一种产生生物乳化剂和降解烷烃的耐盐红球菌及其在石油 污染盐碱土壤生物修复中的应用 【技术领域】
本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域， 具体地说， 它涉及一株耐盐红 球菌 Rhodococcus sp.JH， 一种由该菌发酵产生的生物乳化剂， 及其在石油污染盐碱土壤生 物修复中的应用。 【背景技术】
随着对石油产品的需求量增加， 原油的开采、 加工和运输活动日益频繁， 这些过程 使大量的石油及其加工产品进入土壤， 打破了自然界原有的生态平衡， 给动植物和人类带 来了严重的危害， 目前， 这已成为世界性的环境问题。现在世界石油总产量每年近 3×1010 吨左右， 我国当前石油年产量也早已超过 1×108 吨， 而每年新污染土壤达 1×105 吨之多。 黄河三角洲地区拥有丰富的油气资源， 是我国第二大石油基地。这里油井分布广泛的同时 污染也十分严重， 一般井场污染范围在 1000-2000m2 之间。随着石油的大规模勘探、 开发、 冶炼、 运输和使用， 污染、 遗漏、 井喷、 输油管道泄漏等事故频发， 造成土壤污染和植被破坏， 严重威胁着黄河三角洲地区生态系统的安全。近年来， 黄河断流影响了黄河三角洲湿地生 态系统淡水水源的补给， 破坏了湿地土壤中水盐的平衡， 使土壤含盐量上升， 土壤盐碱化现 象日益严重。 盐渍化土地面积占全区总面积的一半以上， 土壤以滨海盐土为主， 土壤含盐量 高， 盐分主要以氯化物为主， 占可溶性盐总量的 80％以上， 土壤表层盐分在 0.4-3％范围。 深入了解黄河三角洲地区盐渍化条件下石油污染的特点， 对该地区进行污染修复， 恢复其 生态功能迫在眉睫。
微生物降解是修复石油污染土壤的一种有效、 经济、 环保的方法， 是石油烃类有机 污染物去除的主要机制。 利用微生物降解环境中的污染物具有成本低、 效率高、 以及不易造 成二次污染等优点， 所以一直受到广泛关注。然而， 在高盐条件下， 微生物既要忍受长期的 高渗透压胁迫， 又要承受短期的渗透冲击。当盐度＞ 3％时， 非嗜盐微生物的代谢会受到抑 制， 使其生物修复效率明显降低， 甚至丧失修复能力。盐度从 0.5％升高至 2％时， 也会严重 扰乱非嗜盐微生物的代谢活动。因此， 传统的非嗜盐微生物并不适合对污染的高盐环境进 行生物修复。
嗜盐微生物可分为嗜盐型和耐盐型。前者是在一定浓度盐中可正常生长， 且高 浓度盐是生长必需条件的微生物 ； 后者是一类能耐受一定浓度盐溶液， 但在无盐条件下 也可正常生长的微生物。嗜盐菌种类繁多， 它们的分类主要依据三个方面 ： 表型特征、 化学分类数据和分子生物学数据。根据表型特征的不同， 有嗜盐球菌和嗜盐杆菌。根据 16SrRNA/rDNA 序列分析并结合其它生物学形状有盐杆菌属 (Halebacterium)， 盐深红菌属 (Halorubrum)， 富盐菌属 (Haloferax)， 盐盒菌属 (Haloarcula)， 盐球菌属 (Halococcus)， 嗜盐碱球菌属 (Natronococcus) 等菌属。嗜盐微生物 嗜盐碱杆菌属 (Natronobacterium)， 一般生活在含 10％ -20％盐成分的天然盐湖中、 晒盐场和腌制海产品等处。由于嗜盐微生 物能够在高盐环境中栖息繁殖， 因此， 利用嗜盐微生物修复污染的天然盐环境或处理排放的高盐度有机污染物废水， 不需要通过稀释、 反渗透、 离子交换、 或者电渗透等方法降低待 处理样品的盐度， 具有操作简单和成本低廉等诸多优点。关于有关高盐环境中能够降解烷 烃或原油， 同时产生生物表面活性剂的菌株的报道也还很少。 但是， 上述菌属的应用范围仅 限于对石油污染的污水的生物修复， 目前， 还没有成功实现原油污染的土壤生物修复的先 例。
受烷烃和原油污染的土壤生物修复是一门新兴的技术， 在采用微生物修复石油污 染的土壤中面临这样一个难题， 即石油难溶于水， 生物可利用性低， 单纯的石油降解菌难以 与之接触从而造成修复率低等问题。有研究表明， 表面活性剂可以乳化污染土壤中不溶性 有机物， 使它们的解吸附增强， 水溶性增加。 生物乳化剂是一类由生物产生的具有表面活性 的化合物， 其分子结构由一个疏水部分和一个亲水部分构成， 同时具有亲脂和亲水的性质， 因此具有减小表面张力、 稳定乳化、 增加泡沫等作用， 另外， 生物乳化剂具有与环境的兼容 性， 即它没有毒性， 并可被生物降解， 因此它们不会对环境造成不利的影响， 利用其能够乳 化原油增强油的水溶性的特性， 在石油开采、 环境治理以及食品饮料、 化妆品生产等领域有 广阔的应用前景。
为了提高土壤中烷烃降解速度， 加入生物表面活性剂， 能够增强憎水性化合物的 亲水性和生物可利用性， 或给土壤提供帮助生物降解的物质， 提高土壤微生物的数量， 继而 提高烷烃的降解速度。生物表面活性剂是微生物在一定条件下培养时， 其代谢过程中分泌 出的具有一定表面活性的代谢产物， 如糖脂、 多糖脂、 脂肽或中性类脂衍生物等。广义的生 物表面活性剂分为生物表面活性和生物乳化剂， 前者是一些低分子量的小分子， 能明显改 变表 / 界面张力， 后者是一些生物大分子， 并不能明显降低表 / 界面张力， 但对油 / 水界面 表现出很强的亲和力， 因而可使乳状液得以稳定， 表现出相当高的表面活性和乳化能力。 与 化学合成表面活性剂相比， 生物表面活性剂具有以下优点 ： ①水溶性好， 在油 / 水界面有高 的表面活性 ； ②具有很强的乳化原油的能力 ； ③可生物降解， 不对环境造成污染和破坏 ； ④ 分子结构类型多样， 具有特殊的官能团， 其中有些基团是化学方法难以合成的 ； ⑤无毒、 安 全； ⑥生产工艺简单， 在常温常压下即可发生反应。正因为这些特性， 生物表面活性剂尤其 适合石油工业和环境工程， 如石油的生物降粘、 提高原油的采收率、 重油污染土壤的生物修 复等。
微生物以自己的方式摄取石油烃类然后参与自身代谢， 最终生成小分子有机酸。 目前所知的微生物细胞对于烷烃的摄取机制有以下几个方面 ： 一是主动运输， 这些细胞对 烷烃具有很高的亲和力， 通过相差和扫描电镜可以观察到不动杆菌可附着于烷烃小液滴的 表面， 絮凝物的形成也使得细胞可与烷烃保持紧密接触， 从而造成一种微生态环境。 当然并 非依靠烷烃生长的微生物种群都会附着于烃类， 有的细胞与烃的接触可能是依靠一种非特 异性疏水作用引起的。二是细胞与 “拟增溶” 的小液滴互相作用 ： 微生物所产生的胞外的生 物表面活性剂和生物乳化剂有增加油水界面之间接触面积的作用。
生物乳化剂的研究开始于本世纪六十年代， 目前所知多种微生物可产乳化剂， 但 对乳化剂的结构和理化性质知之甚少 ； 生物乳化剂具有对烃良好的乳化性能和促进烃降解 的特性， 但是直到现在生物乳化剂的合成机制尚不清楚， 尤其是耐盐菌产生的乳化剂还未 见报道。 生物降解石油作为一种高效率、 低成本、 无污染的生物治理技术， 适应我国的国情， 也是增加可利用耕地面积的有效途径。因此有必要进一步研究， 这对于生物修复技术的机理具有重要的理论价值和实际应用价值。
本发明主要从能够产生表面活性物质的耐盐解烃菌入手， 对菌株的烃降解特性及 产生的表面活性剂进行了深入的研究， 并用于石油污染盐碱土壤的生物修复技术。 【发明内容】
本发明的目的之一在于针对土壤的石油污染日益严重的问题， 提供一种耐盐红球 菌 (Rhodococcus sp.)JH 和并将其用于石油污染土壤的生物治理技术。
本发明的目的之二在于提供一种新型的脂蛋白类的生物乳化剂， 以便提高烷烃和 原油在乳化性能和溶解度， 强化菌株在石油污染土壤中对烷烃和原油的生物降解。
在微生物降解原油的实验中经常会遇到一种现象， 就是乳化效果特别好的实验组 其油水界面张力并不显著降低。基于此类现象， 我们有两个概念必须加以澄清， 就是生物 表面活性剂和生物乳化剂的区别。在广义上生物乳化剂属于生物表面活性剂， 但在狭义上 它们是按照各自的功能区分的。生物表面活性剂 ( 如糖脂、 磷脂、 脂肽、 脂肪酸、 短肽等 ) 是 一些低分子量的小分子， 它们能显著降低空气 - 水或油 - 水界面的张力， 从而有助于油水乳 化， 但形成的乳状液往往不能稳定存在。生物乳化剂是一些生物大分子， 如多糖蛋白、 脂多 糖、 或这些聚合物的混合物等， 它们虽不能显著降低表面张力， 但对油水界面表现出很强的 亲和力， 能够吸附在分散的油滴表面， 防止油滴凝聚， 从而使这种乳状液得以稳定， 这种效 应使得烷烃呈胶状分散， 增加了烷烃与细胞的接触。因此生物乳化剂的主要作用是乳化原 油， 降低原油粘度， 更重要的是可以强化微生物在石油污染土壤修复中的作用。
本发明提供的红球菌 (Rhodococcus sp.)JH 菌株， 于 2009 年 11 月 04 日保藏于 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心” ， 其保藏号为 CGMCC No.3388。
红球菌 (Rhodococcus sp.)JH 菌株的筛选
取石油污染盐碱土土样 1g， 无菌接种至 100ml 无机盐液蜡培养基中 ( 培养基组成 ： Na2HPO41.5g ； KH2PO43.48g ； MgSO40.7g ； (NH4)2SO44g ； 酵母粉 0.01g ； 液体石蜡 2 ％ (v/w)， 蒸 馏水 1000ml ； pH 自然 ； 121℃灭菌 30min)， 37℃摇床往复振荡培养 5d。 将富集培养液充分混 匀， 取 100μl 涂布在 1.5％ LB 固体平板上， 37℃恒温培养箱中培养 2-3d， 观察生长出的菌 落。挑取单菌落并用显微镜检验其纯度。将生长的各个菌落， 接种至 LB 培养基中， 培养至 OD630 为 0.8 左右， 作为种子液以 10％ (v/v) 比例接入 100ml 无机盐液蜡培养基中， 37℃摇 床往复振荡培养 5d。 然后以此发酵液作为种子液， 接种至新鲜的无机盐液蜡培养基， 反复驯 化菌种 3-4 次。
选取对液蜡乳化良好的菌种进行原油降解试验。 将菌落接种至液蜡培养基培养 3d 左右， 作为种子以 10％ (v/v) 比例接入到 100ml 原油培养基中 ( 培养基组成 ： Na2HPO41.5g ； KH2PO43.48g ； MgSO40.7g ； (NH4)2SO44g ； 酵母粉 0.01g ； 原油 0.5 ％ (w/w)， 蒸馏水 1000ml ； pH 自然 ； 121℃灭菌 30min)， 37℃震荡培养 5d 后测定原油降解率。油类测定方法采用红外法， 即发酵液用 100ml 四氯化碳萃取， 用红外测油仪测定剩余原油的量， 降解率 (％ ) ＝ 1- 剩余 原油的量 / 加入原油的量 ×100％ ； 采用高压气相色谱方法检测原油的降解情况。
选取对液蜡乳化良好的菌种发酵液用来测量乳化指数 (EI-24)， 以筛选能够利用 烃产乳化剂的菌株， 最终得到一株能够乳化和降解原油， 并利用烃类物质产生生物乳化剂 的保藏号为 CGMCC No.3388 的红球菌菌株 Rhodococcus sp.JH。红球菌 (Rhodococcus sp.)JH CGMCC No.3388 的菌落特征 ： 在 LB 平板上 37℃培 养 16h 以上即形成圆形菌落， 菌落大小直径 3-5mm， 菌落边缘整齐， 表面湿润， 光滑， 桔黄色。
红球菌 (Rhodococcus sp.)JH CGMCC No.3388 的细胞形态特征 ： 革兰氏染色呈阳 性， 菌体形态为球状， 多呈现双球菌状态 ； 不产芽孢， 细胞直径约 0.6-1.2μm。
红球菌 (Rhodococcus sp.)JH CGMCC No.3388 的生理生化特征 ： 生长温度范围 15-50℃， NaCl 耐受性 0-12％ ； 触酶， 柠檬酸盐利用， MR 实验， V-P 实验， 吲哚实验均为阳性 ； 纤维素水解， 明胶液化， 淀粉水解， 脲酶实验皆为阴性。 能够利用山梨醇、 果糖、 葡萄糖， 不能 利用乳糖、 蔗糖、 木糖醇、 麦芽糖发酵产酸。降解烷烃和石油烃， 产生生物乳化剂。
红 球 菌 (Rhodococcus sp.)JH CGMCC No.3388 的 16S rRNA 基 因 序 列 特 征： CGMCCNo.3388 接 种 于 LB 培 养 基， 37 ℃ 摇 床 培 养 (130rpm)12h， 离 心 收 集 菌 体， 重 新 悬 浮， 加 溶 菌 酶 和 SDS 破 壁， 由 酚 - 氯 仿 法 提 取 基 因 组 DNA， 并采用正相引物 27F(5’ -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ) 和反向引物 1541R(5’ -AAGGAGGTGATCCAGCC-3’ )， 用 这对引物对其 16S rDNA 基因进行 PCR 扩增， 将扩增引物送北京三博公司进行测序。 PCR 条件 为： 94℃， 10min ； 94℃， 45s， 55℃， 45s， 72℃ 90s， 30 个循环 ； 72℃ 10min， 4℃保存。 16S rDNA 基因序列长度为 1479bp， 在 GenBank 中的登录号为 *****， 与 Rhodococcus ruber strain ： DSM43338 的 16S rRNA( 登录号为 NR_026185) 序列相似性为 97％， 其 16S rDNA 的序列如序 列表 1 所示。
参照 《Bergey’ s Mannual of Systematic Bacteriology》 Vol.VIII 的内容， 根据 其形态特征和生理生化特征， 以及根据其 16S rDNA 基因序列在 GenBank 中的搜索结果， 经 多项分类鉴定 JH 为一新菌， 属于红球菌属 (Rhodococcus sp.JH)。
红球菌 (Rhodococcus sp.)JH CGMCC No.3388 可以在营养培养基， 如： 普通牛肉 汁、 LB、 营养琼脂中生长， 也可以在添加葡萄糖或蔗糖的无机盐培养基中生长， 也可以以烷 烃或原油为碳源生长。菌株在 NaCl 0-12％的盐浓度范围内生长。
该菌具有很高的降解石油烃的能力， 可降解 C12 至 C32 的正构烷烃、 芳香烃和原 油。用 JH 生长细胞进行降解实验结果表明， 降解 0.5％ (w/v) 的原油， 在 37℃下， 往复摇床 130rpm 转速培养 72h， 降解率可达 82.5％以上， 对不同碳数的烷烃降解率都在 65.6％以上， 如图 1， 2 所示。
本发明提供的 CGMCC No.3388 菌能够在 0-12 ％ NaCl 浓度范围内解烃， 在 0-5 ％ 的范围内降解率基本相同都在 70％以上， 最高 74.5％ ； NaCl 浓度为 12％时， 原油降解率为 45.4％， 如图 3 所示。
本发明提供的 CGMCC No.3388 菌能在以烃为唯一碳源的无机盐培养基中发酵培养 生产生物乳化剂。培养基组成为 (g/L)Na2HPO41.5 ； KH2PO43.48 ； MgSO40.7 ； (NH4)2SO44 ； 酵母 # 粉 0.01 ； 0 柴油 2％， pH 自然。 培养条件 30℃ -37℃， pH 7.2， 121℃灭菌 30min， 在 30℃ -37℃ 条件下， 130rpm 振荡培养 72h。经发酵所获得的含生物乳化剂的发酵液效果最好， 发酵液中 8 # 生物乳化剂含量为 2.8g/L， 菌浓可达 6.4×10 个 /ml。该发酵液对 0 柴油的乳化能力为 100％， 24h 后乳化液稳定， 如图 4 所示。
本发明提供的 CGMCC No.3388 菌在 0-12％的不同 NaCl 浓度， 生产的含生物乳化剂 的发酵液对柴油的乳化效果明显。在 NaCl 浓度为 0-5％的范围内， 发酵液对柴油的乳化指 数均大于 90％， 随着盐浓度升高， 乳化指数降低， 在 NaCl 浓度为 10％时， 乳化指数为 76％，如图 5 所示。
CGMCC No.3388 菌所产生的生物乳化剂做 Molish 反应判定糖类， 用 Bradford 比色 法测定蛋白， 油红 O 染色， 实验表明该乳化剂含有蛋白质和脂类， 不含糖。
CGMCC No.3388 菌所产生的生物乳化剂有明显的乳化能力， 根据文献中报道的乳 # # 化能力测定方法， 以 0 柴油为乳化对象， 乳化剂与 0 柴油以 7 ∶ 3 体积比混合， 剧烈震荡 1min， 静置 24h， 乳化指数 (Emusification index， EI-24) 用乳化层的高度与测试烃的总高 度之比， 乘以 100％来计算。如果 EI-24 大于等于 50％， 则说明乳状液是稳定的。结果表明 该乳化剂对二甲苯， 甲苯， 煤油和原油等都有很好的乳化作用， 如表 2 所示。
CGMCC No.3388 菌所产生的生物乳化剂能够明显的促使石油污染盐碱土壤中石油 烃的降解。
应用本发明提供的 CGMCC No.3388 菌在以烃为唯一碳源的无机盐培养基中发酵培 养生产的含生物乳化剂的发酵液可直接应用于石油污染的盐碱土壤， 提高微生物对石油烃 的降解率， 以及石油污染盐碱土壤的生物修复中。
具体应用方法为 ： 将发酵液以 (100 ～ 250)ml.kg-1 干土的投加量喷洒到石油污染 的盐碱土壤中， 保持土壤湿润， 即可完成石油污染的生物降解过程。 本发明的优点和积极效果 ：
本发明提供的 CGMCC No.3388 菌能够在高盐含量条件下降解多种烷烃和原油， 并 可以以烃为碳源产生一种新型生物乳化剂， 可以应用在微生物生物修复石油污染盐碱土壤 技术中。
该菌株在 0-12％ NaCl 范围内， 以烃为碳源和能源生长， 能够利用 12 碳至 32 碳的 正构烷烃， 对原油的降解率可达 82.5％以上 ； 以烃为碳源在 0-12％ NaCl 范围内进行培养 时， 可产生一种新型的脂蛋白类的生物乳化剂 ； 该乳化剂对 0# 柴油， 苯， 二甲苯， 煤油， 原油 等具有很好的乳化效果， 能够提高烷烃和原油在水中的溶解度， 明显促进活性菌株对烷烃 和原油的降解。该菌株及其产生的生物乳化剂适用于提高烃摄取效率， 在微生物修复石油 污染土壤技术中应用。
【附图说明】 ：
图 1 是 Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388 菌株对不同碳数烷烃的降解情况 ；
图 2 是 Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388 菌对原油降解的高压气相色谱图 ；
图 3 不同 NaCl 浓度下 Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388 对原油的降解率 ；
图 4 是 Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388 菌生产的生物乳化剂的发酵液对柴油 的乳化作用 ；
图 5 不同 NaCl 浓度下 Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388 发酵液对柴油乳化情 况；
图 6-1 不同浓度生物乳化剂对柴油的乳化指数 ；
图 6-2 在不同温度下乳状液放置 24h 后的稳定性 ；
图 6-3 生物乳化剂在不同 NaCl 浓度下对柴油的乳化指数 ；
图 7 生物乳化剂发酵液不同投加量的条件下对土壤中石油烃去除率曲线 ；
图 8 不同温度条件下对土壤中石油烃去除率曲线 ；图 9Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388 菌对 1# 试验田生物修复效果。【具体实施方式】
实施例 1 ：
本发明提供的 Rhodococcus sp.JH 菌株的分离筛选
取石油污染盐碱土土样 1g， 无菌接种至 100ml 无机盐液蜡培养基中 ( 培养基组成 ： Na2HPO41.5g ； KH2PO43.48g ； MgSO40.7g ； (NH4)2SO44g ； 酵母粉 0.01g ； 液体石蜡 2 ％ (v/w)， 蒸 馏水 1000ml ； pH 自然 ； 121℃灭菌 30min)， 37℃摇床往复振荡培养 5d。将富集培养液充分 混匀， 取 100μl 涂布在 1.5％ LB 固体平板上， 37℃恒温培养箱中培养 2-3d， 观察生长出的 菌落。挑取单菌落并用显微镜检验其纯度。将生长的各个菌落， 接种至 LB 培养基中， 培养 至 OD630 为 0.8 左右， 作为种子液以 10％ (v/v) 比例接入 100ml 无机盐液蜡培养基中， 37℃ 摇床往复振荡培养 5d。 然后以此发酵液作为种子液， 接种至新鲜的无机盐液蜡培养基， 反复 驯化菌种 3-4 次。
选取对液蜡乳化良好的菌种进行原油降解试验。将菌落接种至液蜡培养基培养 3d 左右， 作为种子以 10 ％ (v/v) 比例接入液接入到 100ml 原油培养基中 ( 培养基组成 ： Na2HPO41.5g ； KH2PO43.48g ； MgSO40.7g ； (NH4)2SO44g ； 酵母粉 0.01g ； 原油 0.5 ％ (w/w)， 蒸馏 水 1000ml ； pH 自然 ； 121℃灭菌 30min)， 37℃震荡培养 5d 后测定原油降解率。油类测定方 法采用红外法， 即发酵液用 100ml 四氯化碳萃取， 用红外测油仪测定剩余原油的量， 降解率 (％ ) ＝ 1- 剩余原油的量 / 加入原油的量 ×100％ ； 采用高压气相色谱方法检测原油的降 解情况。
选取对液蜡乳化良好的菌种发酵液用来测量乳化指数 (EI-24)， 以筛选能够利用 烃产乳化剂的菌株， 最终得到一株能够乳化和降解原油， 并利用烃类物质产生生物乳化剂 的保藏号为 CGMCC No.3388 的红球菌菌株 (Rhodococcus sp.)JH。
实施例 2 ：
Rhodococcus sp.JH 菌株的 16S rRNA 基因的 PCR 扩增和序列测定
Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388 接 种 于 LB 培 养 基， 37 ℃ 摇 床 培 养 (130rpm)16 小 时， 离 心 收 集 菌 体， 重 新 悬 浮， 加 溶 菌 酶 和 SDS 破 壁， 由酚 - 氯仿法提 取 基 因 组 DNA， 并 采 用 正 相 引 物 27F(5’ -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ) 和反向引物 1541R(5’ -AAGGAGGTGATCCAGCC-3’ )， 用这对引物对其 16S rRNA 基因进行 PCR 扩增， 将扩增 引物送上海生工进行测序。PCR 条件为 ： 94℃， 10min ； 94℃， 45s， 55℃， 45s， 72℃ 90s， 30 个 循环 ； 72℃ 10min， 4℃保存。16S rRNA 基因序列长度为 1479bp， 在 GenBank 中的登录号为 HM134277， 与 Rhodococcus ruber strain ： DSM43338 的 16S rRNA( 登录号为 NR 026185) 序 列相似性为 97％。其 16S rRNA 的序列如序列表所示。
实施例 3 ：
本发明提供的 Rhodococcus sp.JH 菌株对烷烃和胜利油田滨南采油厂原油的降解 将菌株在 LB 平板上进行活化， 取单菌落接入 5ml LB 液体培养基中过夜培养， 以 1％接种量 接种至 100ml LB 液体培养基中， 37℃振荡培养 5h 至对数生长期， 以 10％接种量接种至装有 100ml 含有不同烷烃或原油为碳源的无机盐培养基 ( 培养基组成同实施例 1) 的锥形瓶中， 37℃培养 3d， 用气相色谱法分析， 该菌株对不同碳数烷烃的降解率， 用红外测油仪测定原油的降解率并用高压气相色谱法进行残留原油的气相色谱分析， 结果如图 1 和图 2 所示。该 菌株对 C12 至 C32 烷烃， 降解率均在 65.6％以上， 对原油的降解率可达 82.5％。
实施例 4 ：
本发明提供的 Rhodococcus sp.JH 菌株在不同盐浓度下对原油的降解情况
在以原油为碳源的无机盐培养基 ( 培养基组成同实施例 1) 中， 添加不同浓度的 NaCl， 接入 Rhodococcus sp.JH 菌株， 3d 后测定用红外测油仪不同浓度下原油降解率 ( 同 实施例 3)。结果如图 3 所示。JH 菌株在 NaCl 浓度 0-12％的范围内对原油都有不同程度 的降解， 在 0-5％的范围内降解率基本相同都在 70％以上， 最高 74.5％ ； 随着盐浓度的升 高降解率逐渐降低， NaCl 浓度为 12％时， 原油降解率为 45.4％。实验结果表明， 烃降解菌 Rhodococcussp.JH CGMCC No.3388 菌株对 NaCl 有很好的耐受性。
实施例 5 ：
本发明提供的 Rhodococcus sp.JH 菌株产生生物乳化剂的条件
通 过 优 化 培 养 基 组 分、 培 养 条 件 ( 通 氧 量， 发 酵 周 期 等 )， 等试验获得该 Rhodococcus sp.JH 菌株产生生物乳化剂的最佳培养基为 g/L ： Na2HPO41.5g ； KH2PO43.48g ； # MgSO40.7g ； (NH4)2SO44g ； 酵母粉 0.01g ； 0 柴油 2％ (v/w)， 蒸馏水 1000ml ； pH 自然 ； 121℃灭 菌 30min， 最佳培养条件为 ： 初始 pH 7.2， 37℃， 130rpm 培养 72h。该培养条件下， 加入的液 蜡能够完全乳化， 通过测量对柴油的乳化指数 (EI-24) 可达 100％， 如图 4 所示， 并可稳定 7d 以上。该乳化剂对二甲苯， 甲苯， 煤油和原油等也都有很好的乳化作用， 如表 2 所示。
表2
实施例 6 ：
本发明提供的 Rhodococcus sp.JH 菌株在不同盐浓度下产生物乳化剂情况
Rhodococcus sp.JH 菌株在产生生物乳化剂的培养基中 ( 同实施例 5) 培养发酵， 在培养基中添加不同浓度的 NaCl(0-12％ )， 37℃， 130rpm 培养 72h。发酵结束后， 用发酵液 测定对柴油的乳化能力， 结果如图 5 所示。 在 NaCl 浓度为 0-5％的范围内， 发酵液对柴油的 乳化指数均大于 90％， 随着盐浓度升高， 乳化指数降低， 在 NaCl 浓度为 10％时， 乳化指数为 76％。实验结果表明， Rhodococcus sp.JH 菌株在不同 0-12％范围的盐浓度下可产生生物 乳化剂， 其发酵液对柴油有很好的乳化效果。
实施例 7 ：
本发明提供的 Rhodococcus sp.JH 菌株所产生的生物乳化剂的分离提取
Rhodococcus sp.JH 菌株在产生生物乳化剂的培养基和条件下 ( 同实施例 5) 培养 发酵， 发酵液用滤纸过滤， 滤液在 8000rpm 4℃离心除去菌体后， 加入 3 倍体积冰冷丙酮或 者工业酒精， 用玻璃棒搅拌均匀， 置于 4℃过夜， 离心得沉淀， 将沉淀透析后冷冻干燥， 得乳 化活性物质， 该物质溶于双蒸水后对柴油的乳化能力为 100％。 在光学显微镜下观察乳化液 滴的大小， 随即测量 20 个液滴， 计算乳化液滴的平均大小， 如表 3 所示， 提取的乳化活性物 质对柴油作用后， 产生的乳化液滴约为发酵液作用的 1/4。
表3
实施例 8 ：
本 发 明 提 供 的 Rhodococcus sp.JH 菌 株 所 产 生 的 生 物 乳 化 剂 的 理 化 性 质 Rhodococcus sp.JH 菌株产生物乳化剂 ( 同实施例 6)， 将该乳化剂溶于双蒸水中测试不同 浓度该乳化剂对柴油的乳化， 以及该乳化剂在不同 NaCl 浓度和 pH 下对柴油的乳化能力以 及对柴油形成的乳状液在不同温度下的稳定性， 结果如图 6-1 至图 6-3 所示。当乳化剂浓 度为 0.8g/L 时， 对柴油的乳化能力可达 100％ ( 图 6-1) ； 在不同 pH 条件下， 该乳化剂对柴 油的乳化能力均为 100％ ； 形成的乳状液在不同温度下测试稳定性， 发现在 100℃水浴中过 夜， 仍保持有 65.3％的乳化层 ( 图 6-2) ； 该乳化剂可耐受的 NaCl 浓度为 25％ ( 图 6-3)， 更 适合于高盐浓度土壤的生物修复。将该乳化活性物质溶于双蒸水中， 置于 121℃高压作用 30min 后， 对柴油仍有 100％的乳化活性。
实施例 9 ：
本发明提供的 Rhodococcus sp.JH 菌株所产生的生物乳化剂的定性反应
Rhodococcus sp.JH 菌株产生的生物乳化剂 ( 同实施例 6) 进行 Molish 反应判定 糖类， 用 Bradford 比色法测定蛋白和油红 O 染色， 实验表明该乳化剂含有蛋白质和脂类， 不 含糖类。
实施例 10 ：
本发明提供的 Rhodococcus sp.JH 菌株在室内模拟不同生物乳化剂投放量对石油 污染土壤的修复作用
供试土壤样品是未受石油污染的农田盐碱土， 掺杂原油为胜利油田原油。供试土 样去除石块、 杂草研磨后过 2mm 筛， 置入烧杯中向其中添加采自胜利油田的原油充分搅拌， 于阴暗处晾干后进一步研磨过 2mm 筛， 使土壤和原油混合均匀， 其中油含量约为 2g/kg。
将 Rhodococcus sp.JH 菌株在最适条件下发酵产生生物乳化剂 ( 同实施例 5)， 将 -1 发酵液以不同量投放到供试土壤中去， 投加量分别为 100、 150、 200 和 250ml.kg 干土， 其中 -1 生物乳化剂含量分别为 12.6、 18.9、 25.2、 31.5mg.kg 干土。设两组对照， 第一组将斜面上 生长的 JH 菌刮入无菌水中制成菌悬液投放至测试土壤中 ； 第二组以不加任何菌和发酵液 的土壤为对照。所有土样均采用每天翻耕 1 次， 每天加水 20ml 以保持土壤水分。间隔一段 时间采样， 采用红外测油仪测定土壤中石油含量， 即称取土样 5g 置于 125ml 磨口三角瓶中， 再加入 20ml CCl4， 振荡片刻， 放置过夜， 将上清液经无水硫酸钠过滤到 50ml 容量瓶中， 随后 再加入 10ml CCL4 在 60℃水浴上加热 30min， 上清液经过漏斗 ( 漏斗放入滤纸， 上层添加 10g 无水硫酸钠 ) 过滤到容量瓶中， 再用 10ml CCl4 清洗三角瓶和滤斗上的无水硫酸钠， 最后将 容量瓶用 CCl4 定容至 50ml， 用红外仪测定石油烃含量， 计算烃去除率。结果如图 7 所示， 降 解 8d 后， 测试土壤含油量发现烃去除率分别为 12.3％、 26.9％、 41.8％和 56.8％， 对照一组 烃去除率为 4.5％， 不加菌液的对照几乎没有降解。 降解后期添加生物乳化剂发酵液的供试
土壤及对照一组中烃降解率都有明显提高。
实施例 11 ：
本发明提供的 Rhodococcus sp.JH 菌株在室内模拟不同温度下石油污染土壤的修 复作用
将 Rhodococcus sp.JH 菌株在最适条件下发酵产生生物乳化剂， 将发酵液以 -1 250m1.kg 干土的投放量投放到供试土壤中去 ( 同实施例 10)， 分别在 20℃和 30℃下作用。 土样采用每天翻耕 1 次， 每天加水 20mL 以保持土壤水分。间隔一段时间采样， 测定土壤中 石油含量， 计算烃去除率。结果如图 8 所示。降解 8d 后， 30℃条件下石油污染土壤中烃去 除率为 60.2％， 20℃条件下为 43.7％。随着时间延长， 在两个温度下烃去除率都有增加。
实施例 12 ：
本发明提供的 Rhodococcus sp.JH 菌株所产生的生物乳化剂对 1# 试验田石油污 染土壤的生物修复能力
将 Rhodococcus sp.JH 菌株在产生物乳化剂的最适培养基和发酵条件下 ( 同实施 例 5) 培养发酵， 将发酵液以 250m1.kg-1 干土的投加量喷洒到石油污染的 1# 试验田中， 时间 为 6-8 月份 ( 平均温度约 28℃， 雨水充足 )。试验田中每周翻耕 1 次， 间隔一段时间采样， 测定土壤中石油含量， 计算烃去除率。结果如图 9 所示。经过 65d 的试验， 发现 1# 试验田 中烃去除率可达 71.8％， 石油污染得到了有效的修复， 而在不添加任何菌剂的对照田中， 由 于土著微生物的降解作用， 石油污染物也有一定的减少 ( 最高 12.2％ )， 但是远远低于 1# 试验田。 实施例 13 ：
本发明提供的 Rhodococcus sp.JH 菌株所产生的生物乳化剂对 2# 试验田石油污 染土壤的生物修复能力
将 Rhodococcus sp.JH 菌株在产生物乳化剂的最适培养基和发酵条件下 ( 同实施 例 5) 培养发酵， 将发酵液以 250ml.kg-1 干土的投加量喷洒到石油污染的 1# 试验田中， 时间 为 6-8 月份 ( 平均温度约 28℃， 雨水充足 )。试验田中每周翻耕 1 次， 间隔一段时间采样， 测定土壤中石油含量， 计算烃去除率。经过 60d 的试验， 2# 试验田中烃去除率也可达 70％ 以上， 石油污染得到了有效的修复。
序列表 1
滨州学院
一种产生乳化剂和降解烷烃的耐盐菌 JH 及用途
1479bp
Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388 16s rRNA gene sequence
1 GACGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAAC GATGAAGCCC AGCTTGCTGG
61 GTGGATTAGT GGCGAACGGG TGAGTAACAC GTGGGTGATC TGCCCTGCAC TTCGGGATAA
121 GCCTGGGAAA CTGGGTCTAA TACCGGATAG GACCTCGGGA TGCATGTTCC GGGGTGGAAA
181 GGTTTTCCGG TGCAGGATGG GCCCGCGGCC TATCAGCTTG TTGGTGGGGT AACGGCCCAC
241 CAAGGCGACG ACGGGTAGCC GGCCTGAGAG GGCGACCGGC CACACTGGGA CTGATACACG
301 GCCCAGACTC CTACGGGAGG CCGCAGTGGG GAATATTGCA CAATGGGCGC AAGCCTGATG
361 TACCGACGCC GCGTGAGGGA TGACGGCCTT CGGGTTGTAA ACCTTTTTCA CTACCGACCA
421 AGCGCAAGTG ACGGTAGGTA CAGAAGAAGC AGCGGCCAGT TCCGTATCGG CAGCCGCGGT 481 AATACGTAGG GTGCGAGCGT TGTCCAGCCA TACTGGGTGT AAAGAGCTCG TAGACGGTTT 541 GTCGCGTCGT CTGTGAAAAT CCGCAGCTCA ACTGAGGGCT TGCAGGCGAT ACGGGCAGAC 601 TTGAGTACTG CAGGGGAGAC TGGAATTCCT GGTGTAGCGG TGAAATGCGC AGATATGAGG 661 AGGAACACCG GTGGCGAAGG CGGGTCTCTG GGCAGTAACT GACGATGAGG AGCGAAAGCG 721 TGGGTAGCGA ACAGGATTAG ATACCCTGGT AGTGCACGCC GTAAACGGTG GGCGCTAGGT 781 GTGGGTTTCC TTACACGGGA TCCGTGCCGT AGCTAACGCA TTAACCGCCC CGCCTGGGGA 841 GTACGGCTGC AAGGCTAAAA CTCAAAGGAA TTCACGGGGG CCCGCACAAG CGGCGGAGCA 901 TGTGGATTAA TTCGATGCAA CGCGAAGAAC CTTACCTGGG TTTGACATAC ACCGGACCGC 961 CCCAGAGATG GGGTTTCCCT TGTGGTCGGT GTACAGGTGG TGCATGGCCG TCGTCAGCTC 1021 GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT AAGTCTCGCA ACGAGCGCAA CCCTTGTCCT GTGTTGCCAG 1081 CACGTAATGG TGGGGACTCG CAGGAGACTG CCGGGGTCAA CTCGGAGGAA GGTGGGGACG 1141 ACGTCAAGTC ATCATGCCCC TTATGTCCAG GGCTTCACAC ATGCTACAAT GGCCGGTACA 1201 GAGGGCTGGG ATACCGCGAG GTGGAGCGAA TCCCTTAAAG CCGGTCTCAG TTCGGATCGG 1261 GGTCTGCAAC TCGACCCCGT GAAGTTGGAG TCGCTAGTAA TCGCAGATCA GCAACGCTGC 1321 GGTGAATACG TTCCCGGGCC TTGTACACAC CGCCCGTCAC GTCATGAAAG TCGGTAACAC 1381 CTGAAGCCGG TGGTCTAACC CCTCGTGGGA GGGAGCCGCC GAAGGTGGGA TCGGCGATTG 1441 GGACGAAGTC GTAACAAGGT AGCCGTACCG GAAGGTGCG