烟草野火病病原菌HRPZ基因及其表达产物与应用.pdf

本发明涉及一种烟草野火病病原菌hrpZ基因及其表达产物与应用，属于生物基因工程领域。该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，应用在调节植物生长发育和使植物获得广谱抗病虫性方面。由于HrpZPsta蛋白质在增强植物抗病、驱虫、抗逆以及促进生长和提高产量方面的良好效果，加之其对环境友好，对人畜鸟鱼无毒性，而且不会引起病原物的抗药性，也不会诱发植物遗传结构(基因组DNA)的改变，在环境中容易分解、没有残留公害，可望成为未来逐步替代高毒、高残留化学农药和化学调节剂的优良环保型生物产品的首选。

权利要求书
1、  一种烟草野火病病原菌hrpZPsta基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

2、  如权利要求1所述的烟草野火病病原菌hrpZPsta基因在调节植物生长发育和使植物获得广谱抗病虫性方面的应用。

3、  如权利要求1所述的烟草野火病病原菌hrpZPsta基因的克隆方法，包括下列步骤：
(1)提取烟草野火病病原菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)的基因组DNA，根据Genebank中登录号为AB112555的hrpZ序列，设计完整开放阅读框(ORF)引物：
hrpZ-P1：5′-ATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC；
hrpZ-P2：5′-TCACCATTGGAATTGCTGTTG。
(2)以烟草野火病病原菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)的基因组DNA为模板进行PCR扩增；反应条件为94℃变性4min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸35s，循环35次，72℃延伸10min，4℃保存；
(3)将PCR产物与PTA2载体连接得PTA2-hrpZ重组体，转化到大肠杆菌菌株top10中，经PCR及酶切鉴定得阳性转化子；
(4)提取阳性重组质粒pTA2-hrpZ的DNA并测序。

4、  如权利要求1所述的烟草野火病病原菌hrpZPsta基因的表达方法，包括下列步骤：
(1)根据所得的hrpZ基因的开放阅读框(ORF)，设计扩增ORF(剔除起始密码子)的引物P3和P4，在5′端分别引入BamH1和EcoR1酶切位点：
hrpZ-P3：5′-GGGGATCCCAGAGTCTCAGTCTTAAC(BamH1)；
hrpZ-P4：5′-GGGAATTCTCACCATTGGAATTGCTG(EcoR1)；
以阳性重组质粒pTA2-hrpZ为模板，PCR扩增，产物经BamH1和EcoR1双酶切处理，插入到载体PGEX-4T-1的BamH1和EcoR1酶切位点之间，使得hrpZpsta基因与PGEX-4T-1上的还原型谷胱甘肽标签形成融合基因，从而得到原核表达质粒PGEX-hrpZpsta；
(2)表达质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，在LB培养基(Amp100ug/mL)中37℃振摇(120～250r/min)培养至OD600＝0.5～0.8，取400～500ul接种于30ml LB表达培养基(Amp100ug/mL)中培养2～3h后加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养3～5h。取诱导的菌液1.5ml于1.5ml的离心管中离心1min，去除上清，将沉淀加入50ul 2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5min，取30ul进行SDS-PAGE，检测目的蛋白的表达情况。

5、  如权利要求1所述烟草野火病病原菌hrpZPsta基因编码的Harpin蛋白质，其特征在于：该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。

6、  烟草野火病病原菌hrpZPsta基因编码的Harpin蛋白质在调节植物生长发育和使植物获得广谱抗病虫性方面的应用。

说明书烟草野火病病原菌hrpZ基因及其表达产物与应用
技术领域
本发明属于生物基因工程领域，更具体地说，涉及一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的hrpZ基因的克隆及其表达产物，以及该基因与其表达产物在植物获得抗病虫害方面的应用。
背景技术
微生物蛋白农药是对多种农作物具有很强生物活性的一类蛋白质药物，按照作用机理的不同又可分为传统微生物蛋白农药和新型微生物蛋白农药。传统微生物蛋白农药主要是来自苏云金芽孢杆菌(Bt)的杀虫晶体蛋白(ICP)，新型微生物蛋白农药主要是蛋白激发子类物质，它与传统微生物蛋白农药最大的区别在于其不直接杀灭害虫和病原物，而是激发植物自身的抗病防虫基因的表达，并促进植物的生长发育。目前研究报道的具有代表性的新型微生物蛋白农药主要有过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)等，其中最受关注、最有应用前景的是Harpin类蛋白激发子。Harpin蛋白主要是由欧文氏杆菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomanas)、黄单孢菌属(Xanthomonas)等细菌产生的一类能激发植物过敏反应的蛋白质，其可诱导植物体内一系列基因的表达，激活植物自身的生长系统和防卫系统，从而使植物能抵御多种病害的侵染和逆境的胁迫，并获得促进生长发育和提高增产的效果。1992年，美国康乃尔大学的韦忠民等首先从梨火疫欧文氏杆菌(E.amylovora)中克隆出这类过敏蛋白基因，迄今为止，所有这些Harpin类蛋白差不多都具有以下分子特征：(1)亲水性；(2)对热稳定，100℃处理10min不会失活；(3)对蛋白酶K和紫外线敏感；(4)富含甘氨酸而缺少半胱氨酸；(5)水溶性酸性蛋白；(6)无四级结构。
最近的研究表明，Harpin类蛋白可能在植物的信号通路中起着重要作用。研究人员用Harpin处理拟南芥，发现拟南芥中Cl、Ca、K、H、Cu、Zn离子通道以及各种氧化酶被激活，这些氧化酶包括ACC合成酶、抗坏血酸氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、Cu分子伴侣前体等等。现在通常认为，植物细胞壁中广泛存在Harpin蛋白的受体，即Harpin结合蛋白(Harpin-binding proteins，HrBP)，Harpin可以通过与这些受体蛋白HrBP结合激活植物中的多条信号通路。这些信号通路大致可以分为以下三类：(1)与植物抗病和驱虫相关的信号通路的激活，包括过敏反应与细胞死亡、离子交换通道、水杨酸途径、茉莉酸途径、苯丙氨酸解氨酶介导的途径以及其它一些抗性基因介导的途径；(2)与促进植物生长相关的信号通路的激活，包括一般的生长调节因子、胚轴延伸转录因子、生长转录因子、乙烯反应元件结合蛋白系以及蔗糖合成酶和其他胚胎形成酶等；(3)与植物抗逆相关的信号通路的激活，包括热休克蛋白、COR基因和耐盐锌蛋白等。另外可能还存在一条比较特殊的不依赖于NPR1介导的植物对细菌抗性的信号通路。
Harpin蛋白虽然来源于病原菌，但作为一类非特异性的激发蛋白因子，却能引起非寄主植物发生过敏反应，并诱导其抗病性、驱虫性和抗逆性的增加，以及促进生长发育、提高产量等。在转hrpNEa基因的梨上，HarpinEa对产生梨火疫病的宿主寄生菌E.amylovora也表现出非常强的抗性。
现代分子植物病理学揭示，植物病原细菌既有其致病性，也有诱导植物产生抗病性和促进生长的能力，而决定这种能力的基因是植物病原细菌的hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因簇。hrp基因决定着植物病原细菌在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitive response on non-host plants，HR)的能力和在寄主植物上的基本寄生性或致病性。HR是植物一种局部的、快速的细胞编程死亡形式，是植物主动抗性的结果，其抗性作用不仅表现在对病原细菌侵染扩展的限制，而且能进一步诱导植物体内产生类似免疫机制的系统获得性抗性反应。
首次提出Harpin蛋白诱导植物的过敏反应可能与其抗病性作用有关，由此推动了新型微生物蛋白农药研究的兴起。经过约10年的努力，以此为背景的美国Eden生物科技公司成功开发和研制出具有广谱抗病防虫功能的新型微生物蛋白农药Messenger，该产品以其对大田作物和经济作物抗病增产方面良好的效果以及对绿色无公害农业卓越的贡献，曾两度获美国环境保护委员会颁发的总统绿色化学挑战奖。国内南京农大以王金生教授为首的科研工作者对水稻黄单胞Harpin蛋白也进行了大量的研究并取得了丰硕的成果。但关于烟草野火病菌hrp基因的克隆及Harpin蛋白应用目前还未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的hrpZPsta基因在调节植物生长发育、防治病虫害方面的应用。
本发明的目的提供一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的hrpZPsta基因，其基因编码区共计423个核苷酸，其基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1，该基因来源于烟草野火病假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)菌株，烟草是其寄主植物。该基因以hrpZ基因簇形式存在于烟草野火病假单胞菌的染色体DNA上。
本发明的所述基因在调节植物生长发育和使植物获得广谱抗病虫性方面的应用。
本发明提供一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的hrpZPsta基因编码的Harpin蛋白质，其蛋白质的氨基酸序列在列表SEQID No.2中，该蛋白共有140个氨基酸残基，分子量14.8kda，等电点为4.61，富含甘氨酸(Gly)，缺乏半胱氨酸(Cys)，并且具有Harpin类蛋白质的基本属性和生物活性。
烟草野火病病原菌hrpZPsta基因编码的Harpin蛋白质在调节植物生长发育和使植物获得广谱抗病虫性方面的应用。
本发明烟草野火病病原菌hrpZPsta基因的克隆方法，包括下列步骤：
(1)提取烟草野火病病原菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)的基因组DNA，根据Genebank中登录号为AB112555的hrpZ序列，设计完整开放阅读框(ORF)引物：
hrpZ-P1：5′-ATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC；
hrpZ-P2：5′-TCACCATTGGAATTGCTGTTG。
(2)以烟草野火病病原菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)的基因组DNA为模板进行PCR扩增；反应条件为94℃变性4min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸35s，循环35次，72℃延伸10min，4℃保存；
(3)将PCR产物与PTA2载体连接得PTA2-hrpZ重组体，转化到大肠杆菌菌株top10中，经PCR及酶切鉴定得阳性转化子；
(4)提取阳性重组质粒pTA2-hrpZ的DNA并测序。
本发明烟草野火病病原菌hrpZPsta基因的表达方法，包括下列步骤：
(1)根据所得的hrpZ基因的开放阅读框(ORF)，设计扩增ORF(剔除起始密码子)的引物P3和P4，在5′端分别引入BamH1和EcoR1酶切位点：
hrpZ-P3：5′-GGGGATCCCAGAGTCTCAGTCTTAAC(BamH1)；
hrpZ-P4：5′-GGGAATTCTCACCATTGGAATTGCTG(EcoR1)；
以阳性重组质粒pTA2-hrpZ为模板，PCR扩增，产物经BamH1和EcoR1双酶切处理，插入到载体PGEX-4T-1的BamH1和EcoR1酶切位点之间，使得hrpZpsta基因与PGEX-4T-1上的还原型谷胱甘肽标签形成融合基因，从而得到原核表达质粒PGEX-hrpZpsta；
(2)表达质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，在LB培养基(Amp100ug/mL)中37℃振摇(120～250r/min)培养至OD600＝0.5～0.8，取400～500ul接种于30ml LB表达培养基(Amp100ug/mL)中培养2～3h后加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养3～5h。取诱导的菌液1.5ml于1.5ml的离心管中离心1min，去除上清，将沉淀加入50ul 2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5min，取30ul进行SDS-PAGE，检测目的蛋白的表达情况。
HrpZPsta蛋白质具有以下主要生物学功能：(1)促进植物生长发育、提高产量；(2)使植物获得广谱抗病性，包括对细菌、真菌和病毒的抗性；(3)使植物获得对某些有害昆虫的驱虫性。
由于HrpZPsta蛋白质在增强植物抗病、驱虫、抗逆以及促进生长和提高产量方面的良好效果，加之其对环境友好，对人畜鸟鱼无毒性，而且不会引起病原物的抗药性，也不会诱发植物遗传结构(基因组DNA)的改变，在环境中容易分解、没有残留公害，可望成为未来逐步替代高毒、高残留化学农药和化学调节剂的优良环保型生物产品的首选。目前正在就其对各种作物、蔬菜、水果、花卉、中草药以及各种经济植物等数十种植物在内的抗病驱虫和促长增产效果进行广泛的试验和比较。已有试验结果显示，HrpZPsta蛋白对白菜、番茄、黄瓜、防风、土豆、水稻、玉米等的抗病驱虫和促长增产效果明显，同时对提高某些植物如葡萄、蓝莓的品质亦有很好的效果，而且在同类Harpin产品中对比效果也很显著。另外HrpZPsta蛋白可直接应用于植物的生长发育调节和病虫害防治，包括粮食作物、经济植物、蔬菜、水果、花卉以及园林和草场的养护等。使用方法有浸种、拌种、蘸根、种子包衣、植株注射、叶面喷施、花果喷涂等。使用剂量因使用方法和品种而异，一般10μg/ml～100μg/ml均为有效浓度；施用后4～12小时内即发生作用，药效可持续20d左右，一个生长季节可用药2～3次。
E.coli BL12(DE3)菌株及基因的高效表达载体PGEX-4T-1质粒在国内外分子生物学研究及医药工业中已广泛应用，对环境安全可靠。
附图说明
图1、PCR及酶切鉴定重组质粒PTA2-hrpzpsta，图中：
M：DNA marker DL2000；1：PTA2-hrpZPsta经EcoR1+BamH1双酶切；2：PCR产物。
图2、PCR及酶切鉴定重组质粒PGEX-hrpZpsta，图中：
M：DNA marker SM0191；1：重组质粒PGEX-hrpZPsta经BamH1+EcoR1双酶切鉴定；2；重组质粒PGEX-hrpZPsta经EcoR1单酶切鉴定；3：PCR产物；4：DNA markerDGL2000。
图3、PGEX-hrpZpsta重组质粒经不同浓度的IPTG诱导表达后的SDS-PAGE分析；图中：
M：蛋白marker D530S；1：含PGEX-hrpZPsta a重组质粒的寄主菌E.coli BL21(DE3)未经IPTG诱导；2-6：含PGEX-hrpZPsta重组质粒的寄主菌E.coli BL21(DE3)经浓度为5，4，3，2，1mmol/L IPTG的诱导。
图4、上清及沉淀的表SDS-PAGE分析，图中：
1：经超声波处理离心后的上清；2：经超声波处理离心后沉淀；3：蛋白marker。
具体实施方式
本发明中使用的缩略语：
LB：细菌培养基，酵母粉5g/L+蛋白胨10g/L+NaCl10g/L，pH7.0；Amp：氨苄青霉素；IPTG：异丙基硫代-β-半乳糖苷；PMSF：苯甲基磺酰氟；Tris：三羟甲基氨基甲烷；PBS：磷酸缓冲液。
实施例1：烟草野火病病原菌hrpZ基因的克隆与测序
1、hrpZPsta基因的来源hrpZPsta基因来源于烟草野火病假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)Psta218菌株(本菌株采集于通化地区的柳河)，烟草是其寄主植物。该基因以hrpZ基因簇形式存在于Psta218菌株的染色体DNA上。
2、hrpZPsta218基因克隆与测序
(1)把烟草野火病假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)Psta218菌株首先KBA平板上筛选，该菌株能分泌荧光色素，并在紫外光下发生荧光。
(2)将选取的单克隆菌落，于28℃下在LB液体培养基中振荡培养12h，离心收集菌体，用于提取基因DNA。
(3)烟草野火病假单胞菌(P.syringae pv.tabaci)基因组DNA的提取及hrpz克隆。按照《现代分子生物学实验手册》第一版上细菌基因组DNA的提取方法及DNA纯化试剂盒说明书进行。根据Genebank中登录号为AB112555的hrpz序列，设计完整ORF的PCR扩增引物PST-P1：5’-ATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC；PST-P2：5’-TCACCATTGGAATTGCTGTTG；
以P.syringae pv.tabaci基因组DNA为模板进行PCR扩增：反应条件为94℃变性4min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸35s，循环35次，72℃延伸10min，4℃保存。
回收后的PCR产物与PTA2载体链接，转化到大肠杆菌感受态细胞top10中，筛选白色菌落，经酶切进一步鉴定得到构建的克隆载体。
重组克隆提取的质粒pTA2-hrpzpst送往上海生工测序。用DNAman软件对测序结果与NCBI上登录的hrpz：登录号为AB112555，进行核苷酸序列比对。利用特异性引物对PST-P1/PST-P2扩增hrpZpsta，扩增产物在凝胶电泳道中只有一条特异性的染色带，大小约420bp，与预计的目的片段大小一致。扩增产物克隆至PTA2载体上，筛选白色菌落，进一步用BamH1/EcoR1酶切鉴定，发现重组质粒2900和420bp左右有相应的条带(图1)，说明重组质粒中含有插入的片段。
实施例2 烟草野火病病原菌hpZ基因表达蛋白的制备
1、hrpZPsta218基因工程表达菌株的构建据本试验测得的hrpZpsta基因，设计剔除起始密码子ORF并引入酶切位点的扩增引物：P3：5’-GGGGATCCCAGAGTCTCAGTCTTAAC(BamH1)，P4：5’-GGGAATTCTCACCATTGGAATTGCTG(EcoR1)。以克隆载体为模板。PCR产物经BamH1和EcoR1双酶切处理，插入到PGEX-4T-1的上述BamH1和EcoR1酶切位点之间，使得hrpZpsta基因与PGEX-4T-1的还原型谷胱甘肽标签形成融合基因，从而得到原核表达质粒PGEX-hrpZpsta。质粒转入感受态细胞BL21(DE3)中，通过选择压及酶切鉴定筛选出含PGEX-hrpZpsta质粒的阳性克隆质粒(图2)。将带有表达质粒PGEX-hrpZpsta的大肠杆菌BL21(DE3)接种与30ml的LB-Amp20μg/ml培养基中，在37℃下培养9h后，吸取600ul菌液于1.5ml的离心管内再加入400ul的甘油后置于-80℃下存。
2、大规模发酵(1)活化原种：将带有hrpZPtsa基因高效表达质粒PGEX-4T-1的工程菌E.coli BL12(DE3)菌株于甘油-LB+Amp20μg/ml的保存液中，37℃培养过夜。(2)制备母种：将原种液按1％体积接种于加有100mlLB+AMP20μg/ml的250ml摇瓶中，于37℃110rpm振荡培养12h。(3)制备生产种：将母种菌液按1％体积比接种于加有3L LB+Amp 25μg/ml的5L发酵罐中，37℃110rpm和0.5L/min通气量条件下培养12h。(4)大规模发酵：将50L以上的发酵罐加入70％体积的LB及终浓度40μg/ml的AMP后，原位灭菌30min(120℃，1.1MPa)；然后按1％体积比接入生产种子菌，37℃200rpm和1L/min通气量条件下发酵培养；待细菌进入对数生长期(OD600＝0.6-0.8)后，调节转速和通气量，以保证发酵环境有充足的供氧(DO>30％)，并按特定程序进行对数分期补料；在细菌对数生长期结束前1～2h，通过微孔滤膜加入诱导剂IPTG至终浓度1mN；继续诱导发酵4～6h，即可下罐。此法可实现工程菌的高密度或高效培养。(5)HrpZPsta蛋白质的制备和纯化。HrpZPtsa蛋白质在大肠杆菌细胞中50％左右以包涵体(inclusion body)形式存在，必须对其细胞进行破碎。首先采用8M尿素破碎制备，然后按下列程序操作：离心(5，000rpm，10min)收集经IPTG诱导4～6h的大肠杆菌细胞，以20mMTris缓冲液(pH9.0)充分悬浮后，加10μl/25ml的溶菌酶(100mg/ml)，冰浴10min，加0.5ml/25mlPMSF(20mg/ml)，超声波(20KHz)破碎10min，再加0.5ml/25ml的PMSF，混匀后再超声波破碎10min，10,000rpm离心10min，取上清液于100℃水浴10min，冷却后12,000rpm离心10min，收集上清液。此上清液中含有浓度3g/L的HrpZPtsa蛋白质。
实例3 HrpZPsta蛋白的表达特性及其生物活性检测
1、重组载PGEX-hrpZpsta导入表达寄主菌E.coli BL21(DE3)中，诱导表达，PGEX-hrpZPsta经终浓度为5mmol/L、4mmol/L、3mmol/L、2mmol/L和1mmol/L IPTG诱导3h后，取诱导的菌液1.5ml于1.5ml的离心管中离心1min，去除上清，将沉淀加入50ul 2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5min，取30ul进行SDS-PAGE，检测目的蛋白的表达情况。SDS-PAGE分析结果表明3h时后均高效表达，在41kDa左右有特异蛋白条带，大小与预测基本一致，IPTG终浓度5mmol/L到1mmol/L诱导表达差异不明显(图3)，而未经诱导的含重组载体PGEX-hrpZpsta的BL21(DE3)无相应的条带。
将诱导的重组质粒及空载体转化的E.coli BL21(DE3)菌体离心的沉淀溶于相当于1/20诱导培养基体积的PBS(5mmol/L，pH6.5)中，超声波破碎离心收集沉淀与上清，将沉淀重悬于20ul的ddH2O，上清与悬浮的沉淀各吸取15ul加入15ul 2×SDS上样缓冲液混匀，煮沸5min，取30ul进行SDS-PAGE，对蛋白进行可溶性分析。12％的SDS-PAGE分析发现上清在41kDa左右有一条蛋白条带(图4)，与沉淀进行电泳出现的电泳条带大小一致，证实融合表达蛋白可溶性，用BANDSCAN软件分析其百分比含量，结果显示沉淀中融合蛋白约占45％，上清中约占50％。对上清与沉淀总蛋白含量进行测定，经换算得沉淀与上清中的融合蛋白含量分别为0.72mg/ml，0.88mg/ml，说明表达产物一半以上溶解在上清中。将HarpinPSTA218蛋白质进一步分离纯化，并对HrpZPsta蛋白质进行Western blot分析和HR检测。根据hrpZpsta基因的核苷酸序列推测，HrpZPsta蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2。该蛋白质具有以下属性：(1)由140个氨基酸残基组成；(2)分子量41.2kda；(3)等电点pI：4.61；(4)富含甘氨酸Gly，缺乏半胱氨酸Cys；(5)对温度稳定，在100℃沸水中耐受10-15min仍有活性；(6)没有四级结构。
2、HrpZPsta蛋白质的生物学活性检测目前公认的Harpin类蛋的生物活性检测方法主要有：(1)过敏反应(hypersensitive response，HR)，通常以烟草作被试植物，但由于本蛋白来源于烟草的宿主菌，所以我们把番茄做为检测植物，这也是Harpin类蛋白生物活性检测快速、简便的方法；(2)血清学反应，即用标准的Harpin蛋白纯品制成血清抗体，然后用这种抗血清对对未知样品进行Western分析，通过抗体识别反应，可以准确检测出未知样品中Harpin蛋白。
实施例4 HrpZPtsa蛋白质的使用方法
HrpZPsta蛋白质在使用上方法多样，可因处理材料、处理部位、处理时间以及处理目的不同而有所差异。具体可按以下介绍的方法使用：
(1)浸种：首先用水将HrpZPsta蛋白质配成40～80μg/ml的浓度，然后将种子浸于其中10h左右。此法适宜作催芽的作物或蔬菜种子。浸种结束后，将种子从HrpZPtsa蛋白质浸种液中取出，即可催芽或播种。出苗一周后，苗高比对照增长10％以上，生长量也提高10％以上，而且苗期抗猝倒病的能力也明显增强。
(2)拌种：将种子稍加湿润，加入种子量0.1％的HrpZPtsa蛋白质制剂，充分拌匀后播种。出苗后苗齐苗壮，增强苗期抗猝倒病的能力。
(3)蘸根：适于移栽定殖的作物，如瓜果、蔬菜、水稻、玉米、防风等。首先将HrpZPsta蛋白质制剂配成30μg/ml的水溶液，然后将被移栽作物幼苗的根浸在该溶液中1～2h。移栽后，植株恢复生长快，缓苗时间缩短，植株长势强劲。
(4)叶面喷雾：作物的整个生长季节均可进行喷施。将HrpZPsta蛋白质制剂配成20～30μg/ml的水溶液，在作物的苗期、分蘖期、初花期、初果期或灌浆期进行喷雾使用。作物生长季节一般可喷雾2～3次。喷雾后，可提高作物营养体生长量15％～20％，提高产量10％～15％，而且整个生长季节可省掉50％以上的化学农药。某些作物如白菜可抗60％的黑斑病、黄瓜可抗50％的灰霉病。另外还有一定的抗逆(抗旱、抗寒、耐盐碱等)和驱虫效果。
实施例5 hrpZPtsa基因的相关应用
(1)用基因重组技术将hrpZPsta基因克隆进抗卡那霉素的PBI121质粒载体中，形成PBI121-hrpZPsta质粒；
(2)用PBI121-hrpZPsta质粒转化农杆菌细胞，筛选含PBI121-hrpZPsta质粒的阳性表达农杆菌；
(3)经外植体选择、高渗和农杆菌共培养、选择培养基筛选转化体用PCR及Southen杂交鉴定获得的转化体；
(4)该转基因植株与未转hrpZPsta基因的马铃薯相比，具有明显的生长优势和抗晚疫及病毒的特性。
实施例6 HrpZPtsa蛋白质的应用举例
目前已对数十种作物、蔬菜、中草药作了HrpZPsta蛋白质的施用效果试验，虽然在不同作物品种上表现程度有所不同，但HrpZPsta蛋白质的促长增产、抗病驱虫、提高抗逆性等方面的作用是显著的。
下面举几例加以说明：
(1)白菜：选取两块5分地大小的4～5叶期白菜苗田，分别用作对照和处理区。处理区分别在6叶期和8叶期用15-20μg/ml的HrpZPsta蛋白质溶液作了叶面喷雾，12h后接种白菜黑斑病菌，此外不使用任何农药，其它方面的管理与对照区一样。在试验过程中发现，用药后一周，白菜黑斑病发病率也比对照区低20％～30％；收获时处理区产量比对照增产15％以上。
(2)玉米：选取两块4分地大小的4叶期玉米苗田，分别用作对照和处理区。处理区分别在4叶期和6叶期用15～20μg/ml的HrpZPtsa蛋白质溶液作了叶面喷雾，其它方面的管理与对照区一样。在试验过程中发现，用药后2周，处理区平均株高比对照区高出4～5cm，同时处理区抽雄比对照区提前2～3d，玉米大斑病发病病级比对照降低1～2级，灌浆期双苞率明显高于对照。收获后比较产量，处理区比对照区增产10％以上。
(3)防风：选取二块5分地大小的4-5片真叶期防风苗田，分别用作对照和HrpZPsta蛋白质处理区，处理苗棚的HrpZPsta蛋白处理液的浓度为20μg/ml。处理区在4叶期、5叶期和7叶期进行过叶面喷雾，其它管理同对照。试验结果表明：HrpZPtsa蛋白质处理块防风叶斑病比对照减少了60％。
(4)油菜：HrpZPsta蛋白对植物有害昆虫的驱杀性。油菜为蚜虫易感植物。用25μg/ml浓度的HrpZPsta蛋白制剂在25℃条件下对油菜种子浸种24～48h，并以pH6.5的5mM磷酸盐缓冲液作对照浸种处理，然后分别播于三个培养钵中萌发，待出苗以后分组移栽于同一块大田中，随后每天观察记录感染蚜虫的数目。结果发现，对照处理组第1、2、3、6、7、8、9、10天单株感染蚜虫的平均数分别为：0、3、4、6、7、8、12、15；HrpZPsta蛋白处理组单株感染蚜虫的平均数分别为：0、0、0、1、1、1、2、3。
序列表
<110>吉林农业大学
<120>烟草野火病病原菌hrpZ基因及其表达产物与应用
<130>gj0801
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>423
<212>DNA
<213>Pseudomonas syringae pv.tabaci
<400>1

<210>2
<211>140
<212>PRT
<213>Pseudomonas syringae pv.tabaci
<400>2