用金葡菌超级抗原制备治疗恶性肿瘤药物的方法 本发明涉及一种使用超级抗原即纯化的金黄色葡萄球菌肠毒素制备治疗恶性肿瘤药物的方法。
目前金黄色葡萄球菌代谢产物已用于抑制人体肿瘤的生长。由于该代谢产物是一种化学成份相当复杂的混合物，其中起治疗作用的物质为金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin,SEA、SEB、SEC1及SEC2)，由于各种肠毒比例的差异及有害代谢产生的存在，使金黄色葡萄球菌代谢产物治疗肿瘤的疗效差，并对人体有较大的副作用，如产生注射局部红肿、疼痛、发烧等不良影响。
本发明的目的是提供一种治疗肿瘤疗效好、毒副作用小、制备工艺简单、产品质量可靠和人体使用安全的用金葡菌超级抗原制备治疗恶性肿瘤药物的方法。
本发明的任务是这样实现的：
该制备方法包括金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C1及C2的发酵及肠毒素上清液的制备、肠毒素的纯化和注射剂的配制三大步骤。
1．金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C1和C2的发酵及肠毒素上清液的制备按下列步骤进行：
1)菌种复苏：采用产生金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C1或C2的标准菌株，在LB琼脂斜面上培养复苏，37℃培养20小时，LB培养基配方如下：
0.5～1％胰蛋白胨
0.1～0.5％酵母浸出物
0.1～0.5％氯化钠；
2)接种：无菌操作，将复苏菌种接种于300毫升LB液体培养中，37℃振荡培养20小时，4℃保存作为种子液，保存时间不超过48小时；
3)转种扩大培养：于细菌发酵罐中配制5升LB培养液，121℃高压灭菌15分钟，冷却至37℃后按5％量将种子液转种于发酵罐培养液中，37℃、80％氧含量、pH6.0～6.8连续发酵20小时；
4)收集上清：4℃14,000xg离心30分钟，收集上清，用0.45-μm微孔滤膜过滤彻底除菌，4℃保存，所收集上清经测定应含肠毒素的产量及分子量如下表所示：
各置毒素地产量及分子特性 类型 菌种代号 产量 分子量 等电点 SEA 13N-290915～30μg/ml 27,800道尔顿 7.3 SEB 10-27565～100μg/ml 28,366道尔顿 8.6 SEC1 13780～200μg/ml 26,000道尔顿 8.6 SEC2 36180～200μg/ml 26,000道尔顿 7.0
2．肠毒素的纯化按下列步骤进行：
一、金黄色葡萄球菌肠毒素A的纯化：
1)分子截流浓缩：将收集上清用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤浓缩蛋白，并用0.008～0.15M磷酸钠缓冲液(pH6.0)清洗平衡，最终收集液15～25毫升，每毫升含肠毒素5～10毫克；
2)离子交换分离：用10mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)平衡羧甲基纤维素柱，将上清浓缩液泵入柱中，用含8mM无机盐的8mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)将不能吸附的杂蛋白去除，再使用0.01M和0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.0)梯度洗脱肠毒素，将洗脱下的肠毒素液的pH值调至5.7，用羟基磷灰石柱再次分离，用8mM磷酸钠缓冲液(pH5.7)清洗平衡羟基磷灰石(1g/3.5mg)后装柱，用30mM磷酸钠缓冲液(pH5.7)清洗24小时后将上一步骤洗脱下的肠毒素液泵入柱中，用0.2M磷酸钠缓冲液(pH7.5)预洗脱杂质蛋白，用0.2M和0.4M磷酸钠缓冲液(pH5.7)梯度洗脱收集肠毒素蛋白，洗脱液用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤，浓缩肠毒素，并用含1M无机盐的0.5M磷酸钠缓冲液(pH6.8)平衡；
3)分子筛纯化：用含1M无机盐的0.5M磷酸缓冲液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小时，将5％柱体积的浓缩肠毒素洗脱液泵入柱中，用0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)洗脱收集肠毒素蛋白峰，至此金黄色葡萄球菌肠毒素A的纯度大于99％,-20℃冻存；
二、金黄色葡萄球菌肠毒素B的纯化：
1)分子截流浓缩：将收集上清用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤浓缩蛋白，并用0.008～0.15M磷酸钠缓冲液(pH6.0～6.2)清洗平衡，最终收集液50～100毫升，每毫升含肠毒素5～10毫克；
2)离子交换分离：用10mM磷酸钠缓冲液(pH6.2)平衡羧甲基纤维素柱，将上清浓缩液泵入柱中，用10mM磷酸钠缓冲液(pH6.2)将不能吸附的杂蛋白去除，再使用0.02M和0.07M磷酸钠缓冲液(pH6.0～6.8)梯度洗脱肠毒素，洗脱液用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤，浓缩肠毒素，并用含1M无机盐的0.5M磷酸钠缓冲液(pH6.8)平衡；
3)分子筛纯化：用含1M无机盐的0.5M磷酸缓冲液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小时，将5％柱体积的浓缩肠毒素洗脱液泵入柱中，用0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)洗脱收集肠毒素蛋白峰，至此金黄色葡萄球菌肠毒素B的纯度大于98％,-20℃冻存；
三、金黄色葡萄球菌肠毒素C1的纯化：
1)分子截流浓缩：将收集上清用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤浓缩蛋白，并用0.05～0.3M磷酸钠缓冲液(pH5.5)清洗平衡，最终收集液50～100毫升，每毫升含肠毒素5～10毫克；
2)离子交换分离：用0.10M磷酸钠缓冲液(pH5.5)平衡羧甲基纤维素柱，将上清浓缩液泵入柱中，用0.10M磷酸钠缓冲液(pH5.5)将不能吸附的杂蛋白去除，再使用0.02M磷酸钠缓冲液(pH6.0)分级梯度洗脱，肠毒素用0.06M磷酸钠缓冲液(pH6.8)洗脱，洗脱液用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤，浓缩肠毒素，并用含1M无机盐的0.5M磷酸钠缓冲液(pH6.8)平衡；
3)分子筛纯化：用含1M无机盐的0.5M磷酸缓冲液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小时，将5％柱体积的浓缩肠毒素洗脱液泵入柱中，用0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)洗脱收集肠毒素蛋白峰，至此金黄色葡萄球菌肠毒素C1的纯度大于98％,-20℃冻存；
四、金黄色葡萄球菌肠毒素C2的纯化：
1)分子截流浓缩：将收集上清用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤浓缩蛋白，并用0.01～0.05M磷酸钠缓冲液(pH5.4)清洗平衡，最终收集液50～100毫升，每毫升含肠毒素5～10毫克；
2)离子交换分离：用20mM磷酸钠缓冲液(pH5.4)平衡羧甲基纤维素柱，将上清浓缩液泵入柱中，用20mM磷酸钠缓冲液(pH5.4)将不能吸附的杂蛋白去除，再使用0.06M磷酸钠缓冲液(pH6.7)洗脱肠毒素，将洗脱下的肠毒素液用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤，浓缩肠毒素，并用5mM磷酸钠缓冲液(pH5.8)平衡准备再次用羧甲基纤维素柱分离，用5mM磷酸钠缓冲液(pH5.8)清洗平衡羧甲基纤维素柱，将上一步骤洗脱下的肠毒素液泵入柱中，用5mM磷酸钠缓冲液(pH5.8)预洗脱杂质蛋白，用0.005M和0.05M磷酸钠缓冲液(pH5.8)梯度洗脱收集肠毒素蛋白，洗脱液用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤，浓缩肠毒素，并用含1M无机盐的0.5M磷酸钠缓冲液(pH6.8)平衡；
3)分子筛纯化：用含1M无机盐的0.5M磷酸缓冲液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小时，将5％柱体积的浓缩肠毒素洗脱液泵入柱中，用0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)洗脱收集肠毒素蛋白峰，至此金黄色葡萄球菌肠毒素C2的纯度大于99％,-20℃冻存。
3．注射剂的配制按下述步骤进行：
1)测定蛋白含量：用Lowry法测定蛋白含量，并用酶联试剂复测；
2)纯度分析：用SDS-PAGE电泳分析，每个样品上样量为5μg，银染后薄层扫描分析纯度；
3)除菌：用0.22μm微孔滤膜过滤除菌；
4)配比定量：用除菌的0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)将上述纯化后的肠毒素配成为62.5ng/毫升；
5)分装：无菌操作分装，金葡菌超级抗原注射剂用金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C1或C2任一种，按每支注射剂2毫升分装，每2毫升肠毒素含量为0.125μg，复方金葡菌超级抗原注射剂按1～3∶0.5～2∶1～3∶1～3比例混合四种肠毒素液后，按每支注射剂2毫升分装，每2毫升含肠毒素总量0.125μg；
6)用兔子进行热源试验合格后4～8℃保存。
上述无机盐为氯化钠、氯化钾、氯化胺或氯化镁。
本发明的药理毒理试验及结果为：
取金葡菌超级抗原及复合金葡菌超级抗原注射剂，用体重约20克小白鼠，雌雄各半、健康无孕。随机取20只小白鼠，每组10只，对照组不给任何药物，试验组每只小白鼠腹腔注射上注射剂1毫升。小白鼠无任何立发反应，观察七天，小白鼠健存，称取体重，断颈处死，解剖肉眼观察，各主要脏器未见明显病理改变。摘取心、肝、脾、双肾分别称重，计算各动物的心-体比、肝-体比、脾-体比、肾-体比，对照组与试验组的相应数据进行统计学显著性检测分析。将上述脏器按常规固定制成组织切片，显微镜下观察对照组与试验组小白鼠各主要脏器(心、肝、脾、肾)的组织学改变。结论为：给药七天后剖析小白鼠各主要内脏无异常。与对照组相比，试验组小白鼠生长速度、心-体比、肝-体比、脾-体比及肾-体比均无显著差异(p＞0.05)，心肝脾肾的组织学检查均未见异常改变。按体重计算，相当于每公斤体重使用金葡菌超级抗原6.25μg，是人体临床剂量(按体重70公斤计算)的3500倍。金黄色葡萄球菌肠毒素对灵长类动物的毒性剂量ED50为每公斤体重0.017～0.12μg，相当于70公斤体重量1.19～8.4μg。因此，每支金葡菌超级抗原注射剂(0.125μg/2毫升/支)的临床剂量是相当安全的。
本发明的药效学试验结果为：
1)升高外周血白细胞的作用用体重为10～18.5公斤的狗进行实验，皮下注射0.25毫升金葡菌超级抗原，于给药前、给药后2小时、4小时、8小时、48小时、72小时、96小时及120小时分别采外周血进行白细胞计数。结果表明，给药后4～8小时外周血白细胞开始升高，8～24小时达到高峰，相当于给药前水平的1.5～2倍。用体重约20克小白鼠40只，雌雄各半，随机分为四组，正常对照组不给任何药物，模型对照组肌肉注射生理盐水。给药组分为两组，分别肌肉注射金葡菌超级抗原，给药剂量为每公斤体重1ml，每天肌肉注射一次，连续注射5天，于给药前第三天开始，除正常对照组外，分别按每公斤体重20mg腹腔注射环磷酰胺，每天一次，连续三天，末次给药后一小时，采各鼠眼眶静脉丛血常规计数各鼠白细胞数。结果表明，金葡菌超级抗原可保护小鼠骨髓，减轻化疗药物抑制骨髓及降低白细胞的毒副作用。
2)增强NK细胞活性的作用用小鼠进行实验，以yac-1细胞为靶细胞，Cr51100uc标记60分钟后，按1∶25及1∶50与效应细胞(小鼠脾脏单核细胞)混合，加入U型96孔板中37℃培养4小时离心收集上清液测Cr51释放量，计算NK细胞活性。结果表明，给药2天后，NK细胞活性明显升高，第4天活性最高，相当于给药前的2倍，一周后开始下降。
3)抑制肿瘤的作用用S180实体瘤、Lewis肺癌和U-14宫颈癌三个标准瘤株二种动物模型进行体内试验和体外-体内试验，将金葡菌超级抗原和瘤细胞混合后皮下接种小鼠，结果表明，可明显抑制肿瘤细胞的生长，在每公斤体重1ng～5ng剂量范围内，抑瘤率随剂量的增加而提高，抑瘤率最高可达90％。荷瘤小鼠的生存时间从平均21天延长到40％以上的小鼠存活100天。
4)人体临床试验按每天一次，每次一支，每个疗程30天使用，共实施治疗晚期恶性肿瘤50例，治疗期间未见与本药相关的毒副作用。实体瘤完全消失达三个月以上者占8％，实体瘤体积缩小50～90％的占43％，实体瘤体积缩小不到50％，但大于20％的占37％，未见有肿瘤继续恶化的病例。按以上客观标准判定，总有效率为51％，明显优于其它抗肿瘤生物制品及化疗药物。按目前初步数据分析单一金葡菌超级抗原(即用一种金黄色葡萄球菌肠毒素)与复合金葡菌超级抗原在效果上没有明显的差别。但由于每个超级抗原的作用方式有所不同，可能通过大量临床试验后能观察出复合金葡菌超级抗原的优点。
本发明所描述的用金葡菌超级抗原制备治疗恶性肿瘤的药物是利用超级抗原对体内免疫机制的各种诱导与激发作用，从而有效改善肿瘤-宿主间的作用关系，消除肿瘤对免疫细胞的抑制或解除肿瘤细胞逃逸免疫状态，通过大量细胞毒性T细胞、NK细胞的激活，以及诱导产生的大量细胞因子的综合作用，加强了细胞免疫及体液免疫清除肿瘤细胞的作用，并最终促使肿瘤细胞凋亡，实体瘤生长抑制与萎缩。由于其他的抗肿瘤生物制品只通过一种机制刺激机体免疫力，其治疗效果常常不稳定，所以不论在理论方面还是实际应用结果考察方面，金葡菌超级抗原的治疗作用及疗效明显优于其他抗肿瘤生物制品。采用本方法制备的金葡菌超级抗原注射剂，质量稳定，无任何防腐剂，4～8℃避光保存有效期可达二年以上。临床人体实验表明，在本发明所确定的剂量范围内无任何毒副反应发生。
实施例：
一、金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的制备、纯化及金葡菌超级抗原A注射剂的制备
1．菌种复苏：无菌操作，将产生金黄色葡萄球菌肠毒素A标准菌株13N-2909接种在LB琼脂斜面上，37℃培养20小时。LB培养基按下方配制：
0.5％胰蛋白胨
0.1％酵母浸出物
0.1％氯化钠
2．接种：无菌操作，将复苏菌种接种于300毫升LB液体培养中，37℃振荡培养20小时，4℃保存作为种子液，保存时间48小时。
3．转种扩大培养：于细菌发酵罐中配制5升LB培养液，121℃高压灭菌15分钟，冷却至37℃后将250毫升种子液转种于发酵罐培养液中，37℃、80％氧含量、pH6.8连续发酵20小时。
4．收集上清：4℃14,000xg离心30分钟，收集上清，用0.45-μm微孔滤膜过滤彻底除菌，4℃保存。所收集上清经测定含25微克/毫升SEA，共产生SEA约125毫克。
5．分子截流浓缩：将收集上清用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤浓缩蛋白，并用0.008M磷酸钠缓冲液(pH6.0)清洗平衡，最终收集液25毫升，每毫升含5毫克SEA。
6．离子交换分离：用10mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)平衡羧甲基纤维素柱，将上清浓缩液泵入柱中，用含8mM氯化钠的8mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)将不能吸附的杂蛋白去除，再使用0.01M和0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.0)进行梯度洗脱SEA。将洗脱下的SEA液的pH值调至5.7，准备用羟基磷灰石柱再次分离。用8mM磷酸钠缓冲液(pH5.7)清洗平衡羟基磷灰石(1g/3.5mg)后装柱，用30mM磷酸钠缓冲液(pH5.7)清洗24小时后将上一步骤洗脱下的SEA液泵入柱中，用0.2M磷酸钠缓冲液(pH7.5)预洗脱杂质蛋白。用0.2M和0.4M磷酸钠缓冲液(pH5.7)梯度洗脱收集SEA蛋白。洗脱液用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤，浓缩SEA至12毫升，并用含1M氯化钠的0.5M磷酸钠缓冲液(pH6.8)平衡。
7．分子筛纯化：用含1M氯化钠的0.5M磷酸缓冲液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小时，将12毫升的浓缩SEA洗脱液泵入柱中，用0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)洗脱收集SEA蛋白峰共25毫升，每毫升含1毫克SEA，纯度分析99.2％，按2.5毫升量分装保存于-20℃。
8．除菌：取2.5毫升SEA纯液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
9．配比定量：取4升除菌的0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)加入上述SEA纯液0.25毫升配成为62.5ng/毫升浓度的分装液。
10．分装：无菌操作分装，每支注射剂装量2毫升，每2毫升肠毒素A含量为0.125μg，共分装2000支。
11．用兔子进行热源试验合格后4℃保存。
二、金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)的制备、纯化及金葡菌超级抗原B注射剂的制备
1．菌种复苏：无菌操作，将产生金黄色葡萄球菌肠毒素B标准菌株10-275接种在LB琼脂斜面上，37℃培养20小时。LB培养基按下方配制：
0.5％胰蛋白胨
0.1％酵母浸出物
0.1％氯化钠
2．接种：无菌操作，将复苏菌种接种于300毫升LB液体培养中，37℃振荡培养20小时，4℃保存作为种子液，保存时间40小时。
3．转种扩大培养：于细菌发酵罐中配制5升LB培养液，121℃高压灭菌15分钟，冷却至37℃后将250毫升种子液转种于发酵罐培养液中，37℃、80％氧含量、pH6.5连续发酵20小时。
4．收集上清：4℃14,000xg离心30分钟，收集上清，用0.45-μm微孔滤膜过滤彻底除菌，4℃保存。所收集上清经测定含100微克/毫升SEB，共产生SEB约500毫克。
5．分子截流浓缩：将收集上清用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤浓缩蛋白，并用0.008M磷酸钠缓冲液(pH6.0)清洗平衡，最终收集液50毫升，每毫升含10毫克SEB。
6．离子交换分离：用10mM磷酸钠缓冲液(pH6.2)平衡羧甲基纤维素柱，将上清浓缩液泵入柱中，用10mM磷酸钠缓冲液(pH6.2)将不能吸附的杂蛋白去除，再使用0.01M和0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.0)梯度洗脱SEB。洗脱液用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤，浓缩SEB至25毫升，并用含1M无机盐的0.5M磷酸钠缓冲液(pH6.8)平衡。
7．分子筛纯化：用含1M氯化钠的0.5M磷酸缓冲液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小时，将12.5毫升的浓缩SEB洗脱液泵入柱中，用0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)洗脱收集SEB蛋白峰共25毫升，每毫升含5毫克SEB，纯度分析98.5％。用除菌的0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)稀释SEB至1毫克/毫升，按2.5毫升量分装保存于-20℃。
8．除菌：取2.5毫升SEB纯液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
9．配比定量：取4升除菌的0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)加入上述SEB纯液0.25毫升，配成为62.5ng/毫升浓度的分装液。
10．分装：无菌操作分装，每支注射剂装量2毫升，每月毫升肠毒素B含量为0.125μg，共分装2000支。
11．用兔子进行热源试验合格后4℃保存。
三、金黄色葡萄球菌肠毒素C1(SEC1)的纯化及金葡菌超级抗原C1注射剂的制备
1．菌种复苏：无菌操作，将产生金黄色葡萄球菌肠毒素C1标准菌株137接种在LB琼脂斜面上，37℃培养20小时。LB培养其按下方配制：
0.5％胰蛋白胨
0.1％酵母浸出物
0.1％氯化钠
2．接种：无菌操作，将复苏菌种接种于300毫升LB液体培养中，37℃振荡培养20小时，4℃保存作为种子液，保存时间30小时。
3．转种扩大培养：于细菌发酵罐中配制5升LB培养液，121℃高压灭菌15分钟，冷却至37℃后将250毫升种子液转种于发酵罐培养液中，37℃、80％氧含量、pH6.5连续发酵20小时。
4．收集上清：4℃14,000xg离心30分钟，收集上清，用0.45-μm微孔滤膜过滤彻底除菌，4℃保存。所收集上清经测定含200微克/毫升SEC1，共产生SEC1约1000毫克。
5．分子截流浓缩：将收集上清用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤浓缩蛋白，并用0.10M磷酸钠缓冲液(pH5.5)清洗平衡，最终收集液100毫升，每毫升含10毫克SEC1。
6．离子交换分离：用0.10M磷酸钠缓冲液(pH5.5)平衡羧甲基纤维素柱，将上清浓缩液泵入柱中，用0.10M磷酸钠缓冲液(pH5.5)将不能吸附的杂蛋白去除，再使用0.02M磷酸钠缓冲液(pH6.0)分级梯度洗脱，SEC1用0.06M磷酸钠缓冲液(pH6.8)洗脱。洗脱液用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤，浓缩SEC2至50毫升，并用含1M氯化钠的0.5M磷酸钠缓冲液(pH6.8)平衡。
7．分子筛纯化：用含1M氯化钠的0.5M磷酸缓冲液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小时，将12.5毫升的浓缩SEC1洗脱液泵入柱中，用0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)洗脱收集SEC1蛋白峰共25毫升，每毫升含5毫克SEC1，纯度分析98.7％。用除菌的0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)稀释SEC1至1毫克/毫升，按2.5毫升量分装保存于-20℃。
8．除菌：取2.5毫升SEC1纯液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
9．配比定量：取4升除菌的0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)加入上述SEC1纯液0.25毫升，配成为62.5ng/毫升浓度的分装液。
10．分装：无菌操作分装，每支注射剂装量2毫升，每2毫升肠毒素C1含量为0.125μg，共分装2000支。
11．用兔子进行热源试验合格后4℃保存。
四、金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)的纯化制备及金葡菌超级抗原C2注射剂的制备
1．菌种复苏：无菌操作，将产生金黄色葡萄球菌肠毒素C2标准菌株361接种在LB琼脂斜面上，37℃培养20小时。LB培养其按下方配制：
0.5％胰蛋白胨
0.1％酵母浸出物
0.1％氯化钠
2．接种：无菌操作，将复苏菌种接种于300毫升LB液体培养中，37℃振荡培养20小时，4℃保存作为种子液，保存时间36小时。
3．转种扩大培养：于细菌发酵罐中配制5升LB培养液，121℃高压灭菌15分钟，冷却至37℃后将250毫升种子液转种于发酵罐培养液中，37℃、80％氧含量、pH6.5连续发酵20小时。
4．收集上清：4℃14,000xg离心30分钟，收集上清，用0.45-μm微孔滤膜过滤彻底除菌，4℃保存。所收集上清经测定含200微克/毫升SEC2，共产生SEC2约1000毫克。
5．分子截流浓缩：将收集上清用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤浓缩蛋白，并用20mM磷酸钠缓冲液(pH5.4)清洗平衡，最终收集液100毫升，每毫升含10毫克SEC2。
6．离子交换分离：用20mM磷酸钠缓冲液(pH5.4)平衡羧甲基纤维素柱，将上清浓缩液泵入柱中，用20mM磷酸钠缓冲液(pH5.4)将不能吸附的杂蛋白去除，再使用0.06M磷酸钠缓冲液(pH6.7)洗脱SEC2。将洗脱下的SEC2用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤，浓缩SEC2，并用5mM磷酸钠缓冲液(pH5.8)平衡。用5mM磷酸钠缓冲液(pH5.8)清洗平衡羧甲基纤维素柱，将上一步骤洗脱并浓缩的SEC2泵入柱中。用5mM磷酸钠缓冲液(pH5.8)预洗脱杂质蛋白，再用0.005M和0.05M磷酸钠缓冲液(pH5.8)梯度洗脱收集SEC2蛋白。用10000道尔顿分子量截流滤膜超滤，浓缩SEC2至50毫升，并用含1M氯化钠的0.5M磷酸钠缓冲液(pH6.8)平衡。
7．分子筛纯化：用含1M氯化钠的0.5M磷酸缓冲液(pH6.8)平衡SephacrylS-200(2.5×100cm)20小时，将12.5毫升的浓缩SEC2洗脱液泵入柱中，用0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)洗脱收集SEC2蛋白峰共25毫升，每毫升含5毫克SEC2，纯度分析98.7％。用除菌的0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)稀释SEC2至1毫克/毫升，按2.5毫升量分装保存于-20℃。
8．除菌：取2.5毫升SEC2纯液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
9．配比定量：取4升除菌的0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)加入上述SEC2纯液0.25毫升，配成为62.5ng/毫升浓度的分装液。
10．分装：无菌操作分装，每支注射剂装量2毫升，每2毫升肠毒素C2含量为0.125μg，共分装2000支。
11．用兔子进行热源试验合格后4℃保存。
五、复合金葡菌超级抗原注射剂的制备
1．除菌：取0.5毫升SEA、1.2毫升SEB、1.6毫升SEC1及0.7毫升SEC2纯液，混合后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
2．配比定量：取4升除菌0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)加入上述混合液0.25毫升，配成为肠毒素总含量为62.5ng/毫升浓度分装液。
3．分装：无菌操作分装，每支注射剂装量2毫升，每2毫升含肠毒素总量0.125μg，共分装2000支。
4．用兔子进行热源试验合格后4℃保存。
另外，本实施例中的氯化钠还可以用氯化钾、氯化胺和氯化镁替代。用上述几种无机盐生产本发明产品仍属于本发明的保护范围。