细胞培养微室 【技术领域】
本发明申请涉及能够边对细胞的状态进行显微镜观察，边以单细胞单位进行培养的新型细胞培养微室。
背景技术
以往，为了观察细胞的状态的变化和细胞对药物等的应答，一直观察细胞集团的值的平均值如同是一细胞的特性。但是，实际上细胞在集团中的细胞周期相互一致是罕见的，各个细胞以不同的周期表达蛋白质。为了解决这些问题，开发了同步培养等方法，但由于培养的细胞的由来不是来自完全相同的一细胞，因此培养前地由来细胞的各个遗传基因的不同有可能产生蛋白质表达的不同，当实际解析对于刺激的应答结果时，其波动是来自于细胞的反应机构自身普遍具有的应答的波动，还是来自于细胞的不同(即遗传信息的不同)，要搞清这一点是困难的。此外，由于相同的理由，由于对于细胞株一般也不是完全从单细胞培养，因此对于刺激的应答的再现性是否因各个细胞的遗传基因的不同而波动，要搞清这一点是困难的。此外，由于对于细胞的刺激(信号)包括细胞周边的溶液含有的信号物质、营养、溶存气体的量所给予的刺激和与其他细胞的物理接触产生的刺激2种，因此实际情况是对于波动的判断难。
另一方面，以往，在生物技术的研究领域中进行细胞的观察时，通常是暂时将在大型培养器中培养的细胞群的一部分从培养器中取出，固定到显微镜上进行观察，或者用塑料容器将显微镜整体围住，对温度进行管理，在其中使用小的另外的容器，对二氧化碳浓度和湿度进行管理，进行显微镜观察。此时，一直努力通过边培养细胞边进行不再新鲜的培养液与新鲜的培养液的交换，使溶液条件保持一定。例如在特开平10-191961中公开的方法中，循环泵在比基材的上端缘高度高的水平和比下端缘高度低的水平间进行将相对于基材表面的培养基水平的提高、下降的操作，如果降低到上述低水平则供给培养基，如果上升到上述高水平则排出培养基，通过该机构使营养状态保持一定。此外，在专利公开平8-172956中，在培养容器内插入将新的培养基导入培养容器的导入管、将培养容器的培养基排出到外部的排出管和将培养容器的气体部和泵连通的气管的各一端，在上述导入管、排出管和气管各自的管路上设置阻止细菌侵入培养容器内的过滤器，成为使培养槽的营养状态保持一定的构成。但是，在所有发明的情况下，边对培养细胞的溶液环境和细胞间的物理接触进行控制边进行培养的例子尚属未知。
因此，作为特原2000-356827，该申请的发明者解决了这些问题，发明如下技术并申请专利：重新只选择特定的单细胞，以该单细胞为细胞株进行培养的技术；观察细胞时对细胞的溶液环境条件进行控制并且将容器中的细胞浓度控制为一定的技术；或者边使相互作用的细胞特定化边培养观察的技术。
但是，本发明者新提出的微室具有目前为止所未知的构成的特征，由于使用玻璃微细加工技术等形成微室形状，因此在开始培养前可以预先在玻璃表面上作成形状，利用其形状培养细胞。因此，将决定各微室间相互作用的各微室间连接的流路的图案根据培养后的状态而柔软地变化是困难的。此外，根据培养的经过使各微室自身的形状变化也是困难的。
此外，通过利用集束光等的热进行加热、变形的技术，在比红外光的波长小的三维空间的局部区域中加热是不可能的。
因此，本发明申请对于本发明者们开发的上述微室进行了更为详细的研究，其课题在于提供可以根据培养的过程任意变化微室的形状的新型微室，此外，其课题还在于提供能够局部地加热纳米水平的微细区域的新型细胞培养微室。
【发明内容】
作为解决上述课题的技术，本发明申请提供细胞培养微室，该细胞培养微室由在对于特定的波长透明的基板上配设的对于上述特定的波长具有吸收的区域、在该吸收区域外对于上述特定波长不具有吸收并且由具有比水的沸点低的温度的熔点的固体，例如常温下为固体，通过加热而溶解的物质的区域构成，此外，提供具备该微室并且具有上述特定的波长的光照射装置的细胞培养装置。
例如，具体地说，在本发明申请的细胞培养装置中，具有向上述细胞培养微室的特定的区域照射上述特定的波长的集束光的装置。这里，对于上述特定的波长不具有吸收并且固体的物质区域通过照射上述特定波长的集束光，在吸收区域局部地发热，该热使与吸收区域邻接存在的固体物质的区域局部地溶解分散，伴随着集束光的移动而形成空间。
此外，为了提供对纳米水平的微细区域进行局部加热的装置，通过微细描画使具有上述吸收的吸收区域的图案形成纳米水平的微细形状，通过向该图案照射集束光，可以局部地对限定于薄膜层的线宽(line width)程度的比照射光的波长小的微细区域进行加热。
此外，在上述细胞培养微室上面具有被覆其上面、具有细胞不能通过程度粗细的孔眼、对于上述集束光在光学上为透明的半透膜以使细胞不从室内逃逸，其上面具有使培养液循环的溶液交换部液体交换成为可能的装置。
【附图说明】
图1为表示本发明申请的基本构成的一例的模式图。
图2为表示图1所示的培养微室的构成的模式图。
图3为表示观察图1所示的培养微室，进行集束光局部过热的装置构成的一例的模式图。
图4为说明采用集束光局部过热进行的培养微室加工过程的模式图。
图5为表示培养微室的构成的一例的模式图。
图6为表示培养微室的构成的一例的模式图。
图7为表示培养微室的构成的一例的模式图。
图8为说明采用集束光局部过热进行的培养微室加工过程的一例的显微镜照片。
图9为表示培养微室的构成的一例的模式图。
图10为表示培养微室的构成的一例的模式图。
图11为表示培养微室的构成的一例的模式图。
图中的符号表示如下内容。
100：细胞培养微室
101：光学上透明的基板
102、601、602、603：具有光学吸收的薄膜层
103、501、502：光学上透明，并且为低熔点温度、对于细胞等不具有毒性的物质的区域
104：细胞等试料
105、801：孔
106：光学上透明的容器
107、108：管
301：光源
302、309、312：滤光器
303：集光透镜
304：具有温度调节功能的平台
305：物镜
306：可动分色镜
308：光源
310：分色镜
311：镜
313：照相机
315：平台移动用马达
316：培养液槽
317：供给装置
318：泵
319：废液滞留部
401：箭头
402：激光集束光
403、803、804、805、806、807、1104：隧道
701：具有吸光的微粒
802 Nd：YAG激光集束光
911、1011：圆形状的孔
912：四方形状的孔
1012：星型形状的孔
1102：采用微细加工技术形成的吸光层的图案
【具体实施方式】
本发明申请具有如上所述的特征，以下对其实施方式进行说明。
首先，使用图1的实施例对本发明申请的细胞培养微室的基本构成的一例进行说明。例如，如图1所示，在本发明申请的细胞培养微室100中，在滑动玻璃等光学上透明的基板101上配置铬的蒸镀层等作为具有光学吸收的吸收层的薄膜层102。当用透过光进行观察时，优选薄膜层102的膜厚为不完全吸收光的程度，并且薄到无斑驳的程度。例如，当为铬时，在膜厚50下，为可见光范围的透过光70％左右。然后，在吸光薄膜层102上层叠琼脂糖等光学上透明并且在低熔点温度下对细胞等不具有毒性的物质的区域103。该区域103的物质如本发明申请中规定的那样，其为对于特定的波长不具有吸收，并且具有比水的沸点低的温度的熔点的固体物质。琼脂糖为其代表例，但优选一般其熔点为45℃以下的物质。特别当使用琼脂糖时，与细胞无粘接性，另外对于细胞的信号物质也无影响，因此对于细胞而言不仅无害，而且对培养实验数据的影响小，因此认为最适。在上述区域103中，在形成区域103时用铸模形成导入细胞104等试料的多个孔105，在各孔105中培养各个特定的细胞104。此时，例如，在铬的蒸镀层等的吸光薄膜层102表面上实施硅烷化处理，在其上涂布胶原等的细胞吸附性的因子进行固定，可以进行使上述细胞104能稳定地接着到孔105的底面的另外的加工。此外，如该实施例所示，通过用纤维素等光学上透明的半透膜109将区域103的上面覆盖，可以防止来自外部的微生物等的污染，并且也可以防止细胞从孔105中逃逸。此时，例如区域103为琼脂糖，半透膜109为纤维素时，共同使糖链的一部分开环，分别修饰在-CHO残基上具有氨基末端的抗生物素蛋白、生物素，通过抗生物素蛋白-生物素键，可以使半透膜109和区域103结合。在培养细胞104时，当有必要进行培养液的循环时，可以用将区域103全部覆盖的形状的光学透明容器106遮盖，从管107导入溶液，从管108回收废液。
图2表示孔105的配置的一例，孔105形成于区域103，即琼脂糖等光学上透明并且具有低熔点温度，对于细胞等不具毒性的物质的区域。从图中可以看到，多个孔105配置在区域103上，可以将细胞导入其中进行培养。
图3表示细胞培养微室100的用于导入用于加工上述区域103的形状的集束光的装置的构成的一例。在该装置中，为了边用细胞培养微室100培养细胞等试料边对其状态变化进行观察，其具有显微镜观察系统、培养液循环系统，此外，为了在培养途中使细胞培养微室100的形状加工变形，其具有集束光照射系统。从图3可以看到，在显微观察光学系统的光路上配置培养微室100，供给溶液的培养液供给-废弃部与该培养微室100相连。即，首先，显微观察光学系具有如下的构成。用滤光器302将从光源301照射的光调整为特定的波长，通过集光透镜303集光，照射到培养微室100上。照射的光作为透过光用于用物镜305进行的观察。培养微室100内部的透过光像被镜311反射而通过滤光器312后，被照相机313诱导，在照相机的受光面上成像。因此，培养室100的材料相对于滤光器302选择的波长的光，优选为光学上透明的材料。具体地说，使用硼硅酸玻璃、石英玻璃等玻璃，聚苯乙烯等树脂或塑料，或硅基板等固体基板和琼脂糖等高分子。此外，特别是当使用硅基板时，考虑将波长900nm以上波长的光用于观测。此外，如在上述吸光层102中叙述的那样，优选选择性使用光吸收不足100％的膜厚或不具吸收的波长。
此外，从光源308照射的光也在滤光器309处进行波长选择，然后通过分色镜310诱导到物镜305上，作为培养微室100内部的荧光观察的激发光使用。从培养微室100发出的荧光再次被物镜305集光，用照相机313只能观察到被滤光器312切割激发光后的荧光和透过光。此时，通过调整滤光器302、309、312的组合，可以用照相机313只观察透过光，或者只观察荧光，或者同时观察透过光像和荧光像。
在光路内还具有通过可动分色镜306将激光光源307产生的激光导入物镜305中的机构。该激光通过物镜305成为集束光，可以对培养微室100进行局部加热。当使集光点移动时，通过使可动分色镜移动，可以使培养微室100内的激光的集束位置变动。作为该激光的波长，优选不具有水的吸收，不具有光化学作用的波长。如果为例如Nd：YAG激光的1064nm等时，对于水、玻璃、琼脂糖等无显著的吸收，选择性地只在铬薄膜层产生激光吸收，只在吸收了光的铬薄膜层的光集束点附近局部地放热。由于该加热，如参照图4在后段中说明的那样，可以在培养过程中使细胞培养微室100的形状加工变形。
此外，用照相机获得的图像数据通过图像处理解析装置314解析，以各种解析结果为基础，可以对在X-Y方向自由移动的平台移动用马达315进行驱动以对可动分色镜306或载置培养微室100的具有温度调节功能的可动XY平台304的位置进行控制。这样，可以对细胞的形状进行认识，在认识后对该细胞进行追踪，或者长时间使其位于图像的中心，或者通过对与物镜的距离进行调节使图像的中心(ピント)与特定的细胞适合。或者，以一定时间的周期对可动分色镜306、和载置培养微室100的带有温度调节功能的平台304进行控制，或者以一定间隔驱动平台移动用马达315。
以下，对培养液供给-废弃部进行说明。供给装置317具有从培养液槽316将多个种类、浓度不同的培养液供给到培养微室100中的功能，通过供给装置317供给的培养液通过供给装置内的温度调节机构对液温进行调节，进而通过溶存空气交换机构调整溶存气体的成分，边调节流速边供给到培养微室100中。容器100的培养液还可以使用泵318吸引容器内部的溶液。吸引的溶液被送入废液滞留部319。
以下，使用图4对实际上通过激光集束光使区域103的形状变化的过程进行说明。通过物镜305而照射到培养微室100中的激光集束光402在吸光层102被选择性地吸收，在照射位置附近局部地产生热。此时，由于在其他的区域101、103不存在激光集束光产生的吸收，因此不存在直接的吸收产生的发热，但由于在集光点的吸热层102的局部发热，附近的区域103局部地溶解，溶解的成分在培养液的水溶液中扩散。在该状态下，如果使集束光的位置沿箭头401的方向移动，区域103在吸光层102的附近选择性地溶解，形成隧道403。此时，隧道的直径的大小依赖于照射的激光的直径、强度、移动速度，可以使其变化。
图5为表示培养微室的另一基本构成的1个的实施例。在该实施例中，使在图1的实施例中构成物为1个的区域103由熔点不同的2个区域501和502构成。这样，例如，当使用区域501的熔点比区域502的熔点低的构成时，通过适当调节集束光的加热强度，可以选择性地只将区域501排除。此外，通过提高集束光强度，也可以使区域501、502一起溶解。在该实施例中，将不同熔点的区域层叠为2相，但还可以层叠3层以上不同熔点的材料。此外，还可以在三维空间分割区域，配置不同熔点的区域。此外，通过调节加热集束光的强度，可以阶梯式选择溶解区域。具体地说，可以通过层叠例如具有不同熔点的低熔点琼脂糖而实现，也可以使用琼脂糖或塑料等不同的材料。
图6也是表示培养微室的另一基本构成的1个的实施例。在该实施例中，在区域103中特定高度的断层上配置吸热层601、602、603。因此，该实施例的特征在于：当通过集束光的加热而使吸热层601、602、603发热时，保持该层的区域103也一起溶解，因此可以在溶解的同时将吸光层除去。此外，通过吸光、发热而制作的隧道的高度依赖于区域103中的吸光层的位置。
图7的实施例也与图6相同，为在区域103中构成吸光层。但是，在该实施例中不是吸光层，而是使用具有吸光的微粒701。这样，例如，在区域103的一定高度上以层状配置微粒701，在特定的高度以层状将区域103溶解，或者通过使微粒701不分散到区域103的整体，也可以使区域103的照射了集束激光的区域全体溶解。
图8表示实际上使用集束光将区域103溶解的结果的一例。在滑动玻璃上蒸镀厚50nm的铬，然后在其上面涂布了胶原的基板上层叠厚50μmm的琼脂糖，在琼脂糖凝固前用铸模，使用50μm×50μm的铸模形成孔801，对这样得到的培养微室81照射Nd：YAG激光集束光802使其移动，如基板82那样挖掘出孔。照射后，如基板83那样，形成直径5μm左右的隧道803。通过同样地进行处理，可以顺次地如基板84中所看到的那样挖掘出隧道804，如基板85那样挖掘出隧道805，如基板86那样挖掘出隧道806。此外，还可以如在基板87中看到的那样，使形成的隧道连接而形成隧道807。
图9和图10为用于表示不仅能在培养微室100中挖掘隧道，而且可以使培养微室的孔的形状改变的实施例。在图9中，表示可以将圆形状的孔911改变为四方形状的孔912。此外，在图10中，表示可以将圆孔1011改变为星型形状1012。
图11对通过微细加工技术形成比集束光的波长微小的吸光区域而可以在比光的波长小的区域局部地发热、溶解的实施例进行说明。采用微细加工技术形成的吸光层的图案1102的线宽比微米小时，例如若照射1064nm波长的集束激光，只选择性地在吸光区域的图案处产生光的吸收，可以只在比光的波长小的区域局部地进行加热，形成隧道1104。只用通常的使用集束光的加热只能将发热源集束到光的波长程度，因此这对于形成亚微以下的形状的隧道等是有效的方法。同样地，当使用亚微以下的吸光微粒时，也具有同样的效果。
当然，本发明申请并不限于以上的例示说明。其细节部分的实施方式可以各种各样。
如以上详细说明的那样，根据本发明申请，使以往不可能的边对生物细胞等进行培养并根据其培养过程使容器的形状变化成为可能。此外，可以在光的波长以下的区域使物质局部地溶解，形成结构。