细胞是组成有机体的最小基本单位，细胞在生命活动过程中具有特定的细胞
形态，可以说细胞形态是细胞功能的一种表现方式。比如细胞分裂、活动过程中
常发生形态的改变。细胞的形态是由细胞骨架(cytoskeleton)结构决定的：细胞接
受外来的信号，包括细胞与细胞间，细胞与基质间的接触这些信号，通过细胞内
的信号传导通路传入胞内，使细胞骨架蛋白发生磷酸化和去磷酸化，从而决定细
胞的形态。在这一过程中，血管舒张剂刺激磷蛋白(Vasodilator-stimulated
Phosphoprotein，简称为“VASP蛋白”)是连接cAMP和cGMP依赖的细胞信号
传导通路和细胞骨架的桥梁分子，在将信号传递到细胞骨架上使细胞形态发生改
变这一途径上起了重要的作用。
Ena/VASP基因家族包含了多个VASP基因，这些基因在序列上有保守性。
目前发现的基因家族成员有：(1)人类VASP基因，编码46/50 KD的蛋白质；(2)
狗的VASP基因，与人VASP基因高度同源(Reinhard M，et al.EMBO J.
1992，11(6)：2063-2070)；(3)果蝇Ena基因，与人VASP基因同源(Ahern-Djamali SM，
et al.Mol Bio Cell.1998；9：2157-2171)；(4)小鼠的mEna基因，与果蝇Ena基因及
人VASP基因同源性很高，还有mEVL基因，称为VASP类基因，与人VASP基
因也有较高的同源性(Gerter FB，et al.Cell 1996；87：227-239.)；(5)大鼠RNB6基
因，是神经组织中克隆到的mEVL同源基因(Othta S，et al.Biochem Biophys Res
Com.1997；237(2)：307-12.)。这些基因构成了Ena/VASP家族。
Ena/VASP基因家族不仅在基因序列上有很高的同源性，而且在蛋白质序列
和功能上也有很高的保守性，其蛋白质的结构特征是：中间区段富含Pro，并具
有以XPPPPP(X指G，P，L，S，A)为特征的结构域(这是与SH3和[肌动蛋白]抑制蛋白
(profilin)结合的区域)，而且VASP磷酸化位点(Ser157，Ser239和Thr278)也位于中
间区域。VASP的N末端与斑联蛋白(zyxin)和粘着斑蛋白(vinculin)结合，C末端
形成一个伸展的带高电荷的α-螺旋，对维持VASP功能完整起着重要作用。
Ena/VASP家族成员N末端和C末端相当保守，其差异主要在于中间富含Pro区
域的长短及结构(Gerter FB，et al.Cell 1996；87：227-239.)。
Ena/VASP基因的功能及其潜在的临床应用价值主要有以下几个方面：
1.参与胚胎中枢神经系统的发育
Ena在果蝇中枢神经发育过程神经元轴突的形成中，调节细胞骨架改变起着
很重要的作用。Ena失活导致突变果蝇胚胎死亡，表现在神经系统神经轴突结构
异常(Ahern-Diamali SM，et al.Mol Bio Cell.1998；9：2157-2171)。此外，Ena突变
对果蝇胚胎的致死性突变可以被人的VASP基因表达所补救，说明Ena/VASP基
因家族成员的作用是相近的。
在大鼠中克隆的Ena/VASP基因家族的一员RNB6，是通过DDRT-PCR在胚
胎中克隆的，与小鼠EVL基因高度同源。该基因在胎脑的表达较成年大脑的表达
量要高，在胚胎发育过程中RNB6在脑中的表达逐渐增高，在产后一天达到最高，
而后就开始降低，提示RNB6在中枢神经发育过程中可能在控制中枢神经细胞活
动，包括神经纤维延伸中起重要作用(Othta S，et al.Biochem Biophys Res Com.
1997；237(2)：307-12.)。
2.参与动脉血管再狭窄的病理过程
冠状动脉粥样硬化是常见和严重的心血管疾病，死亡率很高。目前临床上除
了内科保守治疗外，外科手术治疗对于挽救生命是非常重要的。术后新生内膜成
纤维细胞增生常导致再狭窄，带来严重的临床问题。目前对再狭窄的机制还不清
楚，但平滑肌细胞的增生可能是一个因素，其中VASP扮演了一个重要角色。
VASP是cGMP-PK I的底物，是心房尿钠排泄因子(ANF)和一氧化氮(NO)信号通
路上的分子，可能在血管调节和再狭窄形成中起重要作用，提示这一信号传导通
路可以作为调节和控制再狭窄的靶位点(Monks D et al.Eur J Clin Invest.
1998；28(5)：416-23)。
VASP还是抑血管活动药物(inhibitary vasoactive agents)的重要作用靶，是调
节体内血管壁细胞活动的重要组成部分(Markert T，et al.Basic Res Cardiol
1996；91(5)：337-343.)。
3.与血小板活化有关
血小板是血液凝固必不可缺的成分。而且血小板的异常聚集和活化与动脉粥
样硬化的发生也有密切的关系。血小板活化过程，包括血小板粘附、聚集和释放，
牵涉到了血小板细胞的变形，与细胞骨架的重组有非常密切的关系。不同活化状
态的血小板中的VASP磷酸化程度是不同的，表明VASP参与了血小板粘附聚集
的活化过程(Opper C，et al.Biochem Pharmacol 1997；54(9)：1027-35.Pohl U，et al.
Am J Physiol 1994；266(2Pt2)：H606-12.)。
VASP可被Ser/Thr磷酸化酶(PP)PP1，PP2A，PP2B和PP2C脱磷酸化，
PP1和PP2A的抑制剂冈田(软海绵)酸(Okadaic acid)与人血小板一起孵育，可引起
磷酸化VASP增加，抑制血小板功能。血小板抑制剂通过提高cGMP和cAMP水
平，从而在完整的血小板中协同磷酸化VASP蛋白抑制血小板功能(Able K，et al.
FEBS Lett 95；370(3)：184-8)。
4.与微生物感染有关
某些致病微生物如牛痘病毒、李斯特氏菌(Listeria)和志贺氏杆菌(Shigella)感
染细胞后，可引起肌动蛋白(actin)微丝聚集。这一过程与牛痘病毒体的包装、分
泌和传播，以及李斯特氏细菌和志贺氏杆菌在细胞内活动、细胞间传播所需的丝
状假足形成有关。肌动蛋白微丝的聚集需要VASP的参与。VASP作为桥梁分
子，一边与这些病原体表面蛋白的ABM-1一致序列((D/E)FPPPPX(D/E)，式中X＝P
或T)结合，一边与[肌动蛋白]抑制蛋白和斑联蛋白或粘着斑蛋白蛋白结合，参与
肌动蛋白的组装(Zeile WL，et al.PNAS 1998；95：13917-13922)。
5.肿瘤转移
肿瘤细胞在转移过程发生细胞形态和骨架的改变(Voura EB，et al.Cell Tissue
Res.1998；293(3)：375-387)，这一过程与肌动蛋白微丝解聚，γ-肌动蛋白表达减低
及粘着斑蛋白表达减低有关(Suzuki H，et al.Int J Oncol 1998：12(5)：1079-1084.)，提
示肿瘤细胞的转移过程VASP表达或磷酸化程度可能存在异常。
然而，在本申请之前还没有公开过本发明涉及的新的Ena/VASP类蛋白。
本发明的第一目的就是提供一种新的人基因hEV1(Genbank Accession
No.AF112209)，该基因是一个Ena/VASP类基因。
本发明的第二目的是提供一种新的人蛋白hEV1。
本发明的第三目的是提供一种生产上述的新的人Ena/VASP类蛋白和核酸序
列的方法。
本发明还提供了这种Ena/VASP类蛋白多肽和编码序列的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括：编码
具有人hEV1蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.
6中从核苷酸第120-1370位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者
所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.6中从核苷酸第120-1370
位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸
序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.6中从核苷酸第120-1370位
的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离出的人hEV1蛋白质多肽，它包括：
具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或
其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
在本发明的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。
在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在一个实
例中该宿主细胞是大肠杆菌；在另一实例中，该宿主细胞是真核细胞。
在本发明的另一方面，还提供了一种产生具有人hEV1蛋白质活性的多肽的
方法，该方法包括：
(1)将编码具有人hEV1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控
序列，形成人hEV1蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.6中从核苷
酸第120-1370位的核苷酸序列有至少70％的同源性；
(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成人hEV1蛋白的重组细胞；
(3)在适合表达人hEV1蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；
(4)分离出具有人hEV1蛋白活性的多肽。
较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.6中第120-1370位的
序列。
本发明还提供了与hEV1蛋白多肽特异性结合的抗体。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA
或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经
与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人hEV1蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人hEV1
蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中第120-1370位核苷酸序列及
其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的编码框第120-1370位
核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生
的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.6中第120-1370位核苷酸序
列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.7所述的序列。该术语还
包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.6中从核苷酸
第120-1370位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.6
中从核苷酸第120-1370位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，
更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人hEV1相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6中开
放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90
个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或
取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更
佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少
20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。
纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽
的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人hEV1蛋白或多肽”指具有hEV1蛋白活性的SEQ ID
NO.7序列的多肽。该术语还包括具有与人hEV1相同功能的、SEQ ID NO.7序
列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地
1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在
C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更
佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取
代时，通常不会改变蛋白质的功能，又比如，在C末端和/或N末端添加一个或
数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括hEV1蛋白的活性片段
和活性衍生物。
本发明人hEV1多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异
本、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人hEV1 DNA杂交的
DNA所编码的蛋白、以及利用抗人hEV1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发
明还提供了其他多肽，如包含人hEV1多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长
的多肽外，本发明还包括人hEV1多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人hEV1
多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少
约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续
氨基酸。
在本发明中，“hEV1保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.7的氨基酸序列相
比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近
的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产
生。
表1
最初的残基
代表性的取代
优选的取代
Ala(A)
Val；Leu；Ile
Val
Arg(R)
Lys；Gln；Asn
Lys
Asn(N)
Gln；His；Lys；Arg
Gln
Asp(D)
Glu
Glu
Cys(C)
Ser
Ser
Gln(Q)
Asn
Asn
Glu(E)
Asp
Asp
Gly(G)
Pro；Ala
Ala
His(H)
Asn；Gln；Lys；Arg
Arg
Ile(I)
Leu；Val；Met；Ala；Phe
Leu
Leu(L)
Ile；Val；Met；Ala；Phe
Ile
Lys(K)
Arg；Gln；Asn
Arg
Met(M)
Leu；Phe；Ile
Leu
Phe(F)
Leu；Val；Ile；Ala；Tyr
Leu
Pro(P)
Ala
Ala
Ser(S)
Thr
Thr
Thr(T)
Ser
Ser
Trp(W)
Tyr；Phe
Tyr
Tyr(Y)
Trp；Phe；Thr；Ser
Phe
Val(V)
Ile；Leu；Met；Phe；Ala
Leu
发明还提供人hEV1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人hEV1多肽
的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，
或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各
种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法
或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如
D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)
的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如
乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加
工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖
基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷
酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修
饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘
粒等。在生产本发明的人hEV1多肽时，可以将hEV1编码序列可操作地连于表
达调控序列，从而形成人hEV1蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些
部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为
前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于
多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果
核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。
一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中
相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主
细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆
虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS
细胞等。
本发明还提供了对人hEV1特异的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。
在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对hEV1特异的抗
体。例如，将提纯的人hEV1基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多
克隆抗体。同样，表达人hEV1或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫
而产生抗体。根据本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可以
用杂交瘤技术制备(例如，Kohler et al.，Nature 256：495，1975；Kohler et al.，Eur.J.
Immunol.6：511，1976；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6：292，1976)。本发明的抗体
包括可以阻抑hEV1功能的抗体，也可以是不影响人hEV1功能的抗体。每一类
抗体都可以通过对人hEV1基因产物的片段或功能域致免疫而产生，而人hEV1
基因产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式
的hEV1基因产物结合的抗体，可以通过用在原核细胞例如E.coli中产生的基因
产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽结合的
抗体，可以通过用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物的来免疫动物
而得到。
本发明的人hEV1抗体可以用来鉴定表达人hEV1蛋白或多肽的细胞，如
Jurkat T细胞。例如，可以用一种可检测的分子例如荧光素异硫氰酸(FITC)来标
记hEV1特异抗体，然后让人hEV1特异抗体与细胞样品接触，再用荧光显微镜
或流式细胞仪检测出与hEV1特异抗体结合的细胞。
除了在细胞表面检测人hEV1外，还可以用Western印迹技术分析该蛋白质。
细胞裂解液可以从培养细胞或取自病人的组织标本如肾上腺中提取，并溶解在含
有去污剂的裂解缓冲液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞提取物(同
时将提纯的人hEV1多肽作为阳性对照)，接着通过电泳杂交将其转移到硝酸纤维
素上。为了用Western印迹免疫探测hEV1多肽，可以使用典型的抗体结合检测
方法，例如放射自显影或碱性磷酸酶检测方法。并可使用免疫接种血清或不相关
的单克隆抗体作为非特异反应的对照。
还可用Nothern印迹法技术分析hEV1基因产物的表达，即分析人hEV1的
RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。hEV1基因表达调控可以在用细胞因子
如IFN-α、IFN-γ处理细胞后，分析细胞中hEV1的转录水平来加以评价。
人hEV1 DNA的Nothern印迹分析和人hEV1特异抗体的Western印迹分析
还可以联合使用，以证实人hEV1在生物样本中的表达。人hEV1 DNA还可以用
于Southern印迹分析或原位杂交分析，以将该基因定位于染色体上，并可进行遗
传连锁分析以找出其它可能的疾病相关基因。
此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有hEV1
核苷酸编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样
品中是否存在编码hEV1的核酸分子。
本发明还提供了检测样品中是否存在hEV1核苷酸序列的方法，它包括用上
述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR
扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于hEV1核苷酸编码序列，并可位于该编
码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
此外，根据本发明的hEV1核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或
表达蛋白质的同源性基础上，筛选hEV1同源基因或同源蛋白。
为了得到与hEV1基因相关的人cDNAs或基因组DNAs的点阵，可以用DNA
探针筛选人cDNA或基因组DNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用32P对
hEV1的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自
人肾上腺组织的文库。来自参与内分泌的其它人体组织或特定人体细胞株的
cDNA文库也可用于筛选目的。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的
方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，
例如购自Clontech，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与hEV1相关的基因家
族的核苷酸序列。
根据核苷酸相似性筛选hEV1同源物可以按如下方法完成。人体肾上腺cDNA
文库，例如Clontech Cat.#7430-1(Clontech，Palo Alto，Cal.)可以使用一段包含
hEV1基因序列的全部或部分的随机引物化DNA探针筛选。要完成对与hEV1序
列至少有70％同源性的DNA插入序列的克隆的鉴定，可以使用杂交温度为55℃
的杂交液，然后用0.5×SSC和0.1％SDS清洗。用这种方法识别的克隆的DNA
插入序列可以进一步用DNA限制性内切酶分析和DNA测序来评价它与hEV1基
因的相似性。组织表达的分布可以用上述的Northern印迹法技术分析。
hEV1同源物也可以用针对hEV1蛋白或多肽的抗体来识别。例如，可以用
标准的方法对商品化的或者用已知方法构建的，来自细胞或者组织例如肾上腺的
表达文库进行筛选。将文库倒入平皿，菌落转移到一张硝化纤维素膜上，使表达
的重组蛋白结合到膜上。然后就可以用特异性的人hEV1抗体进行典型的抗体结
合和检测。用这种方法所识别出克隆中的DNA插入序列，可以进一步用DNA限
制性内切酶分析和DNA测序进行分析以评价它与hEV1基因的相似性。新识别的
基因的组织表达分布可以同样地按上述方法进行分析。
本发明的人hEV1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或
人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，
尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已
知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，
常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接
在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常
是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离
得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通
常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
在本发明的一个实施例中，通过RT-PCR而获得了hEV1的全长编码序列。
通过同源检索发现，本发明的新蛋白具有与已发表并被确认为EVL的基因高度同
源的序列，并且本发明的新蛋白具有Ena/VASP基因家族高度保守的氨基酸序
列。进一步的研究表明，本发明与已发表并被确认为小鼠EVL基因具有高度同源
性(小鼠EVL基因属于Ena/VASP基因家族)，此外与其他Ena/VASP家族成员也
存在较高同源性。所以，本发明的hEV1基因属于Ena/VASP基因家族，是小鼠
EVL基因的一个同源基因而具有相似的功能。
在附图中，图1为本发明的人hEV1(hEV1.seq)与小鼠Ena/VASP基因核酸序
列(mEVL_mus，GenBankAccessionNo.U72519)的同源比较(FASTA)图。其中，相
同的核苷酸用“|”标出。在hEV1.seq序列上方的数字为SEQ ID No.6中的核苷
酸编号。
图2为本发明的人hEV1蛋白与其他Ena/VASP基因家族成员的氨基酸序列
的同源比较(PILEUP)图，其中mEna+_mus：小鼠神经变异mEna+蛋白(SwissProt
Accession No.P70431)；mEna++_mus：小鼠神经变异mEna++蛋白(SwissProt
Accession No.P70432)；mEna+++_mus：小鼠神经变异mEna+++蛋白(SwissProt
Accession No.P70433)；mEna_mus：小鼠mEna蛋白(SwissProt Accession No.
P70430)；mEVL_mus：小鼠Ena-VASP类蛋白(SwissProt Accession No.P70429)；
RNB6_rat：大鼠RNB6蛋白(SwissProt Accession No.O08719)；hEV1_hum：人
Ena/VASP类蛋白；mVASP_mus：小鼠VASP蛋白(SwissProt Accession
No.P70460)；vasp_human：人VASP蛋白(SwissProt Accession No.P50552)；
vasp_canfa：狗VASP蛋白(SwissProt Accession No.P50551)；Ena_drosop：果蝇
Ena多肽(SwissProt Accession No.Q24035)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明
本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，
通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold
Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条
件。
实施例1
hEV1基因的克隆
1.组织分离(Tissue isolation)
肾上腺来源于5个正常成年男性供体，在死后四小时内取出肾上腺组织，立
即置于液氮中冷冻保存。
2.mRNA的分离(mRNA isolation)
取出组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振荡后，再移入
玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml新管，抽提总RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，
USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。用带Oligo d(T)的纤维素柱分离总
RNA中的mRNA，定量。
3.cDNA文库的构建(Construction of cDNA library)
以mRNA为模板，合成双链cDNA，反转录引物见SEQ ID NO.1。补平末
端后，加含EcoRI切点的接头，接头序列分别见SEQ ID NO.2和3。磷酸化EcoRI
末端后，用XhoI限制性内切酶消化1.5小时，再进行片段分离。过柱筛选长度
＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，无菌水溶解，连接至Uni-ZAP XR载
体(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit
(Stratagene，CA9203，USA)进行包装，宿主菌使用XL 1-Blue MRF细菌。涂板并
测定滴度。
4.测序及数据库建立(Seqencing and Database Constructing)
挑选文库中有外源片段插入的克隆，扩增后抽提质粒(Qiagen，Germany)，用T3
和T7作为3＇端和5＇端的通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，
USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行EST大规模测序。测
序结果用FACTURA软件去除载体序列，传输到SUN Ultra 450 Server上进行下
一步的处理。所有的序列信息再用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的
BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，将无同源性或同源
性低于95％的序列视为新基因建立数据库。
5.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)
在得到的新基因片段序列信息基础上，进行cDNA全长克隆，分两阶段进行：
(1)“电子克隆”(Electronic Cloning)
以新基因片段序列作为探针搜寻dbEST数据库，将重叠序列＞50bp，同源性
在98％以上的表达序列标签(Expressed Sequence Tag，简称“EST”)序列认为同
一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER软件进行拼接，部分
EST可以延伸探针序列。再用STRIDER软件分析被延伸的序列是否具有完整的
开放阅读框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜寻Genebank或SwissProt
以确定该序列在核苷酸和氨基酸水平上是否与其他物种有同源性，以帮助判别所
得到的基因全长完整性如何。通过电子克隆的方法，通常可获取hEV1基因的全
长序列。
(2)cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)
如果通过“电子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全长，则在已有序列的5＇
或3＇端设计引物，在人类肾上腺Marathon-Ready cDNA文库(Clontech Lab，Inc，
USA)中进行长距离PCR反应。然后对PCR产物克隆、测序。用
AUTOASSEMBLER及STRIDER软件分析被延长的序列有无完整的ORF，如无，
重复上述过程直至获得全长。
(3)RT-PCR
对于5＇和3＇端已知的序列，中间尚有一段间隙(gap)无法从已有的公共数据库
或自身数据库获得，可考虑采用RT-PCR的方法。在序列5＇端设计引物，3＇端引
物采用Oligo-dT，在肾上腺总RNA库中进行扩增。然后对产物进行克隆、测序。
最后拼接并获得全长。
通过组合使用上述3种方法，获得了候选的人hEV1蛋白的全长编码序列。
在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物：R1：5＇-
AACCAGGATTCCCTCAGTAACG-3′(SEQ ID NO.4)为正向引物，寡核苷酸R2：
5＇-TTCAACACCATGAGCGCTG-3′(SEQ ID NO.5)为反向引物，以肾上腺组织的总
RNA为模板，进行RT-PCR扩增，R1/R2的PCR条件为94℃5分钟，随之以
94℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸5分钟。
电泳检测PCR扩增产物，获得目的片段长度为1807bp。然后按常规方法以PCR
扩增产物进行克隆、测序，获得如SEQ ID NO.6所示的序列。
实施例2
hEV1基因的序列信息与同源性分析：
本发明新的人hEV1全长cDNA(GenBank Accession No.AF112209。因申请保
密，故在本申请之前未对公众公开)的长度为1807bp，详细序列见SEQ ID NO.6，其
中开放读框位于120-1370位核苷酸。根据全长cDNA推导出hEV1的氨基酸序
列，共416个氨基酸残基，分子量44609.76，pI为8.91。详细序列见SEQ ID NO.
7。
将hEV1的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant
GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+
SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索。结果发现，
它与人、大鼠、小鼠、狗乃至果蝇中的基因都存在一定的同源性。在核苷酸水平
上，它与小鼠Ena/VASP类基因(即mEVL)的mRNA全编码序列(GenBank
Accession No.AF025506)的173-1271位碱基有86.6％的相同性，在氨基酸水平
上，它与小鼠Ena/VASP类蛋白(即mEVL)(SwissProt Accession No.P70429)的第
1-416位氨基酸残基有88.7％的相同性和93.3％的相似性(图1和图2)。由上可见，
hEV1基因与小鼠Ena/VASP类基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同
源性，因而两者在功能上也有很高相似性。
实施例3
hEV1蛋白的结构和功能研究：
1.将hEV1蛋白的氨基酸序列在PROSITE数据库(网址为：
http：//expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html)中检索基序(motif)，得到以下结果：
1 MSEQSICQAR ASVMVYDDTS KKWVPIKPGQ QGFSRINIYH NTASNTFRVV
51 GVKLQDQQVV INYSIVKGLK YNQATPTFHQ WRDARQVYGL NFASKEEATT
101 FSNAMLFALN IMNSQEGGPS SQRQVQNGPS PDEMDIQRRQ VMEQHQQQRQ
151 ESLERRTSAT GPILPPGHPS SAASAPVSCS GPPPPPPPPV PPPPTGATPP
201 SPPPLPAGGA QGSSHDESSM SGLAAAIAGA KLRRVQRPED ASGGSSPSGT
251 SKSDANRASS GGGGGGLMEE MNKLLAKRRK AASQSDKPAE KKEDESQMED
301 PSTSPSPGTR AASQPP NSSE AGRKPWERSN SVEKPVSSIL SRTPSVAKSP
351 EAKSPLQSQP HSRMKPAGSV NDMALDAFDL DRMKQEILEE VVRELHKVKE
401 EIIDAIRQEL SGISTT
(1)在氨基酸序列中，存在以下功能基序：
(i)下划线(155-158)：cAMP-和cGMP-依赖的蛋白激酶磷酸化位点(cAMP-and
cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site)
(ii)区域(19-21，20-22，46-48，121-123，250-252，285-287)：蛋白激酶C磷酸化位点
(Protein kinase C phosphorylation site)
(iii)区域(94-97，130-133，213-216，214-217，251-254，283-286，296-299，369-372)：
酪蛋白激酶II磷酸化位点(Casein kinase II phosphorylation site)
(iv)斜体区(68-73，89-94，117-122，208-213，209-214，222-227，244-249，249-254-
261-266，262-267，308-313)：N-豆蔻酰化位点(N-myristoylation site)
(v)粗斜区(321-324)：酰胺化位点(amidation site)
(vi)双下划线区(62-65，317-320)：N-糖基化位点(N-glycosylation site)
(2)功能分析：
N端糖基化位点，酪蛋白激酶II型磷酸化位点，糖氮聚糖结合位点，N-糖基化
位点，N-豆蔻酰化位点，蛋白激酶C磷酸化位点与翻译后修饰(post-translational
modifications)有关。在序列中间区域具有的磷酸化位点，与激活该蛋白与其他蛋白
的结合相关，这是Ena/VASP基因家族的特征之一。
2．将hEVl蛋白的氨基酸序列在proDom数据库(网址为：
http：//www．motif.genome,ad.jp)中检索结构域，得到以下结果：
(1)在氨基酸序列中，存在以下结构模块区：
(i)下划线区域(1-112)：血管扩张剂激活的磷酸蛋白VASP(Vasodilator-
stimulated Phosphoprotein VASP)结构模块区
(ii)粗斜区(157-213)：NPC来源的脯氨酸富含蛋白1(NPC Derived Proline
Rich Protein 1)结构模块区。
以上结果表明，本发明的人hEV1基因的N末端是一个相当保守的功能域，
而中间区域有一段富含脯氨酸的结构域，这是与SH3和[肌动蛋白]抑制蛋白等蛋
白结合的区域。这一结构域是Ena/VASP家族蛋白的特征性结构，在发挥信号传
导的功能中起着重要的作用。因此，本发明的人hEV1属于Ena/VASP家族。
3.将hEV1蛋白序列进行电荷分布的检测(http：//www.isrec.isb-
sib.ch/software/SAPS form.html)结果显示，电荷分布主要集中在蛋白的C端，如
下：
1 00-000000+ 000000--00 ++0000+000 0000+00000 0000000+00 00+00-0000
61 000000+00+ 0000000000 0+-0+00000 0000+--000 0000000000 00000-0000
121 00+0000000 0--0-00++0 00-00000+0 -00-++0000 0000000000 0000000000
181 0000000000 0000000000 0000000000 00000--000 0000000000 +0++00+0--
241 0000000000 0+0-00+000 00000000-- 00+000++++ 00000-+00- ++---000--
301 000000000+ 000000000- 00++00-+00 00-+000000 0+00000+00 -0+0000000
361 00+0+00000 0-000-00-0 -+0+0-00-- 00+-00+0+- -00-00+0-0 000000
按本领域的标准方法，将hEV1蛋白序列进行α-螺旋的预测(http：//www.embl
heidelberg.de/Services/serrano/agadir/agadir-start.html)。结果显示：α-螺旋出现可
能最高的区域是：361-416(36.15％)，241-300(10.78％)。
以上结果表明，在该hEV1蛋白的C末端，有一个带高电荷的α-螺旋，这与
Ena/VASP基因家族的蛋白结构特征所吻合。
综上所述，从hEV1蛋白的结构和理化特性进一步证实了该基因是Ena/VASP
基因家族的成员。由于蛋白质结构决定了功能特异性的生物化学原理，因此本发
明的人hEV1基因具有与Ena/VASP基因家族成员相似或相同的功能。该基因在
联系细胞信号传导通路和细胞骨架之间起着重要的桥梁作用。
本发明的人hEV1除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与
其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发
明人hEV1还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例
如将本发明人hEV1的N端与小鼠的EVL的N端进行交换，以产生新的活性更高或
具有新特性的蛋白。
针对本发明人hEV1的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化
相关蛋白(如该家族的其他成员)。
此外，本发明人hEV1核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高
人hEV1的表达水平或者抑制人hEV1的过度表达。本发明的人hEV1蛋白或其活
性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人hEV1缺失、无功能或异常而导
致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或
预后判断。
实施例4
hEV1基因的组织表达谱
1.电子Northern表达谱。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.，Biochem Biophys
Res Commun 1997 Dec 18；241(2)：589-594；Hwang DM，et al.，Circulation 1997 Dec
16；96(12)：4146-4203)，将hEV1 cDNA序列在GCG软件包中的dbEST数据库中
做BLAST检索，在得到的人类EST中，概率值＜10e-10、相同性＞95％的EST有
41个，可视为该基因在组织中的转录表达本，由此得出表达该基因的组织谱，发
现其在脑、松果体腺、心脏、肾脏、肝、乳腺、胎盘、睾丸、脾脏、子宫和黑色
素细胞中均有表达。这表明这种蛋白在人体许多组织中都发挥着重要作用。
实施例5
hEV1多肽的制备和提纯
全长的hEV1编码序列或其片段可以构建入许多商品化的蛋白质融合表达载
体之中，以表达和提纯重组蛋白。
1.hEV1蛋白或多肽可以以GST融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表
达。
4.原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌
根据人hEV1的全长编码序列(SEQ ID NO.6)，设计扩增出完整编码阅读框
的引物(分别对应于编码序列5＇和3＇端的约20个以上核苷酸)，并在正反引物上
分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实
施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将hEV1基因在保证阅读框正
确的前提下克隆至pGEX-2T载体(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鉴定好的表达载体
利用CaCl2方法转入大肠杆菌DH5α，筛选鉴定得到含有pGEX-2T-hEV1表达载
体的工程菌DH5α-pGEX-2T-hEV1。
3.表达GST-hEV1重组蛋白的工程菌的分离鉴定
挑取单菌落的DH5α-pGEX-2T-hEV1工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉
素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养
基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD600达0.5后，加入IPTG至
终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的
1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水
45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm/min离
心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋
白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达GST-hEV1融合蛋白的工程
菌。
4.GST-hEV1融合蛋白的提取纯化
按上述方法诱导表达GST-hEV1融合表达蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-
hEV1。诱导后的细菌离心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重悬细菌，超声破
碎细菌。破菌完全的超声液按每毫升加入20微升的量加入PBS饱和的50％谷胱
苷肽Sepharose 4B，37℃振摇结合30分钟，10000rpm/min离心10分钟沉淀
结合了GST-hEV1的谷胱苷肽Sepharose 4B，弃上清。按每毫升超声液所得沉淀
加入100μl PBS的量清洗两次，而后按每毫升超声液所得沉淀加入10μl还原型
谷胱苷肽洗脱液，室温置10分钟，10000rpm/min离心10分钟，上清即为洗脱
的融合蛋白。重复洗脱两次。洗脱的上清保存于-80℃，并进行SDS-PAGE电泳，
检测纯化效果。
实施例6
hEV1蛋白或多肽在昆虫细胞中进行真核细胞表达
1.hEV1杆状病毒表达载体的构建及转染Sf9昆虫细胞株
根据人hEV1的全长编码序列(SEQ ID NO.6)，设计扩增出完整编码阅读框
的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，
以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将
hEV1 cDNA在保证阅读框架的前提下克隆至pVL1392载体
(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鉴定好的表达载体3μg，野生型线性杆状病毒
DNA(BaculoGoldTM AcMNPV DNA，Pharmingen，San Diego，CA)1μg和
Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml无血清的昆虫培养基中，振荡15秒
混匀，室温孵育15分钟备用。取1ml(2×l06)Sf9昆虫细胞悬液于60mm组织培
养板中，贴壁1小时后换转染培养基，室温孵育15分钟后弃培养基，加入前面
制备好的DNA载体转染混合物，Parafilm密封培养板，于室温27℃振摇培养4
小时，而后换完全培养基培养3天，收集上清备用。
2.转入重组表达载体的昆虫细胞株的筛选鉴定
转染3天后的昆虫细胞用新鲜培养基制成细胞悬液(2×106/l ml)，取1ml
细胞悬液置于60mm组织培养皿中，加入3ml培养基，100μl收集的培养上清，
贴壁1小时，弃2ml培养基，继续室温培养1小时，弃去所有的培养基，加入预
热的含20μl 4％X-gal的3ml半固体培养基，培养5-7天后挑取白色细胞克隆于
96孔培养板中培养3-5天，而后吸取上清感染Sf9昆虫细胞。
收集感染的细胞进行Western鉴定。将细胞裂解后进行SDS-PAGE电泳，电
泳后的胶于Pharmacia的Mltiphor II半干电转移仪中将蛋白质转印到硝酸纤维膜
上，将硝酸纤维膜置于封闭液中封闭1小时，而后于抗hEV1的抗体溶液中封闭1
小时，TBS液振摇清洗5分钟共2次，而后将膜置于生物素标记的抗hEV1一抗
的第二抗体溶液中振摇1小时，TBS清洗，加入亲和素-碱性磷酸酶复合物反应
30分钟，TBS清洗2次，加入新鲜配制的显色液显色观察蛋白条带。
挑取高表达hEV1的Sf9细胞克隆。
3.hEV1蛋白的提取纯化
用高表达hEV1的Sf9细胞克隆的上清大量感染Sf9细胞，感染48小时后收
集细胞，PBS洗涤。每2×108细胞加入20ml细胞裂解液(0.5％Triton X-100，20
mM Na3PO4(磷酸钠，pH7.8)，500mM NaCl，1mM Na3VO4(钒酸钠)，1mM Pefabloc，
1μg/ml胃蛋白酶抑制剂，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破细胞，12000×g离心20
min去除细胞碎片，上清按每2×108的细胞加入2ml NTA-琼脂糖
(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小时。而后用含100 nM咪唑的His缓冲液洗涤
两次，用含20mM N，N＇-二哌嗪，500 mM NaCl，300mM咪唑的缓冲液洗脱以得
到纯化的蛋白。洗脱液保存于4℃，并进行SDS-PAGE电泳检测提取的hEV1蛋
白的纯度。
实施例7
抗人hEV1抗体的制备
1.免疫小鼠和脾细胞的制备：将实施例6中制得的重组蛋白用层析法进行分
离后备用，也可以用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中割
下，并用等体积的完全Freund＇s佐剂乳化。取6-8周龄Balb/C雌鼠，用50-
100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund＇s
佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量再加强免疫一次，3-5天后
用于融合。其中，脾细胞制备见鄂征主编，《组织培养和分子细胞学技术》，
北京出版社，第210页。
2.按《组织培养和分子细胞学技术》(同上)，第211页中的方法，制备饲养
细胞。
3.按《组织培养和分子细胞学技术》(同上)，第213页中的方法，进行细胞
融合。
4.抗体的检测：在细胞融合10-15天后，需逐孔进行检查，一旦发现旺盛
的杂交细胞集落生长，就应用hEV1蛋白做抗体活性的初步筛选，常用的方法有：
免疫荧光试验、发射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。检查出抗体活
性的孔后，应尽早进行克隆培养，并分离出抗体。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被
单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本
领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所
附权利要求书所限定的范围。
序列表
(1)一般信息：
(i)申请人：国家人类基因组南方研究中心
(ii)发明名称：一种新的人类蛋白及其编码序列
(iii)序列数目：7
(2)SEQ ID NO.1的信息
(i)序列特征：
(A)长度：50bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(ix)序列描述： SEQ ID NO.1
GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 50
(2)SEQ ID NO.2的信息
(i)序列特征：
(A)长度：13bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(ix)序列描述：SEQ ID NO.2
AATTCGGCACGAG 13
(2)SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征：
(A)长度：9bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(ix)序列描述：SEQ ID NO.3
GCCGTGCTC 9
(2)SEQ ID NO.4的信息
(i)序列特征：
(A)长度：22bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(ix)序列描述：SEQ ID NO.4
AACCAGGATTCCCTCAGTAACG 22
(2)SEQ ID NO.5的信息
(i)序列特征：
(A)长度：19bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(ix)序列描述：SEQ ID NO.5
TTCAACACCATGAGCGCTG 19
(2)SEQ ID NO.6的信息
(i)序列特征：
(A)长度：1807bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核苷酸
(ix)序列描述：SEQ ID NO.6
1 AACCAGGATT CCCTCAGTAA CGGCGAGTGA ACAGGGAAGA GCCCAGCGCC
51 GAATCCCCGC CCGCCGCCGC CGCCGCCGCC GGGTCGCCCC TGGCCGGGCG
101 CCCGTCCCCG GCAGCGACAA TGAGTGAACA GAGTATCTGC CAAGCCCGGG
151 CTTCCGTGAT GGTCTACGAT GACACCAGTA AGAAATGGGT ACCAATCAAA
201 CCTGGCCAGC AGGGATTCAG CCGGATCAAC ATCTACCACA ACACTGCCAG
251 CAACACCTTC AGAGTCGTTG GAGTCAAGTT GCAGGATCAG CAGGTTGTGA
301 TCAATTATTC AATCGTGAAA GGGCTGAAGT ACAATCAGGC CACGCCAACC
351 TTCCACCAGT GGCGAGATGC CCGCCAGGTC TACGGCTTAA ACTTTGCAAG
401 TAAAGAAGAG GCAACCACGT TCTCCAATGC AATGCTGTTT GCCCTGAACA
451 TCATGAATTC CCAAGAAGGA GGCCCCTCCA GCCAGCGTCA GGTGCAGAAT
501 GGCCCCTCTC CTGATGAGAT GGACATCCAG AGAAGACAAG TGATGGAGCA
551 GCACCAGCAG CAGCGTCAGG AATCTCTAGA AAGAAGAACC TCGGCCACAG
601 GGCCCATCCT CCCACCAGGA CATCCTTCAT CTGCAGCCAG CGCCCCCGTC
651 TCATGTAGTG GGCCTCCACC GCCCCCCCCA CCCCCAGTCC CACCTCCACC
701 CACTGGGGCT ACCCCACCTT CCCCACCCCC ACTGCCAGCC GGAGGAGCCC
751 AGGGGTCCAG CCACGACGAG AGCTCCATGT CAGGACTGGC CGCTGCCATA
801 GCTGGGGCCA AGCTGAGAAG AGTCCAACGG CCAGAAGACG CATCTGGAGG
851 CTCCAGTCCC AGTGGGACCT CAAAGTCCGA TGCCAACCGG GCAAGCAGCG
901 GGGGTGGCGG AGGAGGCCTC ATGGAGGAAA TGAACAAACT GCTGGCCAAG
951 AGGAGAAAAG CAGCCTCCCA GTCAGACAAG CCAGCCGAGA AGAAGGAAGA
1001 TGAAAGCCAA ATGGAAGATC CTAGTACCTC CCCCTCTCCG GGGACCCGAG
1051 CAGCCAGCCA GCCACCTAAC TCCTCAGAGG CTGGCCGGAA GCCCTGGGAG
1101 CGGAGCAACT CGGTGGAGAA GCCTGTGTCC TCGATTCTGT CCAGAACCCC
1151 GTCTGTGGCA AAGAGCCCCG AAGCTAAGAG CCCCCTTCAG TCGCAGCCTC
1201 ACTCTAGGAT GAAGCCTGCT GGGAGCGTGA ATGACATGGC CCTGGATGCC
1251 TTCGACTTGG ACCGGATGAA GCAGGAGATC CTAGAGGAGG TTGTGAGAGA
1301 GCTCCACAAG GTGAAGGAGG AGATCATCGA CGCCATCAGG CAGGAGCTGA
1351 GTGGGATCAG CACCACGTAA GGGGCCGGCC TCGCTGCGCT GATTCGTCGA
1401 GCCCATCCGG CGACAGAGGA CAGCCAGAAG CCCAGCCAGC CCCAGACTCC
1451 AGTGCACCAG AGCACGCACA GGAGCCTGGG CGCGCTGCTG TGAAACGTCC
1501 TGACCTGTGA TCACACATGA CAGTGAGGAA ACCAAGTGCA ACTCCTGGGT
1551 TTTTTTAGAT TCTGCCTGAC ACGGAACACC AGGTCTGCTC GTCTTTTTTG
1601 TGTTTTATAT TTGCTTATTT AAGGTACATT TCTTTGGGTT TCTAGAGACG
1651 CCCCTAAGTC ACCTGCTTCA TTAGACGGTT TCCAGGTTTT CTCCCAGGTG
1701 ACGCTGTTAG CGCCTCAGCT GGCGGTGACA GCCGGCCCAG CGTGGCGCCA
1751 CCACACACCG CAGAGCTGTC CAGGCACAGC TCCGTCCCCA GCGCTCATGG
1801 TGTTGAA
(2)SEQ ID NO.7的信息
(i)序列特征：
(A)长度：416氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：多肽
(ix)序列描述： SEQ ID NO.7
1 Met Ser Glu Gln Ser Ile Cys Gln Ala Arg Ala Ser Val Met Val
16 Tyr Asp Asp Thr Ser Lys Lys Trp Val Pro Ile Lys Pro Gly Gln
31 Gln Gly Phe Ser Arg Ile Asn Ile Tyr His Asn Thr Ala Ser Asn
46 Thr Phe Arg Val Val Gly Val Lys Leu Gln Asp Gln Gln Val Val
61 Ile Asn Tyr Ser Ile Val Lys Gly Leu Lys Tyr Asn Gln Ala Thr
76 Pro Thr Phe His Gln Trp Arg Asp Ala Arg Gln Val Tyr Gly Leu
91 Asn Phe Ala Ser Lys Glu Glu Ala Thr Thr Phe Ser Asn Ala Met
106 Leu Phe Ala Leu Asn Ile Met Asn Ser Gln Glu Gly Gly Pro Ser
121 Ser Gln Arg Gln Val Gln Asn Gly Pro Ser Pro Asp Glu Met Asp
136 Ile Gln Arg Arg Gln Val Met Glu Gln His Gln Gln Gln Arg Gln
151 Glu Ser Leu Glu Arg Arg Thr Ser Ala Thr Gly Pro Ile Leu Pro
166 Pro Gly His Pro Ser Ser Ala Ala Ser Ala Pro Val Ser Cys Ser
181 Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Thr
196 Gly Ala Thr Pro Pro Ser Pro Pro Pro Leu Pro Ala Gly Gly Ala
211 Gln Gly Ser Ser His Asp Glu Ser Ser Met Ser Gly Leu Ala Ala
226 Ala Ile Ala Gly Ala Lys Leu Arg Arg Val Gln Arg Pro Glu Asp
241 Ala Ser Gly Gly Ser Ser Pro Ser Gly Thr Ser Lys Ser Asp Ala
256 Asn Arg Ala Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Met Glu Glu
271 Met Asn Lys Leu Leu Ala Lys Arg Arg Lys Ala Ala Ser Gln Ser
286 Asp Lys Pro Ala Glu Lys Lys Glu Asp Glu Ser Gln Met Glu Asp
301 Pro Ser Thr Ser Pro Ser Pro Gly Thr Arg Ala Ala Ser Gln Pro
316 Pro Asn Ser Ser Glu Ala Gly Arg Lys Pro Trp Glu Arg Ser Asn
331 Ser Val Glu Lys Pro Val Ser Ser Ile Leu Ser Arg Thr Pro Ser
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376 Asp Ala Phe Asp Leu Asp Arg Met Lys Gln Glu Ile Leu Glu Glu
391 Val Val Arg Glu Leu His Lys Val Lys Glu Glu Ile Ile Asp Ala
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