的酵母菌株。
(11)一种包括通过在适当条件下培养根据(1)～(6)中任何一项的酵母菌株获得的培养物的食品或饮料，或者含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培养物的分级分离产物，或者在其中已通过热处理而产生半胱氨酸的培养物或分级分离产物。
(12)一种根据(11)的食品或饮料，其中该食品或饮料是含酒精的饮料、面包食品或发酵的食品调味品。
(13)一种应用培养物产生的酵母提取物，所述培养物通过在适当条件下培养根据(1)～(6)中任何一项的酵母获得。
(14)一种生产含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的食品的方法，该方法包含以下步骤：培养根据(1)～(6)中任何一项的酵母菌株，将获得的培养物或其分级分离产物，或者进行了热处理的培养物或其分级分离产物，与饮料或食品原材料混合，并将该混合物加工为食品或饮料。
在下文中将对本发明进行详细描述。
本发明的酵母菌株是对MNNG有抗性且可产生γ-谷氨酰半胱氨酸的菌株。
在本发明中，“对MNNG有抗性”指在一定浓度MNNG存在时显示比野生菌株更好的生长。然而，并不需要在存在和不存在MNNG时显示相同程度的生长。换句话说，如果在存在MNNG时其生长比野生菌株的生长更好，那么尽管与不存在MNNG时相比在存在MNNG时生长不佳，都认为该菌株具有MNNG抗性。一般地，“对MNNG有抗性”指当收集在液体培养基中预先培养的酵母菌株并将其接种于含有30μg/ml MNNG的YPD培养基(含MNNG的培养基)和不含MNNG的YPD培养基(不含MNNG的培养基)中，从而每一种培养基在660nm的吸收(OD660)为0.1，并然后将该菌株在适当的温度进行固定培养时，由如下公式计算的生长程度为0.03或更大，优选地为0.04或更大，更优选地为0.05或更大。
生长程度＝
当培养于含MNNG的培养基中时培养基的OD660/当培养于不含MNNG的培养基中时培养基的OD660
此外，人们认为生长程度为0.015或更大、优选地为0.02或更大、更优选地为0.025或更大的酵母菌株对MNNG有抗性，该酵母菌株的生长程度除应用MNNG浓度为60μg/ml而不是30μg/ml的含MNNG的培养基之外是以与如上所述相同的方式计算的。
应注意到过高的MNNG抗性显示γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶缺陷的高可能性，从而优选的是MNNG抗性不高于所必需的。特定地，例如，当MNNG浓度为30μg/ml时，生长程度预期为1.0或更小，优选地为0.2或更小，更优选地为0.075或更小。
用于上述预先培养的培养基包括YPD培养基。该预先培养可为振荡培养或固定培养，其中振荡培养是优选的。用于主要培养中的培养基包括YPD培养基。该主要培养可为振荡培养或固定培养，其中固定培养是优选的。
适合于培养的温度可依赖于酵母或菌株的类型而变化，且可通过将酵母接种于适当培养基如YPD培养基上、在各种温度对其进行培养并检查生长良好的温度范围而确定。例如，对于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，通常接近30℃的温度是优选的。培养时间是不特别限制的，但优选的是该培养在不超过对数生长期的培养阶段进行，优选地为直到对数生长期中期到对数生长期晚期。具体地，通常为约20～40小时。
在本发明中，“产生γ-谷氨酰半胱氨酸”指在细胞中以比野生酵母菌株更大的量累积γ-谷氨酰半胱氨酸。优选地，当酵母细胞在SD培养基中培养时，它指在其对数生长期每个干细胞累积1％或更多的γ-谷氨酰半胱氨酸，更优选地为1.5％或更多，且特别优选地是当酵母菌株在SD培养基中培养时累积γ-谷氨酰半胱氨酸而同时谷胱甘肽的累积量为0.1％或更少。γ-谷氨酰半胱氨酸或谷胱甘肽的累积量指γ-谷氨酰半胱氨酸或谷胱甘肽关于细胞的固体成分的含量(％)，该固体成分如在105℃加热4小时后细胞的重量。术语“对数生长期”指在培养过程中酵母细胞数目关于培养时间对数增加的阶段。
不必贯穿整个对数生长期维持上述的γ-谷氨酰半胱氨酸累积量，而仅仅需要在对数生长期时间中的至少一个任选点显示上述值，优选地为在对数生长期的下面状态中。即，上述状态是具有不小于以下液体培养基吸收的1/2的吸收的对数生长期，所述液体培养基处于培养从对数生长期改变为稳定期时的状态。
YPD培养基和SD培养基的组成如下。
[YPD培养基组成]
葡萄糖 2％
蛋白胨 1％
酵母提取物 0.5％
(pH5.0)
[SD培养基组成]
葡萄糖 2％
含氮碱基 1-倍浓度
(10-倍浓度的含氮碱基是1.7g不含氨基酸和硫酸铵的细菌用酵母含氮碱基(Difco Laboratories，Inc.)和5g硫酸铵溶于100ml已灭菌的水中的混合物，将其调节到pH5.2并通过滤器过滤进行灭菌)。
本发明的酵母是不特别限制的，只要它可产生γ-谷氨酰半胱氨酸。特定地，它包括属于酵母属如酿酒酵母的酵母、属于裂殖酵母属(Schizosacchromyces)如粟酒裂殖酵母(Schizosacchromyces pombe)的酵母等。考虑到良好的生长，本发明的酵母菌株优选地具有二倍性或更多的多倍性。
具有二倍性或更多多倍性的酵母可通过如下方法获得，即通过对它们进行突变处理并选择产生γ-谷氨酰半胱氨酸的菌株，或者通过使得用于繁殖产生γ-谷氨酰半胱氨酸的菌株的单倍体酵母与带有野生型谷胱甘肽合成酶的单倍体菌株进行杂交，使得获得的二倍体酵母形成孢子从而选择具有降低的谷胱甘肽合成酶活性且产生γ-谷氨酰半胱氨酸的菌株，然后使两个具有不同交配型的产生γ-谷氨酰半胱氨酸的单倍体酵母菌株相互进行杂交。以相似的方式可获得具有三倍性或更多多倍性的酵母。
如上所述，本发明的酵母菌株对MNNG有抗性且产生γ-谷氨酰半胱氨酸。这种酵母菌株不丧失γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性但具有降低的谷胱甘肽合成酶活性。作为结果，它可在细胞中累积γ-谷氨酰半胱氨酸。
术语“具有降低的谷胱甘肽合成酶活性”指本发明酵母菌株的谷胱甘肽合成酶活性低于野生菌株的，包括活性丧失的情形。然而，优选的是本发明的酵母菌株保持低于野生菌株的谷胱甘肽合成酶活性而不是该菌株丧失谷胱甘肽合成酶活性。
如上所述的酵母菌株可通过如下步骤进行筛选。
(a)从大量酵母中选择对一定浓度范围的MNNG有抗性的酵母菌株，和
(b)从选择的菌株中选择具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰半胱氨酸生产力的菌株。
对一定浓度范围的MNNG有抗性的酵母菌株可通过如将酵母培养于含有各种MNNG浓度的液体培养基中或琼脂培养基上并检查其生长而进行选择。显示比野生菌株更好生长的菌株对MNNG有抗性。可选择地，也可将在其上形成了MNNG浓度梯度的琼脂培养基用于进行选择。MNNG的浓度梯度可通过在琼脂培养基上放置用MNNG溶液浸渗的盘而形成，该MNNG溶液如浓度为1～30mg/ml的MNNG溶液。离该盘越远，培养基中MNNG的浓度越低。因此，作为本发明目的在琼脂培养基中接种大量酵母并在将该盘放置于培养基中央后进行培养使得能够检查许多酵母对各种MNNG浓度的抗性。要在培养基上接种的酵母接种量优选地为这样的量，即出现的菌落不相互接触，且特定地，每个平板约100～约200个细胞是优选的。
术语“对一定浓度范围的MNNG有抗性”指有关菌株在存在一定浓度的MNNG时比野生菌株生长良好，但在存在高于该浓度的MNNG浓度时不能生长。因而，对不具有过高MNNG抗性但具有中等MNNG抗性的菌株的选择使得能够对如下菌株进行有效选择，该菌株不丧失γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶且具有降低的谷胱甘肽合成酶活性。对一定浓度范围的MNNG有抗性的酵母在琼脂培养基上距离该盘一定距离的位置形成了菌落，在该培养基上形成了MNNG浓度梯度。不必对要选择的酵母菌株显示抗性的MNNG浓度进行鉴定，但该浓度可为相对值，如在琼脂培养基上距离该盘的距离。
对优选浓度范围的MNNG有抗性的酵母菌株可通过提供以前选择的酵母菌株作为模型菌株并选择具有与该模型菌株相同水平的MNNG抗性的酵母菌株而获得，该以前选择的酵母菌株具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰半胱氨酸生产力。在应用已在其上形成了MNNG浓度梯度的琼脂培养基的情形中，选择了如下菌株，该菌株中盘和菌落之间的距离与模型菌株的为相同的水平。通过这种方式，与野生菌株相比，应用模型菌株作为对照使得能够对不丧失γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性且具有降低的谷胱甘肽合成酶活性的酵母菌株进行有效选择。
作为模型菌株，可提及酿酒酵母Nα3菌株，其中由染色体上的谷胱甘肽合成酶基因编码的谷胱甘肽合成酶缺失了由位置370的精氨酸残基及其后面部分组成的C-末端区域。该菌株具有降低的谷胱甘肽合成酶活性。
此外，一旦获得了具有降低的谷胱甘肽合成酶活性及γ-谷氨酰半胱氨酸生产力的酵母菌株，那么可应用显示菌株的MNNG抗性的MNNG浓度作为指数而不应用任何模型菌株即可进行选择。
“大量酵母(mass of yeast)”可为包括大量不同属或物种的酵母或包括其各种突变型的相同物种的酵母。要进行选择的酵母菌株可为进行人工突变处理的菌株或自发突变型菌株。该大量酵母优选地通过将作为亲代菌株的野生型酵母菌株或其具有适当突变的突变型进行突变处理而制备。可选择地，该大量酵母可为一种在其中已引入了谷胱甘肽合成酶基因的酵母转化体，在该谷胱甘肽合成酶基因中引入了特定的突变或随机突变。
本发明的酵母菌株可通过组合突变处理与筛选步骤而获得。
突变处理包括如下方法，其中应用紫外线辐射或通常用于突变处理中的诱变剂的处理是优选的，该诱变剂如MNNG、甲基磺酸乙酯(EMS)或甲基甲磺酸(MMS)。
从如上所述选择的菌株中选择了具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰半胱氨酸生产力的菌株。同样地，优选的是对选择的菌株的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性进行测量以证实该菌株保持该酶的活性。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性和谷胱甘肽合成酶活性可分别通过Jackson的方法(Jackson，R.C.，Biochem.J.，111，309(1969))和Gushima等人的方法(Gushima，T.等人，J.Appl.Biochem.，5，210(1983))进行测量。同样地，对γ-谷氨酰半胱氨酸生产力的检查使得能够证实保持了γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性并降低了谷胱甘肽合成酶活性。此外，对在不含谷胱甘肽的培养基上的生长的检查使得能够证实谷胱甘肽合成酶活性是降低的还是丧失的。
通过在适当条件下培养如上所述获得的产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株获得的培养物含有γ-谷氨酰半胱氨酸。这种培养物或其分级分离产物含有γ-谷氨酰半胱氨酸。该培养物可为含有酵母细胞的液体培养基，或者可为从其中收集的酵母细胞、破坏的细胞或细胞提取物(酵母提取物)。同样建议从破坏的细胞或酵母提取物中获得含有γ-谷氨酰半胱氨酸的组分。
加热上述含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培养物或其组分可从γ-谷氨酰半胱氨酸中释放半胱氨酸。
用于进行培养的培养基是不特别限制的，只要它使得本发明的酵母菌株能良好生长并有效产生γ-谷氨酰半胱氨酸。特别地，具有降低的谷胱甘肽合成酶活性但不丧失该活性的酵母菌株可在不含谷胱甘肽的培养基上生长良好。因此，可应用通常在工业规模上应用的培养基。如果必要，依赖于应用的菌株的特征可将必要的养分添加到培养基中。
培养条件和酵母提取物等的制备以与进行通常的酵母培养和酵母提取物等的制备相同的方式进行。酵母提取物可为那些通过处理酵母细胞的热水提取物获得的或那些通过处理消化的酵母细胞获得的。
含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的上述培养物或其组分可用于生产食品或饮料。该食品和饮料包括含酒精的饮料、面包食品或发酵的食品调味品。通过热处理从γ-谷氨酰半胱氨酸生产半胱氨酸可在生产食品和饮料过程中或其生产之后进行。
上述食品和饮料通过将含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的培养物或其组分与食品和饮料原材料混合并将混合物加工为食品和饮料进行生产。除了应用上述的培养物或其分级分离产物之外，本发明的食品和饮料可应用与那些用于通常的食品和饮料中的相同的原材料并通过与用于通常的食品和饮料中的相同的方法进行生产。这种原材料对于含酒精的饮料包括如稻、大麦、玉米淀粉等，对于面包食品包括小麦面粉、糖、精制食盐、黄油、发酵酵母等，对于发酵的食品调味品包括大豆和小麦等。
附图简述
图1是质粒GSH2Mdash/pYES2dash的构建图解，该质粒含有用于置换减弱型谷胱甘肽合成酶基因的盒。
图2是阐明应用图1中所示的盒对谷胱甘肽合成酶基因进行基因置换的示意图。
优选实施方案描述
在下文中，本发明将更详细地进行描述。
实施例1应用MNNG抗性作为表型筛选具有降低的谷胱甘肽合成酶的菌株
<1>繁殖Nα3菌株作为筛选模型菌株
(1)用于置换减弱型谷胱甘肽合成酶基因的盒的制备
通过常规方法从自然界分离的酿酒酵母中获得了单倍体Nα1菌株(尿嘧啶缺陷型)。通过下述方法应用Nα1菌株获得了带有减弱型谷胱甘肽合成酶基因的Nα3模型菌株。
在生产商所示的条件下，应用引物F1(CAGATTCCGAGTTTACTGGA(SEQ ID NO：1))和R1(AGAAGGAATGAGCCTAAAACAGC(SEQ ID NO：2))和PyrobestDNA聚合酶(Takara Shuzo)通过聚合酶链反应(PCR)扩增了一个区域，该区域编码从酿酒酵母S2菌株谷胱甘肽合成酶基因可读框(ORF)的中游到ORF下游的约120个碱基对。使得商业上可购得用于食品中的酿酒酵母形成孢子以获得单倍体面包酵母S菌株(MATα)。进一步地，通过应用含有尿嘧啶的SDFOA琼脂培养基(终浓度中含有2％纯化的琼脂、50mg/l尿嘧啶和1g/l 5-氟乳清酸水合物的SD培养基)从S菌株获得了S2菌株，该S2菌株是尿嘧啶必需型菌株。
将如上所述扩增的基因片段纯化，并在下面条件下于72℃进行10分钟的酶促反应以向末端添加A。
(反应混合物组成)
基因片段溶液 5μl
10×PCR缓冲液(不含MgCl2) 5μl
25mM MgCl2 3μl
2.5mM dATP 5μl
Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo) 0.5μl
纯化的水 31.5μl
总计 50μl
通过常规方法将如上所述获得的基因片段与质粒pGEM-T Easy(Promega Corporation)连接以获得质粒GSH2dash/pGEM。
下一步，使与包含于GSH2dash/pGEM中的谷胱甘肽合成酶基因中位置370的氨基酸相应的密码子由终止密码子替代。该操作是根据由生产商提供的规程通过应用QuikChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene)进行的。应用GSH2M-F1(GGCAGGGAAGGCAAGTAGCTGGCATTAAGTGAGCCCTC(SEQ ID NO：3))和GSH2M-R1(GAGGGCTCACTTAATGCCAGCTACTT GCCTTCCCTGCC(SEQID NO：4))作为引物。以这种方式制备了质粒GSH2Mdash/pGEM。
独立地制备了相应于质粒pYES2(Invitrogen)的质粒，其中去除了2μori。用限制性内切酶Ssp I和Nhe I切割pYES2并使切割的末端形成平端，然后进行连接以获得质粒pYES2dash。将pYES2dash和GSH2Mdash/pGEM各自用限制性内切酶Sac I和Sph I切割以从pYES2dash中切除含有URA3基因的片段及从GSH2Mdash/pGEM中切除具有突变的谷胱甘肽合成酶基因片段，并将这些相互进行连接。从而制备了质粒GSH2Mdash/pYES2dash。用限制性内切酶Mun I消化GSH2Mdash/pYES2dash以获得用于进行基因置换的盒(图1)。
(2)具有减弱型谷胱甘肽合成酶基因置换的构建
通过应用如上所述制备的盒进行了Nα1菌株谷胱甘肽合成酶基因的基因置换(图2)。对Nα1菌株进行预先培养，并将培养物传代培养于50ml YPD培养基中，直到培养物达到对数生长期为止。将培养的细胞悬浮于1M山梨糖醇中，并与盒混合，然后通过电穿孔进行转化。将转化体菌株培养于含有1mM谷胱甘肽的SD平板上，并对在其上生长的菌株进行选择。通过PCR证实盒在染色体的目标位点插入，并将获得的菌株命名为Nα3中间体菌株。
然后，如图2所示，进行下面的操作以仅将减弱型的谷胱甘肽合成酶基因留在染色体上。将Nα3中间体在YPD培养基上进行培养，并将培养产物接种于含有1mM谷胱甘肽的SDFOA平板上。确定了平板上生长的菌株的谷胱甘肽合成酶基因序列，且证实已正确置换了目标位点的序列。因而获得了Nα3菌株。
(3)谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸由Nα3菌株的生产
对Nα3菌株对数生长期中γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽每单位时间的生产量进行了研究。在YPD培养基中对Nα3菌株进行预先培养后，将培养物接种于50ml SD培养基(含有必需量的尿嘧啶)中，并于30℃进行振荡培养。
γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽的生产量测量如下。即，将培养物进行离心以获得细胞，将该细胞用蒸馏水洗涤2次，然后于70℃进行10分钟的热水提取处理以获得细胞内容物。将该细胞内容物进行离心，并测量获得的上清液中γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽的含量。另一方面，将在一定量培养基中获得的酵母细胞置于滤纸上并于105℃加热4小时，随后测量剩余细胞的重量，该重量定义为干细胞重量。表1显示每个干细胞重量中γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽的含量。
表1
测量前的培养时 γ-谷氨酰半胱 谷胱甘肽
间 氨酸(％) (％)
Nα3 No.1 约1.5小时 1.101 0.0043
Nα3 No.2 约3.8小时 1.117 0.0045
(4)Nα3菌株的MNNG抗性程度的测量
将一个滤器置于YPD琼脂平板的中央，将1mg MNNG溶于30μl二甲基亚砜(DMSO)中的溶液完全地浸渗到滤器中以制备MNNG浓度梯度琼脂培养基，其中位置离中央点的距离越远，MNNG浓度则越低。在该琼脂培养基上涂布已在YPD液体培养基上培养的Nα1菌株和Nα3菌株。于30℃培养70小时后，测量了从琼脂培养基中央点到酵母形成的菌落位点之间的距离。作为结果，该距离对于Nα1菌株为2.3cm，而对于Nα3菌株为1.8cm。
<2>谷胱甘肽合成酶减弱的菌株的筛选
通过常规方法使得用于食品的酿酒酵母形成孢子以获得单倍体面包酵母MS菌株，并用EMS作为诱变剂对该菌株进行突变处理。该突变处理是在死亡率为90％的条件下进行的。
突变处理进行如下。即，将MS菌株于30℃在50ml YPD培养基中振荡培养1日，并收集酵母细胞。将收集的酵母细胞用0.2M磷酸钠缓冲液(pH7.5)洗涤3次。然后，将酵母细胞悬浮于含有9.2ml 0.2M的磷酸钠缓冲液(pH7.5)、0.5ml 40％的D-葡萄糖和0.3ml EMS(Nakarai Tesque，Code 155-19)的溶液中，并于30℃振荡培养90分钟。将10％的硫代硫酸钠(用滤器灭菌)(10ml)添加到培养物中以悬浮细胞，然后将悬浮液于室温静置10分钟以中和诱变剂。收集酵母细胞并用0.2M磷酸钠缓冲液(pH7.5)进行洗涤。因而，对酵母进行了突变处理。在这种情况下，死亡率为90％。
将如上所述进行突变处理的MS菌株涂布于MNNG浓度梯度琼脂培养基(通过在YPD琼脂平板中央放置一个滤器，并用全部量的1mg MNNG溶于30μl DMSO中的溶液对滤器进行浸渗而制备)上，从而出现的菌落数目为200个或更少，并于30℃进行5日的固定培养。分离了在如下MNNG浓度范围中生长的酵母突变型，在该MNNG浓度范围中，产生普通量的谷胱甘肽的酵母(Nα1菌株)不能生长(距离琼脂培养基的中央点约2.3cm)，但产生γ-谷氨酰半胱氨酸而不产生或基本不产生谷胱甘肽的酵母(Nα3菌株)能够生长(距离琼脂培养基的中央点约1.8cm)。对93个这种突变菌株进行了γ-谷氨酰半胱氨酸生产力的测量，并获得了一个谷胱甘肽合成酶活性降低的突变菌株AJ14809。
实施例2γ-谷氨酰半胱氨酸由产生γ-谷氨酰半胱氨酸的二倍体酵母的生产
<1>产生γ-谷氨酰半胱氨酸的二倍体酵母的制备
将单倍体酵母(MATα)AJ14809菌株用作具有降低的谷胱甘肽合成酶活性的酿酒酵母，该菌株通过对单倍体酵母进行突变处理并利用MNNG浓度梯度琼脂培养基进行选择而获得，该单倍体酵母是使得商业上可购得的面包酵母(二倍体)形成孢子而获得的。通过如上所述应用Nα3菌株作为对照，将该菌株选择为与Nα3菌株具有相同水平的MNNG抗性的菌株。
AJ14809菌株自2001年10月1日以来以保藏号FERM P-18546保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Central6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)。最初的保藏物基于2002年12月1日的Budapest条约转变为国际保藏物，并指定保藏号FERM BP-8228。
另一方面，应用AJ14810菌株(MATa)作为酿酒酵母野生菌株。该菌株自2001年10月1日以来以保藏号FERM P-18547保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心。最初的保藏物基于2002年12月1日的Budapest条约转变为国际保藏物，并指定保藏号FERM BP-8229。
将AJ14809菌株和AJ14810菌株各自在4ml YPD试管培养基中于30℃进行振荡培养。将培养物在YPD试管培养基中混合在一起，并于30℃进行振荡培养。在证实AJ14809菌株与AJ14810菌株交配之后，将液体培养物涂布于YPD琼脂培养基上并于30℃进行培养。从在琼脂培养基上生长的酵母中获得了二倍体菌株。该二倍体菌株具有源自AJ14809菌株的谷胱甘肽合成酶基因和源自AJ14810菌株的谷胱甘肽合成酶基因。使得该二倍体菌株形成孢子，并通过随机孢子方法选择10个单倍体酵母菌株。该单倍体酵母菌株保持MATa且具有降低的谷胱甘肽合成酶活性，且当培养于SD培养基中时，在对数生长期中每个干酵母细胞含有1％或更多的γ-谷氨酰半胱氨酸且累积0.1％或更少的谷胱甘肽。将这10个菌株各自与AJ14809菌株进行交配以获得二倍体酵母AJ14800菌株，该AJ14800菌株具有降低的谷胱甘肽合成酶活性，且当培养于SD培养基中时，在对数生长期中每个干酵母细胞累积约1.5％γ-谷氨酰半胱氨酸。
从通过使AJ14809菌株与AJ14810菌株进行交配而获得的二倍体酵母中选择产生野生型谷胱甘肽合成酶的菌株作为对照，并将其命名为L菌株。
<2>对AJ14800菌株的MNNG抗性程度的测量
将具有降低的谷胱甘肽合成酶活性的AJ14800菌株和产生野生型谷胱甘肽合成酶的二倍体酿酒酵母L菌株培养于YPD培养基中以获得液体培养物，将该液体培养物接种于含有30μg/ml或60μg/mlMNNG的YPD培养基或YPD培养基中，使得在660nm的吸收为0.1。对于于30℃固定培养26小时的培养基在660nm的吸收进行测量以测量生长程度。作为结果，如表2所示，谷胱甘肽合成酶减弱的菌株AJ14800比野生型保持谷胱甘肽合成酶的菌株更具有对MNNG的抗性。
表2
60μg/ml MNNG时的生 60μg/ml MNNG时的生
长程度 长程度
L 0.0195 0.0139
AJ14800 0.0540 0.0254
<3>对AJ14800菌株的γ-谷氨酰半胱氨酸累积量的测量
在将AJ14800菌株于YPD培养基中培养40小时后收集细胞。将该细胞接种入SD培养基中从而在660nm的吸收为0.2。从培养开始后8小时测量的细胞内γ-谷氨酰半胱氨酸累积量为1.50％。
工业适用性
根据本发明，提供了一种具有降低活性的谷胱甘肽合成酶活性且产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母。本发明的菌株可用于生产含有γ-谷氨酰半胱氨酸的食品或含有半胱氨酸的食品。
序列表
<110>味之素公司
<120>产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母及其筛选方法
<130>C031MKOP1419
<140>
<141>2002-11-21
<150>JP 2001-359781
<151>2001-11-26
<160>4
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>1
cagattccga gtttactgga 20
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>2
agaaggaatg agcctaaaac agc 23
<210>3
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>3
ggcagggaag gcaagtagct ggcattaagt gagccctc 38
<210>4
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>4
gagggctcac ttaatgccag ctacttgcct tccctgcc 38