说明书二苯并呋喃衍生物及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及一种二苯并呋喃衍生物,还涉及该二苯并呋喃衍生物的制备方法,还涉及该二苯并呋喃衍生物在制备治疗神经退行性疾病药物中的用途。
背景技术
神经退行性疾病如阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)等是一种常见的老年性疾病,其发病率较高,已成为现代社会严重威胁老年人健康和生命的疾病之一,死亡率仅次于心血管病、癌症和中风位居第四。AD病因复杂,其病理演变涉及神经、免疫以及血液循环等多个系统,可能的发病机制包括脑部微循环萎缩和供血不足、胆碱神经递质生成不足、β‑淀粉样蛋白(Aβ)缠结、沉淀以及氧化自由基损伤等多个方面。目前应用于临床的抗AD药物主要有胆碱酯酶抑制剂、脑细胞代谢激活剂、N‑甲基‑D‑天冬氨酸受体拮抗剂以及淀粉样前体蛋白和Aβ生成干扰剂等几类药物,但效果均不理想。
加兰他敏(Galantamine)是一种从石蒜属植物中提取得到的活性生物碱,具有良好的抑制乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)活性,而且还能有效调节烟碱受体构象,发挥神经元细胞保护作用,目前已在多个国家和地区上市,用于治疗神经退行性疾病。然而,如前所述,AD病因涉及中枢胆碱能功能、神经毒性Aβ、脑内供血微环境及活泼氧自由基等多种因素,而加兰他敏仅可作用于中枢胆碱能系统,无法干预AD的其他致病因素,因而仅能起到缓解AD症状的作用,无法终止、逆转神经细胞退行溃变进程,难以达到理想的治疗效果。其结构式如下:
为了改善加兰他敏的治疗效果,研究人员对加兰他敏的分子结构进行了改造、优化,其思路有:1)A环烯醇羟基成酯修饰;2)D环叔胺成季铵盐修饰;3)对C环上甲氧基进行取代变换;4)通过直链烷基二溴与两分子加兰他敏反应制备双联加兰他敏,等等。然而,上述结构改造均以价格昂贵的加兰他敏为起始原料,开发成本高昂;此外,所得的衍生物的活性不高。
发明内容
发明目的:本发明的第一目的是提供一种二苯并呋喃衍生物。
本发明的第二目的是提供了一种该二苯并呋喃衍生物的制备方法。
本发明的第三目的是提供了该二苯并呋喃衍生物在治疗神经退行性疾病的用途。
技术方案:本发明提供的二苯并呋喃衍生物,其结构式如下:
其中,R1为氢原子、羟基或C1‑6烷氧基;
R2为氢原子或卤素原子;
R3为氢原子、C1‑8烷基或Ph(CH2)n,其中,n=1‑6;
R4为氢原子、C1‑8烷基或
优选地,本发明的二苯并呋喃衍生物结构式如下:
本发明定义的二苯并呋喃衍生物除了上述15种结构式表述的化合物外,还可举出如下化合物:
2‑正己基氧基‑5‑(N,N‑二正辛基胺基)甲基二苯并呋喃;
2‑正己基氧基‑5‑(6’‑苯基正辛基胺基)甲基二苯并呋喃;
2‑乙氧基‑5‑(4’‑苯基正丁基胺基)甲基二苯并呋喃;
2‑甲氧基‑5‑[N‑异丙基‑N‑(7’‑硝氧基正庚酰基)]胺基甲基二苯并呋喃;
2‑甲氧基‑5‑(N,N‑二乙基胺基)胺基甲基‑8‑溴二苯并呋喃;
5‑异丙胺甲基‑8‑氯二苯并呋喃;
2‑环己氧基‑5‑(2’‑环己基乙基)胺基甲基‑8‑氟‑二苯并呋喃;
2‑环戊基甲氧基‑5‑(2’‑甲基庚基)胺基甲基‑8‑溴‑二苯并呋喃;
2‑异丙氧基‑5‑(2’‑甲基‑3’‑乙基戊基)胺基甲基‑8‑碘‑二苯并呋喃;
2‑甲氧基‑5‑[N‑异丙基‑N‑(5’‑甲基‑6’‑硝氧基己酰基)]胺基甲基二苯并呋喃。
本发明还提供了上述二苯并呋喃衍生物的制备方法:
当R4为氢原子或C1‑8烷基时,包括以下步骤:
(1)取代的邻溴硝基苯与取代的间甲酚在碱性条件下反应得中间体2;
(2)中间体2经催化氢化或铁粉还原得中间体3;
(3)中间体3在酸性条件下与亚硝酸钠环合反应得中间体4;
(4)中间体4与N‑溴代琥珀酰亚胺或溴在光照条件下回流反应,得中间体5;
(5)中间体5与烷基胺反应,得产物6,即为所述R1为C1‑6烷氧基或氢原子的二苯并呋喃衍生物;
(6)产物6与氢溴酸水溶液反应,得产物7,即为R1为羟基的二苯并呋喃衍生物;
反应式如下:
其中,
R1为氢原子或C1‑6烷氧基;
R2为氢原子或卤素原子;
R3为氢原子、C1‑8烷基或Ph(CH2)n,其中,n=1‑6;
R4为氢原子或C1‑8烷基;
当R4为 时,还包括以下步骤:
(7)中间体5与烷基伯胺反应得中间体6’;
(8)中间体6’与酰氯反应得中间体8;
(9)中间体8与硝酸银回流反应,得产物9,即为R4为 的二苯并呋喃衍生物;
反应式如下:
其中,m=1‑6;
R1为氢原子、羟基或C1‑6烷氧基;
R2为氢原子或卤素原子;
R3为氢原子、C1‑8烷基或Ph(CH2)n,其中,n=1‑6;
R4为 其中,m为1‑6。
本发明还优化了反应条件:
步骤(1)中,取代的邻溴硝基苯与取代的间甲酚的摩尔比为1:1‑2;反应温度为150‑180℃;反应时间为1‑4小时;pH为12以上。
步骤(2)中,所述催化氢化反应温度为40‑80℃;反应时间为3‑6小时;催化剂为钯碳;所述铁粉还原反应温度为50‑100℃;反应时间为3‑6小时;中间体2与铁粉的摩尔比为1:(5‑15)。
步骤(3)中,所述中间体3与亚硝酸钠的摩尔比为1:(1.0‑1.5),环合反应温度为50‑100℃;反应时间为1‑3小时;pH为1.0‑3.0;反应还需要催化剂,所述催化剂为CuBr;反应溶剂选自水和甲醇中的一种或两种。
步骤(4)中,中间体4与N‑溴代琥珀酰亚胺或溴的摩尔比为1:(1‑3),反应温度为60‑80℃;反应时间为2‑5小时;反应溶剂为四氯化碳、二氯甲烷或氯仿。
步骤(5)中,中间体5与烷基胺的摩尔比为1:(1‑10),优选地1:5;反应时间为5‑20h;反应温度为20‑30℃;反应溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙腈或丙酮。
步骤(6)中,所述氢溴酸水溶液的质量百分比浓度为30‑50%,优选40%;所述产物6与氢溴酸水溶液的用量比为1mmol:5‑15ml,优选1mmol∶10ml;反应时间为3‑6h,优选5h;反应温度为90‑110℃,优选100℃;反应溶剂选自水和甲醇中的一种或两种。
步骤(7)中,中间体5与烷基伯胺摩尔比为1:(1‑10),优选地1:5;反应时间为5‑20h;反应温度为20‑30℃;反应溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙腈或丙酮。
步骤(8)中,中间体6’与酰氯的摩尔比为1:(1‑2);反应时间为1‑3h;反应温度为10‑30℃;反应溶剂为二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃或乙酸乙酯。
步骤(9)中,中间体8与硝酸银的摩尔比为1:(4‑6);反应时间为3‑12h;反应温度为50‑85℃;反应溶剂为乙腈、丙酮或乙酸乙酯;反应还需要避光。
本发明还提供了一种取代的邻溴硝基苯的制备方法:间溴苯酚与硝化试剂硝化反应,产物与卤代烷烃取代反应即得。
其中,所述硝化试剂选自硝酸与硫酸组成的混酸、硝酸或硝酸铝中的一种;间溴苯酚与硝化试剂的摩尔比为1:(1‑3),优选地,为1:1.5;硝化反应温度为50‑85℃,优选地为75℃;硝化反应时间为5‑10小时,优选地为9小时。
卤代反应温度为60‑80℃,优选地为75℃;反应时间为2‑5小时,优选地为3小时;反应溶剂为四氯化碳、二氯甲烷或氯仿。
本发明还提供了另一种取代的邻溴硝基苯的制备方法:取代溴苯与硝化试剂反应即得。
其中,所述硝化试剂选自硝酸与硫酸组成的混酸、硝酸或硝酸铝中的一种;取代溴苯与硝化试剂的摩尔比为1:1‑3,优选地,为1:1.5;硝化反应温度为0‑10℃,优选地为5℃;硝化反应时间为3‑6小时,优选地为4小时。
本发明还提供了上述二苯并呋喃衍生物在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。该化合物体现了良好的胆碱酯酶抑制活性、温和的Aβ纤维化抑制活性。
有益效果:本发明提供的二苯并呋喃衍生物具有良好的胆碱酯酶抑制活性,部分化合物对乙酰胆碱酯酶的半数抑制浓度(IC50)低于1μM,活性优于阳性对照加兰他敏;同时,部分代表性化合物还表现出了温和的Aβ纤维化抑制活性,而加兰他敏未显现出相应的抑制活性;在动物体内实验中,应用八臂迷宫测试平台,发现部分代表性化合物可有效改善东莨菪碱致使的智力损伤,活性与阳性对照药物他克林相当。这些结果提示该类化合物具有治疗神经退行性疾病的潜在用途。
通过对加兰他敏母环骨架进行改造,将加兰他敏D环开环,同时将A环变为具有刚性平面结构的芳环,从而可以得到以二苯并呋喃为基本骨架的一类新颖衍生物。该类化合物具有以下的结构特点:1)以三环芳香平面结构替代加兰他敏复杂的四环结构,有 利于通过常规有机合成手段获得化合物;2)将加兰他敏D环开环使之变为含氮的取代支链,一方面可以提升化合物的胆碱酯酶抑制活性,另一方面可以通过适宜长度的连接基团引入第二药效基团,从而得到具有AChE抑制及其他多重作用的新型衍生物。基于一氧化氮(nitricoxide,NO)供体如有机硝酸酯在体内能够释放微量的NO,改善中枢系统供血以及抑制炎症反应,具有改善神经退行性疾病治疗的潜在功效,发明人进一步将有机硝酸酯类NO供体结合至二苯并呋喃骨架上,获得NO供体型二苯并呋喃衍生物。
附图说明
图1为射线形八臂迷宫示意图。迷宫中央是直径为30cm的圆形区域,以此为中心发散出8个长44cm、宽14cm、高30cm的通道,在每个通道端头放置一个直径为3cm的食槽。
图2为实验动物寻找食物所费的时间(受试药物6d组)。
图3为实验动物在寻找食物时所犯错误次数(受试药物6d组)。
图4为实验动物的平均移动速度(受试药物6d组)。
图5为实验动物寻找食物所费的时间(受试药物9b组)。
图6为实验动物在寻找食物时所犯错误次数(受试药物9b组)。
图7为实验动物的平均移动速度(受试药物9b组)。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例13‑溴‑4‑硝基苯甲醚(1a)的制备。
5.00g(29.0mmol)间溴苯酚溶于30ml无水乙醇中,加入16.30g(43.5mmol)九水合硝酸铝,机械搅拌,加热至50‑85℃回流反应9h。浓缩除去大部分乙醇,之后加入100ml的1mol/l的稀盐酸溶解,用乙酸乙酯萃取(30ml×3),萃取液用饱和Na2CO3溶液调节至 pH=7,再用饱和食盐水洗涤(30ml×3),无水硫酸钠干燥除水。过滤,浓缩,以乙酸乙酯/石油醚混合液为洗脱剂柱层析得产物3‑溴‑4‑硝基苯酚1.45g,产率为23.3%,熔点为128‑131℃。可选地,九水合硝酸铝也可以根据需要加入29‑87mmol,反应时间也可根据反映温度相应调整,优选地,为5‑10h。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.95[d,9Hz,1H],7.21[d,3Hz,1H],6.87[dd,3Hz,9Hz,1H],5.58[s,1H];IR(KBr):3403(s,OH),1640(s,Ar),1582(s,Ar),1475(s,Ar),1511(vs,NO2),1296(vs,NO2)cm‑1;ESI‑MS:218[M+H]+.
将上述所得3‑溴‑4‑硝基苯酚溶入50ml丙酮中,然后加入3.59g(26mmol)碳酸钾,滴加1.32ml(26mmol)碘甲烷,室温搅拌反应8h。过滤,将滤液倒入水中,用乙酸乙酯萃取(30ml×3),有机相水洗(30ml×3),然后用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,最后得到2.56g黄色固体产物(1a),产率95.1%。熔点44℃‑46℃。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.98[d,10Hz,1H],7.21[d,3Hz,1H],6.91[dd,5Hz,10Hz,1H],3.89[s,3H];IR(KBr):1593(vs,Ar),1519(vs,NO2),1482(s,Ar),1340(vs,‑O‑),1283(s,NO2),1030(s,‑O‑)cm‑1;ESI‑MS:232[M+H]+.
实施例2 2‑溴‑4‑正丙氧基硝基苯(1b)的制备。
将65%的浓硝酸(6ml)和98%的浓硫酸(5ml)配成混酸,置于冰盐浴中,冷却至‑10℃,然后将3‑丙氧基溴苯10mmol缓慢滴入反应瓶中保持反应瓶中溶液的温度低于5℃。滴加完毕后于5℃继续反应4小时。之后用乙酸乙酯萃取(30ml×3),萃取液用饱和Na2CO3溶液调节至pH=7,再用饱和食盐水洗涤(30ml×3),无水硫酸钠干燥除水。过滤,浓缩,以乙酸乙酯/石油醚混合液为洗脱剂柱层析得产物,产率为20.0%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.96[d,10Hz,1H],7.20[s,1H],6.85[d,10Hz,1H],3.94‑3.90[m,2H],1.84‑1.78[m,2H],1.06[t,10Hz,3H];IR(KBr):1590(vs,Ar),1515(vs,NO2),1482(s,Ar),1340(vs,‑O‑),1280(s,NO2),1030(s,‑O‑)cm‑1。
实施例3 2‑溴‑4‑正己氧基硝基苯(1c)的制备。
将65%的浓硝酸(6ml)和98%的浓硫酸(5ml)配成混酸,置于冰盐浴中,冷却至‑10℃,然后将3‑正己氧基溴苯10mmol缓慢滴入反应瓶中保持反应瓶中溶液的温度低于5℃。滴加完毕后于0℃继续反应6小时。之后用乙酸乙酯萃取(30ml×3),萃取液用饱和Na2CO3溶液调节至pH=7,再用饱和食盐水洗涤(30ml×3),无水硫酸钠干燥除水。过滤,浓缩,以乙酸乙酯/石油醚混合液为洗脱剂柱层析得产物,产率为28%。可选地,取代溴苯与硝化试剂的摩尔比可为1:(1‑3),反应温度也可以为0‑10℃,反应时间可以相应调整为3‑6h。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=8.01[d,10Hz,1H],7.29[s,1H],6.90[d,10Hz,1H],3.95‑3.90[m,2H],1.76‑1.73[m,4H],1.39‑1.28[m,4H],0.87[t,10Hz,3H];IR(KBr):1598(vs,Ar),1510(vs,NO2),1482(s,Ar),1335(vs,‑O‑),1282(s,NO2),1033(s,‑O‑)cm‑1。
实施例4 4‑硝基‑3‑(3’‑甲基苯氧基)苯甲醚(2a)的制备。
将0.32g(3mmol)间甲酚至100ml三颈烧瓶中,加入氢氧化钾调pH至13,机械搅拌,升温至130℃‑140℃,熔解为棕色液体,然后冷却至100℃,分批加入催化量铜粉和0.50g(2mmol)化合物1a,然后升温至170℃,反应物呈黑色液体,2h后停止反应。冷却后加入50ml乙酸乙酯溶解,抽滤,滤液用无水硫酸钠干燥,然后过滤,浓缩,以乙酸乙酯/石油醚混合液为洗脱剂柱层析得油状产物0.40g,产率71.7%。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=8.13[d,9Hz,1H],7.29[t,9Hz,1H],7.02[d,9Hz,1H],6.93[d,9Hz,2H],6.85[dd,3Hz,9Hz,1H],6.59[d,3Hz,1H],3.81[s,3H],2.31[s,3H];IR(KBr):1580(vs,Ar),1513(vs,Ar),1442(s,Ar),1342(vs,‑O‑),1290(vs,NO2),1513(vs,NO2)cm‑1;ESI‑MS:260[M+H]+.
实施例5 3‑(2’‑硝基苯氧基)甲苯(2b)的制备。
将2mmol间甲酚至100ml三颈烧瓶中,加入氢氧化钾调pH至12,机械搅拌,升温至130℃‑140℃,熔解为棕色液体,然后冷却至100℃,分批加入催化量铜粉和2mmol邻溴硝基苯,然后升温至180℃,反应物呈黑色液体,1h后停止反应。冷却后加入50ml乙酸乙酯溶解,抽滤,滤液用无水硫酸钠干燥,然后过滤,浓缩,以乙酸乙酯/石油醚混合液为洗脱剂柱层析得油状产物,产率68.2%。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=8.05[d,9Hz,1H],7.38[t,9Hz,1H],7.26‑7.18[m,2H],7.05[d,9Hz,1H],6.97[s,1H],6.95‑6.90[m,2H],2.33[s,3H];IR(KBr):1588(vs,Ar),1510(vs,Ar),1435(s,Ar),1340(vs,‑O‑),1290(vs,NO2)cm‑1;ESI‑MS:230[M+H]+.
实施例6 3‑(1’氯‑5’‑甲基苯氧基)‑4‑硝基苯甲醚(2c)的制备。
将4mmol 2‑氯‑5‑甲基苯酚至100ml三颈烧瓶中,加入氢氧化钾调pH至14,机械搅拌,升温至130℃‑140℃,熔解为棕色液体,然后冷却至100℃,分批加入催化量铜粉和2mmol 1a,然后升温至150℃,反应物呈黑色液体,4h后停止反应。冷却后加入50ml乙酸乙酯溶解,抽滤,滤液用无水硫酸钠干燥,然后过滤,浓缩,以乙酸乙酯/石油醚混合液为洗脱剂柱层析得油状产物,产率69.1%。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.66[d,9Hz,1H],7.40[d,9Hz,1H],6.96[d,9Hz,1H],6.87[d,9Hz,1H],6.81[s,1H],6.70[s,1H],3.77[s,3H],2.33[s,3H];IR(KBr):1590(vs,Ar),1515(vs,Ar),1430(s,Ar),1340(vs,‑O‑),1290(vs,NO2)cm‑1;ESI‑MS:294[M+H]+.
实施例7 3‑(2’‑硝基‑5’‑丙氧基苯氧基)‑4‑溴甲苯(2d)的制备。
由1b与2‑溴‑5‑甲基苯酚反应制得,方法同实施例4。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.71[d,9Hz,1H],7.30[d,9Hz,1H],6.96[d,9Hz,1H],6.84[d,9Hz,1H],6.81[s,1H],6.67[s,1H],3.92[t,6Hz,2H],2.30[s,3H],1.84‑1.78[m,2H],1.06[t,6Hz,3H];IR(KBr):1590(vs,Ar),1515(vs,Ar),1430(s,Ar),1340(vs,‑O‑),1290(vs,NO2)cm‑1;ESI‑MS:367[M+H]+.
实施例8 3‑(2’‑硝基‑5’‑正己氧基苯氧基)甲苯(2e)的制备。
由1c与间甲苯酚反应制得,方法同实施例4。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=8.13[d,9Hz,1H],7.29[t,9Hz,1H],7.02[d,9Hz,1H],6.93[d,9Hz,2H],6.85[dd,3Hz,9Hz,1H],6.59[d,3Hz,1H],3.95‑3.90[m,2H],2.30[s,3H],1.76‑1.73[m,4H],1.39‑1.28[m,4H],0.87[t,10Hz,3H];IR(KBr):1580(vs,Ar),1513(vs,Ar),1442(s,Ar),1342(vs,‑O‑),1290(vs,NO2),1513(vs,NO2)cm‑1;ESI‑MS:330[M+H]+
实施例9 3‑(3’‑甲基苯氧基)‑4‑氨基苯甲醚(3a)的制备。
1.0g(3.8mmol)化合物2a加入氢化釜中,然后加入200ml无水乙醇,0.5g钯碳,然后于5Mpa气压50℃下氢化还原5h,反应结束后,趁热过滤,滤液浓缩,得油状产物0.8g,产率为87.1%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.18[t,7.5Hz,1H],6.88[d,7.5Hz,1H],6.75‑6.79[m,3H],6.58[dd,2.5Hz,7.5Hz,1H],6.49[s,3Hz,1H],3.70[s,3H],2.33[s,3H];IR(KBr):3449(s,NH2),3365(s,NH2),1583(vs,Ar),1511(vs,Ar),1444(s,Ar),1156(vs,‑O‑),1037(s,‑O‑)cm‑1;ESI‑MS:230[M+H]+.
实施例10 2‑(3’‑甲基苯氧基)苯胺(3b)的制备。
将2b 5mmol溶于乙醇50ml中,加入催化量的醋酸和铁粉25mmol,加热至100℃回流反应3h,然后冷却到室温,滤出未反应的铁粉,滤液浓缩,得产物,产率75.0%。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.19[t,9Hz,1H],6.91[d,9Hz,1H],6.83[t,9Hz,1H],6.72‑6.66[m,3H],6.54[d,9Hz,1H],4.91[b,2H],2.31[s,3H];ESI‑MS:200[M+H]+.
实施例11 3‑(3’‑甲基‑5‑氯苯氧基)‑4‑氨基苯甲醚(3c)的制备。
1.0g(3.8mmol)化合物2c加入氢化釜中,然后加入200ml无水乙醇,0.5g钯碳,然后于5Mpa气压80℃下氢化还原3h,反应结束后,趁热过滤,滤液浓缩,得油状产物,产率为85.7%。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.36[d,9Hz,1H],6.96[d,9Hz,1H],6.64‑6.57[m,2H],6.50[s,1H],6.44[s,1H],4.90[b,2H],3.77[s,3H],2.29[s,3H];ESI‑MS:264[M+H]+.
实施例12 3‑(2’‑氨基‑5’‑丙氧基苯氧基)‑4‑溴甲苯(3d)的制备。
1.0g(3.8mmol)化合物2d加入氢化釜中,然后加入200ml无水乙醇,0.5g钯碳,然后于5Mpa气压40℃下氢化还原6h,反应结束后,趁热过滤,滤液浓缩,得油状产物,产率为84.3%。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.25[d,9Hz,1H],6.97[d,9Hz,1H],6.76[d,9Hz,1H],6.72[d,9Hz,1H],6.59[s,1H],6.47[s,1H],3.97[t,6Hz,2H],2.33[s,3H],1.84‑1.78[m,2H],1.06[t,6Hz,3H];ESI‑MS:336[M+H]+.
实施例13 3‑(2’‑氨基‑5’‑正己氧基苯氧基)甲苯(3e)的制备。
将2e 10mmol溶于乙醇50ml中,加入催化量的醋酸和铁粉150mmol,50℃反应6h,然后冷却到室温,滤出未反应的铁粉,滤液浓缩,得产物,产率73.8%。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.19[t,9Hz,1H],6.92[dd,3Hz,9Hz,1H],6.80[dd,3Hz,9Hz,1H],6.69‑6.66[m,2H],6.59[d,9Hz,1H],6.48[d,3Hz,1H],3.95‑3.90[m,2H],2.30[s,3H],1.76‑1.73[m,4H],1.39‑1.28[m,4H],0.87[t,10Hz,3H];ESI‑MS:300[M+H]+.
实施例14 2‑甲氧基‑5‑溴甲基二苯并呋喃(5a)的制备。
4.00g(17mmol)化合物3a溶入20ml、1mol/l的稀盐酸和10ml甲醇中,冰盐浴冷却至0℃,调pH至2,滴加10ml(含亚硝酸钠20mmol)亚硝酸钠的水溶液,控制内温于 0℃‑5℃之间,滴加完毕后继续搅拌1小时。然后加入溴化亚铜粉末1.41g(10mmol),升温至60℃,2h后停止反应。趁热过滤,滤液用乙酸乙酯萃取(30ml×3),萃取液用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,得2.35g油状中间体。将所得中间体1mmol溶入30ml四氯化碳中,然后加入0.445g(2.5mmol)NBS,0.25g(1.5mmol)AIBN,光照加热至70℃,3h后停止反应。将反应液过滤,滤液浓缩,得0.4g油状产品,产率约为71.4%。
实施例15 5‑溴甲基二苯并呋喃(5b)的制备。
10mmol 3b溶入20ml、1mol/l的稀盐酸和10ml甲醇中,冰盐浴冷却至0℃,调pH至3,加入含亚硝酸钠10mmol的水溶液,控制内温于0℃‑5℃之间,滴加完毕后继续搅拌1小时。然后加入溴化亚铜粉末1.41g(10mmol),升温至100℃,1h后停止反应。趁热过滤,滤液用乙酸乙酯萃取(30ml×3),萃取液用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,得油状中间体。将1mmol所得中间体溶入30ml二氯甲烷中,然后加入Br23mmol和催化量的偶氮二异丁腈(AIBN),光照加热至80℃,2h后停止反应。将反应液过滤,滤液浓缩,得产物,产率约为55.6%。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=8.04[d,9Hz,1H],7.72‑7.56[m,4H],7.39[d,9Hz,1H],7.12[t,9Hz,1H],5.09[s,2H];ESI‑MS:262[M+H]+.
实施例16 2‑甲氧基‑5‑溴甲基‑8‑氯二苯并呋喃(5c)的制备。
10mmol 3c溶入20ml、1mol/l的稀盐酸和10ml甲醇中,冰盐浴冷却至0℃,调pH至1,加入含亚硝酸钠15mmol的水溶液,控制内温于0℃‑5℃之间,滴加完毕后继续搅拌1小时。然后加入溴化亚铜粉末1.41g(10mmol),升温至50℃,3h后停止反应。趁热 过滤,滤液用乙酸乙酯萃取(30ml×3),萃取液用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,得油状中间体。将1mmol所得中间体溶入30ml氯仿中,然后加入NBS1mmol和催化量的偶氮二异丁腈(AIBN),光照加热至60℃,5h后停止反应。将反应液过滤,滤液浓缩,得产物,产率约为66.8%。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.91[d,9Hz,1H],7.30[d,9Hz,1H],7.23[s,1H],7.09[d,9Hz,1H],7.02[d,9Hz,1H],5.09[s,2H],3.93[s,3H];ESI‑MS:327[M+H]+.
实施例17 2‑丙氧基‑5‑溴甲基‑8‑溴二苯并呋喃(5d)的制备。
15mmol 3d溶入20ml、1mol/l的稀盐酸和10ml甲醇中,冰盐浴冷却至0℃,调pH至2,滴加10ml、20mmol亚硝酸钠的水溶液,控制内温于0℃‑5℃之间,滴加完毕后继续搅拌1小时。然后加入溴化亚铜粉末1.41g(10mmol),升温至60℃,3h后停止反应。趁热过滤,滤液用乙酸乙酯萃取(30ml×3),萃取液用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,得油状中间体。将1mmol所得中间体溶入30ml二氯甲烷中,然后加入NBS2.8mmol和催化量的偶氮二异丁腈(AIBN),光照加热回流,3h后停止反应。将反应液过滤,滤液浓缩,得产物,产率约为71%。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.88[d,9Hz,1H],7.32[d,9Hz,1H],7.25[s,1H],7.06[d,9Hz,1H],7.00[d,9Hz,1H],5.09[s,2H],3.97[t,6Hz,2H],1.84‑1.78[m,2H],1.06[t,6Hz,3H];ESI‑MS:397[M+H]+.
实施例18 2‑正己氧基‑5‑溴甲基二苯并呋喃(5e)的制备。
由3e反应制得,方法同实施例14。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.79[d,9Hz,1H],7.65[d,9Hz,1H],7.39[d,9Hz,1H],7.21[d,9Hz,1H],7.19[s,1H],7.12[t,9Hz,1H],5.08[s,2H],3.95‑3.90[m,2H],1.76‑1.73[m,4H],1.39‑1.28[m,4H],0.87[t,10Hz,3H];ESI‑MS:361[M+H]+.
实施例19 6a‑6j的合成通法
化合物5(2mmol)和各种相应的烷基胺(2‑20mmol)溶于50ml无水二氯甲烷(或氯仿、丙酮、乙腈)中,加入无水碳酸钾(4mmol)和碘化钾(4mmol),20‑30℃搅拌反应,5‑20h后停止反应,过滤,滤液水洗之后用无水硫酸钠干燥,浓缩,以乙酸乙酯/石油醚混合液为洗脱剂柱层析得到产物。
以下为制备的二苯并呋喃衍生物:
(1)2‑甲氧基‑5‑甲胺基甲基二苯并呋喃(6a)
白色固体,熔点116℃‑120℃,产率11.4%。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.88[d,9Hz,1H],7.45[d,9Hz,1H],7.34[t,9Hz,1H],7.25[m,1H],7.11[d,3Hz,1H],6.98[dd,3Hz,9Hz,1H],4.31[s,2H],3.91[s,3H],2.59[s,3H];IR(KBr):3399(s,NH),1365(s,Ar),1578(s,Ar),1438(s,Ar)cm‑1;ESI‑MS:242[M+H]+.
(2)2‑甲氧基‑5‑乙胺基甲基二苯并呋喃(6b)
浅黄色固体,熔点137℃‑141℃,产率30.0%。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.89[d,9Hz,1H],7.45[d,9Hz,1H],7.34[t,9Hz,1H],7.26[m,1 H],7.11[d,2Hz,1H],6.97[dd,3Hz,9Hz,1H],4.39[s,2H],3.91[s,3H];IR(KBr):3190(s,NH),1627(s,Ar),1511(s,Ar),1445(s,Ar),1270(s,‑O‑)cm‑1;ESI‑MS:256[M+H]+.
(3)2‑甲氧基‑5‑丙胺基甲基二苯并呋喃(6c)
油状物,产率8.3%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.88[d,10Hz,1H],7.43[d,10Hz,1H],7.32[t,10Hz,1H],7.26[d,10Hz,1H],7.10[d,2Hz,1H],6.96[dd,2Hz,10Hz,1H],4.24[s,2H],3.90[s,3H],2.75[t,2H],1.59[m,2Hz,2H],0.93[m,3H];IR(KBr):2953(s,NH),1633(s,Ar),1583(s,Ar),1436(s,Ar),1281(vs,‑O‑)cm‑1;ESI‑MS:270[M+H]+.
(4)2‑甲氧基‑5‑异丙胺基甲基二苯并呋喃(6d)
油状物,产率45.0%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.89[d,10Hz,1H],7.42[d,10Hz,1H],7.32[t,10Hz,1H],7.26[d,10Hz,1H],7.10[d,2Hz,1H],6.96[dd,2Hz,10Hz,1H],4.24[s,2H],3.90[s,3H],3.01[m,1H],1.18[d,3Hz,6H];IR(KBr):2958(s,NH),1632(s,Ar),1584(s,Ar),1437(s,Ar),1282(vs,‑O‑)cm‑1;ESI‑MS:270[M+H]+.
(5)2‑甲氧基‑5‑二甲胺基甲基二苯并呋喃(6e)
黄色粉末,熔点174℃‑178℃,产率48.0%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=8.45[d,5Hz,1H],7.67[d,10Hz,1H],7.61[d,10Hz,1H],7.40[t, 10Hz,1H],7.07[m,2H],5.50[s,2H],3.90[s,3H],3.52[s,9H];IR(KBr):1605(s,Ar),1577(s,Ar),1487(s,Ar),1278(vs,‑O‑)cm‑1;ESI‑MS:270[M+H]+.
(6)2‑甲氧基‑5‑甲乙胺基甲基二苯并呋喃(6f)
油状物,产率40.0%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=8.00[d,10Hz,1H],7.42[d,10Hz,1H],7.29[t,10Hz,1H],7.23[d,10Hz,1H],7.07[d,2Hz,1H],6.94[dd,2Hz,10Hz,1H],3.90[s,2H],3.89[s,3H],2.57‑2.59[m,2H],2.25[s,3H],1.13[t,3H];ESI‑MS:270[M+H]+.
(7)2‑甲氧基‑5‑二乙胺基甲基二苯并呋喃(6g)
油状物,产率37.0%。
1H‑NMR(300MHz,CDCl3):δ=8.04[d,9Hz,1H],7.91[d,9Hz,1H],7.34[t,9Hz,1H],7.28[d,9Hz,1H],7.09[d,2Hz,1H],6.94[dd,2Hz,9Hz,1H],4.04[s,2H],3.91[s,3H],2.65‑2.68[m,4H];IR(KBr):1632(s,Ar),1583(s,Ar),1437(s,Ar),1280(vs,‑O‑)cm‑1;ESI‑MS:284[M+H]+.
(8)2‑甲氧基‑5‑苄胺基甲基二苯并呋喃(6h)
油状物,产率41.2%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.71[d,10Hz,1H],7.43[dd,10Hz,1H],7.36‑7.38[m,2H],7.32 ‑7.34[m,3H],7.25‑7.27[m,2H],7.08[d,3Hz,1H],6.88[dd,3Hz,10Hz,1H],4.23[s,2H],3.93[s,2H],3.89[s,3H];IR(KBr):3026(s,NH),1632(s,Ar),1584(s,Ar),1503(s,Ar),1437(s,Ar),1279(vs,‑O‑)cm‑1;ESI‑MS:318[M+H]+.
(9)2‑甲氧基‑5‑环己胺基甲基二苯并呋喃(6i)
油状物,产率48.6%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.32[d,10Hz,1H],7.10[d,10Hz,1H],6.97[s,1H],6.83[d,10Hz,1H],6.63[dd,5Hz,10Hz,1H],6.53[d,5Hz,1H],3.81[s,2H],3.72[s,3H],2.49[t,20Hz,1H],1.15‑1.19[m,10H];IR(KBr):2926(vs,NH),1577(s,Ar),1482(vs,Ar),1441(s,Ar),1252(s,‑O‑)cm‑1;ESI‑MS:346[M+H]+.
(10)2‑甲氧基‑5‑环戊胺基甲基二苯并呋喃(6j)
油状物,产率52.3%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.33[d,10Hz,1H],7.09[d,10Hz,1H],6.97[s,1H],6.83[d,10Hz,1H],6.64[dd,5Hz,10Hz,1H],6.53[d,5Hz,1H],3.83[s,2H],3.76[s,3H],3.11[t,25Hz,1H],1.58‑1.61[m,8H];IR(KBr):2954(s,NH),1577(vs,Ar),1482(vs,Ar),1442(s,Ar),1249(s,‑O‑)cm‑1;ESI‑MS:332[M+H]+.
(11)5‑异丙胺基甲基二苯并呋喃(6k)
油状物,产率46.8%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.33[d,10Hz,1H],7.09[d,10Hz,1H],6.97[s,1H],6.83[d,10Hz,1H],6.64[dd,5Hz,10Hz,1H],6.53[d,5Hz,1H],3.83[s,2H],3.76[s,3H],3.11[t,25Hz,1H],1.58‑1.61[m,8H];IR(KBr):2954(s,NH),1577(vs,Ar),1482(vs,Ar),1442(s,Ar),1249(s,‑O‑)cm‑1;ESI‑MS:240[M+H]+.
(12)2‑甲氧基‑5‑环戊胺基甲基‑8‑氯二苯并呋喃(6l)
油状物,产率33.0%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.82[d,10Hz,1H],7.13[d,10Hz,1H],6.98‑6.96[m,2H],6.77[d,10Hz,1H],4.00[s,2Hz,1H],3.93[s,3H],2.90‑2.84[m,1H],1.14[d,10Hz,6H];IR(KBr):3041(s,NH),1570(vs,Ar),1480(vs,Ar),1441(s,Ar),1229(s,‑O‑)cm‑1;ESI‑MS:304[M+H]+.
(13)2‑丙氧基‑5‑苯己胺基‑8‑溴二苯并呋喃(6m)的制备。
油状物,产率36.0%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.71[d,10Hz,1H],7.24‑7.05[m,7H],6.94‑6.92[m,2H],4.00[s,2H],3.90[t,10Hz,2H],2.98[b,1H],2.70[t,10Hz,2H],2.54[t,10Hz,2H],1.78‑1.64[m,4H],1.47‑1.37[m,6H],1.06[t,10Hz,3H];IR(KBr):3066(s,NH),1570(vs,Ar),1480(vs,Ar),1441(s,Ar),1229(s,‑ O‑)cm‑1;ESI‑MS:494[M+H]+.
(14)2‑正己氧基‑5‑苯丙胺基二苯并呋喃(6n)的制备。
油状物,产率42.0%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.67[d,10Hz,1H],7.55[d,10Hz,1H],7.47[d,10Hz,1H],7.24‑7.10[m,5H],6.99‑6.92[m,3H],4.00[s,2H],3.91[t,10Hz,2H],2.81[b,1H],2.71‑2.63[m,4H],1.75‑1.68[m,6H],1.40‑1.26[m,4H],0.86[t,10Hz,3H];IR(KBr):3060(s,NH),1578(vs,Ar),1480(vs,Ar),1440(s,Ar),1229(s,‑O‑)cm‑1;ESI‑MS:415[M+H]+.
实施例20 2‑羟基‑5‑异丙胺基甲基二苯并呋喃(7a)的制备。
将化合物6d(0.54g,2mmol)溶入10‑30ml40%的氢溴酸溶液中,90‑110℃反应3‑6h,冷却,碱液中和至近中性,二氯甲烷提取(20ml×3),无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,以乙酸乙酯/石油醚混合液为洗脱剂柱层析得到产物,收率74.0%。可选地,氢溴酸溶液浓度也可选择30‑50%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.85[d,10Hz,1H],7.40[d,10Hz,1H],7.29[t,10Hz,1H],7.26[d,10Hz,1H],7.10[d,2Hz,1H],6.96[dd,2Hz,10Hz,1H],4.24[s,2H],3.00‑3.02[m,1H],1.18[d,3Hz,6H];IR(KBr):2958(s,NH),1633(s,Ar),1580(s,Ar),1437(s,Ar),1282(vs,‑O‑)cm‑1;ESI‑MS:256[M+H]+.
实施例21 2‑甲氧基‑5‑(N‑异丙基‑N‑氯乙酰基)胺基甲基二苯并呋喃(8a)的制备。
将0.54g(2mmol)化合物6d溶入20ml无水二氯甲烷中,于冰浴条件下滴加氯乙酰氯2mmol,滴毕,于10℃继续搅拌反应1.5h,然后滴加1mol/L NaOH水溶液调节pH至10,分离有机相,水相继续用二氯甲烷萃取(30ml×3),合并有机相,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩得油状产物,收率95.0%。
实施例22 2‑甲氧基‑5‑(N‑异丙基‑N‑氯丙酰基)胺基甲基二苯并呋喃(8b)的制备。
将0.54g(2mmol)化合物6d溶入25ml无水乙腈中,于冰浴条件下滴加氯丙酰氯2.5mmol,滴毕,于10℃继续搅拌反应3h,然后滴加1mol/L NaOH水溶液调节pH至10,分离有机相,水相继续用二氯甲烷萃取(30ml×3),合并有机相,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩得油状产物,收率95.0%。
实施例23 2‑甲氧基‑5‑(N‑异丙基‑N‑氯庚酰基)胺基甲基二苯并呋喃(8c)的制备。
将0.54g(2mmol)化合物6d溶入25ml无水四氢呋喃中,于冰浴条件下滴加氯庚酰氯4mmol,滴毕,于30℃继续搅拌反应1h,然后滴加1mol/L NaOH水溶液调节pH至10,分离有机相,水相继续用二氯甲烷萃取(30ml×3),合并有机相,无水硫酸钠干燥,过滤, 浓缩得油状产物,收率95.0%,产物无需纯化投入下一步反应。
实施例24 2‑甲氧基‑5‑(N‑异丙基‑N‑硝氧基乙酰基)胺基甲基二苯并呋喃(9a)的制备。
将0.35g(1mmol)化合物8a和0.85g(5mmol)硝酸银溶于15ml无水乙腈中,避光60℃回流反应8h。然后冷却反应液至室温,过滤,滤液浓缩,以乙酸乙酯/石油醚混合液为洗脱剂柱层析得到黄色油状产物,收率42.0%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.32[d,10Hz,1H],6.97[d,5Hz,1H],6.88[d,10Hz,1H],6.81‑6.83[m,1H],6.67[d,5Hz,1H],6.55[d,10Hz,1H],4.78[s,2H],4.43[s,2H],3.74[s,3H];IR(KBr):1648(vs,‑ONO2),1579(s,Ar),1484(s,Ar),1503(s,Ar),1282(vs,‑ONO2),848(s,‑ONO2)cm‑1.
实施例25 2‑甲氧基‑5‑(N‑异丙基‑N‑硝氧基丙酰基)胺基甲基二苯并呋喃(9b)的制备。
将1mmol化合物8b和4mmol硝酸银溶于25ml丙酮中,避光85℃回流反应3h,然后冷却反应液至室温,过滤,滤液浓缩,以乙酸乙酯/石油醚混合液为洗脱剂柱层析得到产物,收率33.0%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.35[d,10Hz,1H],6.96[t,10Hz,1H],6.85[m,1H],6.80[d,2.5Hz,1H],6.68[m,1H],6.56[d,10Hz,1H],4.76[t,20Hz,2H],3.77[s,3H],3.74[s,2H],2.87‑2.89[m,1H],2.60[t,5Hz,2H],1.18[d,10Hz,3H],1.13[d,10Hz,3H];IR(KBr):1634(vs,‑ONO2),1485(vs,Ar),1280(vs,‑ONO2),855(s,‑ONO2)cm‑1。
实施例26 2‑甲氧基‑5‑(N‑异丙基‑N‑硝氧基庚酰基)胺基甲基二苯并呋喃(9c)的制备。
将1mmol化合物8c和6mmol硝酸银溶于25ml无水乙酸乙酯中,氮气保护,避光50℃反应12h。然后冷却反应液至室温,过滤,滤液浓缩,以乙酸乙酯/石油醚混合液为洗脱剂柱层析得到产物,收率45.0%。
1H‑NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.76[d,10Hz,1H],7.62[d,10Hz,1H],7.18[d,2.5Hz,1H],7.06‑7.03[m,1H],6.88[s,1H],6.81[d,2.5Hz,1H],4.72[s,2H],4.52[t,10Hz,3H],3.92[s,3H],3.86‑3.80[m,1H],2.80‑2.76[m,2H],1.72‑1.62[m,4H],1.41‑1.36[m,2H],1.24[d,10Hz,6H];IR(KBr):1630(vs,‑ONO2),1480(vs,Ar),1280(vs,‑ONO2),855(s,‑ONO2)cm‑1。
实施例27 典型化合物的体外胆碱酯酶抑制活性。
应用Ellman法,对一些典型化合物做了体外胆碱酯酶抑制活性测定,具体操作如下:
1.1药品与试剂
乙酰胆碱酯酶(AChE)(500unit,E.C.3.1.1.7,TypeVI‑S,fromElectricEel)及丁酰胆碱酯酶(BChE)(500unit,E.C.3.1.1.8,fromequineserum)购于Sigma‑Aldrich(Steinheim,Germany)公司;
5,5’‑二硫双(2‑硝基苯甲酸)(5,5’‑Dithiobis(2‑nitrobenzoicacid),DTNB)、乙酰硫代胆碱(ATC)碘化物及丁酰硫代胆碱(BTC)碘化物购于Fluka(Buchs,Switzerland)公司;
受试化合物由发明人制备,结构经质谱、核磁、红外等谱图确证。
1.2实验原理
实验采用Ellman法测试目标物体外胆碱酯酶抑制活性,实验原理为在pH=8的缓冲溶液条件下,AChE及BChE可以迅速分别将ATC及BTC水解为硫代胆碱,硫代胆碱随之可快速与DTNB反应生成具有强烈紫外吸收的5‑巯基‑2‑硝基苯甲酸,故用紫外分 光光度法可测量其浓度,进而可测算AChE或BChE的活性抑制率。
1.3实验操作
(1)配制缓冲溶液。13.6g磷酸二氢钾溶于1L水中,以氢氧化钾调节pH=8±0.1。溶液保存于4℃温度下以备用。
(2)配制0.01mol/L DTNB溶液。将0.396gDTNB及0.15g碳酸氢钠溶于100mL水中制得0.01mol/L DTNB溶液,将之保存于‑30℃温度下以备用。
(3)配制0.075mol/LATC/BTC溶液。将0.217gATC/0.237gBTC溶于10mL水中制得0.075mol/L ATC/BTC溶液,将之保存于‑30℃温度下以备用。
(4)配制AChE/BChE溶液。将500单位的AChE/BChE溶于1mL1%的凝胶溶液中,然后用水稀释至100mL制得浓度为5单位/mL的AChE/BChE溶液,将之保存于‑30℃温度下以备用。
(5)配制受试物溶液。将受试物溶于水:乙醇=7:3(v/v)的混合溶剂中以制得浓度为10‑3mol/L的溶液(乙醇不影响测试结果),然后用水稀释分别制得浓度为10‑4、10‑5、10‑6、10‑6.3、10‑7、10‑7.3、10‑8、10‑8.3、10‑9、10‑10M的溶液,将之保存于‑30℃温度下以备用。
实验开始前,将所用溶液均加温至20℃。用空白缓冲液(3mL)测得背景紫外吸收。受试物的测量操作为先将100μL受试物溶液、100μLDTNB溶液、100μL酶溶液加至3mL缓冲溶液中,待加入20μLATC或BTC溶液触发反应后立即计时并同时快速混匀测试溶液,2min后于412nm波长下测量紫外吸收度。空白对照可用等容积的水代替受试物溶液测得。所有测试均平行操作三次。所测得结果用GraphPadPrismTM(GraphPadSoftware,SanDiego,CA,USA)软件以非线性衰退分析模式(non‑linearregressionanalysismodel)计算得相应的IC50值。测试结果见表1。
表1部分典型化合物的体外胆碱酯酶抑制活性
a数据为至少三次测定的平均值。b选择比=(AChE的IC50)/(BChE的IC50)。
从测试结果可见,所有受试化合物均显示出了较好的胆碱酯酶抑制活性,部分化合物的活性要优于阳性对照加兰他敏,其中化合物9a、9b的活性比加兰他敏提高了100倍以上。
实施例28 典型化合物的体外Aβ纤维化抑制活性。
本发明对代表性化合物6d进一步测试了其体外Aβ纤维化抑制活性,具体测试方法如下:
(1)β‑淀粉样蛋白母液配制:将Aβ(1‑42)溶于100%的六氟异丙醇,配成1mg/ml母液,水浴超声10min,等分至doff管,真空或氮气将溶剂挥干,存于‑20°C,临用前将其溶于DMSO,用pH7.4的PBS稀释至所需浓度。
(2)实验分组:分为模型对照组、药物对照组、阳性对照组、受试药物组。
模型对照组:取2μlAβ母液加38μl含有10%乙醇的PBS;
药物对照组:再取20μl受试药加等量含10%乙醇的PBS,将其设为药物对照组;
阳性对照组或受试药物组:取2μlAβ溶液加20μl阳性对照药或受试药和18μl含有一定浓度乙醇的PBS;受试药物为6d;姜黄素为阳性对照药;
溶剂对照为含有10%乙醇的PBS。
(3)Aβ老化:以上各组加入96孔黑板,于37°C条件下老化24h。
(4)加入分子探针硫磺素T:各孔加入160μL l5mmol/L硫磺素T,反应1min后,放入酶标仪中,在激发波长450nm和发射波长480nm处测定荧光强度,并计算药物对纤维化Aβ的抑制率。
所有实验均平行测试3次。
各药物抑制率计算公式为:
测试结果见表2。
表2典型化合物的体外Aβ纤维化抑制活性
从测试结果可见,受试化合物显示了温和的Aβ纤维化抑制活性,活性略低于阳性对照姜黄素。化合物的活性与给药剂量具有相关性,药物浓度增加,抑制活性亦随之加强。
实施例29 典型化合物体内智力改善活性。
1.1药品与试剂
东莨菪碱氢溴酸盐购自Sigma化学试剂公司(Munich,Germany);
食饵(Dustless Precision Rodent Pellets)购于Bilaney Consultants(Sevenoaks,Kent,U.K.)公司;
受试目标化合物为实验室自制,结构经质谱、核磁、红外及元素分析等谱图确证。
1.2实验动物
60天雌性Wistar大鼠(Han:Wist),德国耶拿大学药理研究所饲养。
1.3实验原理
东莨菪碱是强效可逆性胆碱受体阻滞剂,实验动物注射后因胆碱神经递质传递受阻,空间记忆及行动能力受损。胆碱酯酶抑制剂可通过抑制乙酰胆碱水解提升中枢胆碱神经递质水平,逆转东莨菪碱所诱发的智力损伤。
1.4实验操作
实验采用东莨菪碱(scop)诱导智力损伤大鼠为动物模型,用射线形八臂迷宫(见图1)研究动物行为能力,测试受试物对实验动物智力改善活性。
具体实验过程描述如下:将食饵分别置于八臂迷宫臂部末端,训练大鼠适应并能够快速依次寻找到八个食饵。
待训练完成后,将实验动物分成四组,分别为模型组、阳性药物组、受试药物6d组和受试药物9b组,分别注射东莨菪碱(2.52×10‑3mmol/100体重)、等摩尔浓度的东莨菪碱和他克林、等摩尔浓度的东莨菪碱和受试受试药物6d、等摩尔浓度的东莨菪碱和受试受试药物9b。
给药20min、60min及2h后,分别再测试各组动物寻找食饵能力,并通过记录大鼠寻找到所有食饵所需的时间、寻找过程中所犯的错误次数(指重复进入同一个臂膀次数加上未寻找到的食饵个数)以及实验过程中动物的平均移动速度来显示受试物的智力改善效果。实验全程录像以便结果分析,以给药前(即0min)动物表现作为空白对照。
1.5测试结果
受试化合物6d的测试结果如图2‑图4所示,受试化合物9b的测试结果如图5‑图7所示。
从测试结果可见,模型组(即scop组)在注射东莨菪碱(scop)后智力及行动能力显著受损,特别在给药20min后最为明显,具体体现在空间记忆力下降(6次重复进入同一个臂膀),思考决断能力降低(寻找食物所需时间从给药前的30多秒延长至230多秒)以及行动迟缓(移动速度从20cm/s下降至8cm/s左右)。而受试化合物6d及9b均显示出了良好的智力改善活性,与模型组比,在给药20min后,实验动物所犯错误数由6降为2~3,寻找所需时间从220秒分别缩短至110秒(化合物9b)和160秒(化合物6d),而移动速度也有所提升。与阳性对照他克林(tacrine)组相比,受试化合物6d及9b在改善记 忆力方面(即降低动物犯错误次数)活性与他克林大致相当,而在改善思考决断能力(即寻找食物所需时间)及行动能力(即平均移动速度)方面要明显优于他克林。