测定多核苷酸序列.pdf

靶多核苷酸序列可通过以下步骤测定：(i)在适合聚合酶反应进行的条件下，将靶多核苷酸与聚合酶、核苷酸A、T(U)、G和C中的一种接触；(ii)测定聚合酶结合靶多核苷酸以及随后解离的时间，由此确定聚合酶是否将核苷酸引入靶多核苷酸上；(iii)可选地，使用其他核苷酸重复步骤(i)和(ii)，由此确定靶多核苷酸的序列。

权利要求书
1.  一种测定靶多核苷酸序列的方法，包括：
(i)在适合聚合酶反应进行的条件下，将靶多核苷酸与聚合酶、核苷酸A、T(U)、G和C中的一种接触；
(ii)测定聚合酶结合靶多核苷酸以及随后解离的时间，由此确定聚合酶是否将核苷酸引入靶多核苷酸上；
(iii)可选地，使用其他核苷酸重复步骤(i)和(ii)，由此确定靶多核苷酸的序列。

2.  一种识别靶多核苷酸突变的方法，包括如下步骤：
(i)在适合聚合酶反应进行的条件下，将靶多核苷酸与聚合酶、核苷酸A、T(U)、G和C中的一种接触；
(ii)测定聚合酶结合靶多核苷酸以及随后解离的时间，由此确定聚合酶是否将核苷酸引入靶多核苷酸上，参照靶标的原始序列确定是否存在突变。

3.  根据权利要求1或2的方法，其中进行步骤(i)～(ii)时依次使用不同的核苷酸，直至检测到核苷酸引入。

4.  根据前述任一权利要求的方法，其中靶多核苷酸固定于支持材料上。

5.  根据前述任一权利要求的方法，其中多种靶多核苷酸固定于支持材料上。

6.  根据前述任一权利要求的方法，其中步骤(ii)通过测量施加的辐射进行。

7.  根据前述任一权利要求的方法，其中步骤(ii)通过测量拉曼散射进行。

8.  根据权利要求1～6之一的方法，其中步骤(ii)通过应用表面电磁波进行。

9.  根据权利要求8的方法，其中表面电磁波为表面电浆波。

10.  根据权利要求1～8之一的方法，其中通过测量表面电磁波进行检测。

11.  根据前述任一权利要求的方法，其中聚合酶包括附着于其上的可检测标记。

12.  根据权利要求11的方法，其中所述标记为荧光团。

13.  根据引用权利要求1～6之一时的权利要求11的方法，其中聚合酶进一步包括能量供体标记或能量受体标记，并且其中步骤(ii)通过测量荧光团和能量供体或受体之间的能量转移进行。

说明书测定多核苷酸序列
技术领域
本发明涉及测定多核苷酸序列或检测多核苷酸序列之间变异的方法。
背景技术
能够测定多核苷酸序列在科学上非常重要，这一点已被人类基因组计划所证实，该计划已经测定了人类基因组30亿个碱基的全部序列。然而，这些序列信息只代表普通人，很有必要了解其在基因水平上的个体差异。
常用的大规模DNA测序的主要方法是链终止法。该方法由Sanger和Coulson(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1977；74：5463-5467)首先提出，依靠在聚合酶链反应中，将四种三磷酸核苷的双脱氧衍生物引入新生多核苷酸链。引入后，双脱氧衍生物终止聚合酶反应的进行，然后通过凝胶电泳分离产物，分析显示特定双脱氧衍生物引入链中的位置。
尽管该方法被广泛使用，并且能够得到可靠的结果，但人们也意识到该方法费时费力，价格昂贵。而且，对于检测两个序列的差异(经常由单碱基变换构成，称为单核苷酸多态性，即SNP)来说，该方法并非有效方法。
核酸阵列近来成为测定多核苷酸序列和SNP的优选方法，通常用于杂交事件环境中(Mirzabekov，Trends in Biotechnology(1994)12：27-32)。大量基于阵列的测序方法使用标记的核苷酸，以获得加入的(杂交的)碱基的身份。这些阵列依靠对适当标记的碱基进行逐一识别，这在US-A-5634413中称为“单碱基”测序方法。这种“单碱基”方法使用两种类型的标记：放射标记和荧光标记。核苷酸的放射标记具有高灵敏度和低背景的优点。然而，放射标记的解析度较差。
荧光标记的核苷酸现已在许多技术中广泛应用。该核苷酸可通过聚合酶链反应逐一引入新生多核苷酸链。每种核苷酸(A、T、G和C)在3’位引入一个独特的荧光团，该荧光团可使用灵敏的荧光检测器(如电荷耦合检测器，CCD)检测。该荧光团通常还用作“封闭基团”，使引入的核苷酸不能作为底物以进一步增加核苷酸，因而可防止失控的聚合反应。通常使用“可去除的封闭基团”，该基团可通过能够导致核苷酸和封闭基团之间的共价键断裂的特殊处理而去除，使得测序反应继续进行。
可去除的封闭基团依赖于几种可能的去除处理手段，例如光化学、化学或酶处理。然而，这些手段已被证明难以控制和应用。局部环境(例如在一个阵列内)的差异可导致整个核苷酸，甚至几个核苷酸被除去，而不仅仅是除去预想的标记。这些现象对测序方法的精度具有严重影响，这是由于核苷酸的失控去除可导致测序数据不同相，序列数据破坏或不可用。
两种标记方法的另一缺点是重复序列可导致结果模糊。在Automation Technologies for Genome Characterisation，Wiley-Interscience(1997)，ed.T.J.Beugelsdijk，Chapter 10：205-225中已经注意到这个问题。
因此需要一种测定多核苷酸序列，特别是测定多核苷酸序列内变异(如测定SNP)，并且结合了放射标记的核苷酸的高灵敏度、低背景和荧光标记的标记的高解析度的改进的方法。而且，该方法与现有方法相比，应该能够高通量、自动化地进行，并且减少成本。
发明内容
本发明基于可通过测量聚合酶反应过程中聚合酶与靶多核苷酸的结合时间来测定多核苷酸序列这一发现。一般情况下，当没有核苷酸可引入时，聚合酶与靶多核苷酸的结合时间较短。因此，如果唯一可用的核苷酸非互补，聚合酶结合多核苷酸的时间就会缩短，这样就可检测并显示出靶多核苷酸的互补序列的身份。
根据本发明的第一方面，一种测定多核苷酸序列的方法包括：
(i)在适合聚合酶反应进行的条件下，将靶多核苷酸与聚合酶、核苷酸A、T(U)、G和C中的一种接触；
(ii)测定聚合酶结合靶多核苷酸以及随后解离的时间，由此确定聚合酶是否将核苷酸引入靶多核苷酸上；
(iii)可选地，使用其他核苷酸重复步骤(i)和(ii)，由此确定靶多核苷酸的序列。
根据本发明的第二方面，一种识别靶多核苷酸突变的方法，包括如下步骤：
(i)在适合聚合酶反应进行的条件下，将靶多核苷酸与聚合酶、核苷酸A、T(U)、G和C中的一种接触；
(ii)测定聚合酶结合靶多核苷酸以及随后解离的时间，由此确定聚合酶是否将核苷酸引入靶多核苷酸上，参照靶标的原始序列确定是否存在突变。
具体实施方式
本文所用术语“多核苷酸”或“靶多核苷酸”应从广义上解释，它包括DNA和RNA，包括修饰的DNA和RNA，以及其他杂合的核酸样分子，如肽核酸(PNA)。靶多核苷酸可为双链或单链。靶多核苷酸优选至少为部分单链，更优选具有与之相结合的引物序列，以使聚合酶能够附着于靶多核苷酸上，这一点能够为本领域技术人员所理解。
酶为聚合酶，可在互补链延伸过程中与靶多核苷酸相互作用，并且可为任何已知类型。例如，聚合酶可为任何DNA依赖的DNA聚合酶。如果靶多核苷酸为RNA分子，那么聚合酶可为RNA依赖的DNA聚合酶(即反转录酶)或RNA依赖的RNA聚合酶(即RNA复制酶)。引发酶也包含在此定义之中。
靶多核苷酸优选位于支持材料的特定位点。多核苷酸优选通过固定于固体支持物上而定位。适合用于固定多核苷酸的支持物对本领域技术人员来说是显而易见的，例如硅、玻璃或陶瓷材料都可使用。可以共价或非共价方式进行固定。例如，可使用共价接头分子。在优选的实施方案中，将引物固定于支持材料上，再将靶多核苷酸与该引物杂交。另外，靶多核苷酸和引物的杂交可在溶液中进行，随后或同时将引物或靶多核苷酸附着于支持材料上。
可将一种或多种靶多核苷酸固定于固体支持材料上。在优选地实施方案中，多种靶多核苷酸附着于支持物上。这些靶多核苷酸阵列可为任何已知密度，包括多分子、高密度阵列和“单分子”阵列。在单分子阵列中，可分辨出单个多核苷酸的位置，即可以监测发生于单个多核苷酸上的聚合酶反应。
在本测序方法的第一步中，可在杂交/聚合缓冲液中将靶多核苷酸与适当的引物接触。通常，缓冲液的温度应足够高，以破坏(或离解)存在于靶多核苷酸上的任何二级结构。冷却后，引物退火至靶标的互补处。然后将其与聚合酶接触，形成靶多核苷酸/聚合酶复合物。
在本发明的一个实施方案中，控制核苷酸的加入，以使不同的核苷酸依次加入聚合酶/靶标复合物中。例如，可加入dGTP并使其流过聚合酶/靶标复合物；然后测定聚合酶与多核苷酸结合的时间。未结合的dGTP流出反应位置，再加入另一种核苷酸。用这种方式，复合物形成的时间可与该时间内存在的特定核苷酸相关联，因而可测定多核苷酸序列。
该反应也可通过将聚合酶加至包括靶多核苷酸和核苷酸的反应混合物中起始。监测聚合酶与靶多核苷酸的结合和解离所需时间之后，除去未结合的核苷酸，引入下一种核苷酸继续进行测序步骤。
将核苷酸引入靶标上要求聚合酶与靶标结合的时间要长于不可能发生引入时的时间。因而，测量聚合酶与靶标的结合可显示出具有连续同种核苷酸的靶标区域上是否发生了引入事件，结合时间会成比例增加。因此，该方法可用于测定连续的同种核苷酸。
通过测量施加的辐射(applied radiation)的变化对聚合酶和靶多核苷酸之间的相互作用进行检测。可使用常规设备测量聚合酶和靶多核苷酸相互作用时发生的辐射变化。
在一个实施方案中，使用非线性成像系统测量聚合酶与靶多核苷酸的相互作用。
非线性成像系统为本领域所公知。一般地，物质的非线性极化可表示为：
              P＝X(2)E1+X(2)E2+X(3)E3+......
其中，P为诱导极化，X(n)为n阶非线性极化率(susceptibility)，E为电场矢量。第一项描述光的正常吸收和反射；第二项描述二次谐波发生(SHG)、和频及差频发生；第三项描述光散射、受激拉曼过程、三次谐波发生(THG)以及二光子和三光子吸收。
本发明优选的成像系统依靠检测起因于二次或三次谐波发生的信号。
使用二次或三次谐波发生(以下称SHG)的单分子解析已为本领域所公知(Peleg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999；95：6700-6704和Peleg等，Bioimaging，1996；4：215-224)。适当的系统记载于WO-A-02/095070。
在一个实施方案中，使用拉曼散射和/或LSPR技术在溶液相(即未将聚合酶和靶多核苷酸固定)中进行检测。
当光线照射于分子时，大量入射光子被弹性散射，而频率不发生变化。这叫做瑞利散射(Rayleigh scattering)。然而，一些入射光子(大约每107个光子中有1个)的能量与分子键的不同振动模式发生偶联。这种偶联导致一些入射光线被分子非弹性散射，散射光线的频率范围与入射光线的频率范围不同。这叫做拉曼效应。作出这种非弹性散射光线频率对强度的曲线，就可获得所研究分子的独特拉曼光谱。分析未知样本的拉曼光谱可获得样本的分子组成信息。
通过将拉曼活性分子置于结构金属表面附近(≤50)，拉曼效应可显著增强，该区域离表面呈指数规律衰减。将分子带到金属表面邻近一般通过将拉曼活性分子吸附至适当粗糙的金、银、铜或其他自由电子金属来实现。拉曼活性的表面增强可在金属胶体粒子、电介质基质上的金属膜，以及金属粒子阵列中观察到。不很清楚发生表面增强的拉曼散射机制，但被认为由以下因素相结合而产生：(i)金属的表面等离子共振，可增强局部光密度；(ii)在金属表面和拉曼活性分子之间形成导电复合物并随后跃迁。
拉曼效应可用于测量聚合酶和靶多核苷酸结合的时间。优选将靶标固定于金属表面，以增强拉曼信号。
在本发明优选的实施方案中，通过使用与聚合酶结合的金属胶体纳米粒子(如金或银纳米粒子)来使用表面增强拉曼散射(SERS)。关联于或结合于拉曼活性分子的拉曼增强金属纳米粒子可用作光标记。其一般概念在美国专利6,514,767中记载，其内容通过援引的方式纳入本文。在一个实施方案中，靶多核苷酸和聚合酶可通过搜索拉曼活性分子的特征拉曼光谱检测。因为单个拉曼光谱(从100至3500cm-1)可检测许多不同的拉曼活性分子，结合于或关联于聚合酶的SERS活性纳米粒子可以多重检测方式用于本发明环境中。
在一个单独的实施方案中，通过使用表面电磁波技术监测辐射变化。
使用表面电磁波技术的生物传感器(特别是表面等离子共振-SPR-传感器)是基于表面电磁波(SEW)对传播SEW的表面的邻近薄层的折射率的敏感性。在生物传感器中，使聚合酶和核苷酸流经含固定靶多核苷酸的表面。由于发生结合，表面上物质的积聚或重新分布会改变局部折射率，而折射率可由传感器实时监测。
已经提出几项利用SPR技术的方法并在生物传感器中实现。应用最广的方法基于Kretschmann-Raether构造，其可监测传感器反射的光强度。该技术被认为是最灵敏的技术之一，记载于J.Homola等，Sensors and Actuators B 54，p.3-15(1999)，其具有5×10-7折射率单位的检测极限。测量SPR相变化可使传感器的灵敏度进一步提高一个或两个数量级。该技术记载于Nelson等，Sensors and Actuators B 35-36，p.187(1996)和Kabashkin等，Optics Communications 150，p.5(1998)。已对现有的干涉测量装置如Mach Zehnder干涉仪进行改造，使之可通过相改变测量传感器表面的折射率变化。该技术公开于国际专利申请WO-A-0120295。该装置需要四种独立组分，并且对这些组分的亚波长相对替换敏感，因此对微小的机械和环境微扰敏感。机械上更为牢固的单块干涉测量装置记载于WO-A-03014715。
在优选的实施方案中，所使用的表面电磁波(SEW)传感器系统能够补偿缓冲液整体折射率的改变，或者使得整体折射率对干涉图样的影响与吸附于传感器表面的分析物对它的影响区分开来。因此，生物传感器包括：
相干辐射源，以产生入射波；
支持固定多核苷酸的载体表面，载体表面载有基质，能够支持表面电磁波(SEW)；
将入射波分为SEW和一次散射波的装置，其中SEW沿载体表面传播并与固定多核苷酸相互作用；
从SEW产生二次散射波的装置；以及
监测一次散射波和二次散射波之间干涉的检测器。
在该实施方案中，由单色激光产生的相干光束使用透镜来聚焦于能够支持表面电磁波(SEW)的金属膜边缘。光束透过安装有金属膜的玻璃棱镜。使用近红外激光作为光源。使用近红外光源的优点是金和银中的表面等离振子具有较长的传播长度，同时仍可使用常规光学器件来成像和照明。然而，其他单色光源也适合并且可以使用。
该系统记载于WO-A-04/020985，其内容通过援引的方式纳入本文。
在优选的实施方案中，聚合酶被标记。
本文所用的术语“标记”可从广义上解释。适合的标记对本领域技术人员来说是显而易见的。在优选的实施方案中，标记是荧光团。在一个特定的实施方案中，聚合酶制备成与GFP(绿色荧光蛋白)的重组融合体。它可以是野生型GFP或其光谱移动的变体(Tsien，Ann.Rev.Biochem.1998；67：509，US 5,777,079和US 5,625,048)。GFP可位于酶的N或C末端(如果聚合酶用于与“滑动钳”连接，则C末端较好)。或者，GFP分子可位于酶的任何位置，只要保持酶活性。还可采用其他标记。已经报道了多种标记分子的手段，如微球法(microsphere，Anal.Chem.(2000)72，15：3678-3681)，金纳米粒子法(J.Am.Chem.Soc.(2000)122，15：3795-3796)，银胶体粒子法(PNAS，(2000)97，3：996-1001)以及量子点法(quantum dot)。任何可清楚分辨聚合酶与靶多核苷酸和核苷酸相互作用的标记技术均可用于本发明的环境中。优选使用对酶与靶多核苷酸:核苷酸复合物的结合和/或脱离具有时间分辨力的标记。
优选地，建立固定靶多核苷酸阵列，在保持酶活性的条件下，使聚合酶与四种核苷酸中的至少一种一起流过该阵列。更优选地，该反应在流动池(flow cell)中进行。然后将阵列之中包括单一固定靶多核苷酸或多个相同的靶多核苷酸的各“阵列位置”以时间分辨率成像，以分辨酶与靶多核苷酸/核苷酸复合物之间的结合，优选从1至至少几千赫兹。
在另一个优选的实施方案中，聚合酶使用荧光共振能量转移(FRET)对标记。该系统记载于WO-A-01/25480。本领域技术人员可以理解，FRET对需要荧光团，以及可与该荧光团相互作用的、用作能量供体或受体的第二分子。该对之间的相互作用改变了所检测的荧光团的发射光谱。第二分子可为另一个荧光团，或其他任何适当的分子，如金属粒子。优选使用常规FRET对，其两个标记均为荧光团，所选荧光团满足一个荧光团的发射波长相应于另一个的激发波长的条件。荧光团在酶上的固定位置应该满足以下条件：当酶与多核苷酸结合形成三元复合物时，荧光团之间发生相对移动。根据FRET对的设计方式，FRET对的这种相对移动会导致该对的发射谱移。或多或少的来自供体的能量会与受体发生耦合，导致供体荧光的激发或衰减。该变化以高时间分辨率监测，获得所需信息。用于对荧光水平进行成像的设备优选电荷耦合设备(CCD)，其具有快速读出时间，并带有高空间分辨率的适当光学器件。
所需监测聚合酶和靶标相互作用的解析系统可根据“扫描”所研究的样本的需要进行修改。这种扫描特别可能存在于高解析系统，如单分子系统。在单分子实验所需的高水平空间解析的情况下，有效观察区域相应减小。由于“动态”分析通常需要对单个确定的区域进行连续“实时”监测，扫描会带来监测不连续的问题。由于会丢失相互作用事件，这种非连续监测与动态分析不能相容。因而在本发明的一个优选的方面，采用在5引物端标记的核苷酸；该标记用作可去除性封闭基团。这样，在采用高空间分辨率的情形下(如单分子阵列，这时观察区域通常只有100μm×100μm，芯片通常至少大100倍)，观察区域“移向”新位置，该区域使用适于去除封闭基团的辐射(如UV)照射。该手段确保了结合/动态事件只发生于“观察”区域。然后将“观察”区域在芯片上移动，通过只将所观察的区域暴露于足以使核苷酸去除封闭的辐射下，使选择性反应只发生于该区域。
在另一个独立的优选实施方案中，成像区域限制在单个流动池中，即在观察区域限制在100μm×100μm的事件中，流动池限制在大约与此相应的尺寸内。这样，在该实施方案中，核苷酸只注射到正在活动成像的流动池内。因而，多核苷酸阵列排布于其上的支持材料可由单个可寻址的流动池“阵列”构成。当成像区域在芯片上移动时，只将核苷酸注入成像区域所在的流动池。
在另一个实施方案中，聚合酶的结合通过嵌入分子和聚合酶上的染料/猝灭剂之间的共振能量转移检测。嵌入染料(如CYBRGreen，分子探针)只有在与双链引物-模板复合物结合时才会发出荧光。该信号可用于分辨靶多核苷酸的位置。聚合酶使用染料修饰，该染料为“受体”分子，能够从嵌入染料吸收并重新发射能量。或者，“标记”也可为猝灭剂。这样，结合/相互作用事件可通过观察能量转移引起的信号变化来监测。
本发明方法可用于测定靶多核苷酸的完全序列，也可用于测定多核苷酸的部分序列。该方法适于检测靶标中是否存在突变，例如，与对照序列或参照序列相比，确定是否发生替换、缺失或插入。
在优选的实施方案中，该方法可用于测定基因样本的单核苷酸多态性。本文所用术语“多态性”是指在不同的基因组或受试者之间出现两种或多种等位基因组序列(alternative genomic sequence)或等位基因。单核苷酸多态性(SNP)是单碱基对的变化。通常，SNP是在多态性位点一种核苷酸被另一种核苷酸替换。单碱基缺失或单碱基插入，同样产生单核苷酸多态性。
本方法用来测定位于推测的突变位点的核苷酸的身份，然后将该信息与参照序列比较，确定是否存在突变。
用以下实施例对本发明作示例性说明。
实施例
在本实验中，通过本领域公知的重组技术制备绿色荧光蛋白(GFP)和聚合酶的融合蛋白。
石英芯片(直径14mm，厚0.3mm)使用固定链亲和素(Xantec，Germany)修饰的平整的葡聚糖层旋转涂布(spin-coated)。使用装有全内反射(TIR)照明装置的正立显微镜(135TV，Zeiss)作为实验平台。峰值488nm、功率100mW的激光束(Melles Griot)通过1/4波片循环极化在定制棱镜中进行TIR。通过折射率匹配的凝胶将棱镜与芯片在光学上耦合。然后将带有O型密封环和透明光轴的流动池装于棱镜和石英芯片上。物镜通过流动池的透明上表面收集荧光信号。图像穿过带通滤镜进入薄型背照式电荷耦合器件(Andortechnologies)。
使用标准的亚磷酰胺(phosphoamidite)化学法合成两段寡核苷酸。定义为SEQ ID NO.1的寡核苷酸用作靶多核苷酸，定义为SEQ IDNO.2的寡核苷酸经过生物素化，用作引物。通过将10pM的SEQ IDNO.2溶于含100mM MgCl2的Tris缓冲液中形成的溶液注入流量池，将生物素化引物(SEQ ID NO.2)沉淀到链亲和素包被的芯片上，温育10分钟。
SEQ ID NO.1
CAAGGAGAGGACGCTGCTTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAG
SEQ ID NO.2
生物素-CTCTCCCTTCTCTCGTC
流动的缓冲液以500μl/min的速率流入流动池。然后将互补序列SEQ ID NO.1以1μM的浓度、5μl/min的流动速率注入流动池。在注入过程中，通过流动池内的铂加热电极将流动池加热至70℃维持几分钟，冷却至25℃。然后继续注入10分钟。注入结束后，流动缓冲液继续以500μl/min的流动速率流过该系统。10分钟后，在缓冲液中以500μl/min的流动速率注入0.4mM dATP(8μl)，开始测序反应。开始注入后一秒钟，以最大帧率(每秒30帧)记录到一系列CCD图像，并存储包含最高信号密度的图像。然后以0.4mM注入互补核苷酸dCTP，注入后一秒钟，再次存储一些CCD图像。
当以“时间解析”的方式成像时，与非互补核苷酸(图1b)相比，互补核苷酸产生强信号(图1a)。