受油污污染湿地的微生物修复方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201010290937.9	申请日：	2010.09.21
公开号：	CN101972774A	公开日：	2011.02.16
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):B09C 1/10申请公布日:20110216\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):B09C 1/10申请日:20100921\|\|\|公开
IPC分类号：	B09C1/10	主分类号：	B09C1/10
申请人：	上海大学
发明人：	刘晓艳; 王珍珍; 张新颖; 王君; 苏鹏程; 曹正楠; 田翔; 朱树超
地址：	200444 上海市宝山区上大路99号
优先权：
专利代理机构：	上海上大专利事务所(普通合伙) 31205	代理人：	陆聪明
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内容摘要

本发明涉及一种受污染湿地的微生物修复方法。该方法的具体步骤为：采集待修复的受油污污染湿地的土壤，用含有所受的油污的无机盐培养基进行土著嗜油菌的筛选，并扩大化培养筛选土著嗜油菌，将其以尿素浓度为4g/L，过磷酸钙浓度为1.5g/L的营养底物制成OD600≈0.5的活性菌制剂，以掘孔倾倒的方式，按照每100kg土壤10L活性菌制剂的比例投加质量比约为10∶1，投入到所述的待修复湿地的受油污污染的土壤中。该嗜油菌群具有良好的去除水与含水率高的油污土中柴油的能力，能在7天之内去除柴油污水中15.21～33.05％的柴油，室外自然条件下，能在30～60d之内对污泥中的柴油去除率达到20.33～85.55％。且菌群在生长2个月后嗜油菌群数量稳定，且不对生态环境产生威胁。表明该嗜油菌群在微生物处理石油污染物方面有很好的应用前景，但更细致的研究工作有待进行。

权利要求书

1：一种受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于该方法的具体步骤为：采集待修复的受油污污染湿地的土壤，用含有所受的油污的无机盐培养基进行土著嗜油菌的筛选，并扩大化培养筛选土著嗜油菌，将其以尿素浓度为 4g/L，过磷酸钙浓度为 1.5g/L 的营养底物制成 OD600 ≈ 0.5 的活性菌制剂，以掘孔倾倒的方式，按照每 100kg 土壤 10L 活性菌制剂的比例投入到油类污染的湿地土壤中。
2：根据权利要求 1 所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的受油污污染湿地有：海洋、江河、湖泊岸带的受油污污染湿地。
3：根据权利要求 1 所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的受油污污染为：受汽油、柴油、重油、原油或废弃油污排放带来的污染。
4：根据权利要求 1 所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于受油污污染的土壤中油污的浓度为 1000 ～ 20000mg/kg。
5：根据权利要求 1 所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的土著嗜油菌的筛选为：在 100ml 含有 100mg/L 油污浓度的无机盐培养基中培养 10g 受油污污染的土壤，每天取样涂油污平板、分离菌种；再将该菌种加入到含有更高油污浓度的无机盐培养基中培养，分离菌种，如此反复至最终含油污的浓度为 8460mg/L，筛选出最终菌种；将该最终筛选得到的菌种接种于富集培养基中，置于 37℃、 100 ～ 150r/min 的摇床培养至对数生长期，离心收集菌体；重新悬浮于灭菌营养液中，制成 OD600 ≈ 0.5 的活性菌制剂。
6：根据权利要求 5 所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的含有所受的油污的无机盐培养基为： K2HPO41g， KH2PO41g， NaCl 0.5g， NH4(SO4)20.5g， MgSO40.2g， KNO30.2g， CaCl20.02g， NaCl 0.5g， FeCl3 痕量，微生素母液 0.1ml， 8.46 ～ 84.6g 油污，蒸馏水 1000ml， pH
7： 5。 7. 根据权利要求 5 所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的富集培养基为：蛋白胨 10g/L，牛肉膏 5g/L，氯化钠 5g/L，油污 42.3g/L，蒸馏水 1000ml/L， pH 7.5。 8. 根据权利要求 5 所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的菌制剂营养底物为：尿素 4g/L，过磷酸钙 1.5g/L，蒸馏水 1000ml/L， pH 7.5。
8： 46 ～ 84.6g 油污，蒸馏水 1000ml， pH 7.5。 7. 根据权利要求 5 所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的富集培养基为：蛋白胨 10g/L，牛肉膏 5g/L，氯化钠 5g/L，油污 42.3g/L，蒸馏水 1000ml/L， pH 7.5。 8. 根据权利要求 5 所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的菌制剂营养底物为：尿素 4g/L，过磷酸钙 1.5g/L，蒸馏水 1000ml/L， pH 7.5。

说明书

受油污污染湿地的微生物修复方法
    技术领域本发明涉及一种受油污污染湿地的微生物修复方法，特别是一种湿地土著嗜油菌群强化受油污污染湿地生态系统的原位微生物修复方法。
     背景技术石油的大规模开采、冶炼、运输、使用和处理过程中，污染、遗漏、井喷、输油管道泄漏等事故频发，导致严重的土壤污染。石油类污染物在水体表面形成油膜，致使水中溶氧量急剧下降，造成水生生物的大量死亡，破坏水生生态环境和渔业资源；还可进入地下水系，直接污染地下水源，影响居民用水和农田灌溉；石油中的一些致畸致癌物质还可通过食物链的生物富集作用而直接危害人类健康。石油烃种类多，分子结构稳定且构象复杂，毒性大，生物效应缓慢。而石油烃在环境中污染面广而分，不易集中治理。油污废水已经成为环保水处理领域的一项技术难题。目前，石油类污水的处理采用非生物方法和生物方法，非生物方法处理对于应急溢油污染事件效果好，但处理费用高，耗费人力财力。生化方法一直是水处理工艺中的首先方法，因石油类污染的特殊性，一般的传统活性污泥法， SBR 法，生物滤池等，都不适用于会在水体表面形成油膜的油污水的处理，因此需要特殊的微生物。柴油在石油类污染中具有代表性。近年来，国内外已有嗜油菌处理含油污水的报道，而对于含高浓度柴油污水有高效降解率的微生物处理方法，还属于研究的薄弱环节。
     利用自然界广泛存在的微生物对有机物很强的分解代谢能力对石油烃污染环境进行修复，具有其它方法不可替代的优势。大量的资料调研结果表明，石油烃污染物修复势在必行，生物修复不但可行，并且对环境造成的负面影响小。生物修复中微生物的作用占优势。因此获得优良的微生物，并研究其降解特性，对于成功实施环境修复十分重要。土著微生物相对于外源混合菌在石油污染土壤的生物修复中可以发挥更重要的作用。
     发明内容本发明的目的是提供一种受油污污染湿地的微生物修复方法。
     为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
     一种受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于该方法的具体步骤为：采集待修复的受油污污染湿地的土壤，用含有所受的油污的无机盐培养基进行土著嗜油菌的筛选，并扩大化培养筛选土著嗜油菌，将其以尿素浓度为 4g/L，过磷酸钙浓度为 1.5g/L 的营养底物制成 OD 600 ≈ 0.5 的活性菌制剂，以掘孔倾倒的方式，按照每 100kg 土壤 10L 活性菌制剂的比例投入到油类污染的湿地土壤中。
     上述的受油污污染湿地有：海洋、江河、湖泊岸带的受油污污染湿地。
     上述的受油污污染为：受汽油、柴油、重油、原油或废弃油污排放带来的污染。
     上述的受油污污染的土壤中油污的浓度为 1000 ～ 20000mg/kg。
     上述的土著嗜油菌的筛选为：在 100ml 含有 100mg/L 油污浓度的无机盐培养基中培养 10g 受油污污染的土壤，每天取样涂油污平板、分离菌种；再将该菌种加入到含有更高
     油污浓度的无机盐培养基中培养，分离菌种，如此反复至最终含油污的浓度为 8460mg/L，筛选出最终菌种；将该最终筛选得到的菌种接种于富集培养基中，置于 37℃、 100 ～ 150r/min 的摇床培养至对数生长期，离心收集菌体；重新悬浮于灭菌营养液中，制成 OD600 ≈ 0.5 的活性菌制剂。
     上述的含有所受的油污的无机盐培养基为： K2HPO41g， KH2PO41g， NaCl 0.5g， NH4(SO4)20.5g， MgSO40.2g， KNO30.2g， CaCl20.02g， NaCl 0.5g， FeCl3 痕量，微生素母液 0.1ml， 8.46 ～ 84.6g 油污，蒸馏水 1000ml， pH 7.5。
     上述的富集培养基为：蛋白胨 10g/L，牛肉膏 5g/L，氯化钠 5g/L，油污 42.3g/L，蒸馏水 1000ml/L， pH 7.5。
     上述的菌制剂营养底物为：尿素 4g/L，过磷酸钙 1.5g/L，蒸馏水 1000ml/L， pH 7.5。
     将菌种接入富集培养基中， 37℃、 100 ～ 150r/min 的摇床培养 1d。测定该嗜油菌群的生长曲线，生长期用 FDA( 荧光素双醋酸酯 ) 法测定以柴油为唯一碳源生长的菌种活性 [ 俞毓馨，吴国庆，孟宪庭 . 环境工程微生物检验手册 [M]. 北京：中国环境科学出版社， 1990]。并进行该菌种的耐湿、耐酸碱、耐盐实验，比较培养前后菌数的变化。并在最适宜的生长条件下富集培养菌群，并制成具有一定营养成分的活性菌制剂来应用到油污降解中。
     本发明有益效果：从黄浦江 - 长江口湿地油污土壤中筛选得到 3 株在高浓度柴油条件下具有一定生长能力的嗜油菌群。该嗜油菌群具有良好的去除水与含水率高的油污土中柴油的能力，能在 7 天之内去除柴油污水中 15.21 ～ 33.05％的柴油，室外自然条件下，能在 30 ～ 60d 之内对污泥中的柴油去除率达到 20.33 ～ 85.55％。且菌群在生长 2 个月后嗜油菌群数量稳定，且不对生态环境产生威胁。表明该嗜油菌群在微生物处理石油污染物方面有很好的应用前景，但更细致的研究工作有待进行。附图说明
     图 1 嗜油菌群中各菌的生长曲线
     图 2 嗜油菌群中各菌的适宜生长温度
     图 3 嗜油菌群中各菌的适宜生长 pH 值
     图 4 嗜油菌群中各菌的适宜生长盐度
     图 5 嗜油菌群降解柴油各组分特征
     图 6 嗜油菌群降解柴油污染物特征 ( 第 30 天时 )
     图 7 嗜油菌群降解柴油污染物特征 ( 第 60 天时 ) 具体实施方式
     本实施例以黄浦江 - 长江口湿地 (N31° 23’ 5.4” E121° 30’ 28.3” ) 受石油类污染土壤为例说明本发明的嗜油菌群降解柴油油污的方法及效果。
     一、材料与方法
     1、菌源和菌采集环境
     (1) 菌源：黄浦江 - 长江口湿地 (N31° 23’ 5.4” E121° 30’ 28.3” ) 受石油类污染沉积物；(2) 沉积物基本理化性质见表 1 所列。表 1 黄浦江 - 长江口湿地沉积物性质分析2、供试柴油
     供试柴油为零号柴油：上海市宝山区中石化明和加油站购买。
     3、培养基
     筛选培养基： K2HPO41g， KH2PO41g， NaCl 0.5g， NH4(SO4)20.5g， MgSO40.2g， KNO30.2g， CaCl20.02g， NaCl 0.5g， FeCl3 痕量，微生素母液 0.1ml， 8.46 ～ 84.6g 柴油，蒸馏水 1000ml， pH 7.5 ；
     富集培养基 (g/L) ：蛋白胨 10g，牛肉膏 5g，氯化钠 5g，柴油 42.3g，蒸馏水 1000ml， pH7.5 ；
     微生素母液：硫胺素 10mg、核黄素 5mg，维生素 B65mg，泛酸钙 20mg，对 - 氨基苯甲酸 5mg，烟碱 5mg，肌醇 100mg，用无菌水定容至 1000ml，用 0.4μm 滤膜过滤除菌；
     以上培养基分别于 121℃高压灭菌 30min 后备用。
     4、实验仪器和设备
     常用小型设备：恒温振荡器，光照生物培养箱，蒸汽灭菌锅， 755 型分光光度计，超声波清洗机，光学显微镜，超净工作台， pH 计；
     中大型仪器： PCR 反应扩增仪 ( 加拿大 BBI 公司 ) ； 3730 测序列分析仪 ( 美国 ABI 公司) ； DK-8D 型电热恒温水槽 ( 上海森信实验仪器有限公司 ) ； DYY-8 型稳压稳流电泳仪 ( 上海琪特分析仪器有限公司 ) ； YXJ-2 离心机 ( 湘仪离心机仪器有限公司 )H6-1 微型电泳槽 ( 上海精益有机玻璃制品仪器厂 ) ；凝胶成像系统 (Gene Genius 公司 ) ； Agilent 6890GC。
     5、嗜油菌群的筛选方法
     菌种筛选自有石油污染历史的目标污染地黄浦江溢油污染湿地，采用 100ml 细菌筛选培养基培养 10g 油污土。每天取样涂原油平板，分离菌种；将菌种接种于富集培养基中，置于 37℃、 100 ～ 150r/min 的摇床培养至对数生长期，离心收集菌体；将菌体接种入装有一定柴油浓度的摇瓶中进行耐油实验，培养 48h 后用平板计数法检查活菌数，筛选得到 3 株以柴油为碳源，长势较快的细菌菌株组成的嗜油菌群。
     二、油降解菌菌液的制备
     将菌种接入富集培养基中， 37℃、 100 ～ 150r/min 的摇床培养 1d，测定该嗜油菌群的生长曲线，每隔 2 小时取样，分光光度计测定 OD600 吸收值。生长情况如图 1 所示。生长期用 FDA( 荧光素双醋酸酯 ) 法测定以柴油为唯一碳源生长的菌种活性 [ 俞毓馨，吴国庆，孟宪庭 . 环境工程微生物检验手册 [M]. 北京：中国环境科学出版社， 1990]。并进行该菌种的耐湿、耐酸碱、耐盐实验，比较培养前后菌数的变化。
     嗜油菌适宜生长条件的选择：接种一环菌种接入种子培养基中，分别于 20， 25， 30， 32， 35， 40℃下培养 48h 后用紫外分光光度计于 600nm 处测量其 OD 值。接种一环菌于 pH
     值分别为 5， 6， 7， 7.5， 8， 9， 10 的种子培养基中， 30℃培养 48h 后于 600nm 处测 OD 值。接种一环菌种于 NaCl 含量分别为 0， 0.5％， 1.0％， 3.0％， 5.0％， 7.0％的种子培养基中， 30℃培养 48h 后于 600nm 处测 OD 值。
     得该嗜油菌群中各菌在各种条件下的生长情况如图 2、 3、 4 所示。嗜油菌的总体适宜生长温度为 30℃，适宜 pH 值为 7.5，适宜盐度为 0 ～ 1％。将菌种接种于最适宜生长条件下的富集培养基中，置于 37℃、 100 ～ 150r/min 的摇床培养 12h 至对数生长期，离心收集菌体；重新悬浮于灭菌营养液中，制成 OD600 ≈ 0.5 的活性菌制剂。菌制剂营养底物 (g/L) ：尿素 4，过磷酸钙 1.5，蒸馏水 1000， pH 7.5。
     三、嗜油菌群的应用
     1、接种单菌落于富集培养基中， 30℃培养 24h，制成菌悬液，以 10％的接种量接入含油无机盐培养基中检测菌株对柴油的降解效果。石油烃浓度分别为 84.6g/L，每种菌做 3 个重复，同时做三个不接菌对照。置于 30℃恒温摇床上 120rpm 培养 7d。
     降解率计算公式：
     菌株对石油降解率＝ ( 空白含油率 - 接菌含油率 )/ 空白含油率 ×100％
     各单菌株对柴油的去除率为 15.21 ～ 33.05％。经气相色谱测定具体各组分情况见图 5。2、接种活性菌液于 1000、 5000、 10000、 15000、 20000mg/kg 五个浓度梯度的柴油污泥，室外放置半月后，按照每 100kg 土壤 10L 活性菌制剂的比例投加，在以后 60 天内测定各梯度油污泥中油含量，以此值作为初始油浓度。具另设一组不加菌悬液的对照。在堆料 5 厘米深处进行多点采样，混合均匀风干后测油含量。并采鲜土样进行土样中菌数量的计算。实验共进行 60d。室外培养 30 天后柴油浓度为 1000mg/kg 的污泥中柴油降解率最高，为 22.5％，而在 60 天时柴油浓度为 20000mg/kg 的污泥中柴油降解率最高，达到 25.19％。第 30 天时的柴油降解情况见图 6， 60 天时的柴油降解情况见图 7。
     本发明分离、筛选出的嗜油菌群具有较好降解高浓度柴油污水的功能。这就为降解高浓度柴油污水与污泥提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。本发明的积极效果在于；菌制剂的菌源来自于其原生态环境，在适量营养物质补及情况下能够极快形成微生态优势菌群，发挥其降解有机物、促生、益生的作用；具有适应性强、对湿地生态环境修复效果好、活菌数高等特点。该土著菌群富集投加法适用于许多不同的环境条件下，属于环境友好型修复措施，可再进一步研究其应用于石油类污染的处理中。

资源描述

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1、(10)申请公布号 CN 101972774 A(43)申请公布日 2011.02.16CN101972774A*CN101972774A*(21)申请号 201010290937.9(22)申请日 2010.09.21B09C 1/10(2006.01)(71)申请人上海大学地址 200444 上海市宝山区上大路99号(72)发明人刘晓艳王珍珍张新颖王君苏鹏程曹正楠田翔朱树超(74)专利代理机构上海上大专利事务所(普通合伙) 31205代理人陆聪明(54) 发明名称受油污污染湿地的微生物修复方法(57) 摘要本发明涉及一种受污染湿地的微生物修复方法。该方法的具体步骤为：采集待修复。

2、的受油污污染湿地的土壤，用含有所受的油污的无机盐培养基进行土著嗜油菌的筛选，并扩大化培养筛选土著嗜油菌，将其以尿素浓度为4g/L，过磷酸钙浓度为1.5g/L的营养底物制成OD6000.5的活性菌制剂，以掘孔倾倒的方式，按照每100kg土壤10L活性菌制剂的比例投加质量比约为101，投入到所述的待修复湿地的受油污污染的土壤中。该嗜油菌群具有良好的去除水与含水率高的油污土中柴油的能力，能在7天之内去除柴油污水中15.2133.05的柴油，室外自然条件下，能在3060d之内对污泥中的柴油去除率达到20.3385.55。且菌群在生长2个月后嗜油菌群数量稳定，且不对生态环境产生威胁。表明该嗜油菌群在微生。

3、物处理石油污染物方面有很好的应用前景，但更细致的研究工作有待进行。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 4 页附图 3 页CN 101972776 A 1/1页21.一种受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于该方法的具体步骤为：采集待修复的受油污污染湿地的土壤，用含有所受的油污的无机盐培养基进行土著嗜油菌的筛选，并扩大化培养筛选土著嗜油菌，将其以尿素浓度为4g/L，过磷酸钙浓度为1.5g/L的营养底物制成OD6000.5的活性菌制剂，以掘孔倾倒的方式，按照每100kg土壤10L活性菌制剂的比例投入到油类污染的湿地土壤中。。

4、2.根据权利要求1所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的受油污污染湿地有：海洋、江河、湖泊岸带的受油污污染湿地。3.根据权利要求1所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的受油污污染为：受汽油、柴油、重油、原油或废弃油污排放带来的污染。4.根据权利要求1所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于受油污污染的土壤中油污的浓度为100020000mg/kg。5.根据权利要求1所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的土著嗜油菌的筛选为：在100ml含有100mg/L油污浓度的无机盐培养基中培养10g受油污污染的土壤，每天取样涂油污平板、分离菌种；再将该。

5、菌种加入到含有更高油污浓度的无机盐培养基中培养，分离菌种，如此反复至最终含油污的浓度为8460mg/L，筛选出最终菌种；将该最终筛选得到的菌种接种于富集培养基中，置于37、100150r/min的摇床培养至对数生长期，离心收集菌体；重新悬浮于灭菌营养液中，制成OD6000.5的活性菌制剂。6.根据权利要求5所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的含有所受的油污的无机盐培养基为：K2HPO41g，KH2PO41g，NaCl 0.5g，NH4(SO4)20.5g，MgSO40.2g，KNO30.2g，CaCl20.02g，NaCl 0.5g，FeCl3痕量，微生素母液0.1ml，8.。

6、4684.6g油污，蒸馏水1000ml，pH 7.5。7.根据权利要求5所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的富集培养基为：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，油污42.3g/L，蒸馏水1000ml/L，pH 7.5。8.根据权利要求5所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的菌制剂营养底物为：尿素4g/L，过磷酸钙1.5g/L，蒸馏水1000ml/L，pH 7.5。权利要求书CN 101972774 ACN 101972776 A 1/4页3受油污污染湿地的微生物修复方法技术领域0001 本发明涉及一种受油污污染湿地的微生物修复方法，特别是一。

7、种湿地土著嗜油菌群强化受油污污染湿地生态系统的原位微生物修复方法。背景技术0002 石油的大规模开采、冶炼、运输、使用和处理过程中，污染、遗漏、井喷、输油管道泄漏等事故频发，导致严重的土壤污染。石油类污染物在水体表面形成油膜，致使水中溶氧量急剧下降，造成水生生物的大量死亡，破坏水生生态环境和渔业资源；还可进入地下水系，直接污染地下水源，影响居民用水和农田灌溉；石油中的一些致畸致癌物质还可通过食物链的生物富集作用而直接危害人类健康。石油烃种类多，分子结构稳定且构象复杂，毒性大，生物效应缓慢。而石油烃在环境中污染面广而分，不易集中治理。油污废水已经成为环保水处理领域的一项技术难题。目前，石油类污水。

8、的处理采用非生物方法和生物方法，非生物方法处理对于应急溢油污染事件效果好，但处理费用高，耗费人力财力。生化方法一直是水处理工艺中的首先方法，因石油类污染的特殊性，一般的传统活性污泥法，SBR法，生物滤池等，都不适用于会在水体表面形成油膜的油污水的处理，因此需要特殊的微生物。柴油在石油类污染中具有代表性。近年来，国内外已有嗜油菌处理含油污水的报道，而对于含高浓度柴油污水有高效降解率的微生物处理方法，还属于研究的薄弱环节。0003 利用自然界广泛存在的微生物对有机物很强的分解代谢能力对石油烃污染环境进行修复，具有其它方法不可替代的优势。大量的资料调研结果表明，石油烃污染物修复势在必行，生物修复不但。

9、可行，并且对环境造成的负面影响小。生物修复中微生物的作用占优势。因此获得优良的微生物，并研究其降解特性，对于成功实施环境修复十分重要。土著微生物相对于外源混合菌在石油污染土壤的生物修复中可以发挥更重要的作用。发明内容0004 本发明的目的是提供一种受油污污染湿地的微生物修复方法。0005 为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：0006 一种受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于该方法的具体步骤为：采集待修复的受油污污染湿地的土壤，用含有所受的油污的无机盐培养基进行土著嗜油菌的筛选，并扩大化培养筛选土著嗜油菌，将其以尿素浓度为4g/L，过磷酸钙浓度为1.5g/L的营养底物制成OD6000.。

10、5的活性菌制剂，以掘孔倾倒的方式，按照每100kg土壤10L活性菌制剂的比例投入到油类污染的湿地土壤中。0007 上述的受油污污染湿地有：海洋、江河、湖泊岸带的受油污污染湿地。0008 上述的受油污污染为：受汽油、柴油、重油、原油或废弃油污排放带来的污染。0009 上述的受油污污染的土壤中油污的浓度为100020000mg/kg。0010 上述的土著嗜油菌的筛选为：在100ml含有100mg/L油污浓度的无机盐培养基中培养10g受油污污染的土壤，每天取样涂油污平板、分离菌种；再将该菌种加入到含有更高说明书CN 101972774 ACN 101972776 A 2/4页4油污浓度的无机盐培。

11、养基中培养，分离菌种，如此反复至最终含油污的浓度为8460mg/L，筛选出最终菌种；将该最终筛选得到的菌种接种于富集培养基中，置于37、100150r/min的摇床培养至对数生长期，离心收集菌体；重新悬浮于灭菌营养液中，制成OD6000.5的活性菌制剂。0011 上述的含有所受的油污的无机盐培养基为：K2HPO41g，KH2PO41g，NaCl 0.5g，NH4(SO4)20.5g，MgSO40.2g，KNO30.2g，CaCl20.02g，NaCl 0.5g，FeCl3痕量，微生素母液0.1ml，8.4684.6g油污，蒸馏水1000ml，pH 7.5。0012 上述的富集培养基为：蛋白胨1。

12、0g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，油污42.3g/L，蒸馏水1000ml/L，pH 7.5。0013 上述的菌制剂营养底物为：尿素4g/L，过磷酸钙1.5g/L，蒸馏水1000ml/L，pH 7.5。0014 将菌种接入富集培养基中，37、100150r/min的摇床培养1d。测定该嗜油菌群的生长曲线，生长期用FDA(荧光素双醋酸酯)法测定以柴油为唯一碳源生长的菌种活性俞毓馨，吴国庆，孟宪庭.环境工程微生物检验手册M.北京：中国环境科学出版社，1990。并进行该菌种的耐湿、耐酸碱、耐盐实验，比较培养前后菌数的变化。并在最适宜的生长条件下富集培养菌群，并制成具有一定营养成分的活性菌制剂来。

13、应用到油污降解中。0015 本发明有益效果：从黄浦江-长江口湿地油污土壤中筛选得到3株在高浓度柴油条件下具有一定生长能力的嗜油菌群。该嗜油菌群具有良好的去除水与含水率高的油污土中柴油的能力，能在7天之内去除柴油污水中15.2133.05的柴油，室外自然条件下，能在3060d之内对污泥中的柴油去除率达到20.3385.55。且菌群在生长2个月后嗜油菌群数量稳定，且不对生态环境产生威胁。表明该嗜油菌群在微生物处理石油污染物方面有很好的应用前景，但更细致的研究工作有待进行。附图说明0016 图1嗜油菌群中各菌的生长曲线0017 图2嗜油菌群中各菌的适宜生长温度0018 图3嗜油菌群中各菌的适宜生长p。

14、H值0019 图4嗜油菌群中各菌的适宜生长盐度0020 图5嗜油菌群降解柴油各组分特征0021 图6嗜油菌群降解柴油污染物特征(第30天时)0022 图7嗜油菌群降解柴油污染物特征(第60天时)具体实施方式0023 本实施例以黄浦江-长江口湿地(N31235.4”E1213028.3”)受石油类污染土壤为例说明本发明的嗜油菌群降解柴油油污的方法及效果。0024 一、材料与方法0025 1、菌源和菌采集环境0026 (1)菌源：黄浦江-长江口湿地(N31 235.4”E121 3028.3”)受石油类污染沉积物；说明书CN 101972774 ACN 101972776 A 3/4页5002。

15、7 (2)沉积物基本理化性质见表1所列。0028 表1黄浦江-长江口湿地沉积物性质分析0029 0030 2、供试柴油0031 供试柴油为零号柴油：上海市宝山区中石化明和加油站购买。0032 3、培养基0033 筛选培养基：K2HPO41g，KH2PO41g，NaCl 0.5g，NH4(SO4)20.5g，MgSO40.2g，KNO30.2g，CaCl20.02g，NaCl 0.5g，FeCl3痕量，微生素母液0.1ml，8.4684.6g柴油，蒸馏水1000ml，pH 7.5；0034 富集培养基(g/L)：蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，柴油42.3g，蒸馏水1000ml，pH7.5。

16、；0035 微生素母液：硫胺素10mg、核黄素5mg，维生素B65mg，泛酸钙20mg，对-氨基苯甲酸5mg，烟碱5mg，肌醇100mg，用无菌水定容至1000ml，用0.4m滤膜过滤除菌；0036 以上培养基分别于121高压灭菌30min后备用。0037 4、实验仪器和设备0038 常用小型设备：恒温振荡器，光照生物培养箱，蒸汽灭菌锅，755型分光光度计，超声波清洗机，光学显微镜，超净工作台，pH计；0039 中大型仪器：PCR反应扩增仪(加拿大BBI公司)；3730测序列分析仪(美国ABI公司)；DK-8D型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司)；DYY-8型稳压稳流电泳仪(上海琪特分析。

17、仪器有限公司)；YXJ-2离心机(湘仪离心机仪器有限公司)H6-1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂)；凝胶成像系统(Gene Genius公司)；Agilent 6890GC。0040 5、嗜油菌群的筛选方法0041 菌种筛选自有石油污染历史的目标污染地黄浦江溢油污染湿地，采用100ml细菌筛选培养基培养10g油污土。每天取样涂原油平板，分离菌种；将菌种接种于富集培养基中，置于37、100150r/min的摇床培养至对数生长期，离心收集菌体；将菌体接种入装有一定柴油浓度的摇瓶中进行耐油实验，培养48h后用平板计数法检查活菌数，筛选得到3株以柴油为碳源，长势较快的细菌菌株组成的嗜油菌群。0。

18、042 二、油降解菌菌液的制备0043 将菌种接入富集培养基中，37、100150r/min的摇床培养1d，测定该嗜油菌群的生长曲线，每隔2小时取样，分光光度计测定OD600吸收值。生长情况如图1所示。生长期用FDA(荧光素双醋酸酯)法测定以柴油为唯一碳源生长的菌种活性俞毓馨，吴国庆，孟宪庭.环境工程微生物检验手册M.北京：中国环境科学出版社，1990。并进行该菌种的耐湿、耐酸碱、耐盐实验，比较培养前后菌数的变化。0044 嗜油菌适宜生长条件的选择：接种一环菌种接入种子培养基中，分别于20，25，30，32，35，40下培养48h后用紫外分光光度计于600nm处测量其OD值。接种一环菌于pH说。

19、明书CN 101972774 ACN 101972776 A 4/4页6值分别为5，6，7，7.5，8，9，10的种子培养基中，30培养48h后于600nm处测OD值。接种一环菌种于NaCl含量分别为0，0.5，1.0，3.0，5.0，7.0的种子培养基中，30培养48h后于600nm处测OD值。0045 得该嗜油菌群中各菌在各种条件下的生长情况如图2、3、4所示。嗜油菌的总体适宜生长温度为30，适宜pH值为7.5，适宜盐度为01。将菌种接种于最适宜生长条件下的富集培养基中，置于37、100150r/min的摇床培养12h至对数生长期，离心收集菌体；重新悬浮于灭菌营养液中，制成OD6000。

20、.5的活性菌制剂。菌制剂营养底物(g/L)：尿素4，过磷酸钙1.5，蒸馏水1000，pH 7.5。0046 三、嗜油菌群的应用0047 1、接种单菌落于富集培养基中，30培养24h，制成菌悬液，以10的接种量接入含油无机盐培养基中检测菌株对柴油的降解效果。石油烃浓度分别为84.6g/L，每种菌做3个重复，同时做三个不接菌对照。置于30恒温摇床上120rpm培养7d。0048 降解率计算公式：0049 菌株对石油降解率(空白含油率-接菌含油率)/空白含油率1000050 各单菌株对柴油的去除率为15.2133.05。经气相色谱测定具体各组分情况见图5。2、接种活性菌液于1000、5000、100。

21、00、15000、20000mg/kg五个浓度梯度的柴油污泥，室外放置半月后，按照每100kg土壤10L活性菌制剂的比例投加，在以后60天内测定各梯度油污泥中油含量，以此值作为初始油浓度。具另设一组不加菌悬液的对照。在堆料5厘米深处进行多点采样，混合均匀风干后测油含量。并采鲜土样进行土样中菌数量的计算。实验共进行60d。室外培养30天后柴油浓度为1000mg/kg的污泥中柴油降解率最高，为22.5，而在60天时柴油浓度为20000mg/kg的污泥中柴油降解率最高，达到25.19。第30天时的柴油降解情况见图6，60天时的柴油降解情况见图7。0051 本发明分离、筛选出的嗜油菌群具有较好降解高浓。

22、度柴油污水的功能。这就为降解高浓度柴油污水与污泥提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。本发明的积极效果在于；菌制剂的菌源来自于其原生态环境，在适量营养物质补及情况下能够极快形成微生态优势菌群，发挥其降解有机物、促生、益生的作用；具有适应性强、对湿地生态环境修复效果好、活菌数高等特点。该土著菌群富集投加法适用于许多不同的环境条件下，属于环境友好型修复措施，可再进一步研究其应用于石油类污染的处理中。说明书CN 101972774 ACN 101972776 A 1/3页7图1图2图3说明书附图CN 101972774 ACN 101972776 A 2/3页8图4图5图6说明书附图CN 101972774 ACN 101972776 A 3/3页9图7说明书附图CN 101972774 A。

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