组织改造雌性生殖器官的建造.pdf

本发明涉及用于重构人造雌性生殖器官的组合物和方法。本发明的构造和方法利用组织改造的雌性生殖器官，如子宫、阴道、子宫颈、和输卵管改善先天性畸形和雌性生殖道疾病。这些组织改造的雌性生殖器官可通过灌注源于雌性生殖组织，如子宫、阴道、子宫颈、输卵管上皮细胞和平滑肌细胞的培养细胞群体产生。

权利要求书
1.  一种用于重构雌性生殖器官或组织结构的构造，它包括：可植入的生物相容性基质，和至少两种不同的细胞群体，细胞群体沉积在生物相容性基质上或生物相容性基质中，并被培养形成雌性生殖器官或组织；其中两种不同细胞群体中的至少一种包括雌性生殖细胞群体。

2.  根据权利要求1所述的构造，其中第一细胞群体包括基本同型的雌性生殖上皮细胞群体。

3.  根据权利要求1所述的构造，其中第二细胞群体包括基本同型的平滑肌细胞群体。

4.  根据权利要求1所述的构造，其中所述雌性生殖器官或组织结构选自阴道、子宫、输卵管、和子宫颈。

5.  根据权利要求1所述的构造，其中所述生物相容性基质是由至少一种聚合材料形成的，所述聚合材料选自纤维素醚、纤维素、纤维素酯、氟化聚乙烯、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚苯并唑、聚碳酸酯、聚氰基芳基醚、聚酯、聚酯碳酸酯、聚醚、聚醚醚酮、聚醚酰亚胺、聚醚酮、聚醚砜、聚乙烯、聚氟代烯烃、聚乙醇酸、聚酰亚胺、聚烯烃、聚二唑、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、聚硫化物、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚三唑、聚氨酯、聚乙烯基化合物、聚偏二氟乙烯、再生纤维素、聚硅氧烷、脲-甲醛聚合物、其共聚物和物理混合物。

6.  根据权利要求1所述的构造，其中所述生物相容性基质包括去细胞化的结构。

7.  根据权利要求1所述的构造，其中所述生物相容性基质包括聚乙醇酸聚合物。

8.  根据权利要求1所述的构造，其中所述雌性生殖器官或组织结构是具有沉积在基质表面上的雌性生殖上皮细胞和沉积在基质另一表面上的平滑肌细胞的雌性生殖器官。

说明书组织改造雌性生殖器官的建造
本申请是国际申请日为2002年11月15日、国际申请号为PCT/US02/36965(本国申请号为02827224.2)、发明名称为“组织改造雌性生殖器官的建造”的申请的分案申请。
优先权
本发明要求2001年11月16日提交的名称为：组织改造雌性生殖器官的建造的美国临时申请第60/331,503号的优先权。
技术领域
本发明的技术领域为组织工程，具体而言，为组织改造雌性生殖器官的构造。本发明特别用于构造组织改造的阴道、输卵管、子宫、和子宫颈。
背景技术
现有的多种病理性疾病都会影响外生殖器并要求进行广泛性外科手术干预(Hendren，H.W.(1998).泄殖腔畸形“Campbell’sUrology”7th ed.，Saunders，Philadelphia，1991-2001)。雄性生殖器重构利用组织工程学获得了最多目前报道的长期临床成功以及对尿道重构的确实适合性(Atala等，J.Urol.162：1148-1151(1999)；Chen等，World J.Urol.18(1)67-70(2000))。当然，其它疾病，像泄殖腔畸形和外翻可导致雄性和雌性的严重生殖器模糊。然而，缺乏有关雌性生殖器和阴道重构的信息。
对于妇科患者而言，阴道、子宫颈、和子宫的先天性畸形具有很深刻的暗示。这些异常时常在青春期被检测出来。为了进行适当的处理，医生需要彻底了解正常的胚胎学和性分化。虽然临床经验可帮助妇科医生了解复杂的解剖学构型，但是必需对有缺陷的每位个体进行彻底评估，因为生殖道畸变并非必定遵循任何规定和一致的模式。雌性生殖异常的例子包括模糊不清的生殖器、阴道和子宫闭锁、梗阻性流出道疾病、子宫颈闭锁、泌尿生殖窦疾病、和雄性化疾病(Edmonds，D.K.，Obstet Gynecol Clin North Am 27(1)：49-62(2000))。生殖器畸形尤其会妨害患者和她的家庭，这是因为他们不仅具有生殖疾病，而且还具有严重的心理和性问题，这种问题不仅需要解决，而且要以敏感且鼓励性的方式解决。更深一层的讨论可在教科书中找到(Rock JA“苗勒氏管异常的外科手术”Te Linde’s OperativeGynecology(第8版)，由J Rock，J.Thompson.Philadelphia，Lippincott-Raven编辑，1997；Edmonds DK：“性发育异常和它们的构造：上和下道”Pediatric and Adolescent Gynecology，由JSanfilippo，D Muram，P Lee，J Dewhurst.Philadelphia，W.B.Saunders编辑，1994；Jones HW Jr“先天性子宫阴道异常的构造”Female Reproductive Surgery，由JRock，A Murphy，HW Jones Jr.Baltimore，Williams & Wilkins编辑，1992)。
先天和后天的子宫畸形，如发育不全或再生障碍性子宫异常、癌症、创伤、和严重的炎性疾病，占雌性不孕症的较大比例。但用于子宫重构的选择有限。如果使用子宫外组织进行重构，则无法怀孕。已经实验过使用合成生物材料进行子宫组织替换，然而这些尝试没有成功，这很可能是由于子宫的复杂生理和功能特性(Jonkman等，ArtifOrgans，10：475-80，1986))。
先天性雌性生殖器异常和泄殖腔畸形，如icornuate/中隔子宫、双子宫、子宫颈和阴道闭锁、梗阻性生殖道，可能还需要广泛的外科手术构造。经常需要进行外科手术是由于可获得的天然组织量有限。目前，非-生殖道组织已经用于阴道重构，尽管存在很多相关并发症。这些治疗包括建造乙状阴道的腹膜后sacropexy的经腹方法，例如，在患有Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser综合症的患者中。然而，这些构造有脱垂倾向，导致阴道“脱落”感、疼痛、白带和性交困难，并需要进行修复。其他患者，例如，阴道和子宫颈发育不全，但仍然具有功能性子宫内膜的患者通常是通过进行传统的子宫切除，随后构造新阴道而治疗的。这就需要阴道皮肤的移植，这种移植可能会愈合不好，并可能导致月经失调。
目前，雌性生殖器官重构所用的各种方法都使用的是非同源性组织来源。然而，非同源性组织用于雌性器官重构的应用与有限的功能性有关。因此，本领域仍然需要通过改造雌性生殖和生殖器组织来解决这些问题。
因此，仍然存在生产雌性生殖器官的需要，例如使用自体细胞生产生殖道的器官和组织。
发明内容
本发明提供使用组织改造雌性生殖器官改善雌性生殖道先天性畸形和疾病的组合物及方法。这些组织改造雌性生殖器官可通过培养源于生殖道组织的细胞，如阴道上皮细胞、输卵管上皮细胞、子宫颈上皮细胞、子宫上皮细胞和平滑肌细胞的细胞群体而产生。将培养细胞灌注在生物相容性性基质上或生物相容性基质中。本发明的方法可用于重构雌性生殖器官，包括但不限制于，子宫颈、子宫、阴道、和输卵管。
使用雌性生殖细胞，例如，子宫上皮细胞、阴道上皮细胞、输卵管上皮细胞、和平滑肌细胞，例如子宫肌细胞的群体灌注生物相容性性基质，之后它们发育成各自的生殖道组织层。因此，一方面，本发明提供一种重构人造雌性生殖器官构造的方法，即把培养的雌性生殖细胞的第一群体灌注到生物相容性基质的一侧中，这样培养的雌性生殖细胞就可与生物相容性基质粘附；然后培养生物相容性性基质中的培养的雌性生殖细胞，直到培养的雌性生殖细胞产生第一雌性生殖组织层；将与培养的雌性生殖细胞第一群体不同的培养的雌性生殖细胞第二群体灌注到生物相容性性基质的另一侧，从而使培养的雌性生殖细胞第二群体与生物相容性性基质粘附；并培养生物相容性基质中的培养的雌性生殖细胞的第二群体，直到培养的雌性生殖道细胞产生不同于第一生殖组织层的第二雌性生殖组织层，由此建造雌性生殖器官构造。
所述人造雌性生殖器官构造还可通过在生物相容性性基质同一侧上培养生殖道细胞的第一和第二群体而建造。在一个实施方案中，所述雌性生殖器官构造可通过使用雌性生殖细胞的一个群体，例如阴道上皮细胞建造。在另一实施方案中，所述雌性生殖器官构造可通过使用雌性生殖细胞的至少2个不同群体，例如阴道上皮细胞和平滑肌细胞而建造。在其它实施方案中，所述雌性生殖器官构造可通过使用雌性生殖细胞的任何数目的不同群体，例如3个不同群体或更多群体而建造。本发明的范围内还包括这样一种雌性生殖器官构造，它是从雌性生殖细胞的至少一个群体和并非来源于雌性生殖细胞的另一群体，例如，来源于膀胱的平滑肌细胞而建造的。
另一方面，本发明提供一种重构人造子宫构造的方法，即把培养的子宫上皮细胞群体灌注到生物相容性性基质的一侧，这样子宫上皮细胞与生物相容性基质粘附；培养生物相容性基质中的子宫上皮细胞，直到上皮细胞产生子宫上皮组织层，例如，子宫内膜；将培养的平滑肌细胞，例如子宫肌细胞群体灌注到生物相容性基质的另一侧，这样子宫肌细胞与生物相容性基质粘附；并培养生物相容性基质中的子宫肌细胞，直到子宫肌细胞产生子宫肌肉组织层，由此建造人造子宫。在另一实施方案中，人造子宫可通过将细胞接种在生物相容性基质两侧上而建造。在另一实施方案中，人造子宫可通过铺层培养细胞层而建造，例如，可将子宫上皮细胞接种在生物相容性基质两侧上，然后接种平滑肌细胞，例如子宫肌细胞。另一实施方案中，可将子宫上皮细胞和平滑肌细胞同时接种在生物相容性基质上。
另一方面，本发明提供一种重构人造阴道构造的方法，即把培养的阴道上皮细胞群体灌注到可生物降解基质的一侧，这样阴道上皮细胞与生物相容性基质粘附；培养生物相容性基质中的阴道上皮细胞，直到阴道上皮细胞产生阴道上皮组织层；把培养的平滑肌细胞群体灌注到生物相容性基质的另一侧，这样平滑肌细胞与生物相容性基质粘附；培养生物相容性基质中的平滑肌细胞，直到平滑肌细胞产生平滑肌组织层，由此建造人造阴道。在另一实施方案中，人造阴道可通过在生物相容性基质两侧接种细胞而建造。在另一实施方案中，人造阴道可通过铺层培养细胞层而建造，例如将阴道上皮细胞接种在生物相容性基质的两侧，然后接种平滑肌细胞。在另一实施方案，可将阴道上皮细胞和平滑肌细胞同时接种在生物相容性基质上。
生物相容性基质可由不可降解或可降解的物质组成。生物相容性基质可形成三维支架。生物相容性基质还可由去细胞化的(decellularized)器官物质组成。当在生物相容性基质中生长时，增殖细胞成熟并适当分离形成与在体内找到的相应物类似的组织。在其它实施方案中，雌性生殖系统的一部分可用人造雌性生殖器官代替。
另一方面，本发明提供一种通过植入人造雌性生殖器官而治疗患有生殖疾病患者的方法，所述人造雌性生殖器官是如下形成的：将培养的雌性生殖道细胞第一群体灌注到生物相容性基质的一侧，这样培养的雌性生殖道细胞与生物相容性基质粘附；培养生物相容性基质中的培养的雌性生殖道细胞，直到培养的雌性生殖道细胞产生第一雌性生殖组织层；将与培养的雌性生殖道细胞第一群体不同的培养的雌性生殖道细胞的第二群体灌注到生物相容性基质的另一侧，这样培养的雌性生殖道细胞第二群体与生物相容性基质粘附；并培养生物相容性基质中的培养的雌性生殖道细胞的第二群体，直到培养的雌性生殖道细胞产生不同于第一生殖组织层的第二雌性生殖组织层；并监测生殖器官疾病患者是否适应。所述人造雌性生殖器官或组织结构显示出天然雌性生殖器官的顺应性和脉管系统。在其中一个实施方案中，所述人造雌性生殖器官是人造阴道。在另一实施方案中，所述人造雌性生殖器官是人造子宫。在另一实施方案中，所述人造雌性生殖器官是人造子宫颈。在另一实施方案中，所述人造雌性生殖器官是输卵管。
另一方面，本发明提供一种人造雌性生殖器官，它包括一个用可生物降解基质制成的三维支架，该生物降解基质是用培养的雌性生殖道细胞的至少一个群体灌注的，产生至少一层雌性生殖组织层，从而建造雌性生殖器官构造。在另一实施方案中，所述人造雌性生殖器官构造含有培养的雌性生殖道细胞的至少两个不同群体，从而产生至少两种不同的雌性生殖组织层。在一个实施方案中，两种不同的雌性生殖组织层是在生物降解基质的同一侧上产生的。在另一实施方案中，两种不同的雌性生殖组织层是在生物降解基质的两个不同侧面上产生的。在另一实施方案中，将第一和第二细胞群体灌注到分开的基质层中或基质层上，且将这些基质层在灌注后结合在一起。
另一方面，本发明提供一种筛选调节雌性生殖细胞的化合物的方法。该方法包括提供一种可植入的生物相容性基质，该基质已经用雌性生殖细胞群体和平滑肌细胞群体灌注，这样雌性生殖细胞群体与形成具有正常子宫组织顺应性的组织结构的肌细胞群体粘附；使人造雌性生殖器官与供试化合物库接触；从供试化合物库选择可调节雌性生殖细胞的目标化合物。所述化合物可以是化学品或药物，它可能是细胞毒性的，治疗性的，影响胚胎的植入，或调节收缩。
附图说明
图1是表示植入6周后，正常和组织改造(TE)阴道在不同水平电刺激下的激发电位的曲线图；
图2A是描述正常子宫组织对电场刺激的反应的曲线图；
图2B是描述正常子宫组织对卡巴胆碱(CA)和阿托品(AT)药物刺激的反应的曲线图；
图2C是描述正常子宫组织对脱羟肾上腺素(PE)和酚妥拉明(PL)药物刺激的反应的曲线图；
图2D是描述细胞接种的子宫植入组织对电场刺激(100v；1ms)的反应的曲线图；
图2E是描述细胞接种的子宫植入组织对卡巴胆碱(CA)和阿托品(AT)药物刺激的反应的曲线图；
图2F是描述细胞接种的子宫植入组织对脱羟肾上腺素(PE)和酚妥拉明(PL)药物刺激的反应的曲线图；
图3A是表示植入1、3、和6个月后，子宫细胞接种构造的最大张应力的曲线图；和
图3B是表示植入1、3、和6个月后，子宫细胞接种构造的最大拉伸应变的曲线图。
具体实施方式
本发明涉及雌性生殖器官或组织结构的重构，修复，增大或替换。本发明的实际操作采用组织改造方法，包括细胞培养，细胞扩增，在生物基质上进行细胞接种，以及用于进行组织替换的体内构造植入。
为了更容易理解本发明，定义了一些术语：
这里所用的术语“粘附”是指细胞与三维支架直接粘连，或细胞自身与其它细胞粘附。
这里所用的术语“生物相容性基质”、“生物相容性基底”、“聚合物支架”是指适合植入到受治疗者中、其上面可沉积细胞群体的物质。一旦植入到受治疗者中，生物相容性底物不会引起毒性或有害作用。在一个实施方案中，生物相容性基底是表面可被塑造成需要进行替换的器官的聚合物。所述聚合物还可被塑造成需要进行替换的器官的一部分。在另一实施方案中，生物相容性基底可以是去细胞化的结构。在另一实施方案中，生物相容性基质是一种三维支架，包括生物相容性基质，例如聚乙醇酸的基础结构，或通过除去所有细胞物质而使器官去细胞化后留下的基础结构。这种复合三维支架可提供使细胞与它粘附，并在它上面生长的支持构架。然后，细胞的培养的群体在三维支架上生长，其提供细胞-细胞相互作用所需的精确间隙距离。如此即可提供一种类似体内天然器官的重构器官。这种三维支架是用培养的雌性生殖道细胞的至少一个群体灌注的，该群体生长并发育，从而提供雌性生殖道组织层。在另一实施方案中，所述生物相容性基质是生物可降解的。生物相容性聚合基质的非限制性例子可从下列物质形成，这些物质选自，但不限制于，纤维素醚，纤维素，纤维素酯，氟化聚乙烯，聚-4-甲基戊烯，聚丙烯腈，聚酰胺，聚酰胺酰亚胺，聚丙烯酸酯，聚苯并唑，聚碳酸酯，聚氰基芳基醚，聚酯，聚酯碳酸酯，聚醚，聚醚醚酮，聚醚酰亚胺，聚醚酮，聚醚砜，聚乙烯，聚氟代烯烃，聚乙醇酸，聚酰亚胺，聚烯烃，聚二唑，聚苯醚，聚苯硫醚，聚丙烯，聚苯乙烯，聚硫化物，聚砜，聚四氟乙烯，聚硫醚，聚三唑，聚氨酯，聚乙烯基化合物，聚偏二氟乙烯，再生纤维素，聚硅氧烷，脲-甲醛聚合物，及其共聚物和物理混合物。所述聚合基质可用生物相容性及生物降解的定形物质涂覆。在一个实施方案中，定形物质可以是液体共聚物。在另一实施方案中，所述共聚物是聚-DL-丙交酯-共-乙交酯。
这里所用的术语“去细胞化的结构”是指一种三维生物学排列(例如，器官，或器官的一部分)，它是通过除去全部细胞和组织内容物，留下复合基础结构的方法产生的。器官的专门组织结构是提供与器官有关的特定功能的实质。器官的支持纤维网是基质。绝大多数器官都具有由支持专门组织的非专门结缔组织构成的基质构架。去细胞化过程可除去所述的，专门组织留下结缔组织复合三维网。结缔组织基础结构主要由胶原组成。术语“去细胞化的结构”包括除去细胞和组织物质的整个器官。术语“去细胞化的结构”还包括已经除去细胞和组织物质的器官结构的一部分。去细胞化的结构提供了一种上面可灌注不同细胞群体的生物相容性基底。去细胞化的结构可以是刚性、或半-刚性的，具有改变它们形状的能力。例如，去细胞化的子宫能够使子宫扩张，但在生产后即恢复到它的原始形状。去细胞化的结构的例子包括，但不限制于，去细胞化的子宫、阴道、子宫颈、卵巢、和输卵管。
这里所用的术语“雌性生殖器官”和“雌性生殖组织”包括与生殖有关的所有器官或组织。这些包括但不限于阴道、子宫、卵巢、输卵管、和子宫颈。
在这里交换使用的术语“雌性生殖细胞群体”和“雌性生殖细胞”是指源于雌性生殖系统任何部位的细胞。雌性生殖系统包括能够使雌性产卵(卵细胞)、性交、营养和受精卵着床直到它完全发育、并生产的器官。雌性生殖细胞群体可来源于如阴道、子宫颈、子宫、输卵管、和卵巢器官。该术语用于指代细胞混合物，包括来源于雌性生殖系统的所有细胞。该术语还可用于指代来源于雌性生殖系统其中一个部位的分离的亚群体，例如，只有阴道细胞、上皮细胞、内皮细胞的单一群体。细胞的分离的亚群体可来源于器官的任何部位，例如子宫内膜、子宫肌层、和子宫外膜(见Gray’s解剖学：药物和手术的解剖学基础，38thed.Churchill Livingstone Eds.H.Gray，L.H.Bannister，M.Berry，P.L.Willliams 1996)。在一个实施方案中，分离的亚群体是细胞的同种亚群体。在一个实施方案中，雌性生殖细胞群体是指基本为阴道、子宫颈、子宫、卵巢、或输卵管上皮细胞的细胞群体。在另一实施方案中，雌性生殖细胞群体是指基本为平滑肌细胞的细胞群体，例如子宫肌层。雌性生殖系统细胞可通过采集受治疗者的活组织检查样品而得到。雌性生殖系统细胞可来源于干细胞、胚胎干细胞、儿童干细胞、胎儿干细胞、成人干细胞、天然细胞、核移植、及parathenogenesis。细胞分选技术可用于将健康细胞与病态细胞分离开来。细胞分选技术，例如，FACS还可用于分离细胞的亚群体。
这里所用的术语“阴道上皮细胞群体”或“阴道上皮细胞”是指来源于阴道的细胞或雌性阴道的天然细胞。阴道上皮细胞包括子宫内膜细胞。阴道上皮细胞包括复层鳞状上皮细胞。
这里所用的术语“子宫上皮细胞群体”和“子宫上皮细胞”是指来源于雌性子宫的细胞或雌性子宫的天然细胞，包括子宫颈中的所有细胞。子宫上皮细胞包括子宫内膜细胞。子宫上皮细胞包括单层柱状细胞，它可以是纤毛和非纤毛柱状细胞。
这里所用的术语“子宫颈上皮细胞群体”和“子宫颈上皮细胞”是指来源于雌性子宫颈的细胞或雌性子宫下部的天然细胞。子宫颈上皮细胞包括子宫内膜细胞。子宫颈上皮细胞包括柱状细胞和鳞状上皮细胞。子宫颈上皮细胞包括纤毛和非纤毛柱状细胞。
这里所用的术语“输卵管上皮细胞群体”和“输卵管上皮细胞”是指来源于雌性输卵管的细胞或雌性输卵管的天然细胞。输卵管上皮细胞包括子宫内膜细胞。输卵管上皮细胞包括柱状细胞，它可以是纤毛和非纤毛柱状细胞。
在细胞群体同质性范围内，所用术语“基本上”是指超过50％的细胞来源于同一细胞群体，例如，阴道上皮细胞。优选，70％的细胞来源于同一细胞群体。更优选，85％的细胞来源于同一细胞群体，甚至更优选超过95％、96％、97％、98％和99％的细胞来源于同一细胞群体。
这里所用的术语“多层”是指包含多层相互层压的同种培养细胞群体的排列。产生“多层”的方法包括使一层细胞群体沉积在表面，例如生物相容性基底上。将沉积的细胞在生长培养基中培养，直到它们发育并增殖产生具有所需表型和形态学的细胞第一单层。一旦第一单层达到所需的细胞密度，同一细胞群体的第二层在第一单层上沉积。在可供给第二细胞层和第一单层营养的生长培养基中培养第二层沉积的细胞，直到第二层的细胞发育并增殖到所需细胞密度，从而产生具有所需表型和形态学细胞的双层。同一细胞群体的第三层沉积在双层上，在供给双层和第三层细胞营养的生长培养基中培养该细胞，直到第三层的细胞发育并增殖到所需密度，产生具有所需表型和形态学的三层。重复该过程，直到产生含有多层同源细胞群体的多层。多层的特征是它与体内器官等价实质组织的形态学和功能特征非常类似。例如，含有平滑肌细胞群体的多层可能具有阴道或子宫的平滑肌组织，即子宫肌层的功能特征。
这里所用术语“偶联”是指彼此接触的两个不同细胞群体之间的密切相互作用。这些相互作用包括细胞-细胞相互作用、生长、发育、和增殖。负责组织发育、修复和维持的细胞行为很大程度上是通过细胞与它们微环境成分之间的相互作用调节的。这些相互作用是由结合生长因子、酶的细胞表面分子，和诱导应答的其它分子介导的，其导致细胞表型改变。这些相互作用还可导致新细胞的产生，其能够产生具有独特的、不同于各不同细胞群体功能性的细胞物质。
这里所用的术语“嵌合界面”是指在两个不同细胞群体之间形成的边界。
这里所用的术语“间质生物物质”是指细胞物质在嵌合界面上的形成，两种不同细胞群体在嵌合界面上相互接触。广义的术语“间质生物物质”包括当两种或多种不同细胞群体相互接触时，任何新的细胞物质的形成。新细胞物质与在器官的正常体内细胞发育中产生的功能等价细胞物质类似。例如，在人造阴道、输卵管、或子宫的重构中，彼此相互接触的两种不同细胞群体是平滑肌细胞群体，例如，子宫肌层，和上皮细胞群体。在这两个群体的界面上产生的“间质生物物质”因此与粘膜下层的类似。在一个实施方案中，生物相容性基质降解形成粘膜下层。
这里所用的术语“功能等价物”是指一种结构，例如，通过本发明的方法产生的人造器官，它们以和天然器官相同、或相似的方式发挥作用，例如，人造阴道具有与体内阴道相同的功能特性。
这里所用的术语“调节化合物”是指引起细胞活性改变的化合物。这种改变可以是毒性的，例如，诱导会导致流产的过早收缩，或有益的，例如，加强胚胎植入。所述改变可改变细胞功能，例如，诱导收缩、增殖、编程性细胞死亡。所述调节剂还可增加，降低，升高或抑制涉及靶基因或靶蛋白的过程或信号转导级联，从而导致细胞活性改变。
这里所用的术语“个体”是指能够引发免疫应答的任何活的生物。术语个体包括，但不限制于，人，除人以外的灵长类动物，如黑猩猩，和其它猿及猴；饲养动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养的哺乳动物，如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物，如小鼠，大鼠和豚鼠等。该术语不指示特定的年龄或性别。因此，成年和新生的个体，以及胎儿都包括在内。
本发明提供用于重构人造雌性生殖器官的组合物和方法。人造雌性生殖器官的构造包括将培养雌性生殖细胞的至少一个群体灌注到生物相容性基质中，如此培养的雌性生殖细胞与生物相容性基质粘附，并形成至少一个雌性生殖组织层。培养的雌性生殖细胞的其它群体可与生物相容性基质粘附，并被培养产生人造雌性器官或组织结构。
I.解剖学
a.阴道
阴道是一种肌管，顺复层鳞状上皮排列，与子宫颈和外阴粘膜在组织学方面类似，并将子宫颈(子宫下部，或子宫)与肌体外部连接在一起。阴道或产道不包括腺或毛囊，但个体细胞、隐窝，可产生粘液。粘液有助于阻止细菌进入子宫，还可在卵子将要受精时，帮助精子进入子宫。表层没有角质化。儿童和绝经后妇女的阴道非常相似，其上皮层薄，容易受损伤并易受各种感染。正常成人的阴道含有类白喉的德得来氏杆菌，和厌氧的链球菌。这种菌丛可将阴道细胞的糖原转化成乳酸，从而维持阴道的酸性pH并促进正常分泌。在月经期，阴道具有被称作皱褶的横襞。绝经后，在无雌激素的情况下，阴道壁变薄并萎缩，反映出缺少雌激素，就像儿童时期所见到的那样。成人阴道的深度为12-13cm。
阴道上皮对激素敏感。随着细胞中糖原的积聚，雌激素可刺激上皮的增殖和成熟。上皮中糖原的存在构成Schiller试验的基础。给上皮提供Lugol’s溶液(强碘)。糖原与碘结合，产生深棕褐色。没有染色(阳性试验)表示异常上皮，如瘢痕组织，柱状上皮(腺病)，和瘤形成或前体损害。然而，孕激素会抑制上皮的成熟。
阴道是一种部分萎陷的管状结构，它从外阴前庭延伸至子宫。前后壁彼此接触，但在尖端，阴道围绕着外子宫颈和穹隆样隐窝，也被称作fornices，将阴道和子宫颈分开。后穹窿比前穹窿更深。尿道和膀胱的基底在阴道的前面，而直肠在它的后面。阴道的血液有两个主要的供给来源：子宫和阴部的动脉。内阴动脉从下到上供给阴道。常常是子宫动脉分支的阴道动脉，和子宫动脉自身供给阴道的上部位置。
成年妇女的子宫肌层通常要经历自发的节律性收缩。去生殖腺者的子宫则失去了这种节律收缩性。当雌激素水平较高时，子宫肌层常常会出现肥大，绝经之后出现子宫萎缩。子宫内膜通常可反映雌激素和孕酮的水平。雌激素引起子宫内膜及其血管的增殖。孕酮可将增殖子宫内膜转化成分泌子宫内膜，具有促进可能植入的腺和基质特征。子宫内膜的活组织检查可准确解释卵巢激素的产生。
在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于构造实施例1-3所描述的人造阴道。所述人造阴道是正常阴道的功能等价物。该人造阴道包含正常阴道的细胞结构、功能和生理学。人造阴道是如下产生的：提供一种生物相容性基质，将第一细胞群体灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中，第一细胞群体基本为阴道上皮细胞群体，将细胞类型不同于第一细胞群体的第二细胞群体，例如平滑肌细胞，灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中；培养生物相容性基质中的细胞群体。
b.子宫颈
子宫颈是子宫的下部。子宫颈是一种用复层鳞状上皮细胞覆盖的纤维肌肉器官。子宫颈的部分阴道开始于在阴道穹窿，并在子宫颈内道入口处的外子宫颈口终止。这种鳞柱接合点是鳞状上皮细胞癌起源的最常见位点。子宫颈内道排列的是柱状上皮，而顺类似上皮排列的葡萄状腺是在纤维肌性基质中发现的。这种腺，如果被阻塞，可在子宫颈表面上形成纳博特氏囊肿。未经产的子宫颈口是圆形的，但生产将其改变为水平方向平坦的口。子宫颈是妇女生殖恶性肿瘤的第二个最常见的位置。
在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于构造人造子宫颈。该人造子宫颈是正常子宫颈的功能等价物。该人造子宫颈包含正常子宫颈的细胞结构、功能和生理学。人造子宫颈可如下产生：提供一种生物相容性基质，将第一细胞群体灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中，第一细胞群体基本为子宫颈上皮细胞群体，将细胞类型不同于第一细胞群体的第二细胞群体，例如平滑肌细胞，灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中；培养生物相容性基质中的细胞群体。
c.输卵管
输卵管起自子宫侧缘的上部，高于圆韧带的附件，并且是开放的。远端伞部通往腹腔，近端通往子宫腔。输卵管是由单层下柱状上皮排列形成的，有些有纤毛，以分支或叶状方式排列。该结构分为有间隙、峡状、壶腹状、和伞状部分。壁较薄，在阔韧带的上缘内有两层肌肉层和一层腹膜外层。
输卵管上皮还可反映周期性改变、成熟过程中的卵巢激素变化，和退行变化。输卵管肌肉系统具有帮助输卵管转运的内在蠕动作用。某些输卵管细胞纤毛的作用也涉及转运。雌激素似乎可影响这些活性。
输卵管与任何一侧上子宫的上部连接，长约10cm。输卵管是较为狭窄的肌管，可作为卵子从卵巢移动到子宫的通道。每个月在排卵时，由卵巢释放出成熟的卵子。伞部，输卵管末端的边缘，将卵子牵引到输卵管中。每个输卵管是由上百万个被称作纤毛的微毛排列形成的，它们可有节奏地将卵子向前推进。概念上，精于对卵子的授精通常是在输卵管中发生的。然后，受精卵移动到子宫，在那里，它植入到子宫壁。输卵管还可执行其它功能，包括营养腔中的卵子和早期胚胎。
在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于构造实施例4中描述的人造输卵管。该人造输卵管是正常输卵管的功能等价物。该人造输卵管包含正常输卵管的细胞结构、功能和生理学。人造输卵管可如下生产：提供一种生物相容性基质，将第一细胞群体灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中，第一细胞群体基本为输卵管细胞群体，将细胞类型不同于第一细胞群体的第二细胞群体，例如平滑肌细胞，灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中；并培养生物相容性基质中的细胞群体。
d.卵巢
正常卵巢是白色、杏仁状的结构，大小为2×3×3cm，位于阔韧带的后表面上，在输卵管下方。卵巢可产生卵子(卵细胞)，即雌性的生殖细胞，并产生激素。神经、淋巴管和血管在与阔韧带连接处，即门进入卵巢。卵巢的外侧由漏斗骨盆韧带提供支持，其延伸至骨盆侧壁，中间由子宫-卵巢韧带支持延伸到子宫。卵巢具有皮质和髓质。生殖上皮，一种单层的立方形细胞，覆盖了压缩的纤维组织，白膜。卵泡源于卵巢皮质内，由基础胚胎补体组成；生产后，不再形成新的卵泡。卵巢的髓质部分被血管、淋巴管、神经、和结缔组织占据，含有午非氏体前体的残留物。卵巢是一种内分泌腺和生殖器官。卵泡旁粒层细胞产生雌激素，且在排卵和黄体形成之后，产生孕激素。雄激素是由基质细胞产生的，特别是在门中。
在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于构造人造卵巢。该卵巢是正常卵巢的功能等价物。人造卵巢包含正常卵巢的细胞结构、功能、和生理学。
e.子宫
子宫是由腺粘膜排列形成的雌性生殖道的肌器官，其具有专门的血管形成。这种中空的梨形器官位于膀胱和直肠间插入的骨盆腔中。没有怀孕的妇女子宫长度约为8cm，重30-100g。输卵管和子宫颈管与子官腔连接，子宫腔是由子宫内膜排列形成的。膨胀的上部被称作体。体的肌肉非常发达，因此可扩张容纳正在发育的婴儿。靠近两根输卵管与子宫连接处的区域常被称作基底。除了下面的前部之外，子宫基底被腹膜覆盖，在那里，膀胱与下面的子宫部分邻接，腹膜显现出来，并与阔韧带的襞侧面连接。基底下面的收缩部分被称作峡，其下面有一个被称作子宫颈的圆柱形部分。该器官从内到外各层分别为粘膜(子宫内膜)，肌层(子宫肌层)，和绒膜(子宫外膜)。血清雌二醇和孕酮水平的波动可引起所有这三层经历连续的结构性周期改变。子宫是由骨盆内筋膜和纤维肌肉组织在阔韧带基础上的侧面压缩支持的。圆韧带提供侧面支持，子宫膀胱襞提供前面的支持。
子宫内膜大约5mm厚，但会随着激素周期而变化。该层是由凹入形成管状子宫腺的分泌单层柱状上皮排列形成的。某些有纤毛的柱状细胞还可被发现作为上皮的一部分。子宫内膜由上层功能组成，其在每次月经过程中脱落。营养表面子宫内膜中大量毛细血管床的卷曲或螺旋状动脉可供给两层的血管形成。虽然腺和腔的上皮彼此邻接，且通过光学和电子显微镜观察，在形态学方面类似(Davies等，Am.J.Anat.137(4)：423-445(1973)；Davies等，Am.J.Anat.142(3)：335-365(1975))，但它们对激素刺激的反应不同。
子宫上皮是由静止和增殖亚群体组成的，其对雌激素和孕酮表现出不同的增殖反应(Conti等，Endocinology 114(2)：345-351(1984))。施用雌激素导致静止腺细胞重新回到细胞循环中，并降低腔细胞损失的速率。孕酮可通过缩短腺和腔中的细胞周期长度来诱导增殖速率加速(Nawaz等，Am.J.Pathol.127(1)：51-59(1987))。
子宫内膜基质类似间充质，包含具有大量卵形核的星形细胞。由于蜕膜转化，据信基质细胞在植入和妊娠维持方面起作用，这是通过胚泡的营养、内分泌腺分泌(催乳激素)，和胚胎保护而达到的。子宫肌层由4层组成。由于复杂的互连束，这些层不能很清楚地分开，它们上面散布有大量结缔组织。这4层很容易识别：粘膜下层包括具有纵纤维的粘膜下的薄层。血管层包含很多大型血管，可赋予它海绵状的外观，纤维是圆形、斜的。血管上层的纤维主要是圆形、纵向的。绒膜下层由较薄的纵肌肉层组成。腹膜由单层的扁平细胞组成，其围绕在输卵管和子宫周围。该薄层还可起神经和血管上的鞘的作用。围绕在子宫周围并侧面伸向骨盆壁的腹膜部分被称作子宫外膜(Baez和Atala，“Uertus”，组织工程学方法Academic Press 2002(1189-1194)。
供给阴道、子宫、输卵管和卵巢的动脉血通过4对动脉：卵巢动脉，子宫动脉，阴道动脉，和内阴动脉。子宫、子宫颈、和上部阴道位于膀胱的后面，其通过膀胱子宫襞与子宫分开。在该腹膜襞下，膀胱通过蜂窝组织与子宫颈和上部阴道连接。
在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于构造实施例5和6中描述的人造子宫。该人造子宫是正常子宫的功能等价物。该人造子宫包含正常子宫的细胞结构、功能、和生理学。该人造子宫可如下生产：提供一种生物相容性基质，将第一细胞群体灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中，第一细胞群体基本为子宫上皮细胞群体，将细胞类型不同于第一细胞群体的第二细胞群体，例如平滑肌细胞，灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中；并培养生物相容性基质中的细胞群体。
(f)雌性生殖系统的功能
生殖年龄的雌性重复经历间隔约为1个月的激素活性周期。每个周期，妇女的肌体都要准备可能的妊娠。术语月经是指子宫内层的周期性脱落。平均月经周期约为28天，发生下列阶段：卵泡期，排卵期(排卵)，和黄体期。有4种主要的激素、即可刺激或调节细胞或器官活性的化学品，涉及月经周期：促卵泡激素(FSH)，促黄体生成激素(LH)，雌激素和孕酮。
第一期，卵泡期，在月经周期的第一天开始，即月经开始那天。在此期间，促卵泡激素(FSH)和促黄体生成激素(LH)是由位于脑基底的垂体释放的。这些激素在血液中移动至卵巢。在那里，该激素刺激大约15-20个卵子的生长，每个卵子都位于其各自的卵泡中。卵泡是一种小的充满液体的囊泡，可容纳卵子并支持负责卵子生长和营养卵子的细胞。FSH和LH还可使卵泡增加雌激素的产生。
随着雌激素水平在自然月经周期中的升高，垂体产生较少的FSH。激素的平衡可使肌体限制完全成熟的卵泡数。随着卵泡期的发展，一个卵巢中一个卵泡变得更占优势，并继续成熟。该占优的卵泡抑制所有其它的卵泡，终止其生长并退化。发育中的卵泡可产生其自身的激素，包括雌激素。
第二期，排卵期，或排卵，是月经周期的中点，通常在妇女下一次月经周期开始前约2周。在此期间，雌激素的升高引发LH从垂体大量释放。从而引起占优的卵泡自卵巢释放其卵子。随着卵子的释放，其被称作排卵，它被输卵管末端的手指样突出(伞部)捕获。伞部将卵子集中到输卵管中。还是在此期间，妇女的子宫颈粘液增加，其准备接受和营养男人的精子(雄性生殖细胞)。粘液还可帮助精子通过子宫颈管移动。
第三期，黄体期在排卵后立即开始。一旦它释放其卵子，空的卵泡就会发育成被称作黄体的新结构(因此称作黄体期)。黄体分泌雌激素和孕酮。孕酮为子宫准备植入受精卵所需的丰富内层。如果卵子已经由男人的精子授精，那么受精卵(胚胎)将通过输卵管移动，从而植入到子宫中，并进行妊娠。如果卵子没有受精，它就会穿过子宫。无需支持妊娠，子宫内层损坏并脱落，下一个月经周期开始。
II.生物相容性基底
在本发明的其中一方面，所述人造雌性器官借助于支持结构，如聚合结构，生物相容性基质，或去细胞化的器官。
a.聚合结构
生物相容性基底是指对生物功能没有毒性或损伤作用的物质。可生物降解是指可被患者肌体吸收或降解的材料。可生物降解材料的例子包括，例如，可吸收的缝线。用于形成可生物降解结构的代表性材料包括天然或合成的聚合物，例如，胶原、聚(α酯)如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚原酸酯和聚酐以及它们的共聚物，其以可控速率通过水解而被降解并重吸收。这些物质提供可降解性，易处理性，大小和构型的最大控制。优选的可生物降解聚合物材料包括聚乙醇酸和聚polygalactin，它们可被研制成可吸收的合成缝线材料。聚乙醇酸和聚polygalactin纤维可由制造商提供使用。其它生物降解材料包括纤维素醚，纤维素，纤维素酯，氟化聚乙烯，酚醛聚合物，聚-4-甲基戊烯，聚丙烯腈，聚酰胺，聚酰胺酰亚胺，聚丙烯酸酯，聚苯并唑，聚碳酸酯，聚氰基芳基醚，聚酯，聚酯碳酸酯，聚醚，聚醚醚酮，聚醚酰亚胺，聚醚酮，聚醚砜，聚乙烯，聚氟代烯烃，聚酰亚胺，聚烯烃，聚二唑，聚苯醚，聚苯硫醚，聚丙烯，聚苯乙烯，聚硫化物，聚砜，聚四氟乙烯，聚硫醚，聚三唑，聚氨酯，聚乙烯基化合物，聚偏二氟乙烯，再生纤维素，聚硅氧烷，脲-甲醛，或这些物质的共聚物或物理混合物。所述物质可用适宜的抗菌剂浸渍，并用彩色添加剂着色，从而提高可见度并有助于手术过程。
在某些实施方案中，细胞与聚合物的粘附是通过用化合物，如基膜成分，琼脂，琼脂糖，明胶，阿拉伯胶，胶原，如I，II，III，IV，和V型胶原，纤连蛋白，层粘连蛋白，糖胺聚糖，其混合物，和其它具有与细胞培养领域技术人员已知的生物基质分子类似性质的亲水和肽粘附物质涂覆聚合物而提高的。所有聚合物必需满足为随后生长和增殖的细胞提供适宜支持所需的机械和生化参数。此外还可将因子，包括营养物，生长因子，分化或去分化的诱导剂，分泌产物，免疫调制剂，炎症抑制剂，退行因子，提高或使淋巴网或神经纤维向内生长的生物活性化合物，和药物掺入到基质中或与基质联合提供。同样，还可合成含有肽，如附着肽RGD(Arg-Gly-Asp)的聚合物用于形成基质。
在一个实施方案中，生物相容性聚合物是polyglactin和聚乙醇酸。Polyglactin被研制成可吸收的合成缝线材料，一种乙交酯和丙交酯的90∶10共聚物，由Vicryl制造的编织可吸收缝线(EthiconCo.，Somerville，N.J.)(Craig P.H.，Williams J.A.，DavisK.W.等：Polyglactin 910与聚乙醇酸合成可吸收缝线的生物学比较，Surg.141；1010，(1975))。Polyglactin和聚乙醇酸纤维可由制造商提供使用。生物相容性聚合物可使用下列方法成型，如，溶剂浇铸，压模，缝合，拉丝，形成网眼，沥滤，编织和涂覆。在溶剂浇铸法中，可将一种或多种聚合物溶于适当溶剂，如二氯甲烷中的溶液浇铸为分支模型浮雕结构。溶剂蒸发后，获得一层薄膜。在压模法中，以30,000磅/平方英寸的压力将聚合物压成适当的形状。拉丝法包括自熔融的聚合物拉丝，形成网眼包括通过将纤维压缩成毡样材料而形成网状物。在沥滤法中，将含有两种物质的溶液涂成与基质最终形状接近的形状；接着，用溶剂溶解其中一种成分，导致孔的形成。(见Mikos，US 5,514,378，其引入此处作为参考)。在成核作用中，使基质形状的薄膜与放射性裂变产物接触，建造放射性损害物质的轨迹。在一个实施方案中，生物相容性基质可以是由纤维组成的可生物降解聚合物网。
聚碳酸酯板可用酸或碱蚀刻，将放射性-损害物质的轨迹变成孔。最后，使用激光成型，并穿过多种物质灼烧出单个的洞，形成具有均匀孔径的基质结构。涂覆是指用物质，如液态共聚物(聚-D，L-丙交酯共-乙交酯(PLGA，50∶50)80mg/ml二氯甲烷或氯仿(5％w/v))涂覆或渗透聚合结构，从而改变其机械性能。涂覆可以一层或多层进行，直到获得所需的机械性能。这些成型技术可联合使用，例如，可将聚合基质编织、压模并胶粘在一起。
此外，可将通过不同方法成型的不同聚合材料连接在一起，形成复合形状。复合形状可以是层状结构。例如，可将聚合基质与一种或多种相同或不同组成的聚合基质粘附在一起，形成多层假体阴道结构。粘附可通过任何适宜的方法进行，如用液体聚合物胶粘、装订，缝合、或这些方法的组合。此外，聚合基质还可形成实心的块状物，并利用激光或其它标准机械技术成型为所需的终形式。激光成型是指使用激光除去材料的方法。
聚合物可使用机械性能，如拉伸强度和应力来表征。
在优选实施方案中，使用聚乙醇酸(PGA)作为生物材料。PGA已经广泛用于组织改造。PGA支架可很容被处理成各种三维结构，并为细胞的支持和转运提供最佳方式(Christenson L，Mikos AG，Gibbons DF等：用于组织改造的生物材料：概述，Tissue Eng.3(1)：71-73；讨论73-76页，1997)。如实施例2和3所示，已经成功在PGA构造上共同培养了阴道上皮和平滑肌细胞。实施例5和6举例说明PGA可用于建造人造子宫。
在植入之前、用培养的细胞涂覆生物相容性基底之前或之后，可用因子，如血管生成因子、细胞因子、胞外基质成分、和其它生物活性物质或药物处理生物相容性基底，例如，从而在植入后促进新组织的形成和促进移植物愈合。还可将因子，包括药物掺入到生物相容性基底中，或与生物相容性基底联合提供。生长因子和其它添加剂(例如，表皮生长因子(EGF))，血管内皮生长因子(VEGF)，肝素-结合表皮-样生长因子(HBGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，细胞因子，基因，蛋白等)可以超出这种生长因子的任何量(如果加入的话)加入，如果使用的是加入的细胞，可通过在聚合基质上接种细胞而产生。优选这种添加剂的量足以促进新的雌性器官形成，如促进新的阴道组织形成。其它有用的添加剂包括抗细菌和抗真菌剂，以通过抑制感染而促进愈合。
一种优选的支持基质是由交叉丝组成的，一旦植入细胞支持基质，其可通过使营养物穿过较短距离扩散而使细胞存活。
可将生物相容性基质制成具有可控的孔结构，使营养物从培养基到达沉积的细胞群体，但防止培养的细胞穿过孔迁移。在体外，细胞粘附和细胞存活力可使用扫描电子显微镜、组织学以及放射性同位素定量评估而测定。
生物相容性基质可被制成任何数量的所需构型，从而满足任何数量的整个系统，几何或空间限制。例如，在使用聚合基底构造雌性生殖器官时，可将基底制成与器官，例如阴道或子宫的全部或一部分一致的维数和形状。生物相容性基质可被制成不同的大小，从而与不同大小患者的阴道或子宫一致。聚合基底还可被制成满足患者的特殊需要，例如，具有不同腹腔空间的残疾患者可能需要重构适合该空间的阴道或子宫。
在其它实施方案中，生物相容性基质用于处理肌体中的层状结构，如输卵管。在那些应用中，所述聚合基底可被制成中空的管。
b.去细胞化的结构
生物结构，例如，整个器官，或器官的一部分可通过除去器官的全部细胞和组织内容物而被去细胞化。在其中一个实施方案中，去细胞化的雌性生殖器官或组织，如阴道、子宫、输卵管、和子宫颈可用于本发明中。去细胞化的方法包括一系列连续的提取。这种提取方法的其中一个重要特征在于可避免阻碍或破坏生物结构的复杂基础结构的粗提。第一步包括除去细胞碎片，并溶解细胞膜。接着溶解核的胞质成分，一种核成分。
优选，生物结构，例如器官，是使用温和的机械破裂方法，通过除去器官周围的细胞膜和细胞碎片而去细胞化的。所述温和的机械破裂方法必须是以破坏细胞膜。然而，去细胞化的方法应避免损害或阻碍生物结构的复杂基础结构。温和的机械破裂方法包括刮擦器官或组织的表面，振摇器官或组织，或在适宜体积的液体，例如蒸馏水中搅动器官或组织。在一个优选实施方案中，温和的机械破裂方法包括在适宜体积的蒸馏水中搅动器官或组织，直到细胞膜破裂，且已经除去器官的细胞碎片。在另一实施方案中，器官或组织暴露于低渗条件下，从而使血细胞溶解，而保留细胞基质。
除去细胞膜后，再除去生物结构的核及胞质成分。这可在不使基础结构破裂的情况下，通过溶解细胞及核成分而进行。为了使核成分溶解，可使用非离子型洗涤剂或表面活性剂。非离子型洗涤剂或表面活性剂的例子包括，但不限制于，Triton系列，从Rohm and Haas ofPhiladelphia，Pa.商购，包括Triton X-100，Triton N-101，TritonX-114，Triton X-405，Triton X-705，和Triton DF-16，可从多家销售商购得；吐温系列，如单月桂酸酯(Tween 20)，单棕榈酸酯(Tween40)，单油酸酯(Tween 80)，和聚氧乙烯-23-十二烷基醚(Brij.35)，聚氧乙烯醚W-1(Polyox)等，胆酸钠，脱氧胆酸盐，CHAPS，皂苷，正癸基β-D-吡喃葡萄糖苷，正庚基β-D吡喃葡萄糖苷，正-辛基α-D-吡喃葡萄糖苷和Nonidet P-40。
本领域的技术人员应认识到，属于上述分类和销售商的化合物描述可商业获得，并在“化学分类，乳化剂和洗涤剂”，McCutcheon′s，Emulsifiers and Detergents，1986，North American andInternational Editions，McCutcheon Division，MC Pub lishingCo.，Glen Rock，N.J.，U.S.A.和Judith Neugebauer，A Guideto the Properties and Uses of Detergents in Biology andBiochemistry，Calbiochem.R.，Hoechst Celanese Corp.，1987中找到。在优选实施方案中，非离子型表面活性剂是Triton系列，优选Triton X-100。
非离子型洗涤剂的浓度可根据所要去细胞化的生物结构类型而改变。例如，对于柔弱的组织，例如血管而言，应降低洗涤剂的浓度。非离子型洗涤剂的优选浓度为约0.001-约2.0％(w/v)。更优选，约0.05-约1.0％(w/v)。甚至更优选约0.1％(w/v)-约0.8％(w/v)。这些的优选浓度范围约0.001-约0.2％(w/v)，特别优选约0.05-约0.1％(w/v)。
细胞骨骼成分，包括密集的胞质丝网，胞间复合物和尖端微细胞结构可使用碱性溶液，如氨水溶解。包括铵盐或其衍生物的其它碱性溶液也可用于溶解细胞骨骼成分。其它适宜铵溶液的例子包括硫酸铵，醋酸铵和氨水。在优选的实施方案中，使用氨水。在一个实施方案中，温和碱是氢氧化物或非氢氧化物碱。非氢氧化物碱的非限制性例子包括醋酸，苯甲酸，丙酸和苯酚的铵或钠盐或它们的衍生物。氢氧化物碱的非限制性例子包括氨水，三甲铵氢氧化物，三乙铵氢氧化物，一乙醇铵氢氧化物，和苄铵氢氧化物。
碱性溶液，例如氨水的浓度，可根据所要去细胞化的生物结构的类型而改变。例如，对于柔弱的组织，例如输卵管而言，应降低洗涤剂的浓度。优选的浓度范围是约0.001-约2.0％(w/v)。更优选，约0.005-约0.1％(w/v)。甚至更优选约0.01％(w/v)-约0.08％(w/v)。
去细胞化的器官可通过本领域已知的任何方式脱水，如烘焙，冷冻干燥，低压升华干燥法(lyphylization)。去细胞化的器官可在脱水过程中被固定在元件上。
去细胞化的、脱水的结构可在适宜的温度下贮藏，直到需要使用。使用前，可将去细胞化的结构在适宜的等渗缓冲液或细胞培养基中平衡。适宜的缓冲液包括，但不限制于，磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)，生理盐水，MOPS，HEPES，Hank’s平衡盐溶液等。适宜的细胞培养基包括，但不限制于，RPMI 1640，Fisher’s，Iscove’s，McCoy’s，Dulbecco’s培养基等。
III.培养细胞
组织改造可为攻克缺少局部组织的疾病提供一种解决方法。在实验室中，自表型正常的自体衍生细胞成功建造预制器官可导致正常的功能发展。在实施例2和3中，本发明的方法和组合物可用于证实体外培养的阴道细胞可用于体内建造重构的、能生长发育的阴道组织。
本发明描述用于雌性器官重构的组合物和方法。通常，本发明提供含有至少2种不同细胞群体的多细胞器官。该器官构造包括源自第一细胞群体的细胞第一培养群体，和源自不同于第一细胞群体的第二细胞群体的细胞第二培养群体，其中第二细胞群体通过嵌合界面与第一细胞群体偶联，产生一种构造，该构造是天然生物结构的功能等价物。
本发明还提供使用器官形状的生物相容性基底生产人造雌性器官的方法，即在生物相容性基底的一个区域上建造源自第一细胞群体的细胞第一培养群体，使第一培养细胞群体与生物相容性基底粘附；建造源自不同于第一细胞群体的第二细胞群体的细胞的第二培养细胞群体，使第二细胞群体通过嵌合界面与第一细胞群体偶联，这样所述构造在植入后，可提供天然生物结构的功能等价物，由此产生人造雌性器官构造。
(a)细胞采集
大量容易获取的组织来源的可用性对于涉及动物模型和组织改造的任何实验设计的成功是必需的。重构的人造雌性器官可以是同种异体的，细胞群体源自受治疗者的自身组织。例如，阴道上皮细胞可源自受治疗者阴道并在体外培养。
重构的人造雌性生殖器官还可以是异种的，细胞群体源自不同于受治疗者的哺乳动物种类。例如，所述的不同的细胞可源自哺乳动物，如猴，狗，猫，小鼠，大鼠，母牛，马，猪，山羊和绵羊的器官。
这种器官可通过适宜的活组织检查或在尸体解剖后获得。尸体器官可用于提供内皮细胞和元件。分离的细胞优选通过活组织检查从受治疗者获得的自体细胞。例如，手臂，前臂，或下肢骨骼肌的活组织检查样品，或皮下注射少量利多卡因进行局部麻醉区域的平滑肌活组织检查样品，并在培养时扩增。活组织检查可使用活组织检查针，一种快速作用的针获得，从而使过程快速且简单。然后按照实施例所述，扩增并培养骨骼肌或平滑肌的较小活组织检查核心。源自亲缘关系或相同物种其它供体的细胞也可在适当的免疫抑制下应用。
子宫内膜细胞可从子宫活组织检查样品或子宫切除样品获得。应当将活组织检查样品立即转移到运送培养基：DMEM/F-12(Dulbecco改进的Eagle培养基，含有Ham’s F-12营养培养基)中。4℃时，直径超过2cm的活组织检查样品可在该培养基中保持可见达3天。在实施例部分中，新西兰白兔是阴道组织的极好来源，它可通过在采集组织过程中较好暴露的简单、中线、经腹方法采集。兔子的阴道具有充足的大小和周长，可在每次过程中，产生极好的组织。将采集的样品运送到实验室的无菌培养基中，开始分离各组织层的过程。
(b)细胞分离和培养
Freshney，Culture of Animal Cells. A Manual of BasicTechnique，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，1987，Ch.9，pp.107B126和Fauza等(1998)J.Ped.Surg.33，7-12讨论了用于分离和培养细胞的方法将其引入此处作为参考。细胞还可使用本领域技术人员已知的技术分离。例如，组织或器官可被机械解聚和/或用消化酶和/或螯合剂处理，削弱相邻细胞之间的连接，从而将组织分散成单个细胞的混悬液，而不会使细胞破裂。酶离解可通过切碎组织，并用任意数量的消化酶单独或联合处理切碎的组织而完成。这些包括但不限制于胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胶原酶，弹性酶，和/或透明质酸酶，DNA酶，链霉蛋白酶，和分散酶。机械破裂也可通过各种方法完成，包括但不限制于，剖擦器官的表面，使用研磨机，搅拌器，筛网，匀浆器，压榨细胞，或insonators等。组织解聚技术的概述见Freshney，(1987)，Culture of Animal Cells.A Manual of BasicTechnique，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.9，pp.107-126。
优选的细胞类型包括，但不限制于，子宫上皮细胞，子宫肌细胞，阴道上皮细胞，子宫颈上皮细胞，输卵管上皮细胞，子宫上皮细胞，卵巢上皮细胞和平滑肌细胞。在优选实施方案中，人阴道上皮细胞和平滑肌细胞是分开的。在其它实施方案中，人子宫颈上皮细胞和平滑肌细胞是分离的。在其它实施方案中，人输卵管上皮细胞和平滑肌细胞是分离的。在其它实施方案中，人卵巢上皮细胞和平滑肌细胞是分离的。在另一优选实施方案中，人子宫上皮细胞和子宫肌细胞是分离的。
一旦已经将组织分解成单个细胞的混悬液，那么可将混悬液分离成亚群体，从而获得细胞元件。这一点还可使用细胞分离的标准技术来完成，包括但不限制于，特殊细胞类型的克隆和选择，多余细胞的选择性破坏(消极选择)，基于混合群体中不同细胞可凝集性的分离，冻融过程，混合群体中细胞的不同粘着性，过滤，常规的区带离心，离心淘析(反流离心)，单位重力分离，逆流分布，电泳和荧光活化细胞分选(见，例如Freshney，(1987)Culture of Animal Cells.AManual of Basic Techniques，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.11和12，137-168页)。例如，内皮细胞可通过荧光活化细胞分选而富集。
(c)细胞扩增
分离的细胞可体外培养，从而增加可注入到三维支架中的细胞数。同种异体细胞，更优选自体细胞的使用可防止组织排斥。然而，如果在植入重构的人造器官后，受治疗者出现了免疫应答，那么可用免疫抑制剂，如环孢菌素或FK506治疗受治疗者，从而降低排斥的可能性。在某些实施方案中，可将嵌合细胞，或转基因动物的细胞灌注到三维支架上。
在涂覆基因物质前，可转染分离的细胞。有效的基因物质可以是，例如，能够减少或消除宿主免疫应答基因序列。例如，可抑制细胞表面抗原，如I类和II类组织适合性抗原的表达。从而减少移植细胞被宿主排斥的机会。此外，转染也可用于基因送递。在灌注到三维支架中前，阴道上皮细胞可用特殊的基因转染。人造重构器官可携带宿主或重构人造器官长期存活所需的基因信息。
在生物相容性基质上生长的雌性生殖道细胞可被基因工程改造产生对移植有益的基因产物，例如，抗炎因子，例如，抗-GM-CSF，抗-TNF，抗-IL-1，和抗-IL-2。可选择性地，内皮细胞可被基因工程改造为“敲除”促进炎症的天然基因产物，例如GM-CSF，TNF，IL-1，IL-2的表达，或“敲除”MHC的表达，从而降低排斥的风险。此外，内皮细胞还可被基因工程改造用于基因疗法中，调节患者的基因活性水平，帮助或改善组织移植结果。
用逆转录病毒载体，聚乙二醇对细胞进行基因工程改造的方法，或本领域技术人员已知的其它方法都可使用。这些包括使用表达载体，其可转运并在细胞中表达核酸分子。(见Geoddel；Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990))。
经由常规的转化或转染技术，可将载体DNA引入到原核生物或真核生物细胞中。转化或转染宿主细胞的适宜方法可见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)，和其它实验室教科书。
细胞在三维支架中的生长可通过加入，或用蛋白(例如，胶原，弹性纤维，网状纤维)，糖蛋白，糖胺聚糖(例如，硫酸类肝素，软骨素-4-硫酸盐，软骨素-6-硫酸盐，硫酸皮肤素，硫酸角蛋白等)，细胞基质，和/或其它物质涂覆三维支架而提高。
在将雌性生殖道细胞灌注或铺层后，应将三维支架在适宜的营养培养基中培养。很多商购的培养基，如RPMI 1640，Fisher培养基，Iscove培养基，McCoy培养基，Dulbecco培养基等都适合使用。还应当定期更换培养基，从而除去使用过的培养基，减少释放的细胞，并加入新鲜的培养基。重要的是，使雌性生殖道细胞生长至雌性生殖道组织层发育的阶段。
可将生长因子和调节因子加入到培养基中，从而提高，改变或调节培养物中的增殖和细胞成熟及分化。细胞在培养物中的生长和活性可受到各种生长因子，如胰岛素，生长激素，生长调节素，集落刺激因子，红细胞生成素，表皮生长因子，肝红细胞生成因子(hepatopoietin)，和肝细胞生长因子的影响。调节增殖和/或分化的其它因子包括前列腺素，白介素，和天然存在的抑素。
本发明在生物相容性基质上生长的细胞在多层中生长，该多层可形成类似体内生理条件的细胞基质。具有至少一层雌性生殖组织层的三维支架可支持不同类型细胞的增殖和众多其它不同组织的形成。在其中一个实施方案中，其中一个细胞群体可以是内皮细胞群体。血管生成是一种新血管发育的过程，且在雌性生殖周期，例如，排卵，月经和胎盘发育中起重要作用。内皮细胞群体可用于刺激血管形成。
当人造重构的雌性生殖器官被用于体内移植或植入时，它可优选从将要接受移植或植入的个体获得雌性生殖细胞，例如，阴道上皮细胞和平滑肌细胞。该方法可能对于移植和/或移植物抗宿主疾病的免疫排斥特别有利。
一旦灌注在生物相容性基质上，雌性生殖细胞将在基质上增殖并发育，形成雌性生殖组织层。在体外培养过程中，雌性生殖细胞发育并分化，产生雌性生殖组织层，它能够支持其它细胞的生长并产生具有与体内类似结构相似形态学的结构。所产生的雌性生殖组织的生理学类似正常雌性生殖组织的生理学。例如，人造雌性器官对激素敏感。
青春期时，下丘脑增加促性腺激素释放素(GnRH)的释放。然后垂体前叶产生促性腺激素，促卵泡成熟激素(FSH)和促黄体素(LH)，由GnRH和卵巢激素雌激素和孕酮控制。FSH刺激卵泡的发育。LH引起排卵。这些促性腺激素刺激性激素、雌激素和孕激素的产生。促性腺激素与卵巢激素的相互作用可控制生殖周期。促黄体素(LH)的突然增加致使成熟的卵泡释放卵子。卵子释放后，破裂的卵巢卵泡发育成黄体，然后分泌雌激素和孕酮。这些卵巢激素对于子宫内膜内层的维持非常重要，胚泡本身即植入在子宫内膜内层。在一个实施方案中，人造雌性生殖器官是能够对激素作出反应的人造子宫。在另一实施方案中，人造子宫能够对性激素作出反应并产生性激素，如雌激素和孕酮。在另一实施方案中，人造子宫能够激素调节周期事件，例如，构造并使子宫内膜内层脱落，使子宫准备接受受精胚胎。在另一实施方案中，人造子宫能够植入胚泡并支持正在生长的胎儿。人造子宫可被植入到自体受治疗者中。例如，可从植入人造雌性器官的同一受治疗者培养细胞。在另一实施方案中，人造子宫可用于支持同种受治疗者外部的胎儿生长。因此，人造子宫可用于支持胎儿在体外生长。可选择性地，人造子宫可被植入到异种受治疗者中。
在另一实施方案中，人造阴道具有与正常阴道类似的、对激素和感觉刺激的反应。人造阴道的细胞能够产生粘液。人造阴道包括对激素敏感的阴道上皮。雌激素可刺激阴道上皮的增殖和成熟，而孕激素则抑制上皮的成熟。人造阴道能够收缩。
在另一实施方案中，人造输卵管类似正常输卵管的生理学。人造输卵管对激素敏感，且能够蠕动。人造输卵管能够将卵子从卵巢运送到子宫，而且是精子对卵子授精的位置。
培养时，再建造体内细胞微环境对于重构特定的雌性生殖器官而言非常重要。体内使用前，雌性生殖细胞的生长程度可根据所重构的雌性生殖器官类型而改变。
在一个实施方案中，在灌注培养的雌性生殖道细胞，例如阴道上皮细胞之前，可用例如胶原对三维支架进行预处理，从而提高雌性生殖道细胞与三维支架的粘附。在另一实施方案中，可向支架或雌性生殖细胞中加入各种因子，它们选自营养物，生长因子，细胞因子，胞外基质成分，分化诱导剂，分泌产物，免疫调制剂，可提高或使细胞网或神经纤维生长的生物活性化合物。
可使用放在三维支架一定位置的针将培养的雌性生殖道细胞灌注到生物相容性基质中，或铺层到支架上。在将其放到支架中，或支架上以前，通过体外培养到所需的细胞密度而使雌性生殖道细胞扩增。实施例2和3证实本发明如何用于体内建造重构阴道组织。实施例5和6证实本发明如何用于体内建造重构子宫组织。培养的上皮和平滑肌细胞类型可维持正常的表型表达，并繁殖成一个适合组织替换的大细胞库。细胞接种的聚合物支架将形成管状化的阴道和子宫组织，它们具有与天然阴道和子宫类似的表型和功能性。本发明可用于获得临床使用的管状化改造的阴道、子宫、输卵管和子宫颈组织。
(d)组织加工和细胞培养
按照本领域已知的方法加工并培养组织。在优选实施方案中，使用含有乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)进行若干次洗涤循环。可将样品放在干净的培养基贮器中，直到开始显微解剖的过程。
各种商业制造的培养基都可用于上皮和平滑肌细胞的生长。在优选实施方案中，平滑肌细胞使用补充了10％胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM/FBS)，而阴道上皮细胞(keratinocytes)是在专门用于keritinocytes的没有血清的培养基中生长的，其中补充了牛垂体的提取物和表皮生长因子(K-SFM)。
很多技术都可用于分离并培养上皮细胞，例如，子宫内膜细胞，这些技术包括基于酶消化和机械离解的方法(Watson等，J Reprod.Fertil.101(2)：415-420(1994)；Akoum等，J.Reprod.Med.41(8)：551-561(1996)；Barberini等，Cell Tissue Res.190(2)：207-222(1978)；Bentin-Ley等，J.Reprod.Fertil.101(2)：327-332(1994))。同源细胞群体可在其中细胞基本为单一细胞群体的情况下建造。在优选实施方案中，上皮和平滑肌细胞分开生长，各细胞类型的分离包括外植法或酶消化中的任一方法。这些方法的描述见下列参考文献，将其整体引入此处作为参考：Williams等，Methods Mol.Biol.5：139-149(1989)；Baez，C.E.和Atala，A.“Uterus”In：Methods of Tissue Engineering.Academic Press1189-1194(2002)；De Filippo，R.E.和Atala，A.“表皮细胞培养：阴道细胞重构”，Methods of Tissue Engineering.AcademicPress 273-275(2002)。
在一个实施方案中，外植法用于分离细胞。外植法开始先在环路放大的条件下，用无菌器械小心地进行显微解剖，分离上皮和血清肌肉层。在一个实施方案中，将阴道去管状化(detubularizing)成扁平节段，从而有助于解剖。将组织的一小部分单独放在培养皿上，使它们干燥并与表面粘附。37℃下，将组织切片与适宜培养基在空气和5％CO2中培养，直到足量的祖代细胞集落自组织岛发育，这通常要花费大约5-7天。外植体可通过轻轻吸出而除去，定期替换培养基以维持细胞。
在另一实施方案中，酶消化用于分离细胞。培养的雌性生殖道细胞很容易通过将作为细胞来源的适宜器官或组织解聚而分离。这可使用本领域那些技术人员已知的技术进行。例如，组织或器官可被机械解聚和/或用消化酶和/或螯合剂处理，减弱相邻细胞之间的连接，从而能够将组织分散成单个细胞的混悬液，而没有明显的细胞破裂。酶解离可通过切碎组织，并用任意数量的消化酶单独或联合处理切碎组织而完成。这些包括，但不限制于，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胶原酶，弹性酶，和/或透明质酸酶，DNA酶，链霉蛋白酶和分散酶。机械破裂也可通过各种方法完成，包括但不限制于，使用研磨机，搅拌器，筛网，匀浆器，压榨细胞，或insonators等(见，例如Freshney，(1987)Culture of Animal Cells.A Manual of Basic Technique，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.9，pp.107-126)。
在一个实施方案中，酶消化法已经用于加工和培养上皮细胞。上皮细胞的挑剔性有时使它们很难大量生长。然而，使用酶消化已可成功获得大量集落。在优选实施方案中，将粉末形式的IV型胶原酶和分散酶，一种中性蛋白酶结合，并用K-SFM混悬。然后将这种胶原酶-培养基溶液过滤，以确保无菌。将阴道、子宫、子宫颈、或输卵管样品切成若干较大的碎片，浸入到酶溶液中，用力振摇。轻轻吸出，将细胞-流体混悬液转移到另一无菌试管中，低速旋转离心。最后，除去上清液，将细胞颗粒状物重悬浮在培养基中并分配到培养皿中。
(e)细胞扩增
可使用本领域熟知的细胞扩增法。在一个实施方案中，细胞的传代是通过先除去培养基，然后用PBS-EDTA洗涤细胞而进行的。用胰蛋白酶-EDTA溶液培养细胞，并在显微镜下监测，直至观察到细胞分离。将细胞-胰蛋白酶溶液轻轻吸到无菌试管中，该无菌试管中装有含血清的培养基，从而灭活胰蛋白酶。将细胞低速旋转离心。用新鲜培养基把细胞颗粒状物重悬浮至预定体积，将它们等分到若干培养皿中进行扩增。
IV.细胞特征描述
将组织分解为单个细胞的混悬液后，将混悬液分级成亚群体，从中获得雌性生殖道细胞。可获得同源细胞群体，其中每个细胞群体基本含有相同的细胞，例如阴道上皮细胞群体。这还可使用细胞分离的标准技术进行，这些技术包括但不限制于，特定细胞类型的克隆和选择，多余细胞的选择性破坏(消极选择)，基于混合群体中不同细胞可凝集性的分离，冻融过程，混合群体中细胞的不同粘着性，过滤，常规的区带离心，离心淘析(反流离心)，单位重力分离，逆流分布，电泳和荧光活化的细胞分选(见，例如Freshney，(1987)Culture ofAnimal Cells.A Manual of Basic Techniques，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.11和12，137-168页)。例如，平滑肌细胞可通过荧光活化细胞的分选而富集，上皮细胞可被分解用于平滑肌细胞的收集。
细胞可通过使用特殊的分化标记来描述。子宫内膜上皮的标记包括角蛋白中间丝，胞质内糖原，孕酮受体，和雌激素受体(Centola等，In Vitro 20(6)：451-4612(1984)；Cooke等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(7)：2109-2113(1986)；Johnson等，Biol.Reprod.61(5)：1324-1330(1999)；Kirl等，14(8)：651-662(1978)；Merviel等，Biol.Cell.53(3)：636-646(1995)；Osteen等，Fertil.Steril.52(6)：965-972(1989)；Schatz等，Biol.Reprod.62(3)：691-697(2000).细胞角蛋白中间丝(Bongo等，Hum.Reprod.3(6)：705-713(1988)；Classen-Linke等，Cell Tissue Res.287(1)171-185(1997)；Getschenson等，Pathol.Res.Pract.174(3)：285-296(1982))最常用于特性描述。
在优选实施方案中，细胞可用细胞特异性抗体描述。即把细胞转移到分室载玻片上培养，用4％缓冲甲醛固定，并加工。使细胞与施加到细胞表面的抗原-特异性初级抗体接触。细胞特异性抗体的非限制性例子是广泛反应性抗-细胞角蛋白和抗-平滑肌α-肌动蛋白抗体。阴性对照可用普通血清代替初级抗体处理。阳性对照由接触抗原的细胞组成。用磷酸盐缓冲生理盐水洗涤后，用生物素化的次级抗体培养分室载玻片，并再次洗涤。加入底物后，还可加入过氧化物酶试剂，在抗体沉积处见到棕色沉淀物。复染色可用Gill’s苏木精进行。
可使用本领域熟知的任意类型的分子特性描述。在优选实施方案中，使用目标区域抗体，利用蛋白质印迹分析进行分子水平的细胞特性描述。例如，单克隆抗体α-肌动蛋白，肌球蛋白，和细胞角蛋白AE1/AE3可用于比较体外培养的细胞和对照组的蛋白表达，从而证实上皮和平滑肌细胞系的维持。将细胞在冷的溶解缓冲液中匀化，收集可溶性蛋白的上清液。可使用本领域已知的任何蛋白定量方法。例如，BioRad DC蛋白测定试剂盒可用于量化蛋白样品。将等浓度的蛋白上样，在SDS-PAGE凝胶上分离，4℃下使用初级抗体作为探针杂交过夜。过氧化物-接合的抗-小鼠次级抗体是复合的，可用增强的化学发光系统检测。还可相伴进行聚合酶链反应，以进一步限定细胞类型。
V.多层
a.在去细胞化的结构上形成多层
在一个实施方案中，不同的培养的细胞群体可用于在生物相容性基质或去细胞化的结构，例如去细胞化的器官，或器官的一部分上产生不同的多层。使用在去细胞化的器官三维基础结构一定位置包埋的针将第一同源细胞混悬液灌注到去细胞化的结构中。灌注的细胞在基础结构的三维空隙间分布并生长，产生包裹基础结构的细胞层。灌注第一同源细胞混悬液后，37℃下在培养基中培养去细胞化的器官，直到细胞发育并增殖，以产生与去细胞化的器官基础结构粘附的培养的细胞第一群体的单层。一旦建立了单层，再次将第一同源细胞混悬液灌注到单层上的去细胞化的结构中。培养去细胞化的器官，直到细胞发育并增殖，以在第一单层上产生细胞的第二单层，由此产生双层。重复该过程，直到产生第一同源细胞群体的多层。
第一多层与体内器官等价实质组织的功能性和形态学类似。例如，对于去细胞化的子宫而言，第一细胞群体是平滑肌细胞群体。将平滑肌细胞混悬液灌注到子宫，阴道，输卵管或子宫颈中，直到形成平滑肌组织的多层，其具有与子宫，阴道，输卵管或子宫颈的平滑肌组织(即子宫肌层)类似的功能性。
建造第一多层后，使用不同于第一细胞群体的第二培养细胞群体建造第二多层。将第二同源细胞群体的细胞混悬液灌注到去细胞化的器官的第一多层上。灌注的细胞沿着第一多层分布，培养去细胞化的器官，直到第二细胞群体的细胞发育并增殖成第一单层。一旦建立了第一单层，再次将第二同源细胞群体灌注到第一单层上的去细胞化的结构中。培养去细胞化的器官，直到细胞发育并增殖，以在第一单层上产生第二单层，由此产生双层。重复该过程，直到产生第二同源细胞群体的第二多层。
第二多层与体内器官等价实质组织的功能和形态性类似。例如，子宫，阴道，输卵管或子宫颈的第二多层是上皮多层，其与子宫，阴道，输卵管或子宫颈的上皮组织(即，粘膜)的形态和功能性类似。
本领域技术人员应认识到可产生很多异源多层，从而建造人造雌性生殖器官。每个多层都包含多层同源细胞群体，但该多层的细胞群体是不同的。在一个实施方案中，人造器官包括至少约5个多层。在另一实施方案中，人造器官包括至少约4个多层。在另一实施方案中，人造器官包括至少约3个多层。在优选实施方案中，人造器官包括至少约2个多层。
嵌合界面是在两个或多个异源多层彼此相互接触的地方产生的。从而使未受阻的相互作用在多层的细胞之间发生。不同细胞群体之间的广泛相互作用导致间质生物物质的产生，其不同于多层的各层。因为两个不同细胞群体之间的相互作用没有受到结构屏障，如生物相容性基底(例如，聚合物)的阻碍，因此嵌合界面上的细胞可恢复更自然的形状和构型。通过在嵌合界面提供更有益于体内器官的微环境，嵌合界面的细胞更自然地发育并产生生长因子和其它蛋白，促进正常的分裂和分化。这可导致间质生物物质的产生，提供独特的生物和功能性，从而建造更类似体内那些器官的人造器官。例如，平滑肌多层与人造子宫，阴道，输卵管或子宫颈上皮多层的相互作用产生一个嵌合界面，从而导致产生类似体内子宫，阴道，输卵管或子宫颈粘膜下层的细胞层。粘膜下层提供与平滑肌细胞和上皮细胞相比独特的功能性，其中当完全发育时，粘膜下层可为平滑肌细胞供给血液。
本领域的技术人员应认识到，当含有不同细胞群体的两个或更多异源多层相互作用时，所产生的任何间质生物物质都在本发明的范围之内。所产生的不同间质生物物质取决于异源多层中的细胞类型。
在一个实施方案中，可将附加胶原层加入到去细胞化的结构的内表面，从而建造平滑表面，如国际PCT公开号WO 95/22301所述，其内容引入此处作为参考。该平滑胶原层可促进细胞粘附，从而促进生长和发育。如国际PCT公开号WO 95/22301所述，该平滑胶原层可用酸提取的丝状或非丝状胶原制备，主要是I型胶原，但也可以包括II型胶原，IV型胶原，或两者。所用胶原可来源于任何数目的哺乳动物源，通常是猪和母牛的皮肤和腱。胶原优选已经通过酸提取处理，从而产生原纤维分散或产生高纯度凝胶。可用弱酸，如醋酸，柠檬酸，或蚁酸自胶原来源对胶原进行酸提取。一旦提取到溶液中，可使用NaCl将胶原盐-沉淀，并使用标准技术，如离心或过滤得到。酸提取胶原的详细内容见美国专利号US5,106,949，Kemp等，引入此处作为参考。
在另一实施方案中，可将附加胶原层加入到异源多层之间，促进在异源多层的细胞之间生长和发育。在另一实施方案中，可将因子，如营养物，生长因子，细胞因子，胞外基质成分，分化诱导剂或分泌产物，免疫调制剂，提高或使细胞网或神经纤维生长的生物活性化合物加入到异源多层之间。
b.在聚合物基底上的形成多层
在另一实施方案中，不同的培养细胞群体可用于在聚合物的一个区域上产生异源多层。适宜聚合物的例子包括，但不限制于，胶原，聚(α酯)，如聚(乳酸)，聚(乙醇酸)，聚原酸酯和聚酐和它们的共聚物，纤维素醚，纤维素，纤维素酯，氟化聚乙烯，酚醛聚合物，聚-4-甲基戊烯，聚丙烯腈，聚酰胺，聚酰胺酰亚胺，聚丙烯酸酯，聚苯并唑，聚碳酸酯，聚氰基芳基醚，聚酯碳酸酯，聚醚，聚醚醚酮，聚醚酰亚胺，聚醚酮，聚醚砜，聚乙烯，聚氟烯烃，聚酰亚胺，聚烯烃，聚二唑，聚苯醚，聚苯硫醚，聚丙烯，聚苯乙烯，聚硫化物，聚砜，聚四氟乙烯，聚硫醚，聚三唑，聚氨酯，聚偏二氟乙烯，再生纤维素，脲-甲醛，或这些物质的共聚物或物理混合物。
在优选实施方案中，生物相容性基底的一侧用于建造第一同源细胞群体的多层。这是通过用第一同源细胞群体，例如平滑肌细胞的混悬液涂覆生物相容性基底的一侧进行的。在培养基中培养第一同源细胞的混悬液，直到细胞发育并增殖产生单层，且单层的细胞与生物相容性基底粘附。一旦建立了单层，第一同源细胞的混悬液沉积在第一单层上，然后培养细胞，直到它们发育并增殖，以在第一单层上产生细胞的第二单层，由此产生双层。重复该过程，直到产生含有多层第一同源细胞群体的多层。第一多层具有类似体内器官组织的形态和功能性。
建立了第一多层后，在第一多层上建造含有第二同源细胞群体(例如，上皮细胞群体)的第二多层。如此在两个不同的细胞群体之间产生嵌合界面。第二多层是通过使第二同源细胞群体的细胞混悬液在第一多层上沉积而建造的。培养第二同源细胞群体的细胞，直到它们发育并增殖产生第一单层。一旦建立了第一单层，使第二同源细胞的混悬液在第一单层上沉积，并培养细胞，直到它们发育并增殖，以在第一单层上产生细胞的第二单层，由此产生双层。重复该过程，直到产生含有多层第二同源细胞群体的第二多层。第二多层具有与体内器官的实质组织，例如粘膜相类似的形态和功能性。如上所述，间质生物物质是在两种不同细胞群体之间的嵌合界面上产生的。
在一个实施方案中，将平滑肌细胞，例如子宫肌细胞灌注到形成多层的生物相容性基质一侧，将雌性生殖上皮细胞，例如子宫内膜细胞灌注在形成第二多层的生物相容性基质的相反一侧上。所述生物相容性基质形成粘膜下层。该生物相容性基质是可生物降解的，从而使两个细胞群体形成嵌合界面。
因此，本发明提供产生具有多细胞构造的人造器官的组合物和方法，该人造器官与天然的体内器官非常类似。细胞构造包括异源多层。人造雌性生殖器官的各个多层都包括多层同源细胞群体，产生一种有组织的结构，具有与体内天然器官等价组织层类似的细胞形态学和功能性。
不同多层之间的嵌合界面提供一种微环境，它可模拟不同细胞群体之间的天然微环境。本领域的技术人员将认识到：细胞形状在细胞分裂和分化中起着重要的作用(见，例如Darnell等，Molecular CellBiology(1986)由Scientific American Books出版)。通过本发明方法建造的更自然的微环境允许异源多层细胞之间的相互、动态、未受阻的细胞-细胞相互作用。这些未受阻的相互作用使界面上的细胞恢复更自然的细胞和形态学构型。嵌合界面上更自然的细胞发育使细胞产生促进正常分裂和分化的蛋白。
V.体内植入
雌性生殖人造器官的移植可按照本领域确认的方法进行(见，例如Fauza等，(1998)J.Ped.Surg.33：7-12)。例如，人造雌性器官可通过阴道、骨盆、经手术、或通过耻骨弓上区，腹部，或直肠植入。
在一个实施方案中，将人造子宫与输卵管和阴道缝合在一起。输卵管在其上角进入子宫；在下侧狭窄部分，即子宫颈，进入阴道。正常子宫稍稍向前倾斜，位于泌尿膀胱的后面。在优选实施方案中，天然子宫各个末端仍保留一小部分，从而将人造子宫与天然子宫的剩余部分缝合在一起。在一个实施方案中，每侧至少保留10％的天然子宫，从而将人造子宫与剩余的天然子宫结构缝合起来。在另一实施方案中，将人造子宫与子宫骶韧带缝合在一起，这样子宫颈就被固定到骶骨上，并维持阴道纵轴与子宫之间为90度角。
在另一实施方案中，将人造阴道与子宫缝合在一起。在另一实施方案中，将人造阴道与主要、或横向的子宫颈韧带缝合在一起，该韧带从侧骨盆壁延伸到子宫颈。与主要韧带缝合可使阴道穹窿与子宫颈的中线位置稳定。
在另一实施方案中，将人造输卵管与子宫和卵巢缝合在一起。将人造输卵管缝合在子宫尾侧末端的一侧上，在另一侧，其将它缝合在卵巢或靠近卵巢处。
在另一实施方案中，将人造卵巢与子宫缝合在一起。在另一实施方案中，将人造卵巢与腹膜韧带，卵巢系膜缝合在一起，连接子宫阔韧带的后腹膜层。
VI.人造雌性生殖器官的使用
本发明的人造雌性生殖器官可用于各种用途。例如，可将重构的人造雌性生殖器官植入到受治疗者中。本发明的植入物可用于替换或增加现有的组织；例如，治疗先天性阴道异常和泄殖腔畸形的患者。例如，可用本发明的方法和组合物治疗畸形，如缺少或单侧缺少卵巢结构，缺少输卵管和阴道闭锁，以及双角子宫患者。此外，癌症患者可选择替换他们的器官而防止转移。然后监测患者异常的改善。
本发明的方法和构造可被用作各种疾病的选择性治疗。例如，目前利用子宫切除术来治疗各种疾病，包括子宫肌瘤，子宫内膜异位或慢性骨盆疼痛，出血问题，子宫脱垂，以及子宫、卵巢或子宫颈癌。手术除去子宫的子宫切除术有两种类型：除去子宫和子宫颈的全部(完全)切除，或除去子宫而保留子宫颈的部分(子宫颈上)切除。在某些情况下，孵巢或输孵管也被切除。在一个实施方案中，可将人造雌性器官，组织，或其节段植入到患者中，替换已经除去的器官。
本发明的方法和组合物可用于减少不孕。妇女不孕可由多种不同的问题引起，包括但不限制于，多囊卵巢综合征(PCOS)，多囊卵巢，不能产生卵子，排卵停止，子宫内膜异位，输卵管阻塞，子宫瘢痕形成，和不能产生充足数量和质量的子宫颈粘液。在一个实施方案中，本发明的方法可用于调节激素水平。FSH(促卵泡激素)可刺激妇女排卵。在另一实施方案中，可用有效的人造器官替换形成瘢痕的雌性生殖器官。
一方面，本发明提供一种减少受治疗者不孕的方法，包括提供一种生物相容性基质，将第一细胞群体灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中，第一细胞群体基本为子宫上皮细胞群体，将细胞类型不同于第一细胞群体的第二细胞群体灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中，培养生物相容性基质中的细胞群体，如此形成人造子宫，使受精卵沉积在人造子宫中，将人造子宫植入到受治疗者中，由此在受治疗者中建造人造子宫，该人造子宫可支持所沉积的受精卵的生长。
子宫内膜异位，即子宫内膜组织在子宫外的存在，可引起妇女不孕，特别是当涉及卵巢或输卵管时。这种不孕可能是由于粘连，或瘢痕组织形成和阻断输卵管，阻碍卵子进入子宫造成的。本发明的方法可用于使雌性生殖组织，器官，或其节段再生长，从而恢复生育能力。本发明的方法和组合物可用于，例如，建造人造输卵管，这样受治疗者就可有效排卵。在另一实施方案中，建造能够支持胎儿生长的人造子宫。在一个实施方案中，可将受精卵体外或体内植入到人造输卵管中。
在另一实施方案中，本发明的方法和组合物可用于改善胚胎的体外培养。由于体外不完善的受精培养条件，只有约20-40％的人胚胎可在培养5天后，发育到胚泡期。目前，为了增加发育成胚泡的机会，在仅培养2-3天后，将胚胎从体外培养物转移到子宫中。然而，在天然的体内条件下，2-3天大的胚胎通常是在输卵管而不是子宫中发现的。本发明可为目前的体外培养条件提供一种选择。
在一个实施方案中，可将胚胎体外或体内植入到人造输卵管中。在人造输卵管中进一步成熟后，可将胚胎移植到子宫中。事实上，胚胎在排卵后约80小时，从输卵管移动到子宫中。大约3天后，胚泡形成并孵化，然后植入到子宫中。胚泡，一种在受精后发育了5-7天的胚胎，有两种不同的细胞类型，一个中心腔，且刚刚开始分化。表面细胞，也被称作滋养外胚层，将变成胎盘，而内层细胞，也被称作内层细胞团块，将变成胎儿。在第6天结束时，胚泡应开始从其外壳，也被称作透明带孵化。孵化后约24小时内，应开始将它植入到子宫内层中。本发明可使胚泡在植入到子宫前发育。在另一实施方案中，受孕可自然发生，胚泡植入到体内的人造子宫中。
在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于在受治疗者中构造人造输卵管，从而逆转输卵管结扎。输卵管的一部分在Pomeroy过程中被除去。该过程是通过子宫剖腹产术进行的，或在阴道分娩后，立即在产后期进行。腹腔镜输卵管结扎可通过烧灼每根输卵管的片段，将夹子横向夹住输卵管，或在输卵管一部分的周围放置一个小环而进行。共同的结果是阻塞输卵管，由此阻止卵子和精于的正常运输。该过程的可逆性取决于所要重构的输卵管长度(再吻合)。可将人造输卵管或其一部分与剩余的输卵管缝合，这样就可恢复正常功能，且受治疗者可受孕。
重构的人造雌性生殖器官可体外用于筛选各种化合物的有效性，细胞毒性，和/或药剂，化学剂，生长/调节因子的治疗作用。可体外维持培养物，并与供试化合物接触。细胞毒性化合物的活性可通过其损害或杀死培养物中细胞的能力来测量。这可很容易地通过活细胞染色技术加以评估。细胞毒性的化合物可用作流产方法。生长/调节因子的作用可通过分析基质的细胞内容物，例如总细胞数，和分化细胞数而加以评估。这可使用标准的细胞学和/或组织学技术进行，包括使用确定类型-特异性细胞抗原的抗体的免疫细胞化学技术。可评估各种药物对在重构人造雌性生殖器官中培养的正常细胞的作用。
在一个实施方案中，重构的人造雌性生殖器官可体外或体内用于筛选各种调节平滑肌细胞的化合物。平滑肌的收缩可经由旁分泌，经由在平滑肌近端释放的物质，或经由在血液中循环的激素，如在分娩过程中刺激子宫收缩的催产素刺激。当平滑肌细胞不需要用于刺激的运动神经元时，由运动神经元释放的神经递质，如去甲肾上腺素和一氧化氮，可刺激或松弛平滑肌。因此，多种化合物都可对平滑肌细胞收缩起作用。在一个实施方案中，可筛选诱导收缩的化合物。这种化合物可用于刺激生产。
本发明重构的人造雌性生殖器官可被用作体内引入基因和基因产物的载体，促进或改善移植结果和/或用于基因疗法。例如，可将培养的人造雌性生殖细胞改造以表达基因产物。将该细胞改造，从而瞬时和/或在诱导型控制之下表达基因产物，或作为与人造雌性生殖细胞(例如，阴道上皮细胞)相固定的嵌合融合蛋白，例如，嵌合分子由受体或受体-样分子的胞内和/或跨膜结构域组成，与基因产物融合为胞外结构域。在另一实施方案中，雌性生殖细胞可被基因工程改造为表达患者缺少的基因，或发挥治疗作用。被改造成雌性生殖细胞的目标基因需要与所治疗的疾病有关。例如，对于阴道疾病而言，可将培养的阴道上皮细胞改造成表达可改善阴道疾病的基因产物。
雌性生殖细胞，例如，阴道上皮细胞可使用重组DNA构造改造，该重组DNA构造含有目标基因，其用于转化阴道上皮细胞。将表达活性基因产物的三维支架和阴道组织层植入到缺少该产物的个体中。例如，防止或改善各种类型雌性生殖畸形症状的基因可在疾病条件下低水平表达或被负向调节。基因活性水平可通过增加现有基因产物的水平或通过增加三维支架和阴道上皮细胞中存在的活性基因产物水平而增加。然后将表达活性靶基因产物的三维培养物植入到缺少该产物的患者中。
然后将含有这种基因工程改造的雌性生殖组织的三维培养物植入到受治疗者中，从而改善疾病的症状。基因表达可受到非诱导型(即，组成型)或诱导型启动子的控制。基因表达水平和所调节的基因类型可根据个体患者的治疗形式而控制。
从这里公开的本发明说明书和具体实施方面考虑，本发明的其它实施方案和应用对于本领域那些技术人员而言是显而易见的。无论什么原因，这里引用的所有美国专利和其它参考文献具体引入本文作为参考。说明书和实施例应仅被认为是举例说明，本发明的真实范围和实质由下列权利要求表示。
实施例
在实验室中，从表型正常的自体衍生细胞成功建造预制器官可导致正常功能的发展。下列实施例举例说明本发明的方法和组合物可用于采集细胞，优选自体细胞，使它们在体外扩增，随后将它们植入到体内需要重构、修复、增长、或替换的部位上。本发明是在下列实施例中加以证实的，其中重构的活的阴道、输卵管和子宫是在体内建造的。下列实施例仅仅是本发明的举例说明，不应被解释为对本发明范围的限制。
实施例1：用于建造人造阴道的材料和方法
(i)组织采集和细胞培养
使用新西兰白兔作为阴道组织的供体来源。肌内注射氯胺酮(25mg/kg)，赛拉嗪(2mg/kg)，和乙酰丙嗪(0.75mg/kg)将动物麻醉。下腹部是以无菌方式，用聚维酮碘(Betadine)溶液准备的。通过简单、中线、经腹法采集阴道组织(1cm2)和输卵管组织，该方法使得在活组织检查过程中很好暴露。洗涤取回的组织若干次，然后通过显微解剖或酶消化分离肌肉和上皮组织。
平滑肌细胞是用外植法提取的。在环路放大的条件下，从组织的血清肌肉层小心解剖下若干肌肉带。将这些切片单独放在培养皿上，然后于37℃时，在空气和5％CO2中，与补充了10％胎牛血清(FBS，LifeTechnologies，Rockville，Maryland)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM，Mediatech Inc，Herndon，Virgina)培养，在不搅动的情况下，直到从组织岛生长出充足的细胞集落。小心抽去外植体，每24-48小时定期更换一次培养基，从而维持细胞。
上皮细胞可通过使用IV型胶原酶(Worthington BiochemicalCorportation，Lakewood，New Jersey)和分散酶(BoehringerMannheim，Indianapolis，Ind)进行酶消化而从阴道和输卵管样品中分离。将组织浸入到酶溶液中，37℃下剧烈振摇30分钟。小心吸出，将细胞/流体混悬液低速旋转离心5分钟。将上清液重悬浮在角质细胞没有血清的培养基(K-SFM，Life Technologies，Rockville，Maryland)中，并分配到培养皿中，每24-48小时更换一次K-SFM培养基以维持。使各细胞类型在大约50个15cm聚苯乙烯培养皿中扩增，达到所需的细胞密度，其中上皮细胞密度为10×106个细胞/cc，平滑肌细胞密度为20×106个细胞/cc。
(ii)体外细胞表征的组织学和免疫组织化学
将阴道或输卵管上皮和平滑肌细胞接种在分室载玻片上，用4％缓冲甲醛固定，在培养物中建立了适宜集落数后加工。广泛反应的细胞角蛋白(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Ind)和平滑肌α肌动蛋白抗体(Novocastra，Newcastle，UK)分别用于证实上皮和平滑肌细胞的表型。将这些细胞与使用阻断溶液代替初级抗体培养的阴性对照相比较。用磷酸盐缓冲生理盐水洗涤后，将细胞与生物素化的次级抗体一起培养，并在用过氧化物酶试剂显色前洗涤。复染色是用Gill’s苏木精进行的。
(iii)细胞接种和体内植入
(a)实施例2中使用下列方案。用聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)的50∶50共聚物涂覆聚乙醇酸(PGA)支架。该支架是用环氧乙烷气体灭菌的，并在用细胞接种前，用培养基预湿润24小时。将阴道上皮和平滑肌细胞分别以10×106个细胞/cc和20×106个细胞/cc的浓度交错接种在60个支架的对侧。37℃下，将细胞与5％CO2共培养24-48小时。将60个用细胞接种，20个未接种的总共80个支架皮下植入到小鼠中。小鼠接受氯胺酮(25mg/kg)和赛拉嗪(5mg/kg)镇静，接着在手术后接受盐酸叔丁啡(0.1mg/kg)和cephlasporin用于疼痛的控制和抗生素预防。每只小鼠中植入3个细胞接种的和1个未接种的支架。在植入后第1、4和6周处死动物。
(b)在实施例3中，进行下列方案。用聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)的50∶50共聚物涂覆聚乙醇酸(PGA)(Albany International，Mansfield，MA)支架。这些支架是在细胞接种前预成型并管形化。分别以10×106个细胞/cc和20×106个细胞/cc的浓度将阴道上皮和平滑肌细胞动态接种在生物反应器系统中。在植入到兔子中前，37℃下，将细胞与5％CO2共同培养7天。6只动物植入了未接种的支架，9只动物植入了接种的支架。兔子接受氯胺酮(25mg/kg)和赛拉嗪(5mg/kg)镇静，接着在手术后接受盐酸叔丁啡(0.1mg/kg)和cephlasporin用于疼痛的控制和抗生素预防。在植入后第1、4和6周处死动物。
(iv)接种支架的免疫细胞化学和组织学分析
将福尔马林-固定、石蜡-包埋组织的5微米切片进行处理，并用苏木精-曙红和Mason′s trichrome染色。上皮细胞层是用广泛反应的单克隆抗-全细胞角蛋白(全细胞角蛋白s)AE1/AE3鉴定的。平滑肌纤维是用单克隆α-平滑肌肌动蛋白抗体标记的。免疫标记使用抗生物素蛋白-生物素检测系统进行，切片用苏木精复染色。作为阳性对照，也将正常阴道组织的切片染色，以进行比较。
(v)分子分析
使用单克隆抗体α-肌动蛋白和细胞角蛋白AE1/AE3进行的蛋白质印迹分析可用于比较作为对照的天然阴道组织和重构阴道结构的之间的蛋白表达，从而证实上皮和平滑肌细胞表型的维持。将组织在冷的溶解缓冲液中匀化，收集可溶性蛋白的上清液。蛋白样品的量化是用bioRad DC蛋白测定试剂盒进行的。将等浓度蛋白上样，在SDS-PAGE凝胶上分离，并于4℃时，用初级抗体作为探针杂交过夜。在实施例2中，过氧化物接合的抗-小鼠次级抗体是复合的，并用EHL化学发光系统检测。
(vi)器官浴研究
比较天然和组织改造阴道的纵带，用于器官浴分析。用4-0丝缝线将带与一个末端的组织支持钩和另一末端的等张力转换器(RadnotiGlass Technology，Monrovia，CA)连接。将样品固定在含有用95％O2，5％CO2平衡的50mL Tyrode′s溶液的分离浴上，并在37℃下维持，其中的O2和5％CO2由气泡室提供。记录与各种电刺激和化学刺激接触的各组织带的峰收缩。转换器信号反馈到记录仪中。进行电场刺激时，使用具有2个10mm直径铂铱电极的Grass S48刺激器(AstroMed，Inc.，Warick，RI)。将组织以20毫牛顿(2.0gm)的预加荷载张力固定，在60分钟平衡期结束时，产生大约8毫牛顿(0.8gm)的静止张力。
施加连续的场刺激(20，40，和60Hz；100伏，1msec持续时间的矩形脉冲)，每次刺激之间有3分钟的静止间隔，并测量有效张力。为了证实神经递质受体的表达和功能，使用特异性的自主激动剂(卡巴胆碱和脱羟肾上腺素)。
实施例2：组织改造阴道的制备
先天性阴道异常和泄殖腔畸形需要进行大范围的手术构造。常常遇到的手术困难是由于可获得的天然组织量有限。目前，已经使用非-生殖道组织进行阴道构造，但是会产生很多相关的并发症。自体阴道组织是优选的。本实施例描述阴道上皮和平滑肌细胞用于体内改造阴道组织的用途。
使雌兔的阴道上皮(VE)细胞和平滑肌细胞(SMC)生长并在培养物中扩增。两种细胞类型都是在免疫细胞化学方面描述的。分别以10×106个细胞/cm3和20×106个细胞/cm3将阴道上皮细胞和平滑肌细胞接种在聚乙醇酸(PGA)的聚合物上。将细胞接种的支架皮下植入到裸鼠中。在植入后第1、4和6周处死动物。使用全细胞角蛋白AE1/AE3，和平滑肌特异性α-肌动蛋白抗体进行免疫细胞化学和组织化学分析，从而证实重构组织的表型。也进行蛋白质印迹分析和电场刺激，以在分子和功能水平进一步表征组织改造的构造。
结果证实了阴道上皮和平滑肌细胞在免疫细胞化学方面是阳性的，且在体外的所有培养阶段维持，由此证实上皮和平滑肌表型在接种到聚合物基质上前的保存(preservation)。阴道上皮细胞是用抗-全细胞角蛋白AE1/AE3鉴定的，且在裸鼠的所有培养阶段，平滑肌细胞相对于α-平滑肌肌动蛋白抗体都是阳性染色的。
显然，取回的聚合物支架在结构上类似检查时正常出现的组织。植入1周后，组织学上证实收回的支架是多层的组织带，6周后，继续证实阴道上皮和平滑肌细胞类型发展构造成可区别层。用苏木精和曙红染料(100x)将接种在已经植入到体内的支架上的阴道上皮和平滑肌细胞染色，并在第6周时，取回正常阴道组织的细胞。使用广泛反应性抗-全细胞角蛋白AE1/AE3，从免疫细胞化学方面证实所有植入物中都存在阴道上皮细胞的完全过渡细胞层。相对于细胞角蛋白AE1/AE3(200x)，阴道上皮细胞阳性染色。对于α-平滑肌肌动蛋白特异性抗体(200x)，平滑肌细胞被阳性染色，且证实了构造的肌束数量随时间而增加。还注意到了穿透性天然脉管系统。没有证据表明在对照组中有组织形成。使用相同的初级抗体进行蛋白质印迹分析，证实了在用细胞接种的组织改造支架中，存在正常分化的上皮和平滑肌细胞。细胞接种支架的蛋白质印迹证实了植入1、4和6周后，角蛋白AE1/AE3和α-平滑肌肌动蛋白的蛋白带。与对照组相比，可在所有重构组织结构和所有时间点，观察到上皮和平滑肌细胞的相应蛋白带。
当进行电刺激时，可在组织改造的构造中观察到收缩反应。图1证实植入6周后，正常和组织改造阴道在各种电刺激水平的激发电位。用100V和20Hz、40Hz及60Hz的频率下持续刺激3秒，可在组织改造的构造和正常阴道组织之间观察到类似的反应幅度。虽然组织改造的阴道组织与正常阴道组织间的原始激发性反应类似，但与正常组织(1.5秒)达到基线相比，组织改造构造的恢复期要花费更长时间(平均＝7秒)。使用卡巴胆碱或脱羟肾上腺素进行化学刺激时，在组织改造构造中没有观察到诱导的反应。
在接种到PGA聚合物支架上前，阴道细胞很容易体外繁殖成非常大的集落数。上皮和平滑肌这两种细胞类型可在培养的所有阶段维持它们各自表型的表达，这是通过分别使用全细胞角蛋白AE1/AE3和α-肌动蛋白平滑肌抗体的免疫细胞化学染色加以证实的。体外快速复制并复制到较大细胞数，而不侵犯正常表型的能力是成功改造组织所期望的特征。
阴道上皮和平滑肌细胞已成功地在PGA构造上共同培养。当植入到体内时，可通过免疫细胞化学和蛋白质印迹分析，从表型方面成功鉴定阴道细胞是上皮还是平滑肌细胞。此外，组织改造的构造证实了随时间向上皮和平滑肌成分的正常过度层的进行性构造。这些发现暗示了阴道上皮和平滑肌细胞可在体内复制并长期存活，并可向着正常结构方向自我构造。
功能上，当用一系列电脉冲刺激时，组织改造的阴道构造能够产生与天然阴道组织相似的收缩力。这似乎暗示了使细胞去极化的完整结构膜系统，以及转化成收缩力的胞内阳离子的释放。在恢复期中，记录到天然和改造阴道组织间的差异。使用毒蕈碱或肾上腺素能激动剂进行化学刺激时，没有反应。这些发现暗示了神经递质受体复合物在实验中没有完全发育，最长时间仅为6周。这些发现与在其它组织，如膀胱和尿道中见到的功能分布相一致，即，在4周后见到对电刺激的反应，但直到组织发育3个月后，也没有见到对化学刺激参数的反应。
数据表明，阴道上皮细胞和平滑肌细胞很容易在体外培养并扩增。细胞接种的聚合物支架能体内形成管状化的阴道组织，其具有与天然阴道组织相似的表型和功能性。本研究证实了本发明的用途，其中阴道上皮细胞和平滑肌细胞在体内重构成阴道组织。该技术可继续发展，从而改造阴道组织用于临床使用。
实施例3：使用组织改造的构造完全替换大型动物的阴道
下列研究证实了阴道上皮和平滑肌细胞可在兔子体内复制并长期存活，且看来似乎可向着正常结构方向自我构造，从而能够产生与天然阴道组织见到的那些相似的收缩力。
雌兔的自体阴道上皮(VE)细胞和平滑肌细胞(SMC)在培养物中生长并扩增。在接种到聚合物上之前，从免疫细胞化学方面证实这两种细胞类型。以5×106个细胞/cm3的浓度，将共同培养的VE和SMC动态接种在生物反应器中的聚乙醇酸(PGA)聚合物上。本次实验使用了总共15只动物。接种细胞的支架用于9只动物的完全阴道替换，而未接种的构造用于在6只动物中替换以作为对照。阴道X线照相是在植入后第1、3和6个月进行的。在第1、3和6个月时处死动物进行分析。免疫细胞化学和组织化学分析是用全细胞角蛋白AE1/AE3，和平滑肌特异性α-肌动蛋白抗体进行的，以证实重构组织的表型。此外还进行了蛋白质印迹分析和电场刺激的研究，从而进一步在分子和功能水平上表征组织改造的构造。收缩性和神经递质受体的存在是用器官浴研究加以证实的。荧光细胞膜标记(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)用于证实细胞的体内生存力。
植入后1个月，所有未接种的移植物都萎陷或发育狭窄。未接种聚合物的连续阴道X射线照相术证实了狭窄的存在。相反，连续的阴道X射线照相术证实了在植入了接种管状化聚合物的动物中，维持了较宽的阴道口径，没有任何狭窄的征兆。显然，收回的接种支架在结构上与检查时正常出现的组织类似，而没有任何纤维化的迹象。
组织学上，在细胞接种构造上可观察到由肌细胞纤维束围绕的过渡细胞层的细胞构造随时间而增加。植入1个月后，收回的支架证实了多层的组织带，并继续证实了阴道上皮和平滑肌细胞类型随时间进行性构造成可区别层。细胞生存力和构造还可利用细胞膜标记技术加以证实。阴道上皮细胞完全过渡细胞层的存在是从免疫细胞化学方面，用广泛反应性抗-全细胞角蛋白AE1/AE3在所有植入物中加以证实的。使用平滑肌细胞观察到相同的结果，其对于α-肌动蛋白特异性抗体是阳性染色的，且证实了构造的肌肉束数量随时间而增加。当把重构结构与作为阳性对照的正常阴道组织进行比较时，观察到类似的染色模式和强度。还记录了穿透性天然脉管系统。蛋白质印迹分析使用相同的初级抗体，证实在用细胞接种的组织改造支架中，存在正常分化的上皮和平滑肌细胞。当与对照组进行比较时，在所有重构的组织结构和所有时间点(1、3和6个月)，都见到了上皮和平滑肌细胞的相应蛋白带。相反，在未接种的构造上，存在具有少量未构造肌纤维束和大面积纤维化的过渡细胞层。
特异性的激动剂(卡巴胆碱和脱羟肾上腺素)用于从功能上证实毒蕈碱和肾上腺素能受体在改造和正常尿道壁中的存在。加入卡巴胆碱(10-6M)和脱羟肾上腺素(10-3M)可定性引发改造的和正常阴道带的相同收缩。组织改造的阴道组织证实能够通过基于神经递质的机理产生收缩力。在电场刺激和器官浴研究中，观察到组织改造构造的功能性电化学反应。电场刺激证实了与正常阴道相比，在组织改造构造中存在相似的收缩反应。
在本研究中，阴道细胞成功地在体外培养，并用于体内建造重构的活组织。在接种到PGA的聚合物支架上前，阴道细胞很容易体外繁殖到非常大的集落数。上皮和平滑肌这两种细胞类型都可在培养的所有阶段维持它们各自表型的表达，这分别是通过使用全细胞角蛋白AE1/AE3和α-肌动蛋白平滑肌抗体进行的免疫细胞化学染色加以证实的。体外快速复制并复制到较大细胞数，而不侵犯正常表型的能力是成功改造组织所期望的特征。
阴道上皮和平滑肌细胞已成功地在PGA构造上共同培养。当植入到体内时，可通过免疫细胞化学和蛋白质印迹分析，从表型方面成功鉴定阴道细胞是上皮还是平滑肌。此外，组织改造的构造证实了上皮和平滑肌成分随时间向不同过度层的立体定向。这些发现暗示了阴道上皮和平滑肌细胞可在体内复制并长期存活，且看来似乎可向着正常结构方向自我构造。
功能上，当用一系列电脉冲刺激时，组织改造的阴道构造能够产生与天然阴道组织所见那些相似的收缩力。这似乎暗示了完整的结构膜系统可使细胞去极化并释放转化成收缩力的胞内阳离子。使用毒蕈碱或肾上腺素能激动剂进行化学刺激时也有反应。这暗示了正在发展的神经递质受体途径。这些发现与在其它组织，如膀胱和尿道中见到的功能分布相一致，即在组织发育几周后，可见到对电和化学刺激参数的反应(Chen等，World J Urol.18(1)：67-70，(2000)；Oberpenning等，Nature Biotech.17：2(1999))。
本研究证实，VE和SMC可在实验室中，在较大的聚合物构造上重构，用于替换整个阴道。该技术对于那些将来需要进行扩大的下部生殖器重构的患者具有临床益处。
实施例4：组织改造的输卵管的制备
本实施例描述输卵管上皮和平滑肌用于体内改造输卵管的用途。
使雌兔的输卵管上皮细胞和平滑肌细胞在培养物中生长并扩增。通过免疫细胞化学方法表征了这两种细胞类型。分别以大约10×106个细胞/cm3和20×106个细胞/cm3将输卵管上皮细胞和平滑肌细胞接种到聚乙醇酸(PGA)的聚合物上。将细胞接种支架皮下植入到裸鼠中，在植入后第1、4和6周处死动物。免疫细胞化学和组织化学分析可使用全细胞角蛋白AE1/AE3，和平滑肌特异性α-肌动蛋白抗体进行，从而证实重构组织的表型。还可进行蛋白质印迹分析和电场刺激研究，从而进一步在分子和功能水平上表征组织改造的构造。
该实施例证实输卵管上皮细胞和平滑肌细胞可体外培养并扩增。细胞接种的聚合物支架可体内形成管状化输卵管组织，它具有与正常输卵管组织相似的表型和功能性。
实施例5：用于建造人造子宫的材料和方法
(i)细胞采集和培养
肌内注射氯胺酮(25mg/kg)和赛拉嗪(5mg/kg)将12只体重为3.5-4.0kg的新西兰白兔麻醉，并用异氟烷(1-3％)维持。暴露子宫角后，从每只动物切下1×1cm的子宫组织切片。37℃下，用0.1％IV型胶原酶(Worthington，Lakewood，NJ)在振动培养箱中消化粘膜组织40分钟。随后，洗涤粘膜组织，并将细胞平板接种在6-孔培养皿的培养基中，该培养基由F-12(Gibco，Grand Island，NY)和Dulbecco改进的Eagle培养基(Mediatech，Herndon，VA；F-12/DMEM，v/v 1∶1)组成，其中补充了EGF(5ng/ml)，牛垂体提取物(40ng/ml)和10％胎牛血清(Gemini，Wood land，CA)(Baez，C.E.，Atala，A.：Uterus，Methods of Tissue Engineering，由A.Atala和R.P.Lanza.编辑，Boston：Academic Press，1189-1194页，2002)；(Mulholland等，原始培养后，通过兔子宫内膜上皮细胞合成的蛋白的改变，CellTissue Res，252：123，1988)；(Vigano等，人子宫内膜细胞的培养：一种完全分离上皮腺的新的简单技术，Acta Obstet Gynecol Scand，72：87，1993)；(Bongso等，人子宫内膜细胞培养物的建立，HumRepro，3：705，1988))。
在无菌条件下解剖组织样品，并分离上皮和肌肉层。用锋利的剪刀将肌肉组织绞碎成小于2mm3的片段，并放在培养平板上。轻轻加入补充了10％FBS的DMEM肌细胞培养基，并将培养物放在含5％CO2的恒湿培养箱中直到融合(Merviel等：培养物中的正常人子宫内膜细胞：SV40大型T抗原对上皮和基质细胞的无限增殖化和表征，BiolCell，84：187，1995)；(Osteen等：从人子宫内膜活组织检查样品中分离并培养高度纯化的基质和上皮细胞群体的方法的建立，FertilSteril，52：965，1989)。每3天更换一次培养基，用0.5％胰蛋白酶再次培养该细胞(Sigma，St.Louis，MO)。上皮和平滑肌细胞分开扩增，直到获得充足的细胞。
(ii)聚合物支架
用5-0号可吸收缝线将6cm×3cm大小的聚乙醇酸无纺筛网(PGA，堆密度为58mg/cc，Albany International，Mansfield，MA)构造成子宫形状的模型。可生物降解的聚合物筛网是由15μm的纤维构成的，纤维间距离为100-200pm，孔隙率为95％。用聚-DL-丙交酯-共-乙交酯(PLGA，50：50；Sigma Chemical，St.Louis，Missouri)的氯仿溶液(5％w/v)涂覆该构造，从而增加坚硬度，并维持其周围结构。随后蒸发溶剂，将支架在真空下放置2天。用环氧乙烷将支架灭菌。
(iii)细胞接种
将原始子宫平滑肌和上皮细胞逐步接种在管型聚合物上。平滑肌细胞最初是以60×106个细胞/ml的浓度接种的。细胞在恒湿培养箱中的补充了10％FBS的DMEM中生长3天。每24小时更换一次培养基，从而确保营养物的充分供给。随后以60×106个细胞/ml的浓度接种上皮细胞。植入前，再培养接种的细胞48小时。
(iv)手术和术后评估
在麻醉状态下，切开下部中线腹部，使先前进行过子宫活组织检查的12只雌兔的两个子宫角都暴露出来(Millbrook farms，Concord，Massachusetts)。每只切除约80％圆周直径的单侧子宫角，留下一个较细的纵带。用自体细胞接种的构造替换切除的子宫角。该构造与天然卵巢和阴道之间的吻合是用6-0号Vicryl缝线，通过每端的小组织套进行的。将不可吸收的标记缝线放在将来进行鉴定的每个解剖位置上。以没有细胞的聚合物及模拟操作的动物作为对照(每组n＝3)。所有构造都用网膜覆盖。子宫输卵管照相术在手术后第1、3和6个月时进行，从而鉴定所植入构造的结构完整性。手术后第1、3和6个月时处死动物(每个时间点n＝3)。
(v)组织学和免疫细胞化学分析
将得到的子宫组织样品用福尔马林固定，石蜡包埋，切片，并用苏木精和曙红，及Masson’s trichrome进行组织染色。用特异性抗体，对在分室载玻片上生长的培养细胞和得到的样品进行免疫细胞化学分析。子宫平滑肌细胞用单克隆抗-α平滑肌特异性肌动蛋白(Dako，Carpinteria，CA)标记，子宫上皮细胞用全细胞角蛋白AE1/AE3(Dako，Carpinteria，CA)标记，雌激素受体功能用雌激素受体β抗体测定(Santa Cruz，Santa Cruz，CA)(Monje等，天然雌激素受体α和β同种型在兔子宫和卵巢中的亚细胞分布，J CellBiochem，82：467，2001)。免疫标记是用抗生物素蛋白-生物素检测系统进行的(Vector laboratories，Burlingame，CA)。用Gill苏木精将切片复染色。
(vi)蛋白质印迹分析
将新获得的子宫组织样品匀化，并通过常规蛋白提取方法，使用溶解缓冲液制备蛋白，该溶解缓冲液含有1x磷酸盐缓冲生理盐水，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，10μg/ml抑肽酶和10μg/ml亮肽素。4℃下，14,000rpm离心20分钟除去不溶性物质。蛋白浓度是用Bio-Rad蛋白测定试剂盒测定的。用2x样品缓冲液(0.125Mtris-HCI，pH6.8，4％SDS，10％2-巯基乙醇，20％甘油和0.004％溴酚蓝)稀释(1∶1体积)等量(20μg)各样品。将样品沸腾5分钟，并上样到10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上。电泳后，将蛋白转移到具有Multiphore系列半干转移单位的聚偏二氟乙烯薄膜上(Pharmacia Biotech，Inc.).用3％ BSA(4.5g BSA，300μL 10％叠氮化钠，150mL 1×TBS/T)阻断该薄膜1小时，接着于4℃时，在1∶1000稀释的小鼠抗人AE1/AE3，α-肌动蛋白和雌激素受体初级抗体中培养过夜。随后室温下用次级抗体接合物处理薄膜1小时。用ECL试剂盒(Amersham Life Sciences Inc.，Illinois)处理免疫印迹，并暴露于放射线胶片1-10分钟。在X-Omat机器中将胶片显影。
(vii)器官浴研究
改进的Krebs溶液(NaCl 134mmol，KCl 3.4mmol，CaCl2 2.8mmol，磷酸二氢钾1.3mmol，NaHGO3 16mmol，MgSO4 0.6mmol，和葡萄糖7.7mmol)用于组织浴研究(Piechota等：通过膀胱无细胞基质移植物再生的大鼠膀胱的体外功能性，J Urol，159：1717，1998)。在所有实验过程中，通过持续鼓入95％O2/5％CO2而维持溶液pH 7.4。将50ml双室Quiet Bath(Radnoti Glass Technology，Monrovia，CA)用作工作室。连续的气流可使Krebs溶液循环，通过外部加热回路温热至37℃(Immersion Circulator，model 1112，VWR ScientificProduct，West Chester，PA)。
组织收缩时，将子宫组织带(每只动物n＝3)浸入到组织浴中，与具有铂铱电极(10mm直径，20mm间隔)的L-型组织支持物垂直。利用两根5-0号编织丝缝线将等距力位移转换器(Radnoti GlassTechnology，Monrovia，CA)与另一侧连接起来。Grass48电刺激器(Grass Technique，West Warwick，RI)为电场刺激源(EFS)。使转换器信号反馈到图形记录仪(Econo-135，Biorad，Hercules，CA)中。以15分钟的间隔两次施加2.0gm的预加荷载。在每次实验开始前，将所述带平衡至少30分钟。进行电场刺激研究时，使用100伏；1.0ms脉冲持续时间；5，10，20，40，50脉冲/秒(pps)频率，每次刺激之间的间隔为2分钟。进行药物刺激时，收缩性是使用毒蕈碱受体激动剂(卡巴胆碱，1×10-4M)和拮抗剂(阿托品，1×10-4M)，和肾上腺素能受体激动剂(脱羟肾上腺素，1×10-4M)和拮抗剂(酚妥拉明，1×10-4M)测定的。每次收缩性试验后，测量带的重量。收缩强度以g力/100mg组织(g/100mg)表示。器官浴研究是用改造的和正常对照的子宫组织上进行的。
(viii)生物机械性
从正常子宫，改造的子宫植入物和无细胞的植入支架获得矩形组织带(20mm×4.5mm×1.5mm)(每种样品n＝5)。张力试验(Instronmodel 5544，MA，USA)是通过以0.05mm/秒的速度纵向拉伸组织带而进行的(Dahms等：膀胱无细胞基质移植物的组成和生物机械性：在大鼠，猪和人中进行的比较分析，Br J Urol，82：411，1998)。产生每种样品的应力/应变曲线，并测定最大拉伸强度和应变力(MPa)。在响应极限强度时测定的最大拉伸应变是根据与原始长度相比的伸长位移比而计算的。使用不成对的Student’s t检验(InStatTM，GraphpadSoftware Inc.，San Diego，CA)进行统计学分析。p＜0.05被认为是统计学显著的。
实施例6：使用自体细胞建造组织改造的子宫
本研究证实可使用子宫上皮和平滑肌细胞，例如，子宫肌细胞体内形成子宫组织。材料和方法在实施例5中描述。
(i)细胞培养
兔子宫上皮和子宫肌细胞在培养物中可靠生长并扩增。通过显微镜证实上皮和平滑肌细胞分别具有典型的圆石子样外观和伸长的基质样外观。每种细胞类型分别是使用全细胞角蛋白AE1/AE3，雌激素受体β和平滑肌特异性α-肌动蛋白抗体从表型方面加以证实。使用相应抗体对子宫细胞进行的蛋白质印迹分析证实了细胞蛋白的表达。
(ii)肉眼检查
所有动物存活到它们的预定时间点，而没有任何不利作用。鉴定天然和植入组织间过渡区的标记缝线可在所有收回的子宫组织植入物中见到。显然，细胞接种的子宫植入物证实了所有时间点的明确子宫角。用细胞接种构造替换子宫组织证实了分别在第1、3和6个月时的明确子宫角。所有细胞接种的植入物都证实了广泛的开放腔。改造子宫植入物的内腔具有粘膜表面，其不能与正常子宫粘膜很明显地区分开。没有植入细胞的聚合物子宫腔在1个月后萎陷，且在第3和6个月时，移植物随着纤维化增加而萎缩。
(iii)放射照相术研究
细胞接种构造的子宫输卵管照片显示出在所有时间点的完全可扩张的开放式管状子宫结构。第1和6个月时的细胞接种植入物的子宫输卵管照片与模拟操作的动物相似。未接种的构造在手术后1个月时，在子宫中段显示出明显的狭窄，且在第6个月时，腔随时间而完全萎陷。
(iv)组织学和免疫细胞化学分析
用细胞接种并在1个月时收回的子宫植入物显示出较薄的上皮细胞层。在收回的组织内见到未构造的平滑肌细胞纤维和未降解的聚合物。3个月后，检测到形态学正常的子宫组织，它由被粘膜下层和肌肉层包围的子宫内膜细胞内层组成。在所有例子中都观察到平滑肌纤维构造并排列形成肌肉组织束和子宫上皮细胞的均匀层。聚合物纤维在3个月后完全降解。各种细胞类型是用平滑肌α-肌动蛋白，全细胞角蛋白AE1/AE3和雌激素受体β的特异性抗体从表型方面加以证实的((Vigano等：Acta Obstet Gynecol Scand，72：87，1993)；(Bongso等：Hum Repro，3：705，1988)；(Merviel等，Biol Cell，84：187，1995))。
手术1个月后，没有细胞的子宫植入物显示出大量成纤维细胞的沉积和炎性细胞的广泛募集。鉴定了用全细胞角蛋白AE1/AE3抗体阳性染色的分散的上皮岛，和未构造的平滑肌α-肌动蛋白阳性细胞。在第3和6个月时，没有细胞的植入物证实了大量结缔组织形成并具有腔上皮层，但仅有少量未构造的肌肉纤维。收回的子宫植入物证实了适宜的细胞构造。细胞表型是通过用α-肌动蛋白和细胞角蛋白AE1/AE3抗体加以证实的。
(v)蛋白质印迹分析
正常子宫组织和细胞接种植入物的蛋白级分可证实类似表达的40-60kDa细胞角蛋白AE1/AE3和42kDa平滑肌α-肌动蛋白的存在。角蛋白AE1/AE3和α-肌动蛋白表达水平的降低在仅为聚合物的植入物中注意到。50kDa雌激素受体β的表达可在细胞接种的植入物和正常子宫组织的蛋白部级中检测到，然而，该蛋白在仅为聚合物的植入物中表达水平极低。
(vi)器官浴研究
器官浴研究如图2所示。植入1个月后收回的组织改造带对电场或药物刺激没有反应。第3和6个月时，细胞接种植入物的组织带对电场刺激具有收缩反应(图2D)。第6个月时，细胞接种子宫植入物的收缩幅度约为正常子宫组织的70％。最大收缩强度范围是3.7-8.7g/100mg。绝大多数改造的组织带都可达到40-50Hz的最大收缩性。与正常子宫组织相比，细胞接种的植入物松弛到基线较慢。正常子宫组织对电场刺激的反应见图2A，对药物刺激(卡巴胆碱(CA)，阿托品(AT)，脱羟肾上腺素(PE)，和酚妥拉明(PL))的反应见图2B和C。对毒蕈碱和肾上腺素能受体激动剂的药物反应也可在收回3和6个月的改造子宫组织中观察到(图2E & F)。
(vii)生物机械性
植入6个月后，细胞接种的子宫组织的应力/应变性与正常对照组相似。在第3和6个月时，细胞接种子宫组织(□)与仅有支架的对照(Δ)植入物之间的最大张应力存在显著性差异(0.25和0.23vs0.15MPa)(图3A)。在第6个月时，细胞接种的植入物(□)与仅有支架的对照组(Δ)之间的平均最大应变存在显著差异(68％vs38％)(图3B)。
(viii)概述
使用本发明的方法和组合物，采集子宫上皮和肌肉细胞，使它们生长，扩增，然后接种到预成型的聚合物支架上，用于子宫组织的替换。植入的子宫细胞能够存活，重构并形成空间定向的多层子宫组织结构。在研究的整个持续过程中，细胞仍保留它们的表型特征。子宫细胞具有雌激素受体，如通过免疫细胞化学和蛋白质印迹所证实的，这表示它们对雌激素反应的能力。
本研究所用的聚合物支架可作为细胞送递载体，其可维持它们的结构完整性，直到形成成熟组织。将细胞接种到预成型的子宫型聚合物支架上，其被设计为在植入3个月后降解。
通过子宫输卵管照相术和肉眼检测证实，细胞接种的改造子宫构造在结构上是完整的子宫组织。没有细胞的所有植入物均导致狭窄初步形成，其进一步发展，直到出现梗阻。这些发现表明，没有细胞的支架本身不足以用于正常子宫组织再生。
已证实本研究中建造的子宫组织与天然子宫组织的解剖学和组织学特征相似，其由被基质和肌肉层包围的上皮内腔构成。使用抗-全细胞角蛋白AE1/AE3和抗-平滑肌α-肌动蛋白进行的免疫细胞化学和蛋白质印迹分析鉴定了上皮和肌肉的表型及表达。此外，雌激素受体β的表达是在改造子宫组织内加以证实的(Cooke等，用基质移植的阴道和子宫上皮培养物的正常形态学和雌激素反应性的恢复，Proc NatlAcad Sci USA，83：2109，1986)；(Bowen等：极化猪子宫上皮模型系统的特性描述，Biol Reprod，55：613，1996)；(Classen-Linke等：人子宫内膜细胞培养系统的建立和其极化激素反应性上皮细胞的特性描述，Cell Tissue Res，287：171，1997)；(Glasser等：接受性是激素调节的子宫上皮细胞的极性依赖性特殊功能，Microsc ResTech，25：106，1993))。
改造的子宫组织的物理性质与正常天然组织类似。改造的子宫组织具有适宜的组织抗性和顺应性。收缩性是子宫组织功能的其中一个最重要指标。本研究中，改造的子宫组织证实了对电场刺激和药剂的反应有较大程度的收缩和松弛。
本研究证实了使用生物降解聚合物和自体细胞的本发明方法可成功用于建造子宫。本发明可用于需要用于子宫重构的组织的患者。
等效
以上述实施方案为基础，本领域技术人员应认识到，或能够利用不止一种常规实验来确定本发明的其它特征和优点。因此，本发明不受特别给出和描述的内容限制，本发明的范围由权利要求表示。所有公开出版物和参考文献全部引入本文作为参考。